CN105431523A - 纳米级人工抗原呈递细胞 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了纳米级人工抗原呈递细胞(aAPC)，其将刺激信号递送到包括细胞毒性淋巴细胞的淋巴细胞以用作用于免疫疗法的有力工具。

Description

纳米级人工抗原呈递细胞
本公开中引用的每个参考文献全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及免疫疗法。
附图简述
图1A-C.铁-葡聚糖纳米-aAPC的合成和表征。纳米-aAPC以两种方法中的一种合成：图1A，可溶性MHC-Ig二聚体(信号1)和B7.1-Ig(信号2)以1:1摩尔比直接化学偶联到顺磁性铁-氧化葡聚糖-涂覆的颗粒的表面。图1B，生物素酰化的MHC-Ig二聚体(信号1)和生物素酰化的抗-CD28(信号2)以1:1摩尔比结合到抗-生物素涂覆的颗粒。图1C，纳米颗粒跟踪分析确认纳米-aAPC是颗粒的单分散性的混合物，平均直径为50-100nm，以浓度8.3nM悬浮。
图2A-F.纳米aAPC诱导的增殖是抗原特异性和剂量依赖性的。图2A，抗原特异性纳米-aAPC诱导增殖。仅当使用具有同源的MHC/肽的抗-生物素涂覆的颗粒并且在不存在具有非同源肽或非同源MHC的颗粒时温育，TCR转基因2C(灰色)和pMEL(白色)T细胞增殖。图2B，添加信号1和信号2均产生最佳T细胞扩增。以10μL颗粒/1*106T细胞的剂量，仅具有MHC-Ig和抗-CD28两者的抗-生物素颗粒诱导T细胞稳健增殖。图2C，通过第3天CFSE稀释，以剂量当量浓度由LD和HD颗粒诱导的CD8+CTL的增殖。荧光降低表明增殖增加。当量体积的HD颗粒比LD颗粒诱导更大的增殖，其中0.5uLLD颗粒几乎未诱导扩增。图2D，(A)中样品第7天的倍数扩增显示了类似的图案。增殖是剂量依赖性的并且HD颗粒的增殖比当量剂量的LD颗粒大2-4倍。图2E，第3天由蛋白质当量浓度的LD和HD颗粒诱导的CD8+CTL的CFSE稀释。当颗粒剂量归一化至等同蛋白质浓度时，颗粒诱导类似的量的增殖。图2F，(C)中样品第7天的倍数扩增显示等同蛋白质剂量的HD和LD颗粒扩增等同。要求约0.5uLLD颗粒或0.08uLHD颗粒的阈值可诱导可检测的扩增。
图3A-F.T细胞功能表征。图3A，使用HD和LD颗粒扩增CD8+T细胞。选择颗粒剂量以通过HD和LD颗粒诱导等同扩增(分别3.5uL和20uL)并且诱导更多稳健的扩增(HD20uL)。在第7天再刺激样品并且通过细胞内细胞因子染色试验评估效应子功能。20uLHD样品(黑色圆)、3.5uLHD样品(黑色实心方块)和20uLLD样品(空心方块)全部诱导了稳健、等同以剂量依赖性的脱粒(图3B)，如通过CD107a和(图3C)IFNγ产生所测量。图3D，通过染色表面蛋白质CD44和CD62L所测量的记忆效应子表型。T细胞可被分为初始(CD62Lhi，CD44lo)、中央记忆(CD62Lhi，CD44hi)或效应子记忆(CD62Llo，CD44hi)。E)代表性的FACS图显示了纳米-aAPC刺激后七天的三个群体。图3F，使用2、10和50μL的LD或HD铁-氧化物纳米-aAPC刺激T细胞并且七天后表征。柱状图示出了刺激后所生成的初始(未填充的)、Tcm(灰色填充)和Tem(黑色填充)细胞的百分比。
图4A-B.来自内源性的前体的抗原特异性人T细胞扩增。图4A，使用增加剂量的具有A2-M1MHC-Ig的铁-葡聚糖纳米-aAPC温育PBMC并且在刺激前(PBMC，顶部行)或刺激一周后(中间行)或两周后(底部行)通过四聚物染色评估抗原-特异性。顶部左边的数字表示四聚物+(门控的)的CD8+细胞的百分比。M1特异性群体随刺激的重复循环(顶部到底部)和纳米-aAPC的剂量的增加(左到右)而增加。图代表了三个独立的实验，概括于图片B中。图4B，CD8+PBMC结合M1四聚物的百分比随刺激的重复和纳米-aAPC的剂量的增加(左图片)而增加。四聚物-阳性的细胞(右图片)的总数目随刺激的循环和颗粒剂量相似地增加，最高扩增至初始前体群体的800倍。
图5A-B.量子点纳米-Aapc的合成和表征。图5A，通过可溶性MHC-Ig二聚体(信号1)和抗-CD28抗体(信号2)以1:1的比率通过抗生物素蛋白-生物素介导偶联到聚合物-涂覆的量子点的颗粒表面构造量子点(Qdot)纳米-aAPC。图5B，全部CD8+T细胞中Qdot纳米-aAPC的扩增。第7天的倍数扩增是剂量依赖性且抗原-特异性的。非同源的颗粒不诱导任何扩增，而最高剂量的同源的量子点aAPC诱导CTL扩增14.6倍。
图6A-B.纳米-aAPC介导体内肿瘤排斥。图6A，量子点aAPC。在第0天，皮下注射B16肿瘤，在同一日，注射初始pMELT细胞。一天后，静脉内(iv)注射量子点aAPC。在指明的日期，将肿瘤尺寸测量为表面面积(mm2)，其中曲线下面积(AUC)示于右边。相比于未处理的(白色)、仅T细胞(浅灰色)和T细胞+非同源的量子点aAPC(方格)，使用pMELT细胞和同源的量子点aAPC(黑色柱状)处理的小鼠的肿瘤生长更少(4小鼠/组)。相比于非同源量子点aAPC，针对处理组，在整个实验中通过AUC(p<0.02)表征显著性。图6B，铁-葡聚糖aAPC。第7天，静脉内注射初始pMELT细胞。一天后，通过iv或皮下(sc)将量子点aAPC注射在右侧上。第0天，将B16肿瘤sc注射在右侧上。iv或sc注射后4天向处理分组中的小鼠给予另外的注射肿瘤以形成四个处理组：非同源的aAPCiv(第6天)，然后sc(第4天)(方格)，同源的aAPCiv然后iv(浅灰色)，同源的aAPCiv然后sc(深灰色)和同源的aAPCsc然后sc(黑色)。使用pMELT细胞和同源的铁-葡聚糖aAPCiv/sc或sc/sc(实心方块)处理的小鼠的肿瘤生长比非同源的aAPC更少(7只小鼠/组，针对AUC*p<0.01)。
图7A.CFSE，其强度在T细胞增殖后减小的染料显示包括激活的细胞的T细胞群(CD44混合)响应于基于6ng的微-或纳米-aAPC的刺激而增殖，但初始CD44低细胞并不如此。图7B.当将微-和纳米-aAPC滴定至在CD8+(激活)细胞中诱导等同倍数的扩增(约17倍)的剂量时，纳米-aAPC不扩增初始T细胞。
图8A.用于增强的T细胞激活的磁性富集战略的示意图。低频率的前体细胞结合到承载感兴趣的特异性抗原的纳米-aAPC。通过阳性磁性选择富集抗原特异性细胞，从而增强后续的扩增。图8B.使用纳米-aAPC，通过磁性富集增强抗原特异性T细胞的频率(y轴)。图8C.富集后纳米-aAPC介导的扩增的七天后抗原特异性细胞的增大的频率。图8D.作为互补方法，在预结合到纳米-aAPC后，细胞在磁场中被激活。磁场中的培养增强了细胞增殖。图8E.激活后三天CFSE染色显示了激活后1-3小时磁体诱导增强。图8F，这导致激活后七天所测量的增强的扩增，其中磁性刺激在全部所考虑的剂量处提供增强。
图9A-G.纳米-aAPC结合到初始和激活的细胞。图9A，通过将MHC-Ig二聚体和共刺激抗-CD28偶联到铁-葡聚糖纳米颗粒，纳米-aAPC合成的示意图。图9B，使用呈递8ng的Db-GP100的纳米-aAPC刺激后3天，通过CFSE稀释测量的初始(左)和激活的(右)pmelT细胞的增殖。未刺激的对照为灰色。图9C，在纳米-aAPC刺激后七天，初始(红色)和激活的(蓝色)细胞的扩增倍数。相比于T细胞，呈递8ng或更少的MHC-Ig的纳米-aAPC在初始细胞中诱导的增殖最小(*，p<0.01)。图9D，结合到2CT细胞的Kb-SIY纳米颗粒的解离(半衰期明显不同p<0.02通过配对学生t检验)。参见表1。图9E，Kb-SIY二聚体(MHC-Ig)和Kb-SIY纳米颗粒(颗粒)与初始(红色)和激活的(蓝色)细胞之间产生的平均TCR-MHC接触，如通过解离数据估计(p<0.05，通过ANOVA使用Tukey事后测试，参见表1)。图9F，增加的剂量的纳米-aAPC(通过呈递的总MHC-Ig测量)到初始(红色)和激活的(蓝色)细胞的平衡结合(p<0.0001通过双向ANOVA)。图9G，说明增大的平衡结合和颗粒脱离速率的A结合模型：初始细胞比激活的细胞结合更多珠，其中每个珠的接触更少。
图10A-G.由磁场诱导的aAPC和CD3ε的聚集。图10A-C，磁体-诱导的聚集的示意图。图10D，紧接于纳米-aAPC结合(时间0)和在存在或不存在磁场的情况下温育后，aAPC和CD3聚积。使用针对LFA-1(绿色)、纳米-aAPC上MHC-Ig(红色)和CD3ε(洋红)的抗体标记细胞。针对在温育之前的细胞(时间0，顶部左边)、使用非同源颗粒温育的细胞(非同源，顶部右边)、使用同源的纳米-aAPC(无磁体，底部左边)温育的细胞和使用同源的纳米-aAPC在磁场温育的细胞(磁体，底部右边)，示出了代表性的图像。图10E，针对代表性的图像时间0组(左边两个)和磁体组(右边两个)显示的聚积检测。白色轮廓代表通过算法鉴定的CD3簇(洋红)的边界。图10F，使用簇检测算法(15细胞/组)鉴定的平均簇面积。无磁体组比时间0具有显著更大的簇(*，平均差值0.22μm2)，并且磁体组比时间0(**，平均差值0.46μm2，p<0.0001通过ANOVA使用Tukey事后测试)和无磁体(**，平均差值0.24μm2)具有显著更大的簇。图10G，磁体组中细胞比时间0(*，平均差值5.8簇)具有更少的簇，并且磁体组细胞每个细胞比无磁体(**，平均差值1.9簇，p<0.001通过ANOVA使用Tukey事后测试)具有更少的簇。
图11A-G.磁体-增强的纳米-aAPC刺激产生体外稳健的T细胞增殖。图11A，刺激使用纳米-aAPC在存在(红色)或不存在(黑色)0.2T外部磁场的情况下的刺激后三天，通过CFSE稀释的PmelT细胞增殖。图11B，刺激后七天A中描述的样品的倍数扩增。图11C，使用5ngMHC-Ig剂量的纳米-aAPC和0.2T磁场温育0-24小时的PmelT细胞。第3天，通过CFSE稀释评估增殖。图11D，刺激后七天C的样品的倍数扩增。(*，p<0.001通过ANOVA使用Tukey事后测试)图11E，使用5ngMHC-Ig剂量的纳米-aAPC和增加的最高强度(0.15-0.225T)的磁场温育二十四小时的PmelT细胞，所述磁场由厚度增加的钕磁体生成。图11F，刺激后七天E的样品的增殖(*大于无磁体，**大于0.15T磁体,p<0.001通过ANOVA使用Tukey事后测试)。图11G，使用Kb-Trp2纳米-aAPC在存在或不存在0.2T磁场的情况下刺激二十四小时后，野生型小鼠的内源性的CD8+淋巴细胞的抗原特异性扩增。七天后，使用同源的Kb-Trp2(顶部行)或非同源Kb-SIINF(底部行)MHC-Ig二聚体将群体染色。
图12A-F.磁体-增强的T细胞体内扩增和过继性免疫疗法增加的功效。图12A，过继性免疫疗法模型的示意图。在过继性地转移到野生型Thy1.2+B6接受小鼠之前，在存在或不存在纳米-aAPC(5ng总MHC-Ig)和磁场的情况下，将CD44lo，Thy1.1+pmelTCR转基因小鼠的CD8+T细胞体外刺激24小时(6只小鼠/组)。图12B，转移后7天脾的Thy1.1细胞的代表性的频率和转移后21天淋巴结的Thy1.1细胞的代表性的频率。图12C，相比于不使用磁体(灰色)和未刺激(白色)的纳米-aAPC，Thy1.1+细胞的频率在使用纳米-aAPC在磁场(红色)中刺激的小鼠给定T细胞中显著地较高(p<0.001针对处理效应，对于第7天和第21天，通过双向ANOVA)。图12D，在第7天和第21天，合并全部器官中的总Thy1.1+细胞。在第7天，在纳米-aAPC+磁体组比在仅纳米-aAPC中观察到五倍更多的细胞(p<0.05，通过学生t检验)，但在第21天未达到显著性(p＝0.15)。图12E，使用磁场增强的过继性免疫疗法建立肿瘤的处理的示意图。在第0天施用SC肿瘤，第9天部分地清除骨髓细胞，并且在第10天，转移使用纳米-aAPC(5ng总MHC-Ig)在磁场(红色)或纳米-aAPC而无磁体(黑色)刺激24小时的CD44lo，CD8+pmelT细胞。将仅T细胞(灰色)和未经处理的(空心)组用作对照(8只小鼠/组)。图12F，相比于无磁体和对照组，使用磁体-增强的纳米-aAPC激活的T细胞的处理衰减了肿瘤生长(p<0.0001，针对处理效应，通过双向ANOVA)。箭头指出过继性转移的时间点(第10天)。审查小鼠是否死亡或肿瘤大于150mm2。处理使得T细胞+纳米-aAPC+磁体组中生存增加(p<0.001，通过Mantel-Coxlog-级检验)。
图13A-D.通过荧光结合到纳米-和微-aAPC的蛋白质的表征。图13A，结合到纳米颗粒的抗体和对照平均荧光强度(MFI)。使用过量的单克隆抗-小鼠IgG1(针对MHC-Ig)和与PE缀合的抗-抗体将纳米-aAPC和微-aAPC(细胞大小)颗粒温育30分钟并且在磁性柱上洗涤。在背景样品上，结合到颗粒的荧光抗体是可检测的，所述背景样品包括未使用抗-IgG1(无Ab)和未偶联到蛋白质的颗粒染色的微-和纳米-颗粒和使用抗-IgG1染色的微-和纳米-颗粒(空白)。通过与IgG1-PE标准曲线对比，测定溶液中蛋白质浓度。针对抗-IgG1，示出荧光并且为三次实验的代表。HD–高密度。LD–低密度。图13B，溶液中的颗粒不妨碍抗体荧光。滴定可溶性抗-IgG1PE抗体并且测量荧光。当在空白微-和纳米-颗粒的存在下测量可溶性抗体时，观察到相似的荧光发射。图13C，在磁性柱中充分洗涤以去除游离抗体。在三次洗涤(级分3)后，在背景上不能检测到荧光。提供0.63ug/ml游离的抗体的荧光以用于对比。图13D，通过405nm处铁吸光度表征纳米颗粒浓度。通过纳米颗粒跟踪分析测定颗粒浓度。针对吸光度，测量纳米颗粒的滴定并且计算标准曲线以测定颗粒浓度。
图14A-E.由微-aAPC诱导的pMELT细胞增殖。图14A，CD8+pMEL脾细胞包括记忆-表型，CD44阳性细胞群(代表性的百分比示为CD8的百分比，左)。通过非-触摸负选择富集，使用抗-CD44抗体在磁性富集柱中分离CD44lo初始细胞。图14B，通过CFSE稀释液，使用微-aAPC(深红色和深蓝色线条)和纳米-aAPC(浅红色和浅蓝色线条)刺激三天或未刺激(灰色线条)的初始CD44lo(左)和激活的(右)细胞的增殖。使用呈递等同的总量的MHC-Ig(8ng)的剂量的微-和纳米-aAPC。从图1重新产生纳米-aAPC数据。图14C，使用指明的剂量的微-aAPC刺激后七天，初始(红色)和活性(蓝色)细胞的增殖。图14D，MHC-Ig密度对诱导刺激的微-aAPC的影响。针对总MHC-Ig(4-16ng)，对高密度(HD，蓝色)和低密度(LD，红色)的微-aAPC进行规一化。针对密度，参见表1。激活后三天，通过CFSE稀释评估增殖。图14E，激活后七天图14D中示出的样品的倍数扩增是三个实验的代表。
图15A-D.图15A，结合同源的2CT细胞的Kb-SIY纳米颗粒。相比于初始CD44lo分离的2CT细胞(初始，红色，MFI179)和对照非同源CD44lopmelT细胞(非-特异性结合，灰色，MFI21)，肽激活(激活的，蓝色，MFI89)后七天，结合到激活的细胞。将结合表征为结合到细胞的Alexa647标记的颗粒的平均荧光强度。图15B，使用荧光抗-TCRβ测量，初始(MFI137)和激活的(MFI128)细胞的表面TCR表达。图15C，Kb-SIYMHC-Ig二聚体从激活的(深蓝色)和初始(深红色)细胞的解离。从图1重新产生纳米-aAPC从激活的(浅蓝色)和初始(浅红色)细胞的解离以用于对比。图15D，在磁场中温育一个小时前(红色)和一个小时后(黑色)结合到初始CD44low细胞的纳米-aAPC的解离曲线。图是2个实验的代表。
图16A-E.通过微-aAPC在磁场中TCR的聚集和扩增。图16A，磁场中微-aAPC的聚积。施加磁场前(左)和施加磁场后(右)显示的微-aAPC(红色)的代表性共焦图像。图16B，微-aAPC磁性聚积不诱导CD3聚积。使用针对LFA-1(绿色)、微-aAPC上的MHC-Ig(红色)和CD3ε(洋红)的抗体标记细胞。微-aAPC在全部三个通道中尤其是在红色和洋红色通道中显示自动-荧光。示出了使用同源的微-aAPC(无磁体)温育的细胞，所述细胞与微-aAPC未接触(顶部)和接触(底部)两者和使用同源的纳米-aAPC在磁场(磁体)中温育的细胞的代表性图像。图16C，平均簇面积和通过簇检测算法鉴定的簇/细胞(20个细胞/组，在与颗粒接触和未接触细胞之间平均地划分)。对照样品包括在温育之前(时间0)的细胞和非同源微颗粒温育的细胞(非同源)(p>0.05通过ANOVA)。图16D，使用5ng(左)和10ng(右)MHC-Ig剂量的微-aAPC在具有(红色)和不具有(黑色)0.2T磁场的情况下温育3天的PmelT细胞。第4天，通过CFSE稀释评估增殖。图16E，刺激后七天，使用增加的剂量的微-aAPC在具有和不具有0.2T磁场的情况下温育的pmelT细胞的倍数扩增(p>0.05，通过双向ANOVA)。
图17.通过钕圆盘磁体，产生于培养基中的磁场强度。培养基中场强的密度图，如使用FEMM(有限元素法磁力学)软件，通过有限元分析所测量。使用圆盘磁体(洋红)的厚度的3/4”、1/2”和1/4”分别产生最高达0.225T、0.200T和0.150T的磁场。
概述
本公开提供了一种纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)，其包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的淋巴细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物当结合到抗原时，接合独特的典型克隆的淋巴细胞受体，即抗原特异性淋巴细胞受体。
本公开提供了一种纳米-aAPC，其包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的B细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物。
本公开提供一种纳米-aAPC，其包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的T细胞共刺激分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的MHCI类分子复合物。所述至少一种MHCI类分子复合物包括至少两种融合蛋白。第一融合蛋白包含第一MHCI类α链和第一免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二MHCI类α链和第二免疫球蛋白重链。第一和第二免疫球蛋白重链缔合形成MHCI类分子复合物。MHCI类分子复合物包含第一MHCI类肽结合槽和第二MHCI类肽结合槽。
本公开提供了包含以上三段中描述的许多纳米-aAPC的制剂。
本公开提供了诱导抗原特异性T细胞的形成的方法。所述方法包括使包含许多前体T细胞的分离的制剂与包含T细胞影响分子和包含至少一个抗原结合槽的抗原呈递复合物的第一纳米-aAPC接触。抗原结合到抗原的结合槽。从而诱导许多前体T细胞的成员形成包含识别抗原的抗原特异性T细胞的第一T细胞群。如果使用包含特异性结合到CD3的抗体但不包含抗原呈递复合物的纳米-aAPC温育前体T细胞，那么抗原特异性T细胞在第一细胞群中的数目或百分比大于所形成的抗原特异性T细胞的数目或百分比。
本公开提供了增加抗原特异性T细胞在细胞群中的数目或百分比的方法。所述方法包括使用至少一种第一纳米-aAPC温育包含抗原特异性T细胞的第一细胞群，所述第一纳米-aAPC包含T细胞影响分子和包含至少一个抗原结合槽的抗原呈递复合物。抗原结合到抗原结合槽。进行足以形成包含相对于抗原特异性T细胞在第一细胞群中的数目或百分比，抗原特异性T细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的温育。
本公开提供了一种调节患者中免疫应答的方法。所述方法包括向患者施用包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体的制剂。许多颗粒的成员包括(1)至少一种T细胞影响分子；和(2)至少一种抗原呈递复合物。所述至少一种抗原呈递复合物包含至少一个抗原结合槽。抗原结合到所述至少一个抗原结合槽。
本公开提供了一种抑制患者中免疫应答的方法。所述方法包括向患者施用包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体的制剂。许多颗粒的成员包括(1)至少一种细胞凋亡诱导分子；和(2)至少一种抗原呈递复合物。所述至少一种抗原呈递复合物包含至少一个抗原结合槽。抗原结合到所述至少一个抗原结合槽。
本公开提供了一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法。所述方法包括使包含许多前体B细胞的分离的制剂与至少一种第一纳米-aAPC接触，所述第一纳米-aAPC包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的B细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物。从而诱导所述许多前体B细胞的成员形成包含抗体-产生B细胞的第一细胞群，所述抗体-产生B细胞产生特异性结合到抗原肽的抗体。
本公开提供了一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法。所述方法包括使用至少一种第一纳米-aAPC温育包含抗体-产生B细胞的第一细胞群，所述第一纳米-aAPC包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的B细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物。进行足以形成包含相对于抗体-产生B细胞在第一细胞群中的数目或百分比，抗体-产生B细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的温育。
本公开提供了一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法。所述方法包括使包含许多前体B细胞的分离的制剂与纳米-aAPC的制剂接触。纳米-aAPC包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的B细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物。从而诱导所述许多前体B细胞的成员形成包含抗体-产生B细胞的第一细胞群，所述抗体-产生B细胞产生特异性结合到抗原肽的抗体。
本公开提供了一种调节患者中免疫应答的方法。所述方法包括向患者施用包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体的制剂。许多颗粒的成员包括(1)至少一种B细胞影响分子；和(2)至少一种接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物的分子复合物。
本公开提供了一种富集多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞的方法。所述方法包括使用纳米-aAPC温育多克隆T细胞群，所述纳米-aAPC包含纳米颗粒；至少一种在纳米颗粒的表面上的淋巴细胞影响分子；和至少一种在纳米颗粒的表面上的分子复合物，所述分子复合物当结合到抗原时，接合抗原特异性淋巴细胞受体。纳米-aAPC还包含交联抗体或寡聚分子。
本公开提供了一种激活T细胞的方法。所述方法包括在磁场的存在下，使用纳米-aAPC温育T细胞群，所述纳米-aAPC包含T细胞影响分子和包含至少一个抗原结合槽的抗原呈递复合物。纳米-aAPC是顺磁性的。
本公开提供了一种向有此需要的患者提供抗原特异性T细胞群的方法，所述方法包括：
(1)在具有足以生成抗原特异性T细胞的强度的磁场的存在下，使分离的T细胞群与许多纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)接触，其中许多纳米-aAPC是顺磁性纳米颗粒，其在它们的表面上包含(i)至少一种T细胞影响分子和(ii)至少一种抗原呈递复合物，其中抗原呈递复合物包含至少一个抗原结合槽并且其中抗原结合槽包含抗原；
(2)将结合到纳米-aAPC的抗原特异性T细胞的复合物与分离的T细胞群体分离；并且
(3)向患者施用复合物。
在本方法的一些变化形式中，分离的T细胞群包含初始T细胞。在这些方法的一些变化形式中，使用磁性富集柱、流式细胞术或差速离心分离复合物。在本方法的一些变化形式中，通过选自静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和瘤内施用的施用途径施用复合物。
本公开提供了一种将抗原特异性T细胞群提供到有此需要的患者的靶区域的方法，所述方法包括：
(1)在具有足以刺激抗原特异性T细胞的强度的磁场的存在下，向患者施用许多纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)，其中许多纳米-aAPC是顺磁性的，并且在它们的表面上包含(i)T细胞影响分子和(ii)抗原呈递复合物，其中抗原呈递复合物包含抗原结合槽，其中抗原到抗原结合槽的结合接合独特的抗原特异性淋巴细胞受体；并且
(2)向靶区域施加磁场，其中靶区域包含接合独特的抗原特异性淋巴细胞受体的抗原，从而将纳米-aAPC指引到靶区域。
在段落[35]中所述的方法的一些变化形式中，通过选自静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和瘤内施用的施用途径施用纳米-aAPC。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种抗原呈递复合物包含MHCI类肽结合槽。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种抗原呈递复合物是MHCI类分子。在这些变化形式的一些中，所述至少一种抗原呈递复合物是包含至少两种融合蛋白的MHCI类分子复合物，其中第一融合蛋白包含第一MHCI类α链和第一免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二MHCI类α链和第二免疫球蛋白重链，其中第一和第二免疫球蛋白链缔合以形成MHCI类分子复合物，其中MHCI类分子复合物包含第一MHCI类肽结合槽和第二MHCI类肽结合槽。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种抗原呈递复合物包含MHCII类肽结合槽。在这些变化形式的一些中，抗原呈递复合物是MHCII类分子。在这些变化形式的一些中，抗原呈递复合物是包含至少四种融合蛋白的MHCII类分子复合物，其中(a)两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)MHCII类β链的细胞外结构域；和(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)MHCII类α链的细胞外结构域，其中两种第一和两种第二融合蛋白缔合以形成MHCII类分子复合物，其中每种第一融合蛋白的MHCII类β链的细胞外结构域和每种第二融合蛋白的MHCII类α链的细胞外结构域形成MHCII类肽结合槽。在这些变化形式的一些中，免疫球蛋白重链包含可变区。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，抗原肽结合到所述至少一个抗原结合槽。在这些变化形式的一些中，抗原肽选自肿瘤-相关的抗原的肽、自身抗原的肽、同种异型抗原的肽和传染剂抗原的肽。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，纳米-APC包含至少两种抗原呈递复合物。在这些变化形式的一些中，相同的抗原结合到所述至少两种抗原呈递复合物的每个抗原结合槽。在这些变化形式的其他变化形式中，不同的抗原结合到所述至少两种抗原呈递复合物的每个抗原结合槽。在一些变化形式中，第一抗原呈递复合物包含至少一个MHCI类肽结合槽，并且其中第二抗原呈递复合物包含至少一个MHCII类肽结合槽。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种抗原呈递复合物是非典型MHC样分子。在这些变化形式的一些中，非典型MHC样分子是CD1家族成员。非典型MHC-样分子可选自CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种T细胞影响分子是T细胞共刺激分子。T细胞共刺激分子可选自CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134(OX-40L)、B7h(B7RP-1)、CD40、LIGHT、特异性结合到CD28的抗体、特异性结合到HVEM的抗体、特异性结合到CD40L的抗体、特异性结合到OX40的抗体和特异性结合到4-1BB的抗体。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种T细胞影响分子是粘附分子。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，粘附分子选自ICAM-1和LFA-3。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种T细胞影响分子是T细胞生长因子。T细胞生长因子可选自细胞因子和超抗原。细胞因子可选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和γ干扰素。T细胞生长因子可选自：(A)包含至少两种融合蛋白的第一分子复合物，其中第一融合蛋白包含第一细胞因子和免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二细胞因子和第二免疫球蛋白重链，其中第一和第二免疫球蛋白重链缔合以形成第一分子复合物；和(B)包含至少四种融合蛋白的第二分子复合物，其中(a)两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)第一细胞因子；并且(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)第二细胞因子，其中两种第一和两种第二融合蛋白缔合形成第二分子复合物。
在以上所述的变化形式的一些中，T细胞生长因子是第一分子复合物。在这些变化形式的一些中，第一和第二细胞因子是相同的。在这些变化形式的其他变化形式中，第一和第二细胞因子是不同的。
在以上所述的变化形式的一些中，T细胞生长因子是第二分子复合物。在这些变化形式的一些中，第一和第二细胞因子是相同的。在这些变化形式的其他变化形式中，第一和第二细胞因子是不同的。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种T细胞影响分子是调节T细胞诱导分子。T细胞诱导分子可选自TGFβ、IL-10、干扰素-α和IL-15。
在段落[34]和[35]中所述的方法的一些变化形式中，所述至少一种T细胞影响分子是细胞凋亡诱导分子。细胞凋亡诱导分子可选自毒素、TNFα和Fas配体。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，纳米-aAPC包含至少两个不同的T细胞影响分子。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，在37℃进行温育，持续10分钟至3天。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，抗原特异性T细胞是细胞毒性T细胞。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，抗原特异性T细胞是辅助T细胞。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，抗原特异性T细胞是调节T细胞。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，患者患有癌症、自身免疫疾病、传染性疾病或受免疫抑制。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，前体T细胞从患者获得。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，前体T细胞从非患者的供体获得。
在段落[34]和[35]所述的方法的一些变化形式中，通过选自静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和瘤内施用的施用途径施用抗原特异性T细胞。
本公开提供了使用纳米颗粒例如磁性纳米颗粒靶向不同生理状态的细胞(例如初始对先前激活的T细胞)并且刺激靶细胞群的方法。例如如图9C所示并且如以下具体实施例中更多细节所讨论的，提供32ng的剂量的MHC的纳米-aAPC，在一周的时间内在20倍和30倍之间，刺激初始和先前激活的T细胞两者。然而，以8ng或3.2ng的MHC，仅激活的T细胞被刺激。因此，可使用包含例如3.2-8ng的MHC的剂量的纳米-aAPC刺激T细胞群中先前激活的T细胞而不影响群体中的初始T细胞。
本公开提供了差异性地刺激先前激活的T细胞与初始T细胞的方法。在一些变化形式中，可使用包含3.2-8ngMHC与32ngMHC的纳米-aAPC将T细胞的纳米-aAPC结合和分离与T细胞的激活分离。在一些变化形式中，使用例如针对CD44的抗体，T细胞群基本上耗尽了先前的活性T细胞，从而保留了富集初始T细胞的群体。将允许结合到纳米-aAPC的初始T细胞进行它们的纯化。然后可通过将T细胞-纳米-aAPC复合物暴露于磁场，激活包含结合纳米-aAPC的初始T细胞。
本公开提供了分离、表征并且用作其他细胞包括例如B细胞和干细胞的治疗剂的方法。使用诸如以下实施例9中描述的那些方法，测定将差异性地激活不同生理状态的群体中的细胞的纳米颗粒的表面上的最佳配体密度(或可选地，纳米颗粒所包含的此类配体的剂量)。根椐细胞群，配体可包含例如抗体或抗体的一部分、肽、核苷酸、碳水化合物、类脂、用于给定受体的天然配体的全部或一部分(例如，EGF、PDGF)、化学物质(例如铬盐或结合亲免素分子受体诸如FKBP结合结构域的一价的合成配体)、单个抗-整联蛋白Fab片段、RGD肽等等。
详述
免疫疗法包括激活和扩增免疫细胞以治疗疾病。因为CTL特异于给定的肿瘤抗原或病原体，扩增若干指数以产生稳健的应答并且生成可预防疾病(1)复发的长期记忆，针对疗法，诱导胞毒(CD8+)淋巴细胞(CTL)应答的是有吸引力的。CTL可体内直接激活或者可体外扩增并且过继性地转移到患者(3，4)。
对于体外和体内免疫疗法，将刺激信号递送到胞毒淋巴细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)是有力的工具。迄今，已通过将T细胞激活蛋白耦合到直径为若干微米的刚性载体来合成基于颗粒的aAPC。例如，通过耦合递送两种必要且足够的T细胞激活信号(5，6)的蛋白质，我们先前开发了细胞尺寸的直径为4.5μm(“纳米级”)的基于珠的T细胞扩增平台。T细胞激活需要的存在于APC上的信号包括信号1，呈现在主要组织相容性复合体(MHC)中的上下文中结合TCR(7)的同源的抗原肽；和信号2，一组调节T细胞应答的共刺激受体。在本系统的一些实施例中，信号1通过加载有特异性肽(MHC-Ig)的嵌合MHC-免疫球蛋白二聚体赋予，并且信号2是B7.1(T细胞受体CD28的天然配体)或针对CD28的激活抗体。两种蛋白直接化学偶联到微米级(4.5μm)珠的表面以产生人工抗原呈递细胞(aAPC)。
然而，对于微米级aAPC，存在若干缺点。当静脉内注射时，较大的珠可停留在毛细血管床中并且诱导组织损坏。当皮下注射时，尺寸设定成微米的珠不易进行到其中大多数T细胞驻留的淋巴结(8，9)。此外，已知尺寸设定成微米的珠优先地被网状内皮系统的吞噬细胞清除(10,11)。
本公开通过提供各种纳米级aAPC(纳米-aAPC)克服了这些限制。据我们所知，这是对诱导T细胞增殖的纳米级基于珠的aAPC的第一篇描述。针对抗原或药物摄取，评估纳米颗粒；然而，aAPC平台需要特定细胞表面受体-配体相互作用在纳米颗粒-细胞接合部发生。研究表明，仅直径大于2微米的珠能够诱导T细胞增殖(16，17)；并且与较小尺寸的颗粒诸如量子点纳米晶体一起发挥作用，聚焦于这些试剂的使用以研究TCR-MHC相互作用的生物物理学方面(15)。当直接测试时，最近的工作表明纳米颗粒诱导短期功能性应答的效率远低于微珠，但无所报道的增殖(18)。
因此，意料不到的是如本文所述的纳米-aAPC诱导来自TCR转基因小鼠脾细胞和来自人多克隆外周血T细胞两者的抗原特异性T细胞增殖。在再次微生物攻击后，被刺激的T细胞具有稳健的效应子表型，从而脱粒并且产生IFNγ。当体内注射时，本文所述的纳米级aAPC还在皮下小鼠黑素瘤模型中介导肿瘤排斥反应。
虽然不限于以下工作实施例中描述的实施方案，但这些实施例示出纳米-aAPC的两个实施方案：(1)可生物相容的铁-葡聚糖顺磁性珠，直径为50-100nm；和(2)涂覆有抗生物素蛋白的量子点纳米晶体，直径小于20nm。在这些实施方案中，信号1通过肽-MHC复合物提供，并且信号2通过B7.1-Ig或抗-CD28提供。
纳米-aAPC允许探究新的基于颗粒的免疫疗法战略。如以上所提及，微米级aAPC太大而不能由淋巴携带并且当皮下注射时，保留在注射位点。当静脉内注射时，它们停留在毛细血管床中。事实上，微米级珠的不佳通行已排除了针对最佳免疫疗法，aAPC应通行的研究。纳米-aAPC的通行和生物分布可能比微米级aAPC更有效，并且从而允许探究新的体内免疫疗法战略。
例如，其中aAPC可为最有效的两个潜在位点是其中初始和记忆T细胞驻留的淋巴结以及肿瘤本身。直径为约50-100nm的纳米颗粒可通过淋巴被摄取，并且传送到淋巴结(8,30)，因此获得进入较大T细胞库。如以下实施例中所述，皮下注射纳米-aAPC比对照或静脉内注射珠使得肿瘤生长得更少。这表明纳米-aAPC从细胞外空间流至淋巴结可作为最佳体内T细胞扩增的可能的机制。此外，由于不良地形成的肿瘤脉管(45,46)，纳米级递送媒介物通过增强的渗透性保持效应，优先地在肿瘤中积聚。通过原位递送免疫刺激信号，肿瘤微环境中的aAPC可解决癌症免疫疗法中最突出的困难中的一个，免疫抑制肿瘤微环境(47)。
在一些实施方案中，在向患者施用后，通过聚集纳米-aAPC可实现初始T细胞应答的刺激。两种战略在以下实施例7中示出，虽然可使用其他战略。在第一战略中，在刺激前，使用磁性纳米-aAPC珠富集抗-肿瘤、抗原特异性T细胞。在不希望被此解释限定的同时，我们认为富集增加了细胞因子可用性并且为体内T细胞扩增提供了更好的环境。在第二战略中，磁性纳米-aAPC珠和T细胞在磁场中温育，这促进了纳米-aAPC介导的激活。这种战略需要发展基于可商购获得的细胞富集柱的体外培养系统，所述柱不旨在用于短期细胞培养或磁体-诱导的激活。例如使用给纳米-aAPC“加盖”的第二抗体或珠，也可实现这种聚集。例如，可使用针对纳米-aAPC上的蛋白交联抗体或寡聚分子(例如，寡核苷酸或纳米-aAPC表面的抗体)实现聚集。
将纳米-aAPC分别用于抗原特异性T细胞和抗体特异性B细胞的离体扩增具有多个重要优势。纳米-aAPC可被预成形，具有可再现的抗原呈递或抗体诱导活性并且可用于较大的患者群体。相比于使用树枝状细胞的方法，使用纳米-aAPC显著简化并且缩短了抗原特异性T细胞的离体扩增过程并且可诱导前体T或B细胞扩增到适用于治疗剂使用的数目。此外，纳米-aAPC可在一个步骤中，使用抗原特异性刺激，合并前体T或B细胞分离。
在接合后，T细胞受体内化(40)，表明了纳米-aAPC刺激T细胞受体并且随后递送细胞内货物诸如siRNA两者的可能性。
虽然已针对存在于细胞上的MHC7和尺寸设定的MHC涂覆的颗粒8–11广泛研究了TCR-MHC相互作用，但尚未完全了解细胞-纳米颗粒界面处的受体-配体相互作用。12如以下和具体实施例中所述，纳米颗粒结合和细胞激活对膜空间排列敏感，这在T细胞激活期间是非常重要的，并且可使用磁场调控聚集-结合的纳米颗粒以增强激活。例如，T细胞激活诱导持续增强的纳米级TCR聚集13–16的状态，并且如下所述，纳米颗粒以较大的颗粒不如此的方式对这种聚集敏感。
此外，可利用纳米颗粒与TCR聚集的相互作用增强受体触发。T细胞激活由信令蛋白质的聚积介导17,其中几百纳米范围内的“信号集”初始在T细胞-APC接触位点的外周形成并且向内迁移。18如下所述，可使用外部磁场驱动结合到TCR的顺磁性纳米-aAPC的聚积，从而使TCR集聚积并且初始T细胞激活增强。
磁场可在顺磁性颗粒上适当地施加强力，但是否则是生物学惰性的，从而使得它们变成控制颗粒行为的有力的工具。19,20在以下所述的方法中，结合到顺磁性纳米-aAPC的T细胞在外加磁场存在下被激活。纳米-aAPC本身被磁化，并且被吸引到场源和磁场中附近的纳米颗粒，20,21从而诱导珠以及因此TCR聚积以增强aAPC-介导的激活。
如以下具体的实施例所示，纳米-aAPC结合更多的TCR并且诱导相比于初始T细胞先前激活的更大的激活。此外，应用外部磁场诱导初始细胞上纳米-aAPC聚积，从而增强T细胞体外增殖和之后体内过继性地转移两者。重要地，在黑素瘤过继性免疫疗法模型中，由磁场中的纳米-aAPC激活的T细胞介导肿瘤排斥。因此，使用所施加的磁场允许激活初始T细胞群，否则则不良地响应于刺激。这是免疫疗法的重要特征，因为对于癌症免疫疗法，43–45具有更高的增殖能力和生成强效的长期T细胞应答的更大的能力，初始T细胞已显示比更加分化的亚型更有效。因此，本公开提供了一种新颖方法，借此纳米-aAPC可耦合到T细胞的磁场增强的激活以增加从初始前体扩增的抗原特异性T细胞的收率和活性，从而改善用于例如患有传染性疾病、癌症或自身免疫疾病的患者的细胞疗法或对免疫抑制的患者提供预防性保护。
纳米-aAPC
除非另外指明，“纳米-aAPC”包括至少一种淋巴细胞-影响分子和包括至少一个抗原结合槽的至少一种抗原呈递复合物。任选地，抗原可结合到抗原结合槽。
在一些实施方案中，纳米-aAPC包括至少一种T细胞影响分子和包括至少一个抗原结合槽的至少一种抗原呈递复合物。任选地，抗原可结合到抗原结合槽。
可使用纳米-aAPC刺激抗体形成。在这些实施方案中(本文中也称为“抗体-诱导的纳米-aAPC”)，纳米-aAPC包含至少一种B细胞影响分子(例如CD40配体、细胞因子或细胞因子分子复合物，如以下所述)和至少一种分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或接合B细胞表面上的MHC-抗原复合物。
纳米颗粒
纳米颗粒可由例如以下制成：金属诸如铁、镍、铝、铜、锌、镉、钛、锆、锡、铅、铬、锰和钴；金属氧化物和水合氧化物诸如铝氧化物、三氧化二铬、氧化铁、氧化锌和氧化钴；诸如镁、铝、锌、铅、铬、铜、铁、钴和镍的金属硅酸盐；合金诸如青铜、黄铜、不锈钢等。纳米颗粒可由非金属或有机材料诸如纤维素、陶瓷、玻璃、尼龙、聚苯乙烯、橡胶、塑料或胶乳制成。在一些实施方案中，纳米颗粒包含金属和非金属或有机化合物的组合，例如甲基丙烯酸酯-或苯乙烯-涂覆的金属和硅酸盐涂覆的金属。基体材料可掺杂有改变其物理或化学特性的药剂。例如，稀土氧化物可被包括在硅铝酸盐玻璃中以产生具有高密度的顺磁性玻璃材料(参见White&Day,KeyEngineeringMaterials第94-95卷,181-208,1994)。在一些实施方案中，纳米颗粒包含或由可生物降解的有机材料诸如纤维素、葡聚糖等等组成。合适的可商购获得的颗粒包括例如镍颗粒(型号123、VM63、18/209A、10/585A、347355和HDNP，由NovametSpecialtyProducts公司出售，Wyckoff,N.J.；08841R，由Spex,公司出售；01509BW，由Aldrich出售)、不锈钢颗粒(P316L，由Ametek出售)、锌粉(Aldrich)、钯颗粒(D13A17,JohnMattheyElec.)和TiO2、SiO2或MnO2颗粒(Aldrich)。
选择粒子的密度使它在通过样本悬浮液时将差异性地比细胞沉积得更快。因此，颗粒优选地由高密度材料构成以有利于分离细胞和操纵颗粒。使用此类颗粒允许颗粒在重力下沉积以有利于它们从抗原特异性T细胞、T细胞前体、B细胞前体、B细胞或其他细胞分离。
在一些实施方案中，在蛋白质结合到其表面之前，纳米颗粒被涂覆。一旦选择了涂料化学物质，纳米颗粒的表面可被激活以允许特定蛋白分子的特异性附接。因此，可鉴于与各种T或B细胞群或T或B前体细胞群的最佳反应性和生物相容性，选择涂料。优选地，无论使用哪种涂料化学物质，均为另外的激活化学物质提供了合适的基体。多个此类涂料是本领域中为人们所熟知的。例如，纳米颗粒可涂覆有人血清白蛋白、三(3-巯基丙基)-N-甘氨酰氨基)甲烷(美国专利6,074,884)、明胶-氨基葡聚糖类(美国专利5,466,609)或氨基酸均聚物或无规共聚物。在一些实施方案中，使用了包含聚(谷氨酸盐、赖氨酸、酪氨酸)[6:3:1]的无规氨基酸共聚物；此类共聚物以产品号P8854购自SigmaChemicalCo.。它是以6份数谷氨酸、3份数赖氨酸和1分数酪氨酸的比率的氨基酸谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的直链无规聚合物。在一些实施方案中，使用以4份数赖氨酸到1分数酪氨酸的比率包括赖氨酸和酪氨酸的氨基酸共聚物。在一些实施方案中，使用以1份数赖氨酸到1分数丙氨酸的比率包括赖氨酸和丙氨酸的氨基酸共聚物。
在一些实施方案中，纳米颗粒涂覆有合成聚合物，然后合成聚合物在它连接蛋白质分子之前被激活，所述蛋白质分子包括但不限于T或B细胞影响分子、抗原呈递复合物或接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物的分子复合物。
在一些实施方案中，具体地讲非常适合于镍表面(尤其是颗粒)，纳米颗粒涂覆有二氧化硅。相比于更通常使用的有机聚合物表面，二氧化硅表面具有若干优点。它高度均匀、化学确定的且化学和热稳定，其中硅烷醇残余覆盖整个表面并且可用于与三乙氧基硅烷的氨基-或环氧-衍生物稳定共价以用于附接到蛋白质和其他生物分子。硅烷衍生物可覆盖整个表面，形成允许对表面上的特异性和非特异性相互作用的高度控制的二维聚合物的单层。使用二氧化硅涂覆各种固体载体的方法在美国专利2,885,399中有所公开；还可参见Birkmeyer等人，ClinChem.1987年9月；33(9):1543-7。例如，可使用偏硅酸钠、铝酸钠和硼酸的溶液温育纳米颗粒以形成沉积在表面上的聚合的二氧化硅。二氧化硅涂覆的另一个方法是混合硅酸钠和纳米颗粒并且在95℃使用硫酸降低pH，之后用水洗涤。参见美国专利2,885,366；Eagerton,KONA16,46-58,1998。例如，镍表面可通过首先将它们分散在0.2NNaSO4溶液中并且将溶液加热到95℃来涂覆。使用NaOH将pH调节至10。然后添加硅酸钠的硫酸溶液并且在95℃混合0.5小时。使用蒸馏水将载体洗涤若干次。可通过测定载体对硝酸消解的抗性来检查涂覆的程度。可使用基于X-射线散射的用于表面化学组成的ESCA分析获得载体表面的元素组成，从而提供对表面涂覆的程度和活性残余的硅烷化的信息。
在一些实施方案中，通过使用无毒的金属氧化物涂料诸如铝氧化物“钝化”镍表面来提供纳米颗粒上的表面基体。涂覆的其他方法包括将金属氧化物诸如铝氧化物沉积到纳米颗粒的表面。铝氧化物是可用的基体，因为它提供了可被官能化以用于蛋白质缀合的低非特异结合特性的惰性表面。
可通过多种方法提供铝氧化物涂料，诸如溶胶-凝胶法，其中通过将铝溶胶-凝胶蒸发到纳米颗粒上，之后在空气中烘焙以形成氧化物来形成薄型连续层的无定形铝氧化物。Ozer等人，SPIE3789,77-83,1999。在其他实施方案中，可使用常规的物理气相沉积技术(Smidt,InterMatRev35,21-27,1990)或化学气相沉积(Koh等人，ThinSolidFilms304,222-24,1997)。如果使用镍纳米颗粒，可控制此类涂层的厚度以在最小化镍浸出的同时提供足够的稳定性。可通过镍离子的定量化学测定测试密封镍的成功。可在各种温度在各种缓冲液和生物流体中温育纳米颗粒，并且可测量镍离子在这些培养基中的水平。
可通过表面浸出测定确定表面涂层的完整性。例如，当镍纳米颗粒的表面完全被玻璃或其他非反应性金属涂覆时，纳米颗粒在酸性条件下耐受镍浸出。例如，已知质量的涂覆镍的纳米颗粒可在10％硝酸中温育并且观察24小时。因为镍的溶解，溶液变绿。未经过处理的镍使溶液立即变绿。具有氧化镍层在其表面上的镍纳米颗粒在约20分钟中内将溶液变绿。如上所述涂覆有二氧化硅层的纳米颗粒耐受硝酸大于8小时，这指明厚层的二氧化硅沉积在表面上。还可通过在类似于用于B或T细胞激活(如下所述)的培养条件的细胞培养基中温育载体，在水性条件中测试纳米颗粒。通过原子吸收光谱法可测量浸出到溶液中的镍的量。
如果需要，可涂覆前可预处理纳米颗粒。预处理纳米颗粒例如可将载体灭菌并且除去热源，以及在载体的表面产生氧化物层。当使用金属纳米颗粒时，这种预处理尤其有益。在一些实施方案中，预处理涉及在约200-350℃优选约250℃的范围的温度内，将纳米颗粒加热约2-6小时，优选约5小时。
通过吸收或通过直接化学粘合，包括共价粘合，分子可直接附接到纳米颗粒。参见例如Hermanson,BIOCONJUGATETECHNIQUES,AcademicPress,NewYork,1996。使用多种化学官能团可直接激活分子本身，所述官能团包括亲核基团、离去基团或亲电子基团。激活官能团包括烷基和卤化酰基、胺、巯基、醛、不饱和键、酰肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮和其他已知激活用于化学粘合的基团。另选地，通过使用小分子-耦合剂，分子可结合到纳米颗粒。耦合剂的非限制性示例包括碳二亚胺、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、二氯乙基胺、双官能的醛诸如戊二醛、酐等。在其他实施方案中，如本领域所熟知，分子可通过亲和力键合诸如生物素-链亲和素连接或耦合，耦合到纳米颗粒。例如，通过共价或非共价附接，链霉抗生物素蛋白可结合到纳米颗粒，并且使用本领域中为人们所熟知的方法可合成生物素酰化分子。参见例如Hermanson,1996。
如果设想共价键合到纳米颗粒，载体可涂覆有聚合物，所述聚合物包含一个或多个可用于通常通过连接子共价附接到合适的反应物的化学部分或官能团。例如，氨基酸聚合物可具有基团诸如赖氨酸的ε-氨基，所述基团可用于通过适当的连接子共价地耦合分子。本公开还设想将第二涂层放置于纳米颗粒上以提供这些官能团。
可使用激活化学物质以允许分子特异性地稳定地附接到纳米颗粒的表面。存在多种可用于将蛋白质附接官能团的方法；参见Hermanson,1996。例如，可使用常见的交联剂戊二醛以两步法将蛋白质胺基团附接到胺化的纳米颗粒表面。所得的连接为水解稳定的。其他方法包括包含与蛋白质上胺反应的n-氢-琥珀酰亚胺基(NHS)酯的交联剂、与胺-、巯基-反应的活性卤素或包含组氨酸-蛋白质的交联剂、包含与胺或巯基反应的环氧化物的交联剂的使用、马来酰亚胺基团和巯基之间的缀合和侧糖部分的高碘酸盐氧化之后还原胺化的蛋白质醛基团的形成。
在一些实施方案中，使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷，蛋白质分子附接到二氧化硅涂层(Weetall&Filbert,MethodsEnzymol.34,59-72,1974)。这种化合物与二氧化硅表面形成稳定的共价键并且同时使得表面更疏水。可在含水的低pH培养基中进行硅烷化反应，已知这允许具有可用于缀合的氨基的单层的形成。通过同双官能偶联剂戊二醛或通过异双官能剂诸如SMCC进行蛋白质的附接。在蛋白质附接后，通过使用各种蛋白质、亲水性聚合物和氨基酸温育可激活残余的表面-缔合的偶联剂。白蛋白和聚乙二醇类尤其合适，因为它们封闭蛋白质和细胞非特异性结合到固相。
在一些实施方案中，使用氨基硅烷化激活铝氧化物-涂覆的纳米颗粒的表面。参见美国专利4,554,0881985。激活铝氧化物涂覆的纳米颗粒的表面的另一种方法是吸收强效粘附的聚合物诸如glu-lys-tyr三肽。通过赖氨酸胺通过与同双官能交联剂诸如二氟二硝基苯反应或通过与戊二醛反应可激活三肽聚合物。然后蛋白质可直接附接到激活的表面。
通过蛋白质的直接偶联或通过使用间接方法可完成特异性蛋白质到纳米颗粒表面的附接。当偶联到连接子或间隔蛋白质诸如抗-小鼠IgG或链霉抗生物素蛋白时，某些蛋白质将自身提供到直接附接或缀合，而其他蛋白质或抗体保持更好的官能活性。如果需要，可使用连接子或附接蛋白质。
可改变相同纳米颗粒上特定蛋白质的比率以增加抗原或抗体呈递中纳米颗粒的效果。例如，可如下测试A2-Ig(信号1)到抗-CD28(信号2)的最佳比率。纳米颗粒与A2-Ig和抗-CD28以不同的比率偶联，诸如30:1、10:1、3:1、1:1、0.3:1；0.1:1和0.03:1。偶联到载体的蛋白质的总量保持恒定(例如，颗粒为150mg/ml)或可被改变。因为，针对信号1对信号2，效应子功能诸如细胞因子释放和生长可具有不同于T细胞激活和分化的要求，因此可独立地测定这些功能。
纳米颗粒可通过若干分析测定来表征以评估产生载体时发生的加成反应。这些包括对官能团诸如胺和醛的测定以及对于特定类型的蛋白质分子的结合的测定。此外,可使用官能测定评估纳米颗粒的生物活性。可通过本领域已知的任何方法测定结合到纳米颗粒的表面的蛋白质的量。例如，使用280nm处吸光度，可通过测定从反应溶液中去除的蛋白质的量间接测量结合蛋白质。在这个实施方案中，通过280nm处吸光度，测量添加到纳米颗粒之前和之后反应溶液的蛋白含量并且进行对比。还测量包含于任何洗涤溶液中蛋白质的量并且将所述量添加到存在于反应后溶液中存在的量。差值指示结合到纳米颗粒的表面的量。此方法可用于快速筛选不同反应条件的结合效率。
在一些实施方案中，通过标记抗原和抗体的结合测定，可以更直接的测定测量结合到纳米颗粒的蛋白质的量。例如，可使用恒定浓度的HRP-标记抗原或山羊-抗-小鼠IgG温育各种浓度的抗体-缀合的纳米颗粒。在缓冲液中洗涤载体以去除未结合的标记蛋白。使用OPD基材测量载体-缔合的HRP给出了结合标记蛋白的浓度。可商业上获得HRP-标记的抗体或可使用Avrameas&Ternync,Immunochemistry8,1175-79,1971的戊二醛方法用HRP标记抗体。
以上所述的方法测量共价结合和非共价结合的蛋白两者。为了辨别两种类型结合，可使用强效离液剂诸如6M盐酸胍或8M脲洗涤纳米颗粒。通过这些条件破坏非特异性结合，并且可通过280nm处吸光度测量从纳米颗粒洗涤掉的蛋白质的量。结合的蛋白质的总量和使用离液剂洗涤掉的量之间的差值代表紧密结合并且可能共价地附接的蛋白质的量。
纳米颗粒的构型可从不规则形状到球形和/或从具有不平或不规则表面到具有平滑表面之间变化。根椐制备和/或使用ATR的具体的条件，选择纳米颗粒优选的特征。
纳米颗粒可具有均一或可变的尺寸。例如使用动态光散射可便利地测定粒度分布。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有2-500nm的平均粒径。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：2-3nm、2-4nm、2-5nm、2-6nm、2-7nm、2-8nm、2-9nm、2-10nm、2-11nm、2-12nm、2-13nm、2-14nm、2-15nm、2-16nm、2-17nm、2-18nm、2-19nm、2-20nm、2-21nm、2-22nm、2-23nm、2-24nm、2-25nm、2-26nm、2-27nm、2-28nm、2-29nm、2-30nm、3-4nm、3-5nm、3-6nm、3-7nm、3-8nm、3-9nm、3-10nm、3-11nm、3-12nm、3-13nm、3-14nm、3-15nm、3-16nm、3-17nm、3-18nm、3-19nm、3-20nm、3-21nm、3-22nm、3-23nm、3-24nm、3-25nm、3-26nm、3-27nm、3-28nm、3-29nm、3-30nm、4-5nm、4-6nm、4-7nm、4-8nm、4-9nm、4-10nm、4-11nm、4-12nm、4-13nm、4-14nm、4-15nm、4-16nm、4-17nm、4-18nm、4-19nm、4-20nm、4-21nm、4-22nm、4-23nm、4-24nm、4-25nm、4-26nm、4-27nm、4-28nm、4-29nm、4-30nm、5-6nm、5-7nm、5-8nm、5-9nm、5-10nm、5-11nm、5-12nm、5-13nm、5-14nm、5-15nm、5-16nm、5-17nm、5-18nm、5-19nm、5-20nm、5-21nm、5-22nm、5-23nm、5-24nm、5-25nm、5-26nm、5-27nm、5-28nm、5-29nm、5-30nm、6-7nm、6-8nm、6-9nm、6-10nm、6-11nm、6-12nm、6-13nm、6-14nm、6-15nm、6-16nm、6-17nm、6-18nm、6-19nm、6-20nm、6-21nm、6-22nm、6-23nm、6-24nm、6-25nm、6-26nm、6-27nm、6-28nm、6-29nm、6-30nm、7-8nm、7-9nm、7-10nm、7-11nm、7-12nm、7-13nm、7-14nm、7-15nm、7-16nm、7-17nm、7-18nm、7-19nm、7-20nm、7-21nm、7-22nm、7-23nm、7-24nm、7-25nm、7-26nm、7-27nm、7-28nm、7-29nm、7-30nm、8-9nm、8-10nm、8-11nm、8-12nm、8-13nm、8-14nm、8-15nm、8-16nm、8-17nm、8-18nm、8-19nm、8-20nm、8-21nm、8-22m、8-23nm、8-24nm、8-25nm、8-26nm、8-27nm、8-28nm、8-29nm、8-30nm、9-10nm、9-11nm、9-12nm、9-13nm、9-14nm、9-15nm、9-16nm、9-17nm、9-18nm、9-19nm、9-20nm、9-21nm、9-22nm、9-23nm、9-24nm、9-25nm、9-26nm、9-27nm、9-28nm、9-29nm、9-30nm、10-11nm、10-12nm、10-13nm、10-14nm、10-15nm、10-16nm、10-17nm、10-18nm、10-19nm、10-20nm、10-21nm、10-22nm、10-23nm、10-24nm、10-25nm、10-26nm、10-27nm、10-28nm、10-29m、10-30nm、11-12nm、11-13nm、11-14nm、11-15nm、11-16nm、11-17nm、11-18nm、11-19nm、11-20nm、11-21nm、11-22nm、11-23nm、11-24nm、11-25nm、11-26nm、11-27nm、11-28nm、11-29nm、11-30nm、12-13nm、12-14nm、12-15nm、12-16nm、12-17nm、12-18nm、12-19nm、12-20nm、12-21nm、12-22nm、12-23nm、12-24nm、12-25nm、12-26nm、12-27nm、12-28nm、12-29nm、12-30nm、13-14nm、13-15nm、13-16nm、13-17nm、13-18nm、13-19nm、13-20nm、13-21nm、13-22nm、13-23nm、13-24nm、13-25nm、13-26nm、13-27nm、13-28nm、13-29nm、13-30nm、14-15nm、14-16nm、14-17nm、14-18nm、14-19nm、14-20nm、14-21nm、14-22nm、14-23nm、14-24nm、14-25nm、14-26nm、14-27nm、14-28nm、14-29nm、14-30nm、15-16nm、15-17nm、15-18nm、15-19nm、15-20nm、15-21nm、15-22nm、15-23nm、15-24nm、15-25nm、15-26nm、15-27nm、15-28nm、15-29nm、15-30nm、16-17nm、16-18nm、16-19nm、16-20nm、16-21nm、16-22nm、16-23nm、16-24nm、16-25nm、16-26nm、16-27nm、16-28nm、16-29nm、16-30nm、17-18nm、17-19nm、17-20nm、17-21nm、17-22nm、17-23nm、17-24nm、17-25nm、17-26nm、17-27nm、17-28nm、17-29nm、17-30nm、18-19nm、18-20nm、18-21nm、18-22nm、18-23nm、18-24nm、18-25nm、18-26nm、18-27nm、18-28nm、18-29nm、18-30nm、19-20nm、19-21nm、19-22nm、19-23nm、19-24nm、19-25nm、19-26nm、19-27nm、19-28nm、19-29nm、19-30nm、20-21nm、20-22nm、20-23nm、20-24nm、20-25nm、20-26nm、20-27nm、20-28nm、20-29nm、20-30nm、21-21nm、21-22nm、21-23nm、21-24nm、21-25nm、21-26nm、21-27nm、21-28nm、21-29nm、21-30nm、22-23nm、22-24nm、22-25nm、22-26nm、22-27nm、22-28nm、22-29nm、22-30nm、23-24nm、23-25nm、23-26nm、23-27nm、23-28nm、23-29nm、23-30nm、24-25nm、24-26nm、24-27nm、24-28nm、24-29nm、24-30nm、25-26nm、25-27nm、25-28nm、25-29nm、25-30nm、26-27nm、26-28nm、26-29nm、26-30nm、27-28nm、27-29nm、27-30nm、28-29nm、28-30nm或29-30nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-500nm+/-5nm、25-500nm+/-10nm、25-500nm+/-15nm、25-500nm+/-20nm、25-500nm+/-25nm、25-500nm+/-30nm、25-500nm+/-35nm、25-500nm+/-40nm、25-500nm+/-45nm或25-500nm+/-50nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm、25-35nm、25-40nm、25-45nm、25-50nm、25-55nm、25-60nm、25-70nm、25-75nm、25-80nm、25-90nm、25-95nm、25-100nm、25-125nm、25-150nm、25-200nm、25-300nm、25-400nm、30-35nm、35-40nm、35-45nm、35-50nm、35-55nm、35-60nm、35-70nm、35-75nm、35-80nm、35-90nm、35-95nm、35-100nm、35-125nm、35-150nm、35-200nm、35-300nm、35-400、35-500nm、40-45nm、35-50nm、45-55nm、45-60nm、45-70nm、45-75nm、45-80nm、45-90nm、45-95nm、45-100nm、45-125nm、45-150nm、45-200nm、45-300nm、45-400、45-500nm、50-55nm、50-60nm、50-70nm、50-75nm、50-80nm、50-90nm、50-95nm、50-100nm、50-125nm、50-150nm、50-200nm、50-300nm、50-400、50-500nm、55-60nm、55-70nm、55-75nm、55-80nm、55-90nm、55-95nm、55-100nm、55-125nm、55-150nm、55-200nm、55-300nm、55-400、55-500nm、60-70nm、60-75nm、60-80nm、60-90nm、60-95nm、60-100nm、60-125nm、60-150nm、60-200nm、60-300nm、60-400、60-500nm、65-70nm、65-75nm、65-80nm、65-90nm、65-95nm、65-100nm、65-125nm、65-150nm、65-200nm、65-300nm、65-400、65-500nm、70-75nm、70-80nm、70-90nm、70-95nm、70-100nm、70-125nm、70-150nm、70-200nm、70-300nm、70-400、70-500nm、75-80nm、75-90nm、75-95nm、75-100nm、75-125nm、75-150nm、75-200nm、75-300nm、75-400、75-500nm、80-90nm、80-95nm、80-100nm、80-125nm、80-150nm、80-200nm、80-300nm、80-400、80-500nm、85-90nm、85-95nm、85-100nm、85-125nm、85-150nm、85-200nm、85-300nm、85-400、85-500nm、90-95nm、90-100nm、90-125nm、90-150nm、90-200nm、90-300nm、90-400、90-500nm、100-125nm、100-150nm、100-200nm、100-300nm、100-400、100-500nm、125-150nm、125-200nm、125-300nm、125-400、125-500nm、150-200nm、150-300nm、150-400、150-500nm、175-200nm、175-300nm、175-400、175-500nm、200-300nm、200-400、200-500nm、300-400、300-500nm或400-500nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm+/-5nm、25-35nm+/-5nm、25-40nm+/-5nm、25-45nm+/-5nm、25-50nm+/-5nm、25-55nm+/-5nm、25-60nm+/-5nm、25-70nm+/-5nm、25-75nm+/-5nm、25-80nm+/-5nm、25-90nm+/-5nm、25-95nm+/-5nm、25-100nm+/-5nm、25-125nm+/-5nm、25-150nm+/-5nm、25-200nm+/-5nm、25-300nm+/-5nm、25-400nm+/-5nm、30-35nm+/-5nm、35-40nm+/-5nm、35-45nm+/-5nm、35-50nm+/-5nm、35-55nm+/-5nm、35-60nm+/-5nm、35-70nm+/-5nm、35-75nm+/-5nm、35-80nm+/-5nm、35-90nm+/-5nm、35-95nm+/-5nm、35-100nm+/-5nm、35-125nm+/-5nm、35-150nm+/-5nm、35-200nm+/-5nm、35-300nm+/-5nm、35-400、35-500nm+/-5nm、40-45nm+/-5nm、35-50nm+/-5nm、45-55nm+/-5nm、45-60nm+/-5nm、45-70nm+/-5nm、45-75nm+/-5nm、45-80nm+/-5nm、45-90nm+/-5nm、45-95nm+/-5nm、45-100nm+/-5nm、45-125nm+/-5nm、45-150nm+/-5nm、45-200nm+/-5nm、45-300nm+/-5nm、45-400、45-500nm+/-5nm、50-55nm+/-5nm、50-60nm+/-5nm、50-70nm+/-5nm、50-75nm+/-5nm、50-80nm+/-5nm、50-90nm+/-5nm、50-95nm+/-5nm、50-100nm+/-5nm、50-125nm+/-5nm、50-150nm+/-5nm、50-200nm+/-5nm、50-300nm+/-5nm、50-400、50-500nm+/-5nm、55-60nm+/-5nm、55-70nm+/-5nm、55-75nm+/-5nm、55-80nm+/-5nm、55-90nm+/-5nm、55-95nm+/-5nm、55-100nm+/-5nm、55-125nm+/-5nm、55-150nm+/-5nm、55-200nm+/-5nm、55-300nm+/-5nm、55-400、55-500nm+/-5nm、60-70nm+/-5nm、60-75nm+/-5nm、60-80nm+/-5nm、60-90nm+/-5nm、60-95nm+/-5nm、60-100nm+/-5nm、60-125nm+/-5nm、60-150nm+/-5nm、60-200nm+/-5nm、60-300nm+/-5nm、60-400、60-500nm+/-5nm、65-70nm+/-5nm、65-75nm+/-5nm、65-80nm+/-5nm、65-90nm+/-5nm、65-95nm+/-5nm、65-100nm+/-5nm、65-125nm+/-5nm、65-150nm+/-5nm、65-200nm+/-5nm、65-300nm+/-5nm、65-400、65-500nm+/-5nm、70-75nm+/-5nm、70-80nm+/-5nm、70-90nm+/-5nm、70-95nm+/-5nm、70-100nm+/-5nm、70-125nm+/-5nm、70-150nm+/-5nm、70-200nm+/-5nm、70-300nm+/-5nm、70-400、70-500nm+/-5nm、75-80nm+/-5nm、75-90nm+/-5nm、75-95nm+/-5nm、75-100nm+/-5nm、75-125nm+/-5nm、75-150nm+/-5nm、75-200nm+/-5nm、75-300nm+/-5nm、75-400、75-500nm+/-5nm、80-90nm+/-5nm、80-95nm+/-5nm、80-100nm+/-5nm、80-125nm+/-5nm、80-150nm+/-5nm、80-200nm+/-5nm、80-300nm+/-5nm、80-400、80-500nm+/-5nm、85-90nm+/-5nm、85-95nm+/-5nm、85-100nm+/-5nm、85-125nm+/-5nm、85-150nm+/-5nm、85-200nm+/-5nm、85-300nm+/-5nm、85-400、85-500nm+/-5nm、90-95nm+/-5nm、90-100nm+/-5nm、90-125nm+/-5nm、90-150nm+/-5nm、90-200nm+/-5nm、90-300nm+/-5nm、90-400、90-500nm+/-5nm、100-125nm+/-5nm、100-150nm+/-5nm、100-200nm+/-5nm、100-300nm+/-5nm、100-400、100-500nm+/-5nm、125-150nm+/-5nm、125-200nm+/-5nm、125-300nm+/-5nm、125-400、125-500nm+/-5nm、150-200nm+/-5nm、150-300nm+/-5nm、150-400、150-500nm+/-5nm、175-200nm+/-5nm、175-300nm+/-5nm、175-400、175-500nm+/-5nm、200-300nm+/-5nm、200-400、200-500nm+/-5nm、300-400、300-500nm+/-5nm或400-500nm+/-5nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm+/-10nm、25-35nm+/-10nm、25-40nm+/-10nm、25-45nm+/-10nm、25-100nm+/-10nm、25-105nm+/-10nm、25-60nm+/-10nm、25-70nm+/-10nm、25-75nm+/-10nm、25-80nm+/-10nm、25-90nm+/-10nm、25-95nm+/-10nm、25-100nm+/-10nm、25-125nm+/-10nm、25-150nm+/-10nm、25-200nm+/-10nm、25-300nm+/-10nm、25-400nm+/-10nm、30-35nm+/-10nm、35-40nm+/-10nm、35-45nm+/-10nm、35-100nm+/-10nm、35-105nm+/-10nm、35-60nm+/-10nm、35-70nm+/-10nm、35-75nm+/-10nm、35-80nm+/-10nm、35-90nm+/-10nm、35-95nm+/-10nm、35-100nm+/-10nm、35-125nm+/-10nm、35-150nm+/-10nm、35-200nm+/-10nm、35-300nm+/-10nm、35-400、35-1000nm+/-10nm、40-45nm+/-10nm、35-100nm+/-10nm、45-105nm+/-10nm、45-60nm+/-10nm、45-70nm+/-10nm、45-75nm+/-10nm、45-80nm+/-10nm、45-90nm+/-10nm、45-95nm+/-10nm、45-100nm+/-10nm、45-125nm+/-10nm、45-150nm+/-10nm、45-200nm+/-10nm、45-300nm+/-10nm、45-400、45-1000nm+/-10nm、50-105nm+/-10nm、50-60nm+/-10nm、50-70nm+/-10nm、50-75nm+/-10nm、50-80nm+/-10nm、50-90nm+/-10nm、50-95nm+/-10nm、50-100nm+/-10nm、50-125nm+/-10nm、50-150nm+/-10nm、50-200nm+/-10nm、50-300nm+/-10nm、50-400、50-1000nm+/-10nm、55-60nm+/-10nm、55-70nm+/-10nm、55-75nm+/-10nm、55-80nm+/-10nm、55-90nm+/-10nm、55-95nm+/-10nm、55-100nm+/-10nm、55-125nm+/-10nm、55-150nm+/-10nm、55-200nm+/-10nm、55-300nm+/-10nm、55-400、55-1000nm+/-10nm、60-70nm+/-10nm、60-75nm+/-10nm、60-80nm+/-10nm、60-90nm+/-10nm、60-95nm+/-10nm、60-100nm+/-10nm、60-125nm+/-10nm、60-150nm+/-10nm、60-200nm+/-10nm、60-300nm+/-10nm、60-400、60-1000nm+/-10nm、65-70nm+/-10nm、65-75nm+/-10nm、65-80nm+/-10nm、65-90nm+/-10nm、65-95nm+/-10nm、65-100nm+/-10nm、65-125nm+/-10nm、65-150nm+/-10nm、65-200nm+/-10nm、65-300nm+/-10nm、65-400、65-1000nm+/-10nm、70-75nm+/-10nm、70-80nm+/-10nm、70-90nm+/-10nm、70-95nm+/-10nm、70-100nm+/-10nm、70-125nm+/-10nm、70-150nm+/-10nm、70-200nm+/-10nm、70-300nm+/-10nm、70-400、70-1000nm+/-10nm、75-80nm+/-10nm、75-90nm+/-10nm、75-95nm+/-10nm、75-100nm+/-10nm、75-125nm+/-10nm、75-150nm+/-10nm、75-200nm+/-10nm、75-300nm+/-10nm、75-400、75-1000nm+/-10nm、80-90nm+/-10nm、80-95nm+/-10nm、80-100nm+/-10nm、80-125nm+/-10nm、80-150nm+/-10nm、80-200nm+/-10nm、80-300nm+/-10nm、80-400、80-1000nm+/-10nm、85-90nm+/-10nm、85-95nm+/-10nm、85-100nm+/-10nm、85-125nm+/-10nm、85-150nm+/-10nm、85-200nm+/-10nm、85-300nm+/-10nm、85-400、85-1000nm+/-10nm、90-95nm+/-10nm、90-100nm+/-10nm、90-125nm+/-10nm、90-150nm+/-10nm、90-200nm+/-10nm、90-300nm+/-10nm、90-400、90-1000nm+/-10nm、100-125nm+/-10nm、100-150nm+/-10nm、100-200nm+/-10nm、100-300nm+/-10nm、100-400、100-1000nm+/-10nm、125-150nm+/-10nm、125-200nm+/-10nm、125-300nm+/-10nm、125-400、125-1000nm+/-10nm、150-200nm+/-10nm、150-300nm+/-10nm、150-400、150-1000nm+/-10nm、175-200nm+/-10nm、175-300nm+/-10nm、175-400、175-1000nm+/-10nm、200-300nm+/-10nm、200-400、200-1000nm+/-10nm、300-400、300-1000nm+/-10nm或400-1000nm+/-10nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm+/-15nm,25-35nm+/-15nm,25-40nm+/-15nm,25-45nm+/-15nm、25-150nm+/-15nm、25-155nm+/-15nm、25-60nm+/-15nm、25-70nm+/-15nm、25-75nm+/-15nm、25-80nm+/-15nm、25-90nm+/-15nm、25-95nm+/-15nm、25-100nm+/-15nm、25-125nm+/-15nm、25-150nm+/-15nm、25-200nm+/-15nm、25-300nm+/-15nm、25-400nm+/-15nm、30-35nm+/-15nm、35-40nm+/-15nm、35-45nm+/-15nm、35-150nm+/-15nm、35-155nm+/-15nm、35-60nm+/-15nm、35-70nm+/-15nm、35-75nm+/-15nm、35-80nm+/-15nm、35-90nm+/-15nm、35-95nm+/-15nm、35-100nm+/-15nm、35-125nm+/-15nm、35-150nm+/-15nm、35-200nm+/-15nm、35-300nm+/-15nm、35-400、35-1500nm+/-15nm、40-45nm+/-15nm、35-150nm+/-15nm、45-155nm+/-15nm、45-60nm+/-15nm、45-70nm+/-15nm、45-75nm+/-15nm、45-80nm+/-15nm、45-90nm+/-15nm、45-95nm+/-15nm、45-100nm+/-15nm、45-125nm+/-15nm、45-150nm+/-15nm、45-200nm+/-15nm、45-300nm+/-15nm、45-400、45-1500nm+/-15nm、50-155nm+/-15nm、50-60nm+/-15nm、50-70nm+/-15nm、50-75nm+/-15nm、50-80nm+/-15nm、50-90nm+/-15nm、50-95nm+/-15nm、50-100nm+/-15nm、50-125nm+/-15nm、50-150nm+/-15nm、50-200nm+/-15nm、50-300nm+/-15nm、50-400、50-1500nm+/-15nm、55-60nm+/-15nm、55-70nm+/-15nm、55-75nm+/-15nm、55-80nm+/-15nm、55-90nm+/-15nm、55-95nm+/-15nm、55-100nm+/-15nm、55-125nm+/-15nm、55-150nm+/-15nm、55-200nm+/-15nm、55-300nm+/-15nm、55-400、55-1500nm+/-15nm、60-70nm+/-15nm、60-75nm+/-15nm、60-80nm+/-15nm、60-90nm+/-15nm、60-95nm+/-15nm、60-100nm+/-15nm、60-125nm+/-15nm、60-150nm+/-15nm、60-200nm+/-15nm、60-300nm+/-15nm、60-400、60-1500nm+/-15nm、65-70nm+/-15nm、65-75nm+/-15nm、65-80nm+/-15nm、65-90nm+/-15nm、65-95nm+/-15nm、65-100nm+/-15nm、65-125nm+/-15nm、65-150nm+/-15nm、65-200nm+/-15nm、65-300nm+/-15nm、65-400、65-1500nm+/-15nm、70-75nm+/-15nm、70-80nm+/-15nm、70-90nm+/-15nm、70-95nm+/-15nm、70-100nm+/-15nm、70-125nm+/-15nm、70-150nm+/-15nm、70-200nm+/-15nm、70-300nm+/-15nm、70-400、70-1500nm+/-15nm、75-80nm+/-15nm、75-90nm+/-15nm、75-95nm+/-15nm、75-100nm+/-15nm、75-125nm+/-15nm、75-150nm+/-15nm、75-200nm+/-15nm、75-300nm+/-15nm、75-400、75-1500nm+/-15nm、80-90nm+/-15nm、80-95nm+/-15nm、80-100nm+/-15nm、80-125nm+/-15nm、80-150nm+/-15nm、80-200nm+/-15nm、80-300nm+/-15nm、80-400、80-1500nm+/-15nm、85-90nm+/-15nm、85-95nm+/-15nm、85-100nm+/-15nm、85-125nm+/-15nm、85-150nm+/-15nm、85-200nm+/-15nm、85-300nm+/-15nm、85-400、85-1500nm+/-15nm、90-95nm+/-15nm、90-100nm+/-15nm、90-125nm+/-15nm、90-150nm+/-15nm、90-200nm+/-15nm、90-300nm+/-15nm、90-400、90-1500nm+/-15nm、100-125nm+/-15nm、100-150nm+/-15nm、100-200nm+/-15nm、100-300nm+/-15nm、100-400、100-1500nm+/-15nm、125-150nm+/-15nm、125-200nm+/-15nm、125-300nm+/-15nm、125-400、125-1500nm+/-15nm、150-200nm+/-15nm、150-300nm+/-15nm、150-400、150-1500nm+/-15nm、175-200nm+/-15nm、175-300nm+/-15nm、175-400、175-1500nm+/-15nm、200-300nm+/-15nm、200-400、200-1500nm+/-15nm、300-400、300-1500nm+/-15nm或400-1500nm+/-15nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm+/-20nm、25-35nm+/-20nm、25-40nm+/-20nm、25-45nm+/-20nm、25-200nm+/-20nm、25-205nm+/-20nm、25-60nm+/-20nm、25-70nm+/-20nm、25-75nm+/-20nm、25-80nm+/-20nm、25-90nm+/-20nm、25-95nm+/-20nm、25-100nm+/-20nm、25-125nm+/-20nm、25-150nm+/-20nm、25-200nm+/-20nm、25-300nm+/-20nm、25-400nm+/-20nm、30-35nm+/-20nm、35-40nm+/-20nm、35-45nm+/-20nm、35-200nm+/-20nm、35-205nm+/-20nm、35-60nm+/-20nm、35-70nm+/-20nm、35-75nm+/-20nm、35-80nm+/-20nm、35-90nm+/-20nm、35-95nm+/-20nm、35-100nm+/-20nm、35-125nm+/-20nm、35-150nm+/-20nm、35-200nm+/-20nm、35-300nm+/-20nm、35-400、35-2000nm+/-20nm、40-45nm+/-20nm、35-200nm+/-20nm、45-205nm+/-20nm、45-60nm+/-20nm、45-70nm+/-20nm、45-75nm+/-20nm、45-80nm+/-20nm、45-90nm+/-20nm、45-95nm+/-20nm、45-100nm+/-20nm、45-125nm+/-20nm、45-150nm+/-20nm、45-200nm+/-20nm、45-300nm+/-20nm、45-400、45-2000nm+/-20nm、50-205nm+/-20nm、50-60nm+/-20nm、50-70nm+/-20nm、50-75nm+/-20nm、50-80nm+/-20nm、50-90nm+/-20nm、50-95nm+/-20nm、50-100nm+/-20nm、50-125nm+/-20nm、50-150nm+/-20nm、50-200nm+/-20nm、50-300nm+/-20nm、50-400、50-2000nm+/-20nm、55-60nm+/-20nm、55-70nm+/-20nm、55-75nm+/-20nm、55-80nm+/-20nm、55-90nm+/-20nm、55-95nm+/-20nm、55-100nm+/-20nm、55-125nm+/-20nm、55-150nm+/-20nm、55-200nm+/-20nm、55-300nm+/-20nm、55-400、55-2000nm+/-20nm、60-70nm+/-20nm、60-75nm+/-20nm、60-80nm+/-20nm、60-90nm+/-20nm、60-95nm+/-20nm、60-100nm+/-20nm、60-125nm+/-20nm、60-150nm+/-20nm、60-200nm+/-20nm、60-300nm+/-20nm、60-400、60-2000nm+/-20nm、65-70nm+/-20nm、65-75nm+/-20nm、65-80nm+/-20nm、65-90nm+/-20nm、65-95nm+/-20nm、65-100nm+/-20nm、65-125nm+/-20nm、65-150nm+/-20nm、65-200nm+/-20nm、65-300nm+/-20nm、65-400、65-2000nm+/-20nm、70-75nm+/-20nm、70-80nm+/-20nm、70-90nm+/-20nm、70-95nm+/-20nm、70-100nm+/-20nm、70-125nm+/-20nm、70-150nm+/-20nm、70-200nm+/-20nm、70-300nm+/-20nm、70-400、70-2000nm+/-20nm、75-80nm+/-20nm、75-90nm+/-20nm、75-95nm+/-20nm、75-100nm+/-20nm、75-125nm+/-20nm、75-150nm+/-20nm、75-200nm+/-20nm、75-300nm+/-20nm、75-400、75-2000nm+/-20nm、80-90nm+/-20nm、80-95nm+/-20nm、80-100nm+/-20nm、80-125nm+/-20nm、80-150nm+/-20nm、80-200nm+/-20nm、80-300nm+/-20nm、80-400、80-2000nm+/-20nm、85-90nm+/-20nm、85-95nm+/-20nm、85-100nm+/-20nm、85-125nm+/-20nm、85-150nm+/-20nm、85-200nm+/-20nm、85-300nm+/-20nm、85-400、85-2000nm+/-20nm、90-95nm+/-20nm、90-100nm+/-20nm、90-125nm+/-20nm、90-150nm+/-20nm、90-200nm+/-20nm、90-300nm+/-20nm、90-400、90-2000nm+/-20nm、100-125nm+/-20nm、100-150nm+/-20nm、100-200nm+/-20nm、100-300nm+/-20nm、100-400、100-2000nm+/-20nm、125-150nm+/-20nm、125-200nm+/-20nm、125-300nm+/-20nm、125-400、125-2000nm+/-20nm、150-200nm+/-20nm、150-300nm+/-20nm、150-400、150-2000nm+/-20nm、175-200nm+/-20nm、175-300nm+/-20nm、175-400、175-2000nm+/-20nm、200-300nm+/-20nm、200-400、200-2000nm+/-20nm、300-400、300-2000nm+/-20nm或400-2000nm+/-20nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25-30nm+/-25nm、25-35nm+/-25nm、25-40nm+/-25nm、25-45nm+/-25nm、25-250nm+/-25nm、25-255nm+/-25nm、25-60nm+/-25nm、25-70nm+/-25nm、25-75nm+/-25nm、25-80nm+/-25nm、25-90nm+/-25nm、25-95nm+/-25nm、25-100nm+/-25nm、25-125nm+/-25nm、25-150nm+/-25nm、25-200nm+/-25nm、25-300nm+/-25nm、25-400nm+/-25nm、30-35nm+/-25nm、35-40nm+/-25nm、35-45nm+/-25nm、35-250nm+/-25nm、35-255nm+/-25nm、35-60nm+/-25nm、35-70nm+/-25nm、35-75nm+/-25nm、35-80nm+/-25nm、35-90nm+/-25nm、35-95nm+/-25nm、35-100nm+/-25nm、35-125nm+/-25nm、35-150nm+/-25nm、35-200nm+/-25nm、35-300nm+/-25nm、35-400、35-2500nm+/-25nm、40-45nm+/-25nm、35-250nm+/-25nm、45-255nm+/-25nm、45-60nm+/-25nm、45-70nm+/-25nm、45-75nm+/-25nm、45-80nm+/-25nm、45-90nm+/-25nm、45-95nm+/-25nm、45-100nm+/-25nm、45-125nm+/-25nm、45-150nm+/-25nm、45-200nm+/-25nm、45-300nm+/-25nm、45-400、45-2500nm+/-25nm、50-255nm+/-25nm、50-60nm+/-25nm、50-70nm+/-25nm、50-75nm+/-25nm、50-80nm+/-25nm、50-90nm+/-25nm、50-95nm+/-25nm、50-100nm+/-25nm、50-125nm+/-25nm、50-150nm+/-25nm、50-200nm+/-25nm、50-300nm+/-25nm、50-400、50-2500nm+/-25nm、55-60nm+/-25nm、55-70nm+/-25nm、55-75nm+/-25nm、55-80nm+/-25nm、55-90nm+/-25nm、55-95nm+/-25nm、55-100nm+/-25nm、55-125nm+/-25nm、55-150nm+/-25nm、55-200nm+/-25nm、55-300nm+/-25nm、55-400、55-2500nm+/-25nm、60-70nm+/-25nm、60-75nm+/-25nm、60-80nm+/-25nm、60-90nm+/-25nm、60-95nm+/-25nm、60-100nm+/-25nm、60-125nm+/-25nm、60-150nm+/-25nm、60-200nm+/-25nm、60-300nm+/-25nm、60-400、60-2500nm+/-25nm、65-70nm+/-25nm、65-75nm+/-25nm、65-80nm+/-25nm、65-90nm+/-25nm、65-95nm+/-25nm、65-100nm+/-25nm、65-125nm+/-25nm、65-150nm+/-25nm、65-200nm+/-25nm、65-300nm+/-25nm、65-400、65-2500nm+/-25nm、70-75nm+/-25nm、70-80nm+/-25nm、70-90nm+/-25nm、70-95nm+/-25nm、70-100nm+/-25nm、70-125nm+/-25nm、70-150nm+/-25nm、70-200nm+/-25nm、70-300nm+/-25nm、70-400、70-2500nm+/-25nm、75-80nm+/-25nm、75-90nm+/-25nm、75-95nm+/-25nm、75-100nm+/-25nm、75-125nm+/-25nm、75-150nm+/-25nm、75-200nm+/-25nm、75-300nm+/-25nm、75-400、75-2500nm+/-25nm、80-90nm+/-25nm、80-95nm+/-25nm、80-100nm+/-25nm、80-125nm+/-25nm、80-150nm+/-25nm、80-200nm+/-25nm、80-300nm+/-25nm、80-400、80-2500nm+/-25nm、85-90nm+/-25nm、85-95nm+/-25nm、85-100nm+/-25nm、85-125nm+/-25nm、85-150nm+/-25nm、85-200nm+/-25nm、85-300nm+/-25nm、85-400、85-2500nm+/-25nm、90-95nm+/-25nm、90-100nm+/-25nm、90-125nm+/-25nm、90-150nm+/-25nm、90-200nm+/-25nm、90-300nm+/-25nm、90-400、90-2500nm+/-25nm、100-125nm+/-25nm、100-150nm+/-25nm、100-200nm+/-25nm、100-300nm+/-25nm、100-400、100-2500nm+/-25nm、125-150nm+/-25nm、125-200nm+/-25nm、125-300nm+/-25nm、125-400、125-2500nm+/-25nm、150-200nm+/-25nm、150-300nm+/-25nm、150-400、150-2500nm+/-25nm、175-200nm+/-25nm、175-300nm+/-25nm、175-400、175-2500nm+/-25nm、200-300nm+/-25nm、200-400、200-2500nm+/-25nm、300-400、300-2500nm+/-25nm或400-2500nm+/-25nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、224、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：50+/-5nm、75+/-5nm、100+/-5nm、125+/-5nm、150+/-5nm、175+/-5nm、200+/-5nm、225+/-5nm、250+/-5nm、275+/-5nm、300+/-5nm、325+/-5nm、350+/-5nm、375+/-5nm、400+/-5nm、425+/-5nm、450+/-5nm、475+/-5nm或500+/-5nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：50+/-10nm、75+/-10nm、100+/-10nm、125+/-10nm、150+/-10nm、175+/-10nm、200+/-10nm、225+/-10nm、250+/-10nm、275+/-10nm、300+/-10nm、325+/-10nm、350+/-10nm、375+/-10nm、400+/-10nm、425+/-10nm、450+/-10nm、475+/-10nm或500+/-10nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：50+/-15nm、75+/-15nm、100+/-15nm、125+/-15nm、150+/-15nm、175+/-15nm、200+/-15nm、225+/-15nm、250+/-15nm、275+/-15nm、300+/-15nm、325+/-15nm、350+/-15nm、375+/-15nm、400+/-15nm、425+/-15nm、450+/-15nm、475+/-15nm或500+/-15nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：50+/-20nm、75+/-20nm、100+/-20nm、125+/-20nm、150+/-20nm、175+/-20nm、200+/-20nm、225+/-20nm、250+/-20nm、275+/-20nm、300+/-20nm、325+/-20nm、350+/-20nm、375+/-20nm、400+/-20nm、425+/-20nm、450+/-20nm、475+/-20nm或500+/-20nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：50+/-25nm、75+/-25nm、100+/-25nm、125+/-25nm、150+/-25nm、175+/-25nm、200+/-25nm、225+/-25nm、250+/-25nm、275+/-25nm、300+/-25nm、325+/-25nm、350+/-25nm、375+/-25nm、400+/-25nm、425+/-25nm、450+/-25nm、475+/-25nm或500+/-25nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有以下平均粒径：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125nm。
量子点
在一些实施方案中，纳米颗粒是量子点。量子点是离散的纳米颗粒，其具有类似于块状半导体的特性，使得当暴露于电磁能量时，它们继而发出能量的。量子点可被工程化以对红外区域中的能量、可见光谱和甚至尺寸和成分变化的紫外线范围敏感。另外的，它们可被设计为光致发光或光伏的，从而分别产生光照或能量。
胶态半导体量子点通常由溶解于溶液中的前体化合物合成，并且常常基于包含前体、有机表面活性剂和溶剂的三组分系统。在通常的方法中，在将反应培养基加热到期望的温度时，前体化学地转化为单体。一旦单体达到足够高的超-饱和度水平，通过成核作用量子点开始生长。生长期间的温度是确定量子点生长的最佳条件的因素之一。一般来讲，温度必须足够高以至于允许合成过程中原子的再构造和退火。然而，温度不应过高以至于抑制晶体生长。通常也在量子点的生长过程中受到控制的另外的因素是单体浓度。量子点的生长过程可以两种不同方式发生，其为“聚焦(focusing)”及“散焦(defocusing)”。在高单体浓度下，临界尺寸(量子点既不生长也不缩减的尺寸)非常小，引起几乎所有颗粒的生长。在此方式中，生长的相对速率有利于较小颗粒的生长，这提供了“聚焦”并且相对于粒度，提供了高度的单分散性。认为尺寸聚焦在保持单体浓度使得存在的平均量子点尺寸始终略大于临界尺寸时最优。当单体浓度在生长期间降低时，临界尺寸变得大于所存在的平均尺寸，且分布因被称为奥氏熟化(Ostwaldripening)的过程而“散焦”。
存在产生许多不同半导体二元和三元量子点的胶体法。通过胶体法产生的量子点的示例包括但不限于硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、砷化铟(InAs)和磷化铟(InP)硫化镉-碲(CdTeS)。包含量子点的原子的数目可在100到100,000的范围内，通常具有2至20nm范围内的直径(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、2-3nm、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15、2-16、2-17、2-18、2-19、2-20、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-14、3-15、3-16、3-17、3-18、3-19、3-20、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、6-7、6-8、6-9、6-10、6-11、6-12、6-13、6-14、6-15、6-16、6-17、6-18、6-19、6-20、7-8、7-9、7-10、7-11、7-12、7-13、7-14、7-15、7-16、7-17、7-18、7-19、7-20、8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、16-17、16-18、16-19、16-20、17-18、17-19、17-20、18-19、18-20、19-20nm)。
在一些实施方案中，量子点材料包括但不限于碳、胶态的金、锗、砷化铟、锑化铟、砷化镓、氮化镓、碲化镉/硒、铅、氧化铅、硫化铅、硒化铅、磷化铟镓、硅、胶态的银、碲镉汞、铁、氧化铁、钴、石墨烯、镧、铈、碳酸锶、锰、锰氧化物、氧化镍、铂、锂、钛酸锂、钽、铜、钯、钼、碳化硼、碳化硅、碳化钛、氧化钨、铝、铌、铥、铝氮化物、锡、铝氧化物、氧化锡、锑、镝、镨、氧化锑、铒、铼、钡、钌、铍、钐、氧化铋、硼、钆、氮化硼、氧化钒、锶、镱、锆、金刚石(C)、硅(Si)、锗(Ge)、碳化硅(SiC)、硅-锗(SiGe)、锑化铝(AlSb)、砷化铝(AlAs)、氮化铝(AlN)、磷化铝(AlP)、氮化硼(BN)、磷化硼(BP)、砷化硼(BAs)、锑化镓(GaSb)、砷化镓(GaAs)、氮化镓(GaN)、磷化镓(GaP)、锑化铟(InSb)、砷化铟(InAs)、氮化铟(InN)、磷化铟(InP)、砷化镓铝(AlGaAs、AlxGa1-xAs)、砷化镓铟(InGaAs，InxGa1-xAs)、磷化镓铟(InGaP)、砷化铟铝(AlInAs)、锑化铟铝(AlInSb)、氮化砷化镓(GaAsN)、磷化砷化镓(GaAsP)、氮化镓铝(AlGaN)、磷化镓铝(AlGaP)、氮化镓铟(InGaN)、锑化砷化铟(InAsSb)、锑化镓铟(InGaSb)、磷化铟铝镓(AlGaInP，也是InAlGaP、InGaAlP、AlInGaP)、磷化砷化镓铝(AlGaAsP)、磷化砷化镓铟(InGaAsP)、磷化砷化铟铝(AlInAsP)、氮化砷化镓铝(AlGaAsN)、氮化砷化镓铟(InGaAsN)、氮化砷化铝铟(InAlAsN)、氮化锑化砷化镓(GaAsSbN)、氮化砷化锑化铟镓(GaInNAsSb)、磷化锑化砷化铟镓(GaInAsSbP)、硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、氧化锌(ZnO)、硒化锌(ZnSe)、硫化锌(ZnS)、碲化锌(ZnTe)、碲化锌镉(CdZnTe，“CZT”)、碲化镉汞(HgCdTe)、碲化锌汞(HgZnTe)、硒化锌汞(HgZnSe)、氯化亚铜(CuCl)、硒化铅(PbSe)、硫化铅(PbS)、碲化铅(PbTe)、硫化锡(SnS)、碲化锡(SnTe)、碲化锡铅(PbSnTe)、碲化锡铊(Tl2SnTe5)、碲化锗铊(Tl2GeTe5)、碲化铋(Bi2Te3)、磷化镉(Cd3P2)、砷化镉(Cd3As2)、锑化镉(Cd3Sb2)、磷化锌(Zn3P2)、砷化锌(Zn3As2)、锑化锌(Zn3Sb2)、碘化铅(II)(PbI2)、二硫化钼(MoS2)、硒化镓(GaSe)、硫化锡(SnS)、硫化铋(Bi2S3)、铜铟镓硒化(CIGS)、硅化铂(PtSi)、碘化铋(III)(BiI3)、汞化碘(II)(HgI2)、溴化铊(I)(TlBr)、二氧化钛：锐钛矿(TiO2)、氧化铜(I)(Cu2O)、氧化铜(II)(CuO)、二氧化铀(UO2)、三氧化铀(UO3)等。.
在一些实施方案中，用于本发明的量子点的合适的材料包括包含并五苯、蒽和红荧烯的有机半导体。在一些实施方案中，用于本发明的量子点的合适的材料包括磁性半导体，诸如锰-掺杂的砷化铟和砷化镓、锰-掺杂的锑化铟、锰-和铁-掺杂的氧化铟、锰掺杂的氧化锌和铬掺杂的氮化铝、铁掺杂的二氧化锡、n型钴-掺杂的氧化锌、钴-掺杂的二氧化钛(金红石和锐钛矿两者)、铬-掺杂的金红石、铁-掺杂的金红石和铁-掺杂的锐钛矿、镍-掺杂的锐钛矿和锰-掺杂的二氧化锡。
可使用多种技术形成量子点。例如，通过产生第一带隙的第一材料被第二带隙的的第二材料围绕的区域产生量子点，其中第二带隙比第一带隙大。由此类方法产生的示例性量子点包括但不限于被硒化锌(ZnS)壳围绕的硒化镉(CdSe)芯。
另选地，在某些条件下，在分子束外延(MBE)和金属有机物蒸汽相外延(MOVPE)期间，当材料在与其晶格不匹配的基底中生长时，自组装量子点自发地成核。生长层和基底之间的产生的应变在二维“润湿层”的顶部产生了附着应变岛。随后可以由壳围绕所述岛以形成量子点。
还可从存在于远距离地掺杂量子阱或半导体异质结构中的二维的电子或空穴气体产生单个量子点。在这种情况下，表面涂覆有薄层的光致抗蚀剂。然后通过电子束光刻将横向图案限定在光刻胶中。蚀刻或通过允许在电子气体和电极之间应用外部电压的沉积金属电极(剥离工艺)将图案转成电子或空穴气体。
由于阱厚度的单层波动，量子点还可在量子阱结构中形成。另选地，可通过超声气溶胶热解产生量子点(UAP)。
在一些实施方案中，量子点包括由以下形成的内半导体芯：例如，铟/镓/磷化物、硅、砷化镓、碲化镉、硒化铜铟镓、氮化镓铟、碳、胶态的金、胶态的银，或者有机材料诸如聚合物-富勒烯异质结(例如，P3HT+C60)、有机纳米晶体太阳能电池(例如，硒化镉或碲化镉)、染料敏化的电池(例如，染料和氧化钛或氧化锘)、或串联电池(例如，铜-酞菁染料+C60)；例如由硒化锌或其他合适的材料形成的壳；由例如PEG脂质或其他合适的材料形成的涂层；和双官能材料，由例如生物素、链霉亲和素、粘附蛋白、维生素、有机的无机的化合物、碳水化合物、核酸配体、氨基酸、脂质、透明质酸或其他合适的蛋白质形成。
抗原呈递复合物
抗原呈递复合物包含抗原结合槽并且可结合抗原以呈递到T细胞或T细胞前体。抗原呈递复合物可为例如，MHCI类或II类分子、包含MHCI类或II类分子的官能抗原结合槽的融合蛋白、MHCI类或II类“分子复合物”(如下所述)或非典型MHC样分子诸如CD1家族的成员(例如CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e)。
在一些实施方案中，抗原呈递复合物是MHCI类和/或MHCII类分子复合物。MHCI类和II类分子复合物具有多个可用的特征结构。例如，基于免疫球蛋白主链提供的稳定性和分泌效率，它们极其稳定并且易于产生。另外，基于由Fc部分所提供生物功能，通过改变免疫球蛋白的Fc部分，可向分子提供不同的生物功能。用一种类型的免疫球蛋白基因的Fc部分取代另一种在本领域的技术范围内。
“MHCI类分子复合物”描述于美国专利6,268,411中。以构象上完整的形式，在免疫球蛋白重链的末端形成MHCI类分子复合物(参见美国专利6,268,411的图1A以用于示意)。抗原肽所结合到的MHCI类分子复合物可稳定地结合到抗原特异性淋巴细胞受体(例如T细胞受体)。
MHCI类分子复合物包含至少两种融合蛋白。第一融合蛋白包含第一MHCI类α链和第一免疫球蛋白重链，并且第二融合蛋白包含第二MHCI类α链和第二免疫球蛋白重链。第一和第二免疫球蛋白重链缔合形成MHCI类分子复合物，其包含两个MHCI类肽结合槽。免疫球蛋白重链可以是IgM、IgD、IgG1、IgG3、IgG2β、IgG2α、IgE或IgA的重链。优选地，使用IgG重链形成MHCI类分子复合物。如果需要多价MHCI类分子复合物，可使用IgM或IgA重链分别提供五价或四价分子。使用多个免疫球蛋白重链，还可构造具有其他化合价的MHCI类分子复合物。MHCI类分子复合物的构造详细描述于美国专利6,268,411中。
“MHCII类分子复合物”在美国专利6,458,354、美国专利6,015,884、美国专利6,140,113和美国专利6,448,071中有所描述。MHCII类分子复合物包含至少四种融合蛋白。两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)MHCII类β链的细胞外结构域。两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白κ或λ轻链和(ii)MHCII类α链的细胞外结构域。两种第一和两种第二融合蛋白缔合形成MHCII类分子复合物。每种第一融合蛋白的MHCII类β链的细胞外结构域和每种第二融合蛋白的MHCII类α链的细胞外结构域形成MHCII类肽结合槽。
免疫球蛋白重链可以是IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2β、IgG2α、IgE或IgA的重链。优选地，使用IgG1重链形成包含两个抗原结合槽的的二价分子复合物。任选地，可包括重链的可变区。可使用IgM或IgA重链分别提供五价或四价分子复合物。使用多个免疫球蛋白链还可构造具有其他化合价的分子复合物。
MHCII类分子复合物的融合蛋白可包含肽连接子，所述肽连接子插入在免疫球蛋白链和MHCII类多肽的细胞外结构域之间。根据需要调节抗原结合和受体交联的程度的灵活性，连接子序列的长度可变化。可设计构建体使得MHCII类多肽的细胞外结构域直接且共价地附接到免疫球蛋白分子而无需另外的连接子区域。
如果包括连接子区域，则此区域优选地包含至少3个且不多于30个氨基酸。更优选地，连接子为约5并且不多于20个氨基酸；最优选地，连接子少于10个氨基酸。一般来讲，连接子由短甘氨酸/丝氨酸间隔子构成，但可使用任何氨基酸。将免疫球蛋白重链连接到MHCII类β链的细胞外结构域的优选连接子是GLY-GLY-GLY-THR-SER-GLY(SEQIDNO:1)。将免疫球蛋白轻链连接到MHCII类α链的细胞外结构域的优选连接子是GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER(SEQIDNO:2)。
T细胞影响分子
“T细胞影响分子”是对前体T细胞或抗原特异性T细胞有生物效应的分子。此类生物效应包括例如，前体T细胞到CTL、辅助T细胞(例如Th1、Th2)或调节T细胞的分化；T细胞的增殖；和T细胞细胞凋亡的诱导。因此，T细胞影响分子包括T细胞共刺激分子、粘附分子、T细胞生长因子、调节T细胞诱导分子和细胞凋亡诱导分子。在一些实施方案中，纳米-aAPC包含至少一种此类分子；任选地，纳米-aAPC以任何组合包含至少两种、三种或四种此类分子。
T细胞共刺激分子有助于激活抗原特异性T细胞。此类分子包括但不限于特异性结合到CD28(包括抗体)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134(OX-40L)、B7h(B7RP-1)、CD40、LIGHT的分子、特异性结合到HVEM的抗体、特异性结合到CD40L的抗体、特异性结合到OX40的抗体和特异性结合到4-1BB的抗体。
可使用可用于纳米-aAPC的粘附分子介导纳米-aAPC到T细胞或到T细胞前体的粘附。可用的粘附分子包括例如ICAM-1和LFA-3。
T细胞生长因子影响T细胞的增殖和/或分化。T细胞生长因子的示例包括细胞因子(例如白介素、干扰素)和超抗原。如果需要，细胞因子可存在于包含融合蛋白的分子复合物中。在一个实施方案中，细胞因子分子复合物可包含至少两种融合蛋白：包含第一细胞因子和免疫球蛋白重链的第一融合蛋白和包含第二细胞因子第二免疫球蛋白重链的第二融合蛋白。第一和第二免疫球蛋白重链缔合形成细胞因子分子复合物。在另一个实施方案中，细胞因子分子复合物包含至少四种融合蛋白：两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)第一细胞因子，以及两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)第二细胞因子。两种第一和两种第二融合蛋白缔合形成细胞因子分子复合物。各种类型的细胞因子分子复合物中的第一和第二细胞因子可相同或不同。具体地讲，可用的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和γ干扰素。
超抗原是有力的T细胞丝裂原。超抗原通过首先结合到II类主要组织相容性(MHC)分子并且然后作为二元复合物以Vβ特异性方式结合到T细胞抗原受体(TCR)来刺激T细胞有丝分裂发生。超抗原包括但不限于细菌肠毒素，诸如葡萄球菌肠毒素(例如SEA和其活性部分，公开于美国专利5,859,207；SEB、SEC、SED和SEE逆转录病毒超抗原(公开于美国专利5,519,114)；化脓性链球菌外毒素(SPE)、金黄色葡萄球菌中毒性休克综合症毒素(TSST-1)、促有丝分裂链球菌外毒素(SME)和链球菌超抗原(SSA)(公开于US2003/0039655)；和公开于US2003/0036644和US2003/0009015中的超抗原。
调节T细胞诱导分子是诱导调节T细胞分化和/或保持的分子。此类分子包括但不限于TGFβ、IL-10、干扰素-α和IL-15。参见例如US2003/0049696、US2002/0090724、US2002/0090357、US2002/0034500和US2003/0064067。
细胞凋亡-诱导分子引起细胞死亡。细胞凋亡诱导分子包括毒素(例如蓖麻A链、突变型假单胞菌属外毒素、白喉类毒素、链黑菌素、博安霉素(boamycin)、皂草素、白树毒素，以及美洲商陆抗病毒蛋白)、TNFα和Fas配体。
抗原
多种抗原可结合到抗原呈递复合物。抗原的性质取决于所使用的抗原呈递复合物的类型。例如，肽抗原可结合到MHCI类和II类肽结合槽。可使用非典型MHC样分子呈递非肽抗原，诸如磷脂、复合碳水化合物等(例如细菌膜组分，诸如分枝菌酸和脂阿拉伯甘露聚糖)。如本文所用“抗原”还包括“抗原肽”。
能够诱导免疫应答的任何肽可结合到抗原呈递复合物。抗原肽包括肿瘤-相关的抗原、自身抗原、同种异型抗原和传染剂的抗原。
“肿瘤-相关的抗原”包括通过肿瘤抗原衍生的肿瘤排他性地表达的独特的肿瘤抗原、在许多肿瘤但不在正常成人组织中表达的共享肿瘤抗原(癌胚抗原)和也由肿瘤所发生的正常组织表达的组织特异性抗原。肿瘤-相关的抗原可为例如，雏形抗原、具有异常翻译后修饰的抗原、分化抗原、突变的癌基因或肿瘤抑制子、融合蛋白或肿瘤病毒(oncoviral)蛋白的产物。
多种肿瘤-相关的抗原在本领域中是已知的，并且这些中的许多可商购获得。癌胚和雏形抗原包括癌胚抗原和α-胎蛋白(通常仅在发育胚芽中高度表达，但通常由肝脏和结肠的肿瘤分别高度表达)、MAGE-1和MAGE-3(在黑素瘤、乳腺癌和神经胶质瘤中表达)、胎盘碱性磷酸酶唾液酸-LewisX(在腺癌中表达)、CA-125和CA-19(在胃肠、肝和妇科瘤中表达)、TAG-72(在结肠直肠肿瘤中表达)、上皮糖蛋白2(在许多癌中表达)、胰癌胚抗原、5T4(在胃癌中表达)、α胎蛋白受体(在多个类型的肿瘤尤其是乳房肿瘤中表达)和M2A(在生殖细胞瘤形成中表达)。
肿瘤-相关的分化抗原包括酪氨酸酶(在黑素瘤中表达)和特定的表面免疫球蛋白(在淋巴瘤中表达)。
突变的癌基因或肿瘤-抑制子基因产物包括Ras和p53(两者均在许多类型肿瘤中表达)、Her-2/neu(在乳腺癌和妇科癌中表达)、EGF-R、雌激素受体、孕酮受体、眼癌基因产物、myc(与肺癌有关)、ras、p53、与乳腺肿瘤相关的非突变体、MAGE-1和MAGE-3(与黑素瘤癌、肺癌和其他癌症相关)。
融合蛋白包括BCR-ABL，其在铬骨髓性白血病中表达。
肿瘤病毒蛋白质包括HPV16型、E6型和E7型，它们存在于子宫颈恶性肿瘤中。
组织-特异性抗原包括黑素转铁蛋白和MUC1(在胰腺癌和乳腺癌中表达)；CD10(先前已知为常见急性淋巴性白血病抗原或CALLA)或表面免疫球蛋白(在B细胞白血病和淋巴瘤中表达)；IL-2受体的α链、T细胞受体、CD45R、CD4+/CD8+(在T细胞白血病和淋巴瘤中表达)；前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酶(在前列腺恶性肿瘤中表达)；GP100、MelanA/Mart-1、酪氨酸酶、gp75/棕色、BAGE和S-100(在黑素瘤中表达)；细胞角蛋白(在各种癌中表达)；和CD19、CD20和CD37(在淋巴瘤中表达)。
肿瘤-相关的抗原还包括改变的糖脂和糖蛋白类抗原，诸如包含神经氨酸的糖鞘脂(例如GM2和GD2，在黑素瘤和一些脑肿瘤中表达)；血型抗原，尤其是T和唾液酸化的Tn抗原,其可异常地在癌中表达；以及粘蛋白，诸如CA-125和CA-19-9(在卵巢癌上表达)或糖基化不足的MUC-1(在乳腺癌和胰腺癌上表达)。
组织-特异性抗原包括上皮膜抗原(在多发性上皮癌中表达)、CYFRA21-1(在肺癌中表达)、Ep-CAM(在泛癌中表达)、CA125(在卵巢癌中表达)、完整的单克隆免疫球蛋白或轻链片段(在骨髓瘤中表达)以及的β亚基。
“自身抗原”是针对生物体产生免疫应答的生物体自己的“自体抗原”。自身抗原涉及自身免疫疾病，诸如古德帕斯彻氏综合征、多发性硬化症、格雷夫斯病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病、类风湿性关节炎、寻常性天疱疮、阿狄森氏病、疱疹样皮炎、乳糜泻和桥本氏甲状腺炎。
糖尿病-相关的自身抗原包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)和其他胰岛细胞自身抗原、例如，ICA512/IA-2蛋白质酪氨酸磷酸酶、ICA12、ICA69、前胰岛素原或其免疫活性片段(例如，胰岛素B-链、A链、C肽或其免疫活性片段)、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、神经节糖苷(例如，GM1-2、GM3)或其免疫活性片段。
黄斑部退化相关的自身抗原包括补体途径分子和来自RPE、脉络膜和视网膜的各种自身抗原、玻璃体结合蛋白、β晶状体蛋白、钙网织蛋白、血清铁传递蛋白、角蛋白、丙酮酸羧化酶、C1和绒毛蛋白2。
其他自身抗原包括核小体(包含组蛋白和DNA的颗粒；核蛋白(RNP)颗粒(包含RNA和在RNP颗粒中介导特异性功能的蛋白质)以及双链DNA。其他自身抗原仍包括髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓磷脂相关的糖蛋白类(MAG)、髓磷脂/少突细胞碱性蛋白质(MOBP)、少突细胞特异性蛋白质(Osp)、髓磷脂碱性蛋白质(MBP)、蛋白脂质脱辅基蛋白(PLP)、半乳糖脑苷脂类(GalC)、糖脂、鞘脂类、磷脂、神经节糖苷和其他神经元抗原。
“同种异型抗原”是由相同种类的其他成员检测的抗原的等位基因的直接或间接产物。此类等位基因的直接产物包括编码多肽；间接产物包括由等位基因编码的酶合成的多糖和脂质。同种异型抗原包括主要和次要组织相容性抗原(在人中称为HLA)，包括I类和II类抗原、血型抗原诸如ABO、Lewis型、T和B细胞上的抗原以及单核细胞/内皮细胞抗原。HLA特异性包括(例如A1-A74，尤其是A1、A2、A3、A11、A23、A24、A28、A30、A33)、B(例如B1-B77，尤其是B7、B8、B35、B44、B53、B60、B62)、C(例如C1-C11)、D(例如D1-D26)、DR(例如DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8和DR11)、DQ(例如DQ1-DQ9)和DP(例如DP1-DP6)。
“传染剂的抗原”包括原生动物、细菌、真菌(单细胞和多细胞两者)、病毒、阮病毒、细胞内寄生生物、蠕虫和可包括免疫应答的其他传染剂的组分。
细菌抗原包括革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性菌杆菌、革兰氏阴性细菌、厌氧细菌的抗原，诸如放线菌科、芽胞杆菌、巴尔通氏体科、博德特氏菌属、Captophagaceae科、棒状杆菌科、肠杆菌、军团菌科、微球菌、分枝杆菌科、诺卡氏菌科、巴斯德菌科、假单胞菌科、螺旋体科、弧菌科和不动杆菌属、布氏杆菌属、弯曲杆菌属、丹毒丝菌属、爱文菌属、弗朗西斯氏菌属、加德纳菌属、螺杆菌属、肠杆菌属、李斯特氏菌属、链杆菌属和Tropheryma属的生物体。
原生动物传染剂的抗原包括疟疾疟原虫、利什曼原虫属菌种、锥虫属菌种和血吸虫属菌种的抗原。
真菌抗原包括曲霉属、子囊酵母菌、假丝酵母属、球孢子菌、隐球菌、组织浆菌、副球孢子菌属、孢子丝菌的抗原、毛霉目的生物体、诱导广色霉菌和足分枝菌的生物体和发癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属以及马拉色氏霉菌属的生物体。
朊病毒的抗原包括引起羊痒病、牛海绵状脑病(BSE)、猫科动物海绵状脑病、库鲁病、克雅氏病(CJD)、格-史氏病(GSS)和致死性家族性失眠症(FFI)的朊病毒的唾液酸糖蛋白PrP27-30。
可从抗原肽获得的细胞内寄生生物包括但不限于衣原体科、枝原体科、无胆甾原体科、立克次体属以及考克斯氏体属和埃利希氏体属的生物体。
抗原肽可从蠕虫诸如线虫动物、吸虫或绦虫获得。
病毒肽抗原包括但不限于腺病毒、纯疱疹病毒、乳头状瘤病毒、呼吸道合胞体病毒、痘病毒、HIV、流行性感冒病毒和CMV的那些。尤其可用的病毒肽抗原包括HIV蛋白质，诸如HIVgag蛋白(包括但不限于膜锚定(MA)蛋白、核心衣壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流行性感冒病毒基体(M)蛋白质和流行性感冒病毒核衣壳(NP)蛋白、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)、戊型肝炎蛋白(HBeAg)、乙型肝炎DNA聚合酶、丙型肝炎抗原等等。
抗原结合到抗原呈递复合物
抗原包括抗原肽，可主动地或被动地结合到抗原呈递复合物的抗原结合槽，如美国专利6,268,411中所述。任选地，抗原肽可共价地结合到肽结合槽。
如果需要，可使用肽系链将抗原肽连接到肽结合槽。例如，多种I类MHC分子的晶体学分析指明β2M的氨基末端距驻留在MHC肽结合槽的抗原肽的羧基末端非常近，距离约20.5埃。因此，使用长度约13个氨基酸，相对短的连接子序列，其可将肽拴系到β2M的氨基末端。如果所述序列适当，该肽将结合到MHC结合沟槽(参见美国专利6,268,411)。
B细胞影响分子
“B细胞影响分子”是对B细胞或B细胞前体具有生物学效应诸如诱导增殖或抗体形成的分子。此类分子包括CD40配体以及如上所述的细胞因子和细胞因子分子复合物。根椐所使用的细胞因子分子的类型，可促使B细胞产生特定类型的抗体。例如，IL-4诱导IgE的产生，而IL-5诱导IgA的产生。
用于抗体-诱导的纳米-aAPC上的分子复合物
用于抗体诱导的纳米-aAPC上的分子复合物是接合B细胞表面免疫球蛋白或接合B细胞的表面上的MHC-抗原复合物的复合物。接合B细胞表面免疫球蛋白的分子复合物包括复合到纳米-aAPC表面的抗原。接合B细胞表面的MHC-抗原复合物的分子复合物包括T细胞受体(TCR)和TCR分子复合物。抗体诱导的纳米-aAPC可包括此类分子复合物的一种或两种形式(即，B细胞表面免疫球蛋白接合或MHC-抗原接合)。
使用本领域熟知的方法可克隆特异于任何特定抗原的TCR。参见例如US2002/0064521。克隆的抗原特异性TCR可原样使用或可用于形成TCR分子复合物，如下所述。
“TCR分子复合物”在美国专利6,458,354、美国专利6,015,884、美国专利6,140,113和美国专利6,448,071中公开。TCR分子复合物包含至少四种融合蛋白。两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)TCRα链的细胞外结构域。两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白κ或λ轻链和(ii)TCRβ链的细胞外结构域。另选地，两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)TCRγ链的细胞外结构域，并且两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白κ或λ轻链和(ii)TCRδ链的细胞外结构域。两种第一和两种第二融合蛋白缔合形成TCR分子复合物。每种第一融合蛋白的TCR链的细胞外结构域和每种第二融合蛋白的TCR链的细胞外结构域形成抗原识别槽。
免疫球蛋白重链可以是IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2β、IgG2α、IgE或IgA的重链。优选地，使用IgG1重链形成包含两个抗原识别槽的二价TCR分子复合物。任选地，可包括重链的可变区。可使用IgM或IgA重链分别提供五价或四价TCR分子复合物。使用多个免疫球蛋白链还可构造具有其他化合价的TCR分子复合物。
TCR分子复合物的融合蛋白可包含肽连接子，所述肽连接子插在免疫球蛋白链和TCR多肽的细胞外结构域之间。根据需要调节抗原结合和交联的程度的灵活性，连接子序列的长度可变化。可设计构建体使得TCR多肽的细胞外结构域直接且共价地附接到免疫球蛋白分子而无需另外的连接子区域。如果包括连接子区域，则此区域优选地包含至少3个且不多于30个氨基酸。更优选地，连接子为约5并且不多于20个氨基酸；最优选地，连接子少于10个氨基酸。一般来讲，连接子由短甘氨酸/丝氨酸间隔子构成，但可使用任何氨基酸。将免疫球蛋白重链连接到TCRα或γ链的细胞外结构域的优选连接子是GLY-GLY-GLY-THR-SER-GLY(SEQIDNO:1)。将免疫球蛋白轻链连接到TCRβ或δ链的细胞外结构域的优选连接子是GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER(SEQIDNO:2)。
使用纳米-aAPC诱导并且扩增特异性细胞群的方法
抗原特异性T细胞的诱导和扩增
本公开提供了诱导形成和扩增抗原-特异性T细胞的方法，所述细胞包括CTL、辅助T细胞和调节T细胞。这些方法涉及使包含许多前体T细胞的分离的制剂与抗原结合到抗原结合槽的纳米-aAPC接触。使用纳米-aAPC制备的温育诱导群体中的前体细胞以形成识别抗原的抗原特异性T细胞。如下所述，可通过使用纳米-aAPC温育前体T细胞来获得抗原特异性T细胞，或者可通过常规方法，例如使用树枝状细胞温育，或通过使用本领域中已知的其他类型的人工抗原呈递细胞温育获得。
通常，如果使用包含特异性结合到CD3的抗体但不包含抗原呈递复合物的颗粒温育前体T细胞，那么抗原特异性T细胞在第一细胞群中的数目或百分比中任一大于所形成的抗原特异性T细胞的数目或百分比。
在本公开其中使用了纳米-aAPC的实施方案的任一个中，可使用抗原呈递复合物、结合抗原和T细胞影响分子的任何组合。例如，纳米-aAPC可包含一种或多种T细胞共刺激分子(相同或不同)、一种或多种调节T细胞诱导分子(相同或不同)、一种或多种粘附分子(相同或不同)和/或一种或多种T细胞生长因子(相同或不同)。相似地，纳米-aAPC可包含任何组合的抗原可结合到的一种或多种抗原呈递复合物，相同或不同。在一个实施方案中，例如，若干不同的黑素瘤-相关的抗原(例如，酪氨酸酶、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、MelanA/Mart-1、gp75/棕色、BAGE和S-100中任一种或全部)可结合到一种或多种纳米-aAPC上的抗原呈递复合物。
可从患者或合适的供体获得前体T细胞。供体无需为相同的双胞胎或甚至与患者相关。然而，优选地，供体和患者至少共享一个HLA分子。可从多个来源获得前体T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。另选地，可使用本领域中可用的T细胞系。
在一个实施方案中，使用技术人员已知的任意种技术，诸如Ficoll分离，可从受试者收集的血液单元获得前体T细胞。例如，可通过血液成分单采术或白细胞除去法从个体的循环血液中获得前体T细胞。血液成分单采术产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞和前体T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核的白细胞、红细胞和血小板。可洗涤通过血液成分单采术收集的细胞以去除血浆成分并且将细胞放置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。通过本领域中技术人员已知的方法可以完成洗涤步骤，诸如根据制造商的使用说明，使用半自动“极限沉降”离心(例如Cobe2991细胞处理器)。洗涤之后，可将细胞重悬在多种的生物相容性缓冲液中，诸如例如不含Ca、不含Mg的PBS中。另外，可以去除血液成分单采术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬在培养基中。如果需要，通过裂解红细胞并且耗尽单核细胞例如通过PERCOLLTM梯度离心，前体T细胞可与外周血淋巴细胞分离。
任选地，可继续使用相同纳米-aAPC或第二纳米-aAPC温育包含抗原特异性T细胞的细胞群，持续足以形成相对于第一细胞群中抗原特异性T细胞的数目，抗原特异性T细胞数目增加的第二细胞群的时间段。通常，此类温育进行3-21天，优选地7-10天。
合适的温育条件(培养基、温度等)包括用于培养T细胞或T细胞前体的那些条件，以及使用DC或人工抗原呈递细胞用于诱导抗原特异性T细胞的形成的本领域中已知的那些条件。参见例如Latouche&Sadelain,NatureBiotechnol.18,405-09，2000年4月；Levine等人，J.Immunol.159,5921-30,1997；Maus等人，NatureBiotechnol.20,143-48，2002年2月。还参见以下具体实施例。
为了估计增生信号的量值，可使用CFSE标记抗原特异性T细胞群并且分析细胞分裂的速率和数目。在使用抗原所结合到的纳米-aAPC刺激一两轮后，使用CFSE标记T细胞。在那个点，抗原特异性T细胞应代表总细胞群的2-10％。使用抗原特异性染色可检测抗原特异性T细胞，使得CFSE损耗可在抗原特异性T细胞的分裂的速率和数目之后。在刺激后的不同时间(例如，12、24、36、48和72小时)，可针对抗原呈递复合物染色和CFSE两者，分析细胞。可使用抗原未结合到的纳米-aAPC刺激测定增殖的基线水平。任选地，可通过监测3H-胸腺嘧啶核苷的结合检测增殖，如本领域中所公知的。
可使用纳米-aAPC刺激培养基，持续可变的量的时间(例如，0.5、2、6、12、36小时以及连续刺激)。在较大百分比(例如，50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)的纳米-aAPC可被复原而细胞损耗极少的情况下，可估计高度富集的抗原特异性T细胞培养基中刺激时间的效应，并且可确定条件。然后可将抗原特异性T细胞放回培养基，并且分析细胞生长、增殖速率、对细胞凋亡的效应、各种效应子功能等等，如本领域中所公知。此类条件可根据需要的抗原特异性T细胞应答改变。
检测抗原特异性T细胞
可以本领域的技术人员已知的任意种方式测定纳米-aAPC对T细胞前体扩增、激活和分化的效应。通过测定特异于各种类型的T细胞的标记物，测定培养基中CTL、辅助T细胞或调节T细胞的增加，使用增殖实验，可完成对功能的快速测定。此类标记物在本领域是已知的。通过测定细胞因子产生或溶细胞活性，使用铬释放实验可检测CTL。
分析纳米-aAPC-诱导的/扩增的抗原-特异性T细胞上的归巢受体
除使用适当效应子功能生成抗原特异性T细胞之外，抗原特异性T细胞功效的另一个参数是允许T细胞运输至病变位点的归巢受体的表达(Sallusto等人，Nature401,708-12,1999；Lanzavecchia&Sallusto,Science290,92-97,2000)。适当的归巢受体的不存在在慢性CMV和EBV感染的情况中有所涉及(Chen等人，Blood98,156-64,2001)。此外，使用专职APC和非专职APC扩增抗原特异性T细胞之间所注意的一个差异是适当的归巢受体的表达，这可说明的存在体内功能失调的CTL的存在(Salio等人，J.Immunol.167,1188-97,2001)。
例如，效应子CTL功效与归巢受体的以下表型CD62L+、CD45RO+和CCR7-有关。因此，可针对这些归巢受体的表达，鉴定纳米-aAPC-诱导的和/或扩增的CTL群。归巢受体表达是与初始刺激条件相关的复合性状。据推测，这由共刺激复合物以及细胞因子环境两者控制。已涉及的一个重要的细胞因子是IL-12(Salio等人，2001)。如上所讨论，纳米-aAPC提供单个地改变单独组分(例如T细胞效应子分子和抗原呈递复合物)以优化生物结果参数的可能性。任选地，细胞因子诸如IL-12可被包括在初始诱导培养基中以影响抗原特异性T细胞群中的归巢受体特性。
分析诱导和/或扩增的抗原特异性T细胞群的脱离速率
第二免疫应答的进化与亲和力的聚焦相关，如通过TCR“脱离速率”分析所测定(Savage等人，Immunity10,485-92,1999；Busch等人，J.Exp.Med.188,61-70,1998；Busch&Pamer,J.Exp.Med.189,701-09,1999)。TCR-脱离速率的降低(即，导致TCR亲和力增加)是与识别较低量的抗原的增加的能力和感兴趣的T细胞群的生物功效密切关联的参数。可通过改变纳米-aAPC-介导的刺激的量值和/或持续时间优化脱离速率。
将抗原特异性T细胞与其他细胞分离
可将结合到抗原的抗原特异性T细胞与未结合的细胞分离。可使用在本领域中是已知的任何方法完成这种分离，包括磁性富集、血浆成分单采术、流式细胞术或差速离心。在一个实施方案中，可通过使用珠例如抗-CD3/抗-CD28-缀合的珠诸如M-450CD3/CD28T温育，持续足以阳性选择所需的T细胞的时间段来分离T细胞。
如果需要，抗原特异性T细胞亚群可与可能存在的其他细胞分离。例如，可通过阳性或阴性选择技术进一步分离特异性的T细胞亚群，诸如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。一种方法是通过阴性磁性免疫细胞粘连或流式细胞术的细胞分类和/或选择，所述流式细胞术使用涉及存在于阴性选择的细胞的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
使用标记物Foxp3，可检测抗原-特异性调节T细胞或使其与其他细胞分离。时间段在30分钟到36小时或10到24小时的范围内，或可至少为1、2、3、4、5或6小时或至少24小时。还可使用更长的温育时间以在其中相比于其他类型，存在很少T细胞的任何情况下分离T细胞，如将肿瘤渗透淋巴细胞(TIL)从肿瘤组织或从免疫失能的个体分离。
诱导和扩增抗体-产生B细胞
本公开还提供了诱导抗体-产生B细胞的形成的方法。这些方法涉及使包含许多前体B细胞的分离的制剂与抗体诱导纳米-aAPC接触。使用抗体诱导纳米-aAPC温育制剂诱导群体中的前体细胞以形成抗体产生B细胞，所述抗体产生B细胞产生特异性识别抗原的抗体。通常，第一细胞群中抗体产生B细胞的数目或百分比大于如果使用非特异性刺激物例如植物血球凝集素(PHA)、脂多糖(LPS)或美洲商陆温育前体B细胞，形成的抗体-产生B细胞的数目或百分比。在本文所公开的其中使用抗体诱导纳米-aAPC的实施方案的任一个中，可使用B细胞影响分子和接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物的复合物的任意组合。
可从患者或合适的供体获得前体B细胞。供体和患者无需相关，但优选地共享至少一种HLA分子。另选地，可使用本领域中可用的B细胞系。在一个实施方案中，使用技术人员已知的任意种技术，诸如Ficoll分离，可从受试者收集的血液单元获得前体B细胞。例如，可通过血液成分单采术或白细胞除去法从个体的循环血液中获得前体B细胞，如以下所讨论。
可使用本领域中已知的方法培养B细胞或它们的前体。参见例如Schultze等人，J.Clin.Invest.100,2757-65,1997；vonBergwelt-Baildon等人，Blood99,3319-25,2002。此类条件也可适用于使用抗体诱导纳米-aAPC温育B细胞前体。
任选地，可继续使用相同的抗体诱导纳米-aAPC或第二抗体诱导纳米-aAPC温育包含抗体-产生B细胞的细胞群，持续足以形成相对于第一细胞群中抗体-产生B细胞的数目，抗体-产生B细胞数目增加的第二细胞群的时间段。通常，此类温育进行3-21天，优选地7-10天。
优化抗体诱导纳米-aAPC和B细胞之间的相互作用的持续时间
如以上所讨论的T细胞刺激，诱导或扩增抗体-产生B细胞群需要的刺激的持续时间与正常发生不同，尤其是对于纳米-aAPC，如果使用人工不能够生物降解的表面的情况。因此，通过纳米-aAPC的刺激可能即使没有几天，也有几小时。可使用类似以上针对抗原特异性T细胞所讨论的方法，测定各种抗体诱导纳米-aAPC和前体或抗体-产生B细胞之间的相互作用的持续时间。
检测抗体-产生B细胞
可以本领域的技术人员已知的任意种方式，测定抗体-产生纳米-aAPC对B细胞前体的扩增、激活和分化的效应。使用增殖实验，通过检测B细胞-特异性标记物或通过测定特异性抗体产生，可完成功能的快速测定。
使用磁场和纳米-aAPC诱导并且扩增特异性T细胞群的方法
本公开提供了在磁场中诱导形成和扩增抗原-特异性T细胞的方法，所述细胞包括CTL、辅助T细胞和调节T细胞。纳米颗粒平台非常适合于体内施用和细胞疗法，因为当与细胞共结合时，它们比微颗粒更不易于诱导组织梗塞或发炎，37并且铁-葡聚糖纳米颗粒例如以GMP-等级制剂形式获得。
这些方法的一些变化形式涉及使分离的多克隆T细胞群与许多纳米-aAPC接触。纳米-aAPC是顺磁性的并且在它们的表面上包含(1)至少一种T细胞影响分子和(ii)至少一种抗原呈递复合物。抗原呈递复合物包含抗原结合槽，并且抗原结合槽包含抗原。分离的多克隆T细胞群与纳米-aAPC在足够强度的磁场中接触，并且持续足以生成抗原特异性T细胞群即特异于抗原结合到抗原结合槽的T细胞的时间。然后使用例如磁性富集柱、流式细胞术或差速离心分离结合到纳米-aAPC的抗原特异性T细胞群并且施用给患者。使用磁性富集之后通过结合分离细胞的方法在本领域是众所周知的，38,39并且这些方法中任一种可用于公开的方法的操作中。
公开的方法的其他变化形式涉及向患者施用许多纳米-aAPC并且然后将磁场施加到患者或到患者的期望的靶区域(例如，肿瘤或局部感染)。使用磁场以在体内引导顺磁性颗粒和颗粒标记的细胞的运输在本领域是已知的40–42，并且可使用这些方法中任一种将纳米-aAPC引导至期望的靶区域。
使用磁场和纳米颗粒优先地刺激特定生理状态的细胞的方法
本公开提供了使用纳米颗粒诸如磁性纳米颗粒靶向不同生理状态的细胞(例如初始对先前激活的T细胞)并且刺激靶细胞群的方法。例如如图9C所示并且如以下具体实施例中更多细节所讨论的，提供32ng的剂量的MHC的纳米-aAPC，在一周的时间内在20倍和30倍之间，刺激初始和先前激活的T细胞两者。然而，以8ng或3.2ng的MHC，仅激活的T细胞被刺激。因此，可使用包含例如3.2-8ng的MHC的剂量的纳米-aAPC刺激T细胞群中先前激活的T细胞而不影响群体中的初始T细胞。
可使用包含3.2-8ngMHC与32ngMHC的纳米-aAPC的差动效应将T细胞的纳米-aAPC结合和分离与T细胞的激活分离。例如，使用例如针对CD44的抗体，T细胞群基本上耗尽了先前的活性T细胞，从而保留了富集初始T细胞的群体。将包含3.2-8ngMHC的纳米-aAPC结合到此群体将不会激活初始T细胞，但允许它们纯化。通过本领域中已知的多种聚积纳米颗粒的技术，可激活包含结合纳米-aAPC的初始T细胞。就磁性纳米颗粒而言，这可例如通过将T细胞-纳米-aAPC复合物暴露于磁场完成。
可使用相同方法分离、表征其他细胞并且用作其他细胞的治疗法(therapeutic)，所述其他细胞包括举例的方式但不限于例如B细胞和干细胞。使用诸如以下实施例9中描述的那些方法，测定将差异性地激活不同生理状态的群体中的细胞的纳米颗粒的表面上的最佳配体密度(或可选地，纳米颗粒所包含的此类配体的剂量)。根椐细胞群，配体可包含例如抗体或抗体的一部分、肽、核苷酸、碳水化合物、类脂、用于给定受体的天然配体的全部或一部分(例如，EGF、PDGF)、化学物质(例如铬盐或结合亲免素分子受体诸如FKBP结合结构域的一价的合成配体)、单个抗-整联蛋白Fab片段、RGD肽等等。
药物制剂
可配制包含纳米-aAPC以及使用此类纳米-aAPC获得的抗原特异性T细胞或抗体特异性B细胞的药物制剂以向患者直接注射。此类药物制剂包含适用于将组合物递送到患者的药学上可接受的载体，诸如盐水、缓冲盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)或磷酸盐缓冲盐水葡萄糖溶液。
免疫治疗法
施用途径
纳米-aAPC以及使用纳米-aAPC获得的抗原特异性T细胞或抗体-特异性的B细胞，可通过任何适当的途径施用到患者，所述途径包括静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和肿瘤内施用。患者包括了人类患者和兽医学概念上的患者。
治疗方法
可使用纳米-aAPC生成治疗学上可用的数目的可用于本领域中已知的诊断和治疗方法的抗原特异性T细胞或抗体-产生B细胞。参见例如，WO01/94944；US2002/0004041；美国专利5,583,031；US2002/0119121；US2002/0122818；美国专利5,635,363；US2002/0090357；美国专利6,458,354；US2002/0034500。
具体地，可使用抗原特异性T细胞或抗体-产生B细胞治疗患有感染性疾病、癌症或自身免疫疾病的患者，或者向免疫抑制的患者提供预防性保护。
可被治疗的感染性疾病包括由细菌、病毒、阮病毒、真菌、寄生生物、蠕虫等引起的那些疾病。此类疾病包括AIDS、肝炎、CMV感染和移植后淋巴增殖紊乱性疾病(PTLD)。例如，CMV是存在于器官移植患者中最常见的病毒病原体并且是经历骨髓或外周血干细胞移植的患者发病和死亡的主要原因(Zaia,Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.4,603-23,1990)。这是由于这些患者的免疫失能状态，所述免疫失能状态允许再激活血清反应阳性的患者中潜在病毒或血清反应阴性的个体中机会性感染。当前治疗聚焦于使用抗病毒素化合物诸如更昔洛韦，所述化合物具有缺点，最显著的是药物-耐受的CMV的发展。这些治疗的可用的替代是预防性免疫治疗方案，其涉及在开始移植程序前，生成衍生自患者或合适的供体的病毒特异性CTL。
PTLD发生在相当大比例的移植患者中并且由爱泼斯坦－巴尔二氏病毒(EBV)感染引起。据信EBV感染存在于约90％的美国成人群体中(Anagnostopoulos&Hummel,Histopathology29,297-315,1996)。活性病毒复制和感染由免疫系统保持检查，但是在CMV的情况中，由移植疗法而免疫失能的个体丧失了控制T细胞群，这允许病毒再激活。这代表对移植方案的严重阻碍。EBV还涉及多种血液学和非血液学癌症中的肿瘤促进。EBV和鼻咽癌之间存在强烈的关联。因此，使用EBV-特异性的T细胞的预防性治疗为当前疗法提供了优异的替代方法。
可被治疗的癌症包括黑素瘤、癌症例如结肠癌、十二指肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、导管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、发育异常口腔粘膜癌、息肉病、侵入性口腔癌、非小细胞性肺癌、尿道移行细胞癌及鳞状上皮细胞癌等等；神经系统恶性肿瘤，例如成神经细胞瘤、神经胶质瘤等等；血液恶性肿瘤，例如慢性粒细胞白血病、儿童急性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、恶性皮肤T-细胞瘤、蕈样肉芽肿病，非-MF皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、T-细胞富集性皮肤淋巴增生、大疱性类疱疮、全身性盘状红斑狼疮、扁平苔癣等；诸如此类。参见，例如Mackensen等人，Int.J.Cancer86,385-92,2000；Jonuleit等人，Int.J.Cancer93,243-51,2001；Lan等人，J.Immunotherapy24,66-78,2001；Meidenbauer等人，J.Immunol.170(4),2161-69,2003。
可被治疗的自身免疫疾病包括哮喘、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化症、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯病、寻常性天疱疮、爱迪生氏病、疱疹样皮炎、乳糜泻和桥本氏甲状腺炎。
可使用抗原-特异性辅助T细胞激活巨噬细胞或激活B细胞以产生可使用例如治疗感染性疾病和癌症的特异性抗体。抗体-产生B细胞本身也可被用于此目的。
可使用抗原-特异性调节T细胞实现免疫抑制效应，例如治疗或预防移植患者中移植物抗宿主病，或者治疗或预防自身免疫疾病诸如以上列出的那些疾病或过敏反应。使用调节T细胞在例如US2003/0049696、US2002/0090724、US2002/0090357、US2002/0034500和US2003/0064067中公开。可使用其中T细胞影响分子是细胞凋亡诱导分子中的纳米-aAPC抑制免疫应答。
剂量
可向患者施用抗原特异性T细胞，其剂量在约5-10x106CTL/kg体重(～7x108CTL/治疗)最高至约3.3x109CTL/m2(～6x109CTL/治疗)的范围内(Walter等人，NewEnglandJournalofMedicine333,1038-44,1995；Yee等人，JExpMed192,1637-44,2000)。在其他实施方案中，患者可接受静脉内施用103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、109、5x109或1010细胞/剂量。在其他实施方案中，患者可接受例如200μl推注中8x106或12x106细胞的结节内注射。纳米-aAPC的剂量包括103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、109、5x109或1010纳米-aAPC/剂量。
动物模型
可用多个鼠科动物模型，针对肿瘤治疗评估过继性免疫疗法方案。两个模型尤其适用于评估黑素瘤治疗。一个模型使用具有皮下植入的人黑素瘤细胞系诸如BML的人/SCID小鼠。在此类模型中，离体扩增的Mart-1-特异性CTL的转移延迟了肿瘤的开始和/或生长。第二模型使用了鼠科动物A2-转基因小鼠和使用HLA-A2样分子转染的鼠科动物B16黑素瘤小鼠，称为AAD。也是A2-转基因的基础的这种分子是融合到鼠科动物α3结构域的α1-2结构域的人HLA-A2。使用这些转基因小鼠，鼠科动物B16-AAD黑素瘤对衍生自酪氨酸酶和gp100的明确定义的A2-限定的黑素瘤表位上排斥敏感。
试剂盒
可以试剂盒形式提供纳米-aAPC。适合纳米-aAPC的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述容器装可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。任选地，一个或多个不同的抗原可结合到纳米-aAPC或可单独提供。
试剂盒可进一步包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’ssolution)或右旋糖溶液。它还可包含可用于最终使用者的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针和注射器。试剂盒还可包含具有另一种活性剂例如化学治疗剂或抗-感染剂，或包含可结合到纳米-aAPC的抗原呈递复合物的特定抗原的由最终使用者使用的第二或第三容器。
试剂盒还可包含用于评估抗原特异性T细胞或抗体-产生B细胞诱导或扩增的程度和功效的试剂，诸如针对特异性标记物蛋白的抗体、MHCI类或II类分子复合物、TCR分子复合物、抗典型克隆的抗体等等。
试剂盒还可包含包装说明书，其含有对在各种治疗方案中诱导抗原特异性T细胞、扩增抗原特异性T细胞、使用试剂盒中的纳米-aAPC的方法的书面说明。所述包装说明书可以是未被批准的草拟包装说明书，或者是被食品与药物管理局(FDA)或其他监察机构批准的包装说明书。
本领域的技术人员将会知道存在上述实施方案的许多变化和置换，它们落入在所附权利要求书中的本发明的范围内。
实施例1
实施例2-7的材料和方法
小鼠和试剂。通过在C57/BL6背景上培育，将2CTCRRag-/-转基因小鼠保持为杂合子。pMELTCR/Thy1aRag-/-转基因小鼠得自NicholasRestifo(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)并且将其保持为杂合子。C57BL/6j小鼠购自杰克逊实验室(BarHarbor,ME)。根据约翰-霍普金斯大学的机构审查委员会(InstitutionalReviewBoard)保持所有小鼠。荧光标记的单克隆抗体购自BioLegend(SanDiego,CA)。
制备MHC-Ig二聚体。使用肽制备并且加载可溶的MHC-Ig二聚体、Kb-Ig和Db-Ig，如所述(48)。简而言之，通过在碱性条件下(pH11.5)剥离，并且然后在50倍过量肽的存在下再次折叠，Kb-Ig分子加载有肽。将Db-Ig分子在轻度的酸性条件下(pH6.5)下剥离，并在50倍摩尔过量的肽和2倍摩尔过量的人β2-微球蛋白的存在下再折叠。在过量M1肽的存在下，被动地加载人A2-Ig(49)。肽“SIY”(SIYRYYGL，SEQIDNO:3；合成)、“SIIN”(SIINFEKL，SEQIDNO:4；衍生自卵清蛋白蛋白质)、“GP100”(KVPRN量子点WL，SEQIDNO:5；来自黑素细胞GP100蛋白质)、“ASN”(ASNENMETH，SEQIDNO:6；来自流感病毒A核蛋白)和“M1”(GILGFVFTL，来自流感AM1蛋白质)购自Genscript(Piscataway,NJ)。通过尺寸排除高效液相色谱法在标记后测定蛋白质浓度。
粒子制造和表征。以两种方式中一种制造纳米级铁-葡聚糖aAPC。在4℃，使用100μL的抗-生物素Miltenyi微粒(MiltenyiBiotec)温育2μM生物素酰化MHC-Ig二聚体和等摩尔浓度的生物素酰化的抗-CD28抗体，轻微搅拌至少1小时。使用MS磁性富集柱(MiltenyiBiotec)洗涤未结合的蛋白质。使用BeckmanCoulterAD340读板机，通过405nm处的吸光度测量颗粒浓度。
另选地，MHC-Ig二聚体和B7.1-Ig直接化学偶联到可生物降解的颗粒(MiltenyiBiotec)。通过Bradford实验评估总蛋白含量。除非另作说明，“铁-葡聚糖aAPC”是指直接化学偶联到MHC和B7.1，而不是抗-生物素偶联的颗粒。
在4℃，通过使用100μL的1μM链霉抗生物素蛋白涂覆的量子点(LifeTechnologies)，温育5μM,生物素酰化MHC-Ig二聚体和等摩尔浓度的生物素酰化抗-CD28抗体，持续2小时，来制造纳米级量子点aAPC。使用具有300,000截断分子量的SartoriusVivaspin膜，洗涤并且浓缩量子点。使用BeckmanCoulterAD340读板机，通过405nm处的吸光度测量量子点浓度。
纳米颗粒跟踪分析。使用配备有敏感CCD相机的NanosightLM10以通过NTA使铁-氧化物aAPC表征。将50μL稀释的纳米颗粒溶液加载到连接至405nm激光源的样品室中。使用NTA软件(版本2.0)记录包含散射质心(颗粒)的布朗运动跟踪的60s的影片。如所推荐，使用制造商推荐的自动设置和增益、模糊和亮度的手动调节来处理影片。在磷酸盐缓冲盐水中稀释纳米颗粒溶液以将样品浓度调节到5×1012颗粒mL-1。
体外细胞扩增。对于小鼠细胞培养，从均质的小鼠脾获得细胞之后通过低渗裂解耗尽RBC。使用MiltenyiBiotec(德国Cologne)的CD8非-触摸分离试剂盒和磁性富集柱，且如果必要在37℃使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记15分钟，然后充分洗涤来分离细胞毒性淋巴细胞。在96孔圆底平板中，在补充有采集自人血浆的T细胞因子、细胞因子混合物的完整的RPMI培养基中，混合并且培育指明剂量的一百万CD8+T细胞和颗粒，持续4-7天(5)。在第4天，使用BDFacsCalibur流式血细胞计数器测量CFSE荧光并且在FlowJo(TreeStar)中分析。
对于人细胞培养，在制造商规程后(GEHealthcare)，通过Ficoll-PaquePLUS梯度离心分离健康HLA*0201阳性供体的PBMC。使用CD8+T细胞阴性选择试剂盒(MiltenyiBiotec)，从新鲜PBMC进一步纯化CD8+T细胞。CD8+T细胞的纯度高于95％，如通过流式细胞术测定。在96-孔圆底平板中，在补充有T细胞因子的完整的RPMI培养基中，混合并且培养指名剂量的三百万CD8+T细胞和颗粒，最高持续14天。在刺激后第7天，收获T细胞，计数并且以相同的T细胞:纳米-aAPC密度代替。根据制造商规程，使用HLA-M1-特异性、A*0201PE或APC四聚体(BeckmanCoulter)测定抗原特异性。
细胞内细胞因子染色。在初级刺激后七天，通过使用肽-冲击的C57Bl/6j脾细胞再次攻击评估T细胞功能活性。在37℃，使用指示浓度的肽冲击脾细胞，持续2小时，然后洗涤。在完整的RPMI中，在圆底96孔平板中，在0.2μlGolgiPlug、0.2uLGolgiStop和抗-CD107a-fitC(BDBiosciences,MountainView,CA)存在下，使用200,000脾细胞培育200,000T细胞，持续4小时。根据制造商的说明书，使用BDCytofix/Cytoperm试剂盒(BDBiosciences)洗涤并且固定细胞，然后使用抗-IFNγPE(BioLegend)染色。通过流式细胞术评估细胞因子染色并且与FlowJo中未刺激的对照相比，评估细胞因子功能细胞的频率。
纳米-aAPC对体内皮下肿瘤生长的效应。对于量子点aAPC实验，通过尾部静脉注射，将2×106初始CD8+pMELT细胞过继性地转移到8周龄C57BL/6雄性小鼠中，不同之处在于对照小鼠不接受T细胞或aAPC处理。同日，将B16黑素瘤细胞(2×105)皮下注射到右侧。此后一天，使用20μL同源量子点aAPC、20μL非同源量子点aAPC或20μLPBS处理小鼠，每组5只小鼠。第3、4、5天，使用30,000单位的IL-2腹膜内注射处理小鼠。使用数显卡尺，每隔2天监测肿瘤生长，直到肿瘤尺寸为～200mm2，在～200mm2点，对动物施无痛致死术。
对于铁-葡聚糖aAPC实验，如上将2×106初始CD8+pMELT细胞过继性地转移。四天后，处理组的小鼠静脉或皮下接受25μL同源HD纳米-aAPC，每组八只小鼠。三天后，皮下(sc)或静脉内(iv)注射aAPC。四天后，皮下注射B16黑素瘤细胞(2×105)，并且肿瘤后第四天，在同侧面静脉内或皮下施加aAPC的第二次注射。如上进行肿瘤追踪和动物无痛致死术。
实施例2
铁-葡聚糖纳米-aAPC诱导T细胞扩增
由MiltenyiCorporation制造的纳米尺寸的氧化铁芯、葡聚糖涂覆的颗粒的广泛表征和生物相容性，将它们选择为纳米级颗粒平台(21–23)。为了产生纳米级aAPC，将加载有适当肽(信号1)和嵌合B7.1-Ig融合蛋白(信号2)的可溶二聚的MHC-Ig共价地以1:1比率偶联到颗粒表面(图1A)。另选地，通过将生物素酰化的MHC-Ig和抗-CD28偶联到抗-生物素涂覆的铁-葡聚糖颗粒来制造颗粒(图1B)。
使用纳米颗粒跟踪分析，确认铁-葡聚糖aAPC为单分散性的并且直径为50-100nM(NTA，图1C)。颗粒以8.3nM(等同5×1012颗粒mL-1)的浓度悬浮，并且所有后续体积是指此浓度的颗粒。通过滴定偶联反应期间存在的蛋白质的量，我们合成呈现高密度(HD，65ug蛋白质/mL颗粒)或低密度(LD，16ug蛋白质/mL颗粒)的蛋白质的颗粒，如通过Bradford试验测量。
为了评估aAPC-诱导的T细胞扩增，我们使用两个TCR转基因小鼠模型：2C小鼠，其携带受体识别存在于MHCI类H2-Kb情况中的SIY肽，和pMEL小鼠，其识别存在于MHCI类H2-Db,情况中的衍生自黑素瘤分化抗原GP100的肽。制造了四种类型的抗-生物素偶联的铁-葡聚糖颗粒，呈现加载有如上所述的同源肽或非同源肽的Kb或Db(SIIN针对Kb，ASN针对Db)。使用颗粒温育T细胞并且七天后评估增殖。基于扩增的颗粒为抗原-特异性的，因为2C细胞仅在Kb-SIY颗粒的存在下增殖，并且pMEL细胞仅在Db-GP100颗粒的存在下增殖(图2A)。此外，需要信号1和信号2最佳扩增，并且携带MHC-Ig或仅CD28的抗-生物素颗粒在诱导稳健T细胞增殖不那么有效(图2B)。
由APC呈递的抗原的量(24，25)和密度(26，27)两者影响下游T细胞行为诸如增殖和细胞死亡，并且因为可为aAPC刺激重要的参数。使用HD和LD颗粒评估抗原密度对T细胞扩增的效应，并且滴定两组颗粒以评估抗原剂量的效应。使用活体染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)刺激三天后，增殖具体地表征。在每轮T细胞分裂中稀释CFSE，并且因此分裂表现为CFSE荧光降低1.5倍。刺激后七天，计数T细胞以表征增殖和死亡之间的总平衡。
HD和LD颗粒两者能够以剂量-依赖的模式诱导pMELT细胞增殖(图2C)。如通过CFSE稀释所测量，针对1、5和20μL的颗粒，每1百万细胞，HD颗粒分别在79％、98％和99％的细胞中诱导了增殖，而相同数量的LD颗粒在4％、40％和93％的细胞中诱导了增殖。第7天，使用最少阈值为约5μL的LD颗粒和少于0.5μL的HD颗粒，HD和LD颗粒诱导了需要诱导扩增的总体大约5-30倍的扩增的T细胞(图2D)。CFSE增殖和细胞计数均表明以任何指定的量的颗粒，HD纳米-aAPC比LD诱导的扩增更大。例如，以5μL的颗粒，HD颗粒诱导了21倍的扩增而LD颗粒仅诱导了7倍的扩增。
为了评估HD颗粒上的蛋白质增加的量是否完全解释了增殖优势，使用相同蛋白质浓度的T细胞温育LD和HD颗粒(即，比HD给定浓度约5倍多的LD颗粒)。一旦对aAPC的蛋白质的浓度进行规一化，如在第3天通过CFSE稀释所测量，HD和LD颗粒就诱导了类似扩增(图2E)，或在第7天诱导了类似的总体扩增(图2F)。例如，20uL的LD颗粒或3.5uL的HD颗粒第3天均在94％的细胞中诱导了扩增，并且在生长7天后，诱导了约17倍的扩增。因此，在抗原剂量和所评估的密度，扩增由存在于aAPC上的总蛋白质，并且不是颗粒剂量或蛋白质密度驱动。
实施例3
纳米-aAPC诱导稳健的T细胞效应子表型
生成足够的数目的抗原的特异性T细胞是免疫疗法的重要目标。然而，在某些刺激条件下，CTL可变成无反应性或甚至为抑制的(28)，因此必须针对扩增的淋巴细胞产生重要效应子细胞因子诸如IFNγ和分泌胞毒颗粒的能力，对它们进行评估，如通过脱粒标记物CD107a的表面表达所指示。为了评估纳米-aAPC诱导刺激后CTL功能，使用三种不同的颗粒浓度刺激整个CD8+CTL：呈现等同的量的蛋白质的3.5uL的HD和20uL的LD颗粒并且因此诱导等同约10倍的扩增和诱导约17倍的增殖的20uL的HD颗粒(图3A)。基于颗粒刺激后第七天，收获CTL并且使用肽-冲击的脾细胞再次接种，并且通过细胞内细胞因子实验评估功能应答。
全部三种颗粒剂量的功能应答是稳健且等同的。当使用高剂量的肽再次接种时，全部组的CTL表达了高水平的CD107a，其中最高达90％的细胞脱粒(图3B)。相似地，全部三组显示了高水平的IFNγ响应性(图3C)。因此，当颗粒与T细胞的比率和颗粒上蛋白质密度影响CTL扩增的程度时，无论颗粒剂量如何，所得的T细胞显示了类似的强效的效应子表型。
还可通过测量CD44和CD62L表达评估效应子表型。激活后，T细胞上调CD44。保持高CD62L表达的细胞的子组被称为“中央记忆”T细胞(Tcm)并且具有高增殖能力。下调CD62L的剩余的细胞被称为“效应子记忆”(Tem)，运输到组织并且准备稳健的效应子应答但在再次接种时具有较少的增殖能力。已验证这些T细胞表型的体内记忆发展，但是体外激活的细胞显示了类似的表型并且可用作体内记忆形成的模型。图3E示出了纳米-aAPC刺激的T细胞培养物的代表性的染色图案。HD和LD颗粒均诱导稳健的CD44上调(图3F)。较低剂量的颗粒生成了较高比例的CD62LloCD44hiTem细胞，其中2uL的LD和2uL的HD分别生成51％和36％Tem。Tem细胞的比率以剂量依赖性方式下降，但是所检查的全部培养物包含初始的Tcm和Tem细胞。
实施例4
内源性人T细胞应答的纳米-aAPC扩增
抗原-特异性前体T细胞以低频率、异源的外周血单核细胞(PBMC)群存在。因此免疫疗法最终取决于内源性前体的多克隆池的抗原-活性的CTL的扩增。
合成具有人HLA等位基因A2的抗-生物素铁-葡聚糖aAPC，所述等位基因加载有衍生自流感蛋白质M1(信号1)和抗-CD28(信号2)的免疫显性的T细胞表位。使用增加剂量的纳米-aAPC温育PBMC，并且两次连续的刺激后，通过四聚物染色评估抗原特异性T细胞扩增(图4)。
在刺激前，外周血中M1特异性前体频率较低，具有0.4％特异性CD8+PBMC(图4A，顶部行)。使用纳米-aAPC温育一(中间行)或二(底部行)周导致抗原特异性T细胞的百分比中剂量依赖性增加。这些数据概括于图4B中。最高剂量(300uL)的纳米-aAPC一周后诱导了最多至44％的抗原特异性T细胞或两周后诱导了80％(左图片)。这与抗原特异性T细胞(右图片)的总量中的剂量依赖性增加相关，其中以最高颗粒剂量，一周后最高扩增150倍并且两周后扩增800倍。因此，纳米-aAPC诱导了较小的内源性前体群体中较大的抗原特异性T细胞群。
实施例5
量子点纳米-aAPC
为了评估在甚至更小的标度的基于纳米-aAPC的刺激并且表明纳米-aAPC不是平台-排他性的，我们从LifeTechnologies获得可商购获得的量子点芯，抗生物素蛋白涂覆的纳米晶体，其直径小于20nm。生物素标记的二聚Db-GP100(信号1)和抗-CD28抗体(信号2)以1:1摩尔比结合到纳米晶体表面以形成量子点(量子点)纳米-aAPC(图5A)。
量子点aAPC诱导体外剂量依赖性的抗原特异性T细胞扩增(图5B)。在评估的最高剂量，7天后T细胞扩增14.6倍，而使用非同源对照量子点aAPC刺激的T细胞未扩增。
实施例6
体内纳米-aAPC原癌性排斥
选择黑素瘤的皮下小鼠模型以表现对于免疫疗法当直接体内注射时纳米级aAPC的功效。为了评估量子点-aAPC，将初始TCR转基因pMELCTL过继性地转移到野生型B6小鼠，并且在相同日期，使用皮下注射到右侧的B16黑素瘤细胞攻击小鼠，(图6A，顶部)。第二天，使用20uL的同源的量子点aAPC或20uL的非同源量子点aAPC或PBS作为对照注射小鼠。单次注射量子点aAPC显著地衰减肿瘤生长(图6A，底部)。16天后，使用T细胞和同源的量子点aAPC处理的小鼠具有最小的肿瘤负荷，其中平均肿瘤尺寸为22.1mm22.3，相比于使用T细胞+非同源的aAPC处理的小鼠的平均肿瘤尺寸为111.1mm2+/-29.4，仅使用T细胞的为141.1mm2+/-9.6，以及未处理过的小鼠的为133.1mm2+/-7.6。在实验的过程中肿瘤的生长概括为曲线下面积(AUC)。通过AUC,使用同源的量子点-aAPC处理的小鼠比使用对照非同源aAPC处理的小鼠(373.6mm2+/-227.0)具有显著地较少的(p＝0.028)总体肿瘤生长(33.1mm2+/-7.8)。
如先前所述，纳米-aAPC运输到淋巴结中肿瘤或T细胞池的能力可为纳米-aAPC免疫疗法的重要优势。颗粒施用的途径可能影响珠的运输；例如，皮下沉积的珠可经由淋巴排出到淋巴结(30)。为了测试aAPC施用的途径的影响以及铁-葡聚糖aAPC的体内功效，在pMEL过继性转移后三天，静脉内或皮下注射颗粒。四天后，将B16肿瘤皮下注射到右侧面上，并且肿瘤后四天，在同侧面静脉内或皮下施加aAPC的第二次注射。因此，存在三个处理组：接受两次iv珠注射的小鼠、接受一次iv和一次sc注射的小鼠和接受两次sc注射的小鼠(图6B，顶部)。使用非同源aAPC注射的对照小鼠接受一次iv和一次sc注射。
全部三个处理组比使用对照珠注射的小鼠具有更少的肿瘤生长(图6B，底部)。16天后，使用一次sc和一次iv注射处理(sc/iv)的小鼠显示了最少的肿瘤生长(48.0mm2+/-31.16)，之后是sc/sc处理的(73.7mm2+/-37.44)，iv/iv处理的(89.4mm2+/-69.5)，未处理的(88.4mm2+/-17.8)和非同源性处理的(113mm2+/-39.4)。在实验的整个过程中，sc/iv处理的小鼠(AUC52.6mm2+/-29.7)和sc/sc小鼠(AUC73.1mm2+/-36.1)显示了比对照小鼠(AUC162.7mm2+/-77.6)显著较少的(p<0.02)肿瘤生长。使用两次IV注射的小鼠比对照具有更少的肿瘤(AUC103.0+/-86.1)，但未达到显著性阈值(p＝0.19)。因此，使用至少一个剂量的皮下递送的纳米-aAPC处理的小鼠比对照具有显著更少的肿瘤。
实施例7
初始T细胞的刺激
使用生物物理学MHC-Ig脱离速率试验，相比于活性T细胞，纳米-aAPC更容易地与初始T细胞分离，这表明纳米-aAPC与初始细胞之间的接触(8-10)比与活化细胞更少(16-20)。因为认为诱导的TCR聚集(Lillemeier等人NatureImmunology11,90–96,2010)和膜识别(James等人，Nature487,64–69,2012)驱动T细胞活化，因此对于刺激初始T细胞，纳米-aAPC比微-aAPC更不有效并不奇怪。以等同剂量的6ngMHC-Ig/100,000T细胞，纳米-aAPC刺激初始和记忆细胞的混合群体，而不是仅初始细胞，而微-aAPC可等同地刺激两个群体(图7A)。如果纳米-颗粒的剂量增加六倍(数据未示出)，则纳米-aAPC能够诱导初始T细胞激活。当滴定剂量的纳米-和微-aAPC以在活化的细胞中诱导等同的17倍扩增，微-而不是纳米-aAPC以那个剂量诱导初始细胞扩增(图7B)。
然而，最佳T细胞免疫疗法可能需要激活初始T细胞以避免免疫竭染(Besser,ClinicalCancerResearch16,2646–55,2010)。因此，我们使用两种方法以增强纳米-aAPC介导的初始细胞的激活。我们首先假设富集抗原特异性前体将增加免疫-刺激细胞因子诸如可用于激活的T细胞的IL-7和IL-15的量，从而促进aAPC介导的激活。在4℃，顺磁性的纳米-aAPC结合到野生型T细胞，然后在磁性柱上使用阳性选择进行富集(图8A)。这导致激活后七天，Kb-TRP2特异性T细胞群的扩增(图8B)。我们认为这是对可同时富集和激活T细胞的aAPC的第一描述。
然后，我们探索使用磁体-诱导的珠聚集以增强TCR聚集和触发激活。以纳米-aAPC不触发初始T细胞的扩增的低剂量，磁场中的T细胞激活将显著增殖优势赋予到PMELT细胞(图8C)。磁体-增强的激活需要在磁场中温育至少30分钟(数据未示出)，并且对由MiltenyiBiotec出售的钕圆盘磁体和磁性富集柱两者均有效。这表明了用于增强T细胞激活的新型方法，并且表明不仅可使用纳米-aAPC直接通过TCR-MHC相互作用，还可通过通过磁体控制纳米-aAPC，激活T细胞。这在这个尺度下取决于TCR-颗粒相互作用，并且对较大的aAPC是不可行的。重要地，纳米-aAPC必须提供信号1、信号2和用于磁性促进的顺磁性芯，从而使这成为用于过继性免疫疗法的先前初始T细胞的扩增的独特且新型的试剂。
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实施例8.实施例9-13的材料和方法
小鼠和试剂。通过在C57/BL6背景上培育，将2CTCR转基因小鼠保持为杂合子。PmelTCR/ThylaRag-/-转基因小鼠得自NicholasRestifo(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD)并且将其保持为杂合子。C57BL/6j小鼠是自杰克逊实验室(BarHarbor，ME)购买。根据约翰-霍普金斯大学的机构审查委员会(InstitutionalReviewBoard)保持所有小鼠。荧光标记的单克隆抗体购自BioLegend(SanDiego,CA)。
制备MHC-Ig二聚体和纳米-aAPC。使用肽制备并且加载可溶的MHC-Ig二聚体、Kb-Ig和Db-Ig，如所述，8参见补充方法。通过将MHC-Ig二聚体和抗-CD28抗体(37.51；BioLegend)直接缀合到MACS微珠(MiltenyiBiotec)来制备纳米-aAPC，如所述。3通过荧光测量结合到纳米颗粒的蛋白质，如补充方法中所述。
体外细胞扩增。从均质的小鼠脾和淋巴结获得细胞，之后进行RBC的低渗裂解。使用MiltenyiBiotec(Cologne,Germany)的CD8无接触分离试剂盒和磁性富集柱分离细胞毒性淋巴细胞。将CD44-生物素抗体添加到初级混合物以分离CD44lo，初始细胞。在适用情况下，在37℃使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)将细胞标记15分钟，然后充分洗涤。
混合指明剂量的CD8+T细胞和纳米-aAPC，并且在补充有T细胞因子(TF)的完整的RPMI培养基从刺激的人PBMC收获的条件培养基的细胞因子富集混合物中，在24孔平底或96孔圆底平板中培养4-7天。46指明处，将培养板固定在长度在1/4和3/4英寸之间的NeodyniumN52圆盘磁体(K&JMagnetics,Jamison,PA)之间。在指明的时间点，使用BDFacsCalibur流式细胞计数器测量CFSE荧光并且在FlowJo(TreeStar)中分析。刺激后七天，通过细胞计数评估扩增倍数。激活后七天，通过使用400nM荧光标记的MHC-Ig二聚体染色评估内源性的抗原特异性细胞的扩增的扩增。
颗粒结合试验。对于平衡颗粒结合试验，在4℃，以107细胞/ml的浓度在FACS洗涤缓冲液(PBS+2％FCS+.05％叠氮化钠)中温育CD8+T细胞。将30μl细胞的等分试样与不同浓度的具有荧光标记的MHC-Ig二聚体的纳米颗粒混合60-90分钟。洗涤后，通过流式细胞计数器测量细胞-结合的荧光，并且使用FlowJo计算MCF(平均通道荧光)。
对于颗粒脱离速率结合试验，细胞和饱和剂量的纳米颗粒或可溶的MHC-Ig二聚体结合到稳定状态，如上所述。在时间0测量MCF，之后添加过量的克隆型1B2封闭抗体以防止再结合。在指明的时间点测量MCF，并且在GraphPadPrism(LaJolla,CA)中计算有效脱离速率的指数级衰减。如表2中所述，评估细胞-颗粒接触。
显微镜法。在4℃，T细胞结合到纳米-aAPC，持续60分钟。在存在或不存在由钕N52圆盘磁体生成的磁场的情况下，在37℃，细胞随后转移到96孔板。在30分钟后，洗涤细胞并且在4℃，使用Alexa488抗-LFA1、单克隆PE抗-小鼠IgG1和Alexa647抗-CD3ε染色。洗涤样品，并且用2％多聚甲醛直接固定。图像在JohnsHopkinsSchoolofMedicineMicroscopyFacility以100x放大率在ZeissLSM510META(Zeiss,Oberkochen,Germany)激光扫描共聚焦上获得。使用写于ImageJ(NationalInstitutesofHealth)中的颗粒-检测算法，使用内置颗粒分析器测定CD3ε聚集尺寸。
制备MHC-Ig二聚体。如描述制备可溶性MHC-Ig二聚体，Kb-Ig和Db-Ig并装载肽(Schneck,J.P.；Slansky,J.E.；O’Herrin,S.M.；Greten,T.F.MonitoringAntigen-SpecificTCellsUsingMHC-IgDimers.Curr.Protoc.Immunol.2001,.第17章:第17.2单元)。简而言之，通过在碱性条件下(pH11.5)剥离，并且然后在50倍过量肽的存在下再次折叠，将Kb-Ig分子加载有肽。将Db-Ig分子在轻度的酸性条件下(pH6.5)下剥离，并在50倍摩尔过量的肽和2倍摩尔过量的人β2-微球蛋白的存在下再折叠(Chiu,Y.-L.；Schneck,J.P.；Oelke,M.HLA-IgBasedArtificialAntigenPresentingCellsforEfficientExVivoExpansionofHumanCTL.J.Vis.Exp.2011,1–5)。肽SIY(SIYRYYGL，合成；SEQIDNO:3)、SIIN(SIINFEKL，衍生自卵白蛋白；SEQIDNO:4)、GP100(KVPRNQDWL，来自黑素细胞GP100蛋白质；SEQIDNO:5)和ASN(ASNENMETH，来自流感A核蛋白质；SEQIDNO:6)购自Genscript(Piscataway,NJ)。通过尺寸排除高效液相色谱法(HPLC)在标记后测定蛋白质浓度。
微-aAPC合成。如先前所述(Oelke,M.；Schneck,J.P.OverviewofaHLA-IgBased“Lego-LikeSystem”forTCellMonitoring,ModulationandExpansion.Immunol.Res.2010,47,248–56)通过将蛋白质直接化学偶联到4.5μmDynal磁性微珠(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)构造微-aAPC。对于初始偶联步骤，将25μg抗-生物素抗体(Sigma,St.Louis,MO)添加到0.1M硼酸钠缓冲液中的1亿微珠。在磁性柱中洗涤后，添加以克分子数相等的量的生物素标记的MHC-Ig和CD28以形成aAPC。
纳米颗粒跟踪分析。使用配备有敏感CCD相机的NanosightLM10以通过NTA使纳米-aAPC的尺寸分布表征。将50μL稀释的纳米颗粒溶液加载到连接至405nm激光源的样品室中。使用NTA软件(版本2.0)记录包含散射质心(颗粒)的布朗运动跟踪的60s的影片。如所推荐，使用制造商推荐的自动设置和增益、模糊和亮度的手动调节来处理影片。在磷酸盐缓冲盐水中稀释纳米颗粒溶液以将样品浓度调节到5×1012颗粒mL-1。
微-aAPC显微镜法。使用微-aAPC温育T细胞，在1000RPM旋转1分钟以包络细胞和颗粒，并且在4℃温育60分钟。在存在或不存在由钕N52圆盘磁体生成的磁场的情况下，在37℃，随后将细胞转移到96孔板。在30分钟后，洗涤细胞并且在4℃，使用Alexa488抗-LFA1、单克隆PE抗-小鼠IgG1和Alexa647抗-CD3ε染色。洗涤样品，并且用2％多聚甲醛直接固定。图像在JohnsHopkinsSchoolofMedicineMicroscopyFacility以100x放大率在ZeissLSM510META(Zeiss,Oberkochen,Germany)激光扫描共聚焦上获得。使用写于ImageJ(NationalInstitutesofHealth)中的颗粒-检测算法，使用内置颗粒分析器测定CD3ε聚集尺寸。手动去除用于结合到颗粒的细胞的颗粒自动-荧光。
纳米-aAPC对体内T细胞扩增和皮下肿瘤生长的抑制的效应。使用磁性富集柱从pmel脾和淋巴结分离CD44lo，CD8+细胞，并且在存在或不存在磁场的情况下激活24小时，如上所述。将1×106Thy1.1+pmel细胞过继性地转移到B6Thy1.2+野生型宿主(n＝6只小鼠/组)。在过继性转移当天和第二天两者，使用30,000单元的腹膜内注射IL-2处理小鼠。在过继性转移后七天和二十天，处死三只小鼠/组，并且从外周血、脾和腹股沟、子宫颈和腋窝淋巴结分离淋巴细胞，并且使用抗-Thy1.1抗体染色。
如上进行肿瘤排斥实验，不同之处在于在T细胞过继性转移之前十天，皮下注射3x105B16黑素瘤细胞。在使用MSDNordionGammacell双Cs137源(JohnsHopkinsMolecularImagingCenter)进行过继性转移前一天，通过亚致死辐射(500cGy)诱导瞬态淋巴球减少，作为辐射诱发的淋巴细胞减少被认为是去除免疫抑制宿主细胞和减少嗜淋巴细胞细胞因子竞争，35并且显著地增强黑素瘤的免疫疗法在临床试验中的效应。36使用数显卡尺，每隔2天监测肿瘤生长，直到肿瘤尺寸为～150mm2，在该点对动物施无痛致死术。
实施例9.纳米-aAPC优先地刺激激活的T细胞
T细胞刺激需要两个激活信号，所述信号由内源性的APC：信号1，呈现在MHC的上下文中结合TCR的同源的抗原肽和信号2，一组调节T细胞应答的共刺激受体中的一个递送。22通过将嵌合MHC-Ig二聚体(信号1)和抗-CD28抗体(信号2)偶联到50-100nm顺磁性铁-葡聚糖纳米颗粒合成纳米-aAPC(图9A)，这是由于它们的广泛表征和生物相容性而将它们选择为纳米级颗粒平台。23通过使用针对感兴趣的蛋白质的荧光抗体标记来使偶联到颗粒的蛋白质表征(图13)。针对96±10和92±12蛋白质/μm2的蛋白质密度，纳米-aAPC分别呈现13±3MHC-Ig二聚体和12±5抗-CD28抗体/颗粒(表1)。
表1
微(细胞大小)和纳米-aAPC的表面上的MHC-Ig和抗-CD28的量和密度。如图13的说明中所述定量蛋白质，并且通过计数(微-aAPC)或纳米颗粒跟踪分析(纳米-aAPC)测定颗粒浓度。通过在合成期间改变每个颗粒蛋白质的量合成高(HD)和低(LD)密度颗粒。在无抗-CD28的情况下合成信号1纳米颗粒。
为了比较初始T细胞对先前激活的T细胞的刺激，我们使用从pmelTCR或2CTCR转基因小鼠分离的CD44耗尽的初始CD8+脾细胞(图14A)。这种技术允许我们分离具有所定义的抗原特异性的真正的初始T细胞，而我们先前的工作3和其他24、25的工作取决于存在于转基因小鼠中的CD44阴性和CD44高、初始和记忆细胞的混合群体。激活的细胞由通过使用可溶肽刺激CD8+脾细胞七天生成，GP100针对pmelT细胞和SIY针对2CT细胞。
使用呈现8ng总MHC-Ig的低剂量的纳米-aAPC刺激后三天，如通过CFSE，通过每个细胞分裂稀释的活体染料所测量，初始pmelT细胞未增殖(图9B，左)。然而，以相同的剂量，激活的细胞稳健增殖(图9B，右)。纳米-aAPC滴定表明，针对纳米-aAPC-诱导的增殖，初始细胞比激活的细胞(少于1.5ng的总MHC-Ig)具有更高的阈值(8-10ng的总MHC-Ig)(图9C)。
作为aAPC尺寸的对照，我们评估由细胞大小的4.5μm直径的铁-葡聚糖微-aAPC所诱导的T细胞增殖。微-aAPC比纳米-aAPC诱导了更低剂量的初始T细胞增殖(1.5-8ngMHC-Ig)，如通过CFSE稀释在第3天所测量(图14B)，其中在第7天具有约10-20倍的扩增(图14C)。
因此，虽然激活的细胞等同地应答了纳米-aAPC和微-aAPC，但对于基于纳米-aAPC的刺激，初始细胞具有较高的阈值。这种差异不是由微和纳米-aAPC之间蛋白质密度的差异所驱动，因为当对于总MHC-Ig进行归一化时，相比于基于纳米颗粒的aAPC具有较高密度(HD)和较低密度(LD)的微-aAPC诱导了相同的增殖(图14D和图14E)。因为应答对颗粒大小敏感，我们假设应答的差异是由于初始细胞对激活的细胞上纳米颗粒相互作用与TCR纳米聚集的差异。
实施例10.纳米-aAPC在激活时比初始细胞结合更多的TCR
为检查结合到TCR的纳米颗粒，我们合成仅具有MHC-Ig的纳米颗粒，因此去除抗-CD28的结合作用。在初始和激活的T细胞上进行结合实验，所述细胞特异性地结合具有同源的MHC-Ig和低背景的纳米颗粒(图7A)。
纳米颗粒结合到初始和激活的细胞至平衡，之后添加抗-克隆型1B2封闭抗体以防止再结合。纳米颗粒表现出相比于从激活的细胞(984s±221)，从初始细胞解离更快(531秒±149的半衰期)(p<0.02通过配对学生t检验)(图9D，表2)。
表2
A通过温育使用APC-标记MHC-Ig的初始或激活的2CTCR转基因T细胞或仅具有Kb-SIY的APC-标记的纳米颗粒进行脱离速率实验。在4℃温育一小时后，洗涤细胞，进行时间0的荧光测量，并且添加1B2，抗-克隆型抗体防止再结合。然后每隔2-10分钟重复荧光测量。从GraphPadPrism中一维指数拟合计算脱离速率。
B半衰期来源于柱A中的脱离速率。结合到激活的细胞的颗粒比结合到初始细胞的颗粒具有显著更长的半衰期(**p<0.02通过配对t检验，其中通过实验配对测量)。针对每种条件，进行三个实验。
C二聚体或颗粒上单个MHC-Ig的不结合可随机建模为泊松(又叫做无记忆或指数)过程。对于具有速率常数r的泊松过程，第n事件的出发时间通过具有形状参数n和单个-事件速率参数r的γ分布来表征：
此分布的平均值E[t]＝n/r。如果假定MHC-Ig二聚体与初始T细胞有一个接触(Fahmy,T.M.；Bieler,J.G.；Edidin,M.；Schneck,J.P.IncreasedTCRAvidityafterTCellActivation:aMechanismforSensingLow-DensityAntigen.Immunity2001,14,135–43)，则可从初始细胞上MHC-Ig的脱离速率(8.9×10-3)评估r。因此，针对任何给定条件，E[t]来源于初始或活性细胞上MHC-Ig二聚体或颗粒的半衰期(t1/2)，并且假定r为常数。将TCR-MHC接触的数目评估为n：
n = t 1 / 2 * r ln ( 2 )
接触的真实数目可能比此评估值高，因为MHC-Ig可能与初始细胞发生一次以上的接触。
可使用脱离速率评估细胞和多价配体之间接触数，其中接触越多，解离越慢。26将纳米颗粒从细胞的解离建模为指数随机过程，其中使用可溶MHC-Ig二聚体的解离得到参数和验证该方法(详情参见表2)。针对结合到初始细胞的可溶MHC-Ig二聚体，测量单个TCR-MHC接触的脱离速率(图7C)，其有效地为单价。13可以预知，MHC-Ig二聚体从激活的细胞脱离得更缓慢，评估产生1.7接触(图9E)，符合先前记录。13,26
纳米颗粒从初始细胞的脱离显著地慢于游离的MHC-Ig(图7C)，并且从激活的细胞脱离比从初始细胞脱离慢2倍。因此相比于激活的细胞上约双倍(12.6)的接触，估计纳米-aAPC与初始细胞产生6.8接触(图9E，表2)。这些数代表11％和22％的MHC-Ig二聚体分别附接到纳米-aAPC的表面。
在宽泛的颗粒浓度范围中，在平衡时，激活的细胞比初始细胞结合少于两倍的纳米颗粒(图9F)。这种差异不是由T细胞受体表达引起，其在初始和激活的T细胞上是等同的(图7B)，从而指明每个颗粒增加的TCR-MHC接触导致更少可用的TCR，从而抑制结合并且限制结合到相同单个聚集的纳米颗粒的总量。
总而言之，总纳米-aAPC结合两倍的增加和由初始细胞接合的TCR-MHC接触的两倍的降低表明了图9G中示意性地示出的结合模型。在细胞-纳米颗粒接触之前，由于TCR聚集的尺寸较小，使用更少的MHC接触，初始细胞结合更多的纳米-aAPC。与之相反，激活的细胞结合更少的纳米颗粒，因为每个颗粒与更多的TCR接触。
实施例11.磁场驱动aAPC和TCR/CD3的聚积
基于纳米-aAPC结合到纳米级TCR聚集的假说，我们利用了纳米颗粒结合到对照TCR聚集聚积并且从而激活T细胞的优势。使用外源磁场驱动结合到初始细胞的顺磁性纳米-aAPC的聚积。在4℃，纳米-aAPC结合到初始T细胞，然后在37℃在生成最大0.2T场强的两个钕圆盘磁体之间培育以测定在外部磁场中，顺磁性铁-葡聚糖aAPC是否将磁性地极化和并且彼此吸引，27从而驱动TCR的聚积(图10A-C)。
通过共焦显微镜法评估簇的形成。在4℃结合一个小时后，我们直接染色并且固定细胞(时间0)，或在存在或不存在磁场的情况下将细胞转移到37℃的培养箱中30分钟。然后使用针对LFA-1(绿色)的抗体将细胞染色，将粘附分子用作对照；CD3ε(洋红)，与TCR相关联的信号组分；和MHC-Ig(红色)以使纳米-aAPC可视化。最后，固定细胞并且成像。
在37℃温育之前，aAPC和CD3ε以点状图案分布在膜上，其中小簇漫射地分布在细胞表面上(时间0，图10D，上部左边)。LFA-1均匀地分布在细胞上。LFA-1和CD3ε染色图案与使用非同源Kb-SIINF颗粒温育30分钟后时间0的那些图案相同(非同源，图10D上部右边)。不存在磁场时，使用同源的纳米-aAPC温育不会激烈地改变LFA-1、aAPC或CD3ε的分布(非磁体，图10D，底部左边)。然而，在磁场中30分后，在膜上形成大的纳米-aAPC的聚积(磁体，图10D，底部右边)。纳米-aAPC的这些簇与类似尺寸的CD3ε簇共同定位。对照分子LFA-1在膜上保持漫射图案，表明CD3ε聚积是由它与aAPC的缔合引起的。
为了表征由aAPC诱导的聚积的尺寸和数目，在ImageJ中开发颗粒-鉴定程序。所述程序能够鉴定时间0细胞的漫射的点状簇(图10E左)和由磁场诱导的较大的聚积(图10E右)。
磁场中的温育显著地增加了TCR聚积，超过仅使用纳米-aAPC温育后所见到的，并且在细胞上产生更大的CD3复合物聚积。在37℃温育之前，平均簇面积为0.30±0.03μm2，并且这在使用非同源纳米-aAPC温育后未改变(图10F)。仅aAPC将簇的尺寸增加到0.52±0.06μm2的平均值(p<0.001)。聚集在磁场中进一步增强到0.73±0.11μm2的平均尺寸(p<0.001，相比于无磁体)。使用磁场，时间0处每个细胞的簇的平均数目从6.5±0.6降低到3.0±0.2(图10G)。在磁场中培养后的纳米-aAPC解离速率未增大(图7F)，表明聚集体的形成不与TCR/MHC接触的增加相关，而与结合到aAPC的TCR纳米簇的聚集相关。
还使用微-aAPC研究了外部磁场的影响(图8A)。当施加磁场驱动微-aAPC聚积时，微-aAPC的聚积不与细胞上TCR/CD3的聚积相关。当在不存在磁场使用微-aAPC温育时，T细胞上的CD3簇的面积为0.39±0.03μm2，和在磁场的存在下使用微-aAPC时为0.37±0.03μm2(图8B-C)，表明当使用微-aAPC刺激T细胞时磁场未增强CD3簇。这可能是因为相对于TCR纳米簇，微颗粒的尺寸大。
概括地说，由磁场诱导的纳米-aAPC而不是微-aAPC聚积体导致TCR/CD3聚积体尺寸增加2倍并且每个细胞聚积体的数目降低了2倍。因为已知针对T细胞激活，受体聚积体是强且足够的信号，28我们检查了磁体-诱导的TCR簇对T细胞增殖的效应。
实施例12.磁场中的激活增强了初始T细胞的增殖
为了评估通过纳米-aAPC的T细胞的激活是否通过磁场中的培养得到增强，使用增加剂量的Db-GP100纳米-aAPC温育CFSE-标记的pmelT细胞并且在有或没有外部磁场的情况下培养。初始T细胞以另外纳米-aAPC诱导最小增殖的剂量在磁场中增殖(图11A)。在使用具有5ngMHC-Ig的纳米-aAPC温育后，相比于磁场中89％的细胞，培养基中29％的细胞增殖。第7天增殖比磁体对照最多高达4倍(图11B)。不具有纳米-aAPC的磁场中的培养基不导致T细胞增殖。
相比之下，相比于无磁体对照，磁场中具有微-aAPC的培养基不增强T细胞扩增，如通过第3天CFSE稀释和第7天增殖两者所测量(图8D-E)。
先前已使用磁性珠聚集研究机械应力29和其他系统中受体聚集21,27两者的效应，并且已指出TCR的机械触发的作用。30,31然而，因此磁场中的微-aAPC可能比纳米-aAPC传输更大的机械力，但不诱导TCR聚积或增强增殖，通过纳米-aAPC观察到的磁体-增强的增殖效应可能是因为受体聚积而不是机械受体“牵拉”。
通过添加和去除变化尺寸的钕磁体，评估通过纳米-aAPC的最佳扩增需要的磁场刺激的持续时间和强度。一周后，磁场中一至三小时(图11C-11D)和0.2T或更多的场强(图11E-3F；图13)驱动T细胞扩增10倍。
磁场增强了aAPC刺激，还增强了内源性的多克隆T细胞群的抗原特异性T细胞的扩增。我们合成具有加载有Trp2肽的Kb-Ig二聚体的纳米-aAPC，其对Trp2黑素瘤抗原是特异性的。使用限制剂量的aAPC培养野生型B6小鼠的CD8+脾细胞并且在七天后分析抗原特异性T细胞。在此剂量，仅纳米-aAPC扩增产生0.70％Trp2特异性细胞，如通过比较同源的Kb-Trp2结合与非同源Kb-SIINF结合所测定(图11G)。然而，当在磁场中使用T细胞温育时，单周后，aAPC生成约3.4％抗原特异性T细胞(图11G)。这导致从磁场中10x106前体细胞池产生的约37,000±3,900Trp-2特异性细胞，相比于在没有磁场的情况下6700±630(约5.5倍差值，p<0.01通过学生t检验)。估计CD8前体频率为大约10-800/1000万，32这表明在具有磁场的情况下培养基中450至3,600倍的扩增，相当于在体内病毒感染所观察到的1000倍前体扩增。33
实施例13.磁场增强用于过继性免疫疗法的T细胞激活
增强抗原特异性细胞的刺激的可能使得我们在体内过继性转移之前，研究磁场增强的aAPC刺激。在存在或不存在磁场的情况下，使用aAPC体外激活Thy1.1+pmelT细胞并且过继性地转移到野生型Thy1.2+接受小鼠(参见示意图12A)。过继性转移后七或二十一天，处死小鼠并且评估过继性地转移的Thy1.1+细胞。
磁场增强的纳米-aAPC刺激导致转移的T细胞群的稳健扩增。第7天，对于在磁场中刺激的T细胞，脾中3.1％的T细胞是Thy1.1+，相比于使用aAPC但无磁场刺激的细胞为0.6％，和在过继性转移之前未受刺激的未处理过的T细胞仅为0.2(p<0.01，图12B-C)。第7天，在脾中观察到最大百分比的细胞(图12C)。第7天，对于磁场增强的组，所检查的全部器官中总Thy1.1+细胞达到约1×106(图12D)，相比于无磁体组的少于2×105。这种5倍的增强大体符合体外观察到的增强。虽然第21天观察到更少的细胞时，但由aAPC在磁场激活的T细胞在淋巴结中建立了可检测的群体(0.15％)，相比于仅由aAPC激活的T细胞为0.04％和完全未受刺激的细胞为0.01％(p<0.05，图12B-D)。
通过处理B16黑素瘤，对免疫排斥具有高阈值的不佳免疫原性肿瘤，研究磁场增强的T细胞刺激的功能结果。34肿瘤注射后十天，将PmelT细胞过继性地转移到具有建立的皮下B16肿瘤的小鼠(图12E)并且在过继性转移前一天，通过小鼠的亚致死辐射(500cGy)诱导瞬态淋巴球减少，如过继性免疫疗法的每个标准方法。35,36
相比于未处理的对照，仅T细胞和在没有磁场的情况下由aAPC刺激的T细胞，由aAPC在磁场激活的肿瘤-特异性T细胞强效地抑制肿瘤生长(p<0.0001，双向ANOVA处理的效应，图12F)。第18天，使用磁场增强的T细胞处理的小鼠比未处理过的或无磁体T细胞处理的小鼠的肿瘤小8至10倍。相似地，磁场增强的T细胞显著地改善了宿主存活率，其中6/8小鼠存活并且注射后28天，4/8不具有可检测的肿瘤(p<0.001，Mantel-Cox，图12F)。
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Claims (87)

1.一种纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)，其包含：
纳米颗粒；
至少一种在所述纳米颗粒的表面上的淋巴细胞影响分子；和
至少一种在所述纳米颗粒的所述表面上的分子复合物，所述复合物当结合到抗原时，接合抗原特异性淋巴细胞受体受体。
2.根据权利要求1所述的纳米-aAPC，其中所述纳米颗粒的直径为50-100nm。
3.根据权利要求1所述的纳米-aAPC，其中所述纳米颗粒是量子点。
4.根据权利要求1所述的纳米-aAPC，其中所述纳米颗粒是顺磁性的。
5.根据权利要求1所述的纳米-aAPC，其中所述纳米颗粒是可生物降解的。
6.根据权利要求1所述的纳米-aAPC，其中所述纳米颗粒包含塑料。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的纳米-aAPC，还包含交联抗体或寡聚分子。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种淋巴细胞影响分子是T细胞影响分子，并且其中所述分子复合物包含至少一个抗原结合槽的抗原呈递复合物。
9.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种抗原呈递复合物包含MHCI类肽结合槽。
10.根据权利要求9所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种抗原呈递复合物是MHCI类分子。
11.根据权利要求9所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种抗原呈递复合物是包含至少两种融合蛋白的MHCI类分子复合物，其中第一融合蛋白包含第一MHCI类α链和第一免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二MHCI类α链和第二免疫球蛋白重链，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链缔合以形成所述MHCI类分子复合物，其中所述MHCI类分子复合物包含第一MHCI类肽结合槽和第二MHCI类肽结合槽。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种抗原呈递复合物包含MHCII类肽结合槽。
13.根据权利要求12所述的纳米-aAPC，其中所述抗原呈递复合物是MHCII类分子。
14.根据权利要求12所述的纳米-aAPC，其中所述抗原呈递复合物是包含至少四种融合蛋白的MHCII类分子复合物，其中：
(a)两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)MHCII类β链的细胞外结构域；和
(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)MHCII类α链的细胞外结构域，
其中所述两种第一和所述两种第二融合蛋白缔合形成所述MHCII类分子复合物，其中所述每种第一融合蛋白的所述MHCII类β链的细胞外结构域和所述每种第二融合蛋白的所述MHCII类α链的细胞外结构域形成MHCII类肽结合槽。
15.根据权利要求14所述的纳米-aAPC，其中所述免疫球蛋白重链包含可变区。
16.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中抗原肽结合到所述至少一个抗原结合槽。
17.根据权利要求16所述的纳米-aAPC，其中所述抗原肽选自肿瘤-相关的抗原的肽、自身抗原的肽、同种异型抗原的肽和传染剂抗原的肽。
18.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其包含至少两种抗原呈递复合物。
19.根据权利要求18所述的纳米-aAPC，其中相同的抗原结合到所述至少两种抗原呈递复合物的每个抗原结合槽。
20.根据权利要求18所述的纳米-aAPC，其中不同的抗原结合到所述至少两种抗原呈递复合物的每个抗原结合槽。
21.根据权利要求18所述的纳米-aAPC，其中第一抗原呈递复合物包含至少一个MHCI类肽结合槽，并且其中第二抗原呈递复合物包含至少一个MHCII类肽结合槽。
22.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种抗原呈递复合物是非典型MHC样分子。
23.根据权利要求22所述的纳米-aAPC，其中所述非典型MHC样分子是CD1家族成员。
24.根据权利要求23所述的纳米-aAPC，其中所述非典型MHC样分子选自CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e。
25.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞影响分子是T细胞共刺激分子。
26.根据权利要求25所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞共刺激分子选自CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134(OX-40L)、B7h(B7RP-1)、CD40、LIGHT、特异性结合到CD28的抗体、特异性结合到HVEM的抗体、特异性结合到CD40L的抗体、特异性结合到OX40的抗体和特异性结合到4-1BB的抗体。
27.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞影响分子是粘附分子。
28.根据权利要求27所述的纳米-aAPC，其中所述粘附分子选自ICAM-1和LFA-3。
29.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞影响分子是T细胞生长因子。
30.根据权利要求29所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞生长因子选自细胞因子和超抗原。
31.根据权利要求29所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞生长因子是细胞因子，并且所述细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和γ干扰素。
32.根据权利要求29所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞生长因子选自：
(A)包含至少两种融合蛋白的第一分子复合物，其中第一融合蛋白包含第一细胞因子和免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二细胞因子和第二免疫球蛋白重链，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链缔合以形成所述第一分子复合物；和
(B)包含至少四种融合蛋白的第二分子复合物，其中：
(a)两种第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重链和(ii)第一细胞因子；并且
(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)第二细胞因子,
其中所述两种第一和所述两种第二融合蛋白缔合以形成所述第二分子复合物。
33.根据权利要求32所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞生长因子是所述第一分子复合物。
34.根据权利要求32所述的纳米-aAPC，其中所述第一和第二细胞因子是相同的。
35.根据权利要求32所述的纳米-aAPC，其中所述第一和第二细胞因子是不同的。
36.根据权利要求33所述的纳米-aAPC，其中所述T细胞生长因子是所述第二分子复合物。
37.根据权利要求36所述的纳米-aAPC，其中所述第一和第二细胞因子是相同的。
38.根据权利要求36所述的纳米-aAPC，其中所述第一和第二细胞因子是不同的。
39.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞影响分子是调节T细胞诱导分子。
40.根据权利要求39所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种调节T细胞诱导分子选自TGFβ、IL-10、干扰素-α和IL-15。
41.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞影响分子是细胞凋亡诱导分子。
42.根据权利要求41所述的纳米-aAPC，其中所述细胞凋亡诱导分子选自毒素、TNFα和Fas配体。
43.根据权利要求8所述的纳米-aAPC，其包含至少两种不同的T细胞影响分子。
44.一种纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)，其包含：
纳米颗粒；
至少一种在所述纳米颗粒的表面上的B细胞影响分子；和
至少一种在所述纳米颗粒的所述表面上的分子复合物，所述分子复合物接合B细胞表面免疫球蛋白或B细胞表面上的MHC-抗原复合物。
45.根据权利要求44所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种B细胞影响分子是CD40配体。
46.根据权利要求44所述的纳米-aAPC，其中所述分子复合物是T细胞受体(TCR)。
47.根据权利要求44所述的纳米-aAPC，其中所述分子复合物是包含至少四种融合蛋白的TCR分子复合物，其中：
(a)两种第一融合蛋白包含(i)TCRα链或TCRγ链；且
(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)TCRβ链或TCRδ链的细胞外结构域，其中如果所述两种第一融合蛋白包含所述TCRα链，则所述两种第二融合蛋白包含所述TCRβ链，并且其中如果所述两种第一融合蛋白包含所述TCRγ链，则所述两种第二融合蛋白包含所述TCRδ链，
其中所述两种第一和所述两种第二融合蛋白缔合以形成所述TCR分子复合物，其中每种第一融合蛋白的所述TCRα或γ链的所述细胞外结构域和每种第二融合蛋白的所述TCRβ或δ链的所述细胞外结构域形成TCR抗原结合槽。
48.一种纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)，其包含：
纳米颗粒；
至少一种在所述纳米颗粒的表面上的T细胞共刺激分子；和
至少一种在所述纳米颗粒的所述表面上的MHCI类分子复合物，其中所述至少一种MHCI类分子复合物包含至少两种融合蛋白，其中第一融合蛋白包含第一MHCI类α链和第一免疫球蛋白重链，并且其中第二融合蛋白包含第二MHCI类α链和第二免疫球蛋白重链，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链缔合以形成所述MHCI类分子复合物，其中所述MHCI类分子复合物包含第一MHCI类肽结合槽和第二MHCI类肽结合槽。
49.根据权利要求48所述的纳米-aAPC，其中所述至少一种T细胞共刺激分子是特异性地结合CD28的抗体。
50.一种制剂，其包含许多根据权利要求1-49中任一项所述的纳米级人工抗原呈递细胞(纳米-aAPC)。
51.根据权利要求50所述的制剂，其还包含药学上可接受的载体。
52.一种诱导形成抗原特异性T细胞的方法，其包括：
接触分离的制剂，所述制剂包含许多带有至少一种根据权利要求8所述的第一纳米-aAPC的前体T细胞，其中抗原结合到所述抗原的结合槽，从而诱导所述许多前体T细胞的成员形成包含识别所述抗原的抗原特异性T细胞第一细胞群，其中如果使用包含特异性结合到CD3的抗体但不包含抗原呈递复合物的纳米-aAPC温育前体T细胞，那么抗原特异性T细胞在所述第一细胞群中的数目或百分比大于所形成的抗原特异性T细胞的数目或百分比。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞是细胞毒性T细胞。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞是辅助T细胞。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞是调节T细胞。
56.根据权利要求52所述的方法，其进一步包括从所述第一细胞群分离所述抗原特异性T细胞。
57.根据权利要求52所述的方法，其进一步包括用至少一种根据权利要求7所述的第二纳米-aAPC温育所述第一细胞群，其中抗原结合到所述颗粒的所述抗原结合槽，其中进行足以形成包含相对于抗原特异性T细胞在所述第一细胞群中的数目或百分比,抗原特异性T细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的所述温育。
58.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原是相同的。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗原是不同的。
60.根据权利要求52所述的方法，其中所述分离的制剂与至少两种第一纳米-aAPC接触，其中不同的抗原结合到所述第一纳米-aAPC中的每一种。
61.一种增加抗原特异性T细胞在细胞群中的数目或百分比的方法，其包括：
用至少一种根据权利要求8所述的第一纳米-aAPC温育包含抗原特异性T细胞的第一细胞群，其中抗原结合到所述抗原结合槽，其中进行足以形成包含相对于抗原特异性T细胞在所述第一细胞群中的数目或百分比，抗原特异性T细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的所述温育。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述第一细胞群是同质细胞群。
63.根据权利要求62所述的方法，其进一步包括向患者施用所述抗原特异性T细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述患者患有癌症、自身免疫疾病、传染病或受到免疫抑制。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述前体T细胞从所述患者获得。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述前体T细胞从非所述患者的供体获得。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞通过选自静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴管内施用和瘤内施用的施用途径施用。
68.根据权利要求61所述的方法，其进一步包括向所述患者施用所述第二群体的所述抗原特异性T细胞。
69.一种调节患者中免疫应答的方法，其包括：
向患者施用制剂，其包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体，其中所述许多颗粒的成员包含：
(1)至少一种T细胞影响分子；和
(2)至少一种抗原呈递复合物，其中所述至少一种抗原呈递复合物包含至少一个抗原结合槽，其中抗原结合到所述至少一个抗原结合槽。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述至少一种T细胞影响分子选自(1)细胞凋亡诱导分子，(2)调节T细胞诱导分子，(3)T细胞共刺激分子，(4)粘附分子，和(5)T细胞生长因子。
71.一种抑制患者中免疫应答的方法，其包括以下步骤：
向患者施用制剂，其包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体，其中所述许多颗粒的成员包含：
(1)至少一种细胞凋亡诱导分子；和
(2)至少一种抗原呈递复合物，其中所述至少一种抗原呈递复合物包含至少一个抗原结合槽，其中抗原结合到所述至少一个抗原结合槽。
72.一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法，其包括以下步骤：
使包含许多前体B细胞的分离的制剂与至少一种根据权利要求44所述的第一纳米-aAPC接触，从而诱导所述许多前体B细胞的成员以形成包含产生特异性结合到所述抗原肽的抗体的抗体-产生B细胞的第一细胞群。
73.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括从所述第一细胞群分离产生所述抗体的所述B细胞。
74.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括用至少一种根据权利要求43所述的第二纳米-aAPC温育所述第一细胞群，其中进行足以形成包含相对于抗体-产生B细胞在所述第一细胞群中的数目或百分比，抗体-产生B细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的所述温育。
75.一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法：
用至少一种根据权利要求44所述的第一纳米-aAPC温育包含抗体-产生B细胞的第一细胞群，其中进行足以形成包含相对于抗体-产生B细胞在所述第一细胞群中的数目或百分比，抗体-产生B细胞的数目或百分比增加的第二细胞群的时间段的所述温育。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述第一细胞群是同质细胞群。
77.一种增加抗体-产生B细胞在群体中的数目或百分比的方法，其包括以下步骤：
使包含许多前体B细胞的分离的制剂与根据权利要求44所述的制剂接触，从而诱导所述许多前体B细胞的成员以形成包含产生特异性结合到所述抗原肽的抗体的抗体-产生B细胞的第一细胞群。
78.一种调节患者中免疫应答的方法：
向患者施用制剂，其包含(A)许多颗粒和(B)药学上可接受的载体，其中所述许多颗粒的成员包含：
(1)至少一种B细胞影响分子；和
(2)至少一种分子复合物，其接合B细胞表面上的MHC-抗原复合物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述至少一种B细胞影响分子选自(1)CD40配体、(2)细胞因子和(3)细胞因子分子复合物。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述分子复合物选自T细胞受体和包含至少四种融合蛋白的TCR分子复合物，其中：
(a)两种第一融合蛋白包含(i)TCRα链或TCRγ链；且
(b)两种第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白轻链和(ii)TCRβ链或TCRδ链的细胞外结构域，其中如果所述两种第一融合蛋白包含所述TCRα链，则所述两种第二融合蛋白包含所述TCRβ链，并且其中如果所述两种第一融合蛋白包含所述TCRγ链，则所述两种第二融合蛋白包含所述TCRδ链，
其中所述两种第一和所述两种第二融合蛋白缔合以形成所述TCR分子复合物，其中每种第一融合蛋白的所述TCRα或γ链的所述细胞外结构域和每种第二融合蛋白的所述TCRβ或δ链的所述细胞外结构域形成TCR抗原结合槽。
81.一种富集多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞的方法，其包括使用根据权利要求7所述的纳米-aAPC温育所述多克隆T细胞群。
82.根据权利要求81所述的方法，其进一步包括从所述多克隆T细胞群分离所述抗原特异性T细胞。
83.根据权利要求82所述的方法，其中使用磁性富集柱、流式细胞术或差速离心实现所述分离。
84.根据权利要求82或83所述的方法，其进一步包括在所述纳米-aAPC的存在下培养所述抗原特异性T细胞。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其进一步包括向患者施用所述抗原特异性T细胞。
86.一种激活T细胞的方法，其包括：
在磁场的存在下，使用根据权利要求8所述的纳米-aAPC温育T细胞群，其中所述纳米-aAPC是顺磁性的。
87.根据权利要求86所述的方法，其中在37℃进行所述温育，持续10分钟至3天。
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