KR102164405B1 - 나노스케일 인공 항원 제시 세포 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 면역요법을 위한 강력한 도구로서 사용하기 위한, 세포독성 림프구를 포함하여 림프구에 자극성 신호를 전달하는, 나노스케일 인공 항원 제시 세포(nano-scale Artificial Antigen Presenting Cell: aAPC)를 제공한다.

Description

나노스케일 인공 항원 제시 세포 {NANOSCALE ARTIFICIAL ANTIGEN PRESENTING CELLS}
본 발명은 나노스케일 인공 항원 제시 세포에 관한 것이다.
본 개시내용에 인용된 각 참조문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 개시내용은 면역요법(immunotherapy)에 관한 것이다.
요약
본 개시내용은 나노 입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 림프구-작용 분자 (lymphocyte affecting molecule); 및 항원에 결합시, 고유한 클론형 림프구 수용체 (clonotypic lymphocyte receptor), 즉, 항원-특이적 림프구 수용체에 관여하는, 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체(molecular complex)를 포함하는, 나노-스케일 인공 항원 제시 세포 (nano-scale artificial antigen presenting cell; 나노-aAPC)를 제공한다.
본 개시내용은 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 B 세포-작용 분자; 및 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체를 포함하는, 나노-aAPC를 제공한다.
본 개시내용은 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 T 세포 공자극 분자(costimulatory molecule); 및 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자 복합체를 포함하는, 나노-aAPC를 제공한다. 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자 복합체는 적어도 2개의 융합 단백질을 포함한다. 제1 융합 단백질은 제1 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제1 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 제2 융합 단백질은 제2 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 서로 연관되어 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성한다. MHC 클래스 I 분자 복합체는 제1 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트(cleft) 및 제2 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다.
본 개시내용은 상기 3개의 단락에 기재된 다수의 나노-aAPC를 포함하는 제제(preparation)을 제공한다.
본 개시내용은 항원-특이적 T 세포의 형성을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다수의 전구체 T 세포를 포함하는 분리된 제제를, T 세포 작용 분자를 포함하는 적어도 하나의 제1 나노-aAPC 및 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하는 항원 제시 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 항원은 항원 결합 클레프트에 결합한다. 이에 따라, 다수의 전구체 T 세포의 멤버(member)를 유도시켜 항원을 인식하는 항원-특이적 T 세포를 포함하는 제1 세포 집단(first cell population)을 형성한다. 제1 세포 집단 내에 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트는, 전구체 T 세포가 CD3에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지만, 항원 제시 복합체를 포함하지는 않는 나노-aAPC로 배양되는 경우 형성되는 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트보다 더 크다.
본 개시내용은 세포의 집단 내 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항원-특이적 T 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 T 세포 작용 분자를 포함하는 적어도 하나의 제1 나노-aAPC 및 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하는 항원 제시 복합체로 배양시키는 단계를 포함한다. 항원은 항원 결합 클레프트에 결합한다. 상기 배양시키는 단계는 제1 세포 집단 내에 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트와 비교하여 항원-특이적 T 세포의 증가된 수 또는 퍼센트를 포함하는 제2 세포 집단을 형성하는데 충분한 시간의 주기 동안 수행된다.
본 개시내용은 환자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (A) 다수의 입자, 및 (B) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다수의 입자의 멤버는 (1) 적어도 하나의 T 세포-작용 분자; 및 (2) 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함한다. 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함한다. 항원은 적어도 하나의 항원 결합 클레프트에 결합한다.
본 개시내용은 환자에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (A) 다수의 입자, 및 (B) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다수의 입자의 멤버는 (1) 적어도 하나의 세포사멸-유도 분자(apoptosis-inducing molecule); 및 (2) 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함한다. 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함한다. 항원은 적어도 하나의 항원 결합 클레프트에 결합한다.
본 개시내용은 집단(population) 내 항체-생산 B 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 다수의 전구체 B 세포를 포함하는 분리된 제제를, 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 B 세포-작용 분자; 및 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체를 포함하는 적어도 하나의 제1 나노-aAPC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이에 따라, 다수의 전구체 B 세포의 멤버(member)를 유도시켜 항원 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 항체-생산 B 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 형성한다.
본 개시내용은 집단 내에 항체-생산 B 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 항체-생산 B 세포를 포함하는 제1 세포 집단을, 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 B 세포-작용 분자; 및 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체를 포함하는 적어도 하나의 제1 나노-aAPC와 배양시키는 단계를 포함한다. 상기 배양시키는 단계는 제1 세포 집단 내에 항체-생산 B 세포의 수 또는 퍼센트와 비교하여 항체-생산 B 세포의 증가된 수 또는 퍼센트를 포함하는 제2 세포 집단을 형성하는데 충분한 시간 주기동안 수행된다.
본 개시내용은 집단 내에 항체-생산 B 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다수의 전구체 B 세포를 포함하는 분리된 제제를 나노-aAPC의 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 나노-aAPC는 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 B 세포-작용 분자; 및 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체를 포함한다. 이에 따라, 다수의 전구체 B 세포의 멤버(member)를 유도시켜 항원 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 항체-생산 B 세포를 포함하는 제1 세포 집단을 형성한다.
본 개시내용은 환자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (A) 다수의 입자, 및 (B) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다수의 입자의 멤버(member)는 (1) 적어도 하나의 B 세포-작용 분자; 및 (2) B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 적어도 하나의 분자 복합체 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체를 포함한다.
본 개시내용은 폴리클로날 T 세포 집단(polyclonal T cell population) 내 항원-특이적 T 세포를 강화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 폴리클로날 T 세포 집단을, 나노입자; 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 림프구-작용 분자 (lymphocyte affecting molecule); 및 항원에 결합시, 항원-특이적 림프구 수용체에 관여하는, 나노입자의 표면 상의 적어도 하나의 분자 복합체를 포함하는 나노-aAPC와 배양시키는 단계를 포함한다. 나노-aAPC는 가교-결합 항체 또는 올리고머화된 분자 (oligomerizing molecule)를 더 포함한다.
본 개시내용은 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 T 세포의 집단을 자기장의 존재하에, T 세포 작용 분자 및 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하는 항원 제시 복합체를 포함하는 나노-aAPC와 배양시키는 단계를 포함한다. 나노-aAPC는 상자성체(paramagnetic)이다.
문단 [34]: 본 개시내용은 항원-특이적 T 세포의 집단을, 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(1) T 세포의 분리된 집단을, 항원-특이적 T 세포를 발생시키는데 충분한 강도의 자기장의 존재하에, 다수의 나노-스케일 인공 항원 제시 세포(나노-aAPC)와 접촉시키는 단계 (여기서, 다수의 나노-aAPC는, 이들의 표면 상에 (i) 적어도 하나의 T 세포 작용 분자 및 (ii) 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함하는 상자성체(paramagnetic) 나노입자이고, 항원 제시 복합체는 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하고, 항원 결합 클레프트는 항원을 포함한다);
(2) 나노-aAPC에 결합하는 항원-특이적 T 세포의 복합체를, T 세포의 분리된 집단으로부터 분리시키는 단계; 및
(3) 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 변형에서, T 세포의 분리된 집단은 나이브 T 세포(naive T cell)를 포함한다. 이들 방법들의 일부 변형에서, 복합체는 자기 농축 칼럼(magnetic enrichment columns), 유동 세포 계측법(flow cytometry), 또는 차동 원심분리(differential centrifugation)를 사용하여 분리된다. 상기 방법의 일부 변형에서, 복합체는, 정맥 내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여(intradermal administration), 림프내 투여, 및 종양내 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 경로에 의해 투여된다.
문단 [35]: 본 개시내용은 항원-특이적 T 세포의 집단을, 이를 필요로 하는 환자에 있어서 타겟 영역(target area)으로 제공하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
(1) 다수의 나노-스케일 인공 항원 제시 세포(나노-aAPC)를, 항원-특이적 T 세포를 자극시키는데 충분한 강도의 자기장의 존재하에, 환자에게 투여하는 단계 (여기서, 다수의 나노-aAPC는 상자성체(paramagnetic)이고, 이들의 표면 상에 (i) 하나의 T 세포 작용 분자 및 (ii) 항원 제시 복합체를 포함하고, 항원 제시 복합체는 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하고, 항원 결합 클레프트에 결합된 항원은 고유한 항원-특이적 림프구 수용체에 관여한다); 및
(2) 자기장을 타겟 영역에 적용시키는 단계 (여기서, 타겟 영역은 고유 항원-특이적 림프구 수용체에 관여함으로써 나노-aAPC를 타겟 영역에 지향(directing)시키는 항원을 포함한다)를 포함한다.
문단 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 나노-aAPC는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 림프내 투여, 및 종양 내 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 투여 경로에 의해 투여된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 I 분자이다. 이들의 일부 변형에서, 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 적어도 2개의 융합 단백질을 포함하는 MHC 클래스 I 분자 복합체이고, 제1 융합 단백질은 제1 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제1 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 제2 융합 단백질은 제2 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 서로 연관되어 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성하며, MHC 클래스 I 분자 복합체는 제1 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트 및 제2 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다. 이들의 일부 변형에서, 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 II 분자이다. 이들의 일부 변형에서, 항원 제시 복합체는 적어도 4개의 융합 단백질을 포함하는 MHC 클래스 II 분자 복합체이고, (a) 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인을 포함하며; (b) 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인을 포함하고, 2개의 제1 및 제2 융합 단백질은 연관되어 MHC 클래스 II 분자 복합체를 형성하며, 각각의 제1 융합 단백질의 MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인 및 각각의 제2 융합 단백질의 MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인은 MHC 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트를 형성한다. 이들의 일부 변형에서, 면역글로불린 중쇄는 가변 영역을 포함한다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 항원 펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 클레프트에 결합된다. 이들의 일부 변형에서, 항원 펩타이드는 종양-관련된 항원의 펩타이드, 자기항원(autoantigen)의 펩타이드, 동종 항원(alloantigen)의 펩타이드, 및 감염원 항원(infectious agent antigen)의 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 나노-APC는 적어도 2개의 항원 제시 복합체를 포함한다. 이들 일부 변형에서, 동일한 항원은 적어도 2개의 항원 제시 복합체의 각각의 항원 결합 클레프트에 결합된다. 기타 이들의 변형에서, 상이한 항원은 적어도 2개의 항원 제시 복합체의 각각의 항원 결합 클레프트에 결합된다. 일부 변형에서, 제1 항원 제시 복합체는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트를 포함하고, 제2 항원 제시 복합체는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트를 포함한다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 항원 제시 복합체는 비-표준 MHC-유사 분자(non-classical MHC-like molecule)이다. 이들의 일부 변형에서, 비-표준 MHC-유사 분자는 CD1 패밀리 부재(CD1 family member)이다. 비-표준 MHC-유사 분자는 CDla, CDlb, CDlc, CD1d, 및 CDle로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 T 세포 작용 분자는 T 세포 공자극 분자(costimulatory molecule)이다. T 세포 공자극 분자는 CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-lBBL, CD27, CD30, CD 134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, CD28에 특이적으로 결합하는 항체, HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 및 4-lBB에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 T 세포 작용 분자는 접착 분자(adhesion molecule)이다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 접착 분자는 ICAM-1 및 LFA-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 T 세포 작용 분자는 T 세포 성장 인자(T cell growth factor)이다. T 세포 성장 인자는 사이토카인 및 초항원(superantigen)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, 및 감마 인터페론으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. T 세포 성장 인자는, (A) 적어도 2개의 융합 단백질을 포함하는 제1 분자 복합체 (여기서, 하나의 제1 융합 단백질은 제1 사이토카인 및 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 하나의 제2 융합 단백질은 제2 사이토카인 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 서로 연관되어 제1 분자 복합체를 형성한다); (B) 적어도 4개의 융합 단백질을 포함하는 제2 분자 복합체 [여기서, (a) 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) 제1 사이토카인을 포함하고; 그리고 (b) 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 제2 사이토카인을 포함하며, 2개의 제1 및 제2 융합 단백질은 연관되어 제2 분자 복합체를 형성한다]로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기한 일부 변형에서, T 세포 성장 인자는 제1 분자 복합체이다. 상기한 일부 변형에서, 제1 및 제2 사이토카인은 동일하다. 기타의 이들 변형에서, 제1 및 제2 사이토카인은 상이하다.
상기한 일부 변형에서, T 세포 성장 인자는 제2 분자 복합체이다. 상기한 일부 변형에서, 제1 및 제2 사이토카인은 동일하다. 기타의 이들 변형에서, 제1 및 제2 사이토카인은 상이하다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 T 세포 작용 분자는 조절성 T 세포 유도 분자(regulatory T cell inducer molecule)이다. T 세포 유도 분자는 TGFβ, IL-10, 인터페론-a, 및 IL-15로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 적어도 하나의 T 세포 작용 분자는 세포사멸-유도 분자(apoptosis-inducing molecule)이다. 세포사멸-유도 분자는 독소 (toxin), TNFα, 및 Fas 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 나노-aAPC는 적어도 2개의 상이한 T 세포 작용 분자를 포함한다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 배양시키는 단계는, 37℃에서 10분 내지 3일 동안 수행된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 항원-특이적 T 세포는 세포독성 T 세포이다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 항원-특이적 T 세포는 헬퍼(helper) T 세포이다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 항원-특이적 T 세포는 조절성 T 세포(regulatory T cell)이다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 환자는 암, 자가면역 질환, 감염성 질환을 가지거나, 또는 면역억제된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 전구체 T 세포는 환자로부터 수득된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 전구체 T 세포는 환자가 아닌 도너(donor)로부터 수득된다.
문단 [34] 및 [35]에 기재된 방법의 일부 변형에서, 항원-특이적 T 세포는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 림프내 투여, 및 종양 내 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 투여 경로에 의해 투여된다.
본 개시내용은 상이한 생리학적 상태(예를 들면, 나이브 대(vs) 미리 활성화된 T 세포)에서의 타겟 세포에 대한 나노입자, 예를 들면 자성 나노입자를 사용하여 타겟 세포 집단을 자극시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, 도 9C에 도시되고, 아래 특정 실시예에서 상세하게 논의된 바와 같이, 32 ng의 MHC의 용량을 제공하는 나노-aAPC는 주(week)를 기준으로 20배 내지 30배로 나이브 T 세포 및 미리 활성화된 T 세포 둘 다를 자극한다.그러나, 8 ng 또는 3.2 ng의 MHC 용량에서는, 활성화된 T 세포만이 자극되었다. 이에 따라, 예를 들어 3.2 ng 내지 8 ng의 MHC 용량을 포함하는 나노-aAPC의 용량을 사용하여 집단 내 나이브 T 세포에 영향을 미치지 않고 T 세포 집단 내 미리 활성화된 T 세포를 자극할 수 있다.
본 개시내용은 미리 활성화된 T 세포 대(vs) 나이브 T 세포를 상이하게 자극시키는 방법을 제공한다. 일부 변형에서, 3.2 내지 8 ng MHC 대(vs) 32 ng MHC를 포함하는 나노-aAPC를 사용하여 나노-aAPC 결합을 분리하고 T 세포의 활성으로부터 T 세포를 분리할 수 있다. 일부 변형에서, T 세포의 집단은 나이브 T 세포에 대해 강화된 집단을 남기는, 예를 들면, CD44에 대한 항체를 사용하는 미리 활성화된 T 세포가 실질적으로 결손(depletion)되어있다. 나노-aAPC에 결합된 나이브 T 세포는 이의 정제를 허용할 것이다. 이후, 결합된 나노-aAPC를 포함하는 나이브 T세포는, T 세포-나노-aAPC 복합체를 자기장에 노출시킴으로써 활성화될 수 있다.
본 개시내용은 기타 세포, 예를 들면, B 세포 및 줄기 세포에 대한 치료제로서 분리하고, 특징화되며, 사용하는 방법을 제공한다. 상이한 생리학적 상태에 있는 집단에서 세포를 상이하게 활성화시킬 나노입자의 표면 상의 최적 리간드 밀도 (또는, 대안적으로, 이러한 리간드를 포함하는 나노입자의 용량)은, 아래 실시예 9에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정된다. 세포 집단에 따라, 리간드는 예를 들면, 항체 또는 항체의 일부, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 지질, 또는 주어진 수용체 (예를 들어, EGF, PDGF)에 대한 천연 리간드 모두 또는 이의 일부, 화학 물질(예를 들면, 크롬 염 또는 FKBP 결합 도메인과 같은 이뮤노필린 분자 수용체(immunophilin molecule receptor)에 결합하는 1가의 합성 리간드), 단일 항 -인테그린 Fab 단편, RGD 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
도 1A-C. 철-덱스트란 나노-aAPC의 합성 및 특징. 나노-aAPC를 다음 두 가지 방법 중 하나로 합성하였다: 도 1A, 1:1 몰비의 가용성 MHC-Ig 이량체(신호 1) 및 B7.1-Ig(신호 2)를 상자성체(paramagnetic) 산화철, 덱스트란-피복된 입자의 표면에 직접적으로 화학 결합하는 방법. 도 1B, 1:1 몰비의 바이오티닐화(biotinylate)된 MHC-Ig 이량체(신호 1) 및 바이오티닐화된 항-CD28(신호 2)을 항-비오틴 피복된 입자에 결합하는 방법. 도 1C, 나노입자 추적(nanoparticle tracking) 분석을 통하여, 나노-aAPC가 8.3 nM의 농도로 현탁된, 50 내지 100 nm의 평균 직경을 갖는 입자들의 단분산 혼합물임을 확인한다.
도 2A-F. 나노 aAPC 유도 증식은 항원 특이적이고, 용량 의존적이다. 도 2A, 항원 특이적 나노-aAPC 유도 증식. TCR 형질전환 2C(회색) 및 pMEL(흰색) T 세포는 동족 MHC/펩타이드를 함유하는 항-비오틴 피복된 입자와 함께 배양하고, 비-동족 펩타이드 또는 비-동족 MHC 중의 하나를 함유하는 입자들이 존재하지 않는 경우에만 증식했다. 도 2B, 신호 1 및 신호 2 둘 다를 추가하여 최적 T 세포 확장(expansion)을 유도한다. 1 x 106 T 세포당 10 μL 입자의 용량으로, MHC-Ig 및 항-CD28 둘 다를 함유하는 항-비오틴 입자만이 강력한(robust) T 세포 증식을 유도했다. 도 2C, CD8 + CTL의 증식은 3일째 CFSE 희석에 의하여 동등한 용량 농도에서 LD 및 HD 입자로 유도된다. 감소된 형광은 증가된 증식을 나타낸다. 동등한 용적의 HD 입자는 확장을 거의 유도하지 않는 0.5 μL LD 입자와 함께, LD 입자보다 더 큰 증식을 유도한다. 도 2D, (A)에서의 샘플의 7일째 확장 배수(fold expansion)는 유사한 패턴을 나타낸다. 증식은 용량 의존적이며, LD 입자의 동등한 용량과 비교하여 HD 입자는 2 내지 4배 더 큰 용량을 갖는다. 도 2E, 3일날, CD8+ CTL의 CFSE 희석은 동등한 단백질 농도에서 LD 및 HD 입자에 의해 유도된다. 입자 용량이 동등한 단백질 농도로 표준화될 때, 입자는 유사한 양의 증식을 유도한다. 도 2F, (C)에서의 샘플의 7일째 확장 배수는 동등한 단백질 용량에서 HD 및 LD 입자에 대한 동등한 확장을 입증한다. 약 0.5 μL LD 입자 또는 0.08 μL HD 입자의 임계값은 검출가능한 확장을 유도하는데 요구된다.
도 3A-F. T 세포 기능적 특징. 도 3A, CD8+ T 세포를, HD 및 LD 입자를 사용하여 확장시켰다. 입자 용량은 HD 및 LD 입자(각각 3.5 μL 및 20 μL)에 의한 동등한 확장을 유도하고, 보다 강력한 확장(HD 20 μL)을 유도하도록 선택되었다. 샘플을 7일째 재-자극시킨다음, 세포내 사이토카인 염색 분석으로 이펙터 기능(effector function)에 대해 평가하였다. 20 μL HD 샘플(검은색 원으로 표시), 3.5 μL HD 샘플(검은색의 채워진 사각형으로 표시), 및 20 μL LD 샘플(채워지지않은 사각형으로 표시) 모두는, 강력하고, 동등하며, 용량 의존적인, CD 107a에 의해 측정된 탈과립(도 3B) 및 IFNγ 생산(도 3C)을 유도하였다. 도 3D, 표면 단백질 CD44 및 CD62L의 염색으로 측정된 메모리 이펙터 표현형. T 세포는 나이브(naive) (CD62Lhi, CD441o), 센트럴 메모리(Central Memory) (CD62Lhi, CD44hi), 또는 이펙터 메모리(Effector Memory) (CD62Llo, CD44hi)로 구분될 수 있다. E, 대표적인 FACS 그래프는 나노-aAPC 자극 후 7일째인 3개의 집단(population)을 나타낸다. 도 3F, T 세포를, 2, 10, 및 50 μL의 LD 또는 HD 산화철 나노-aAPC로 자극시킨 다음 7일 후 특징이 나타났다. 막대 그래프는 자극 후 발생된 나이브(채워지지 않음), Tcm(회색으로 채워짐), 및 Tem(검은색으로 채워짐) 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 4A-B. 내인성 전구체로부터의 항원-특이적 인간 T 세포 확장. 도 4A, PBMC를, 증가한 용량의 철-덱스트란 나노-aAPC 함유 A2-M1 MHC-Ig로 배양시킨 다음, 자극 전(PBMC, 맨 윗줄) 또는 자극 후 1주째(중간줄) 또는 자극후 2주째(아래 줄) 테트라머 염색에 의해 항원-특이성을 평가하였다. 왼쪽 상단에 있는 숫자는 테트라머(tetramer)+ (게이티드: gated)인 CD8+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. M1 특정 집단의 크기는 자극의 반복 횟수(위에서 아래 방향) 및 나노-aAPC의 증가 용량(왼쪽에서 오른쪽 방향)에 따라 증가한다. 그래프는 패널 B에 요약된 별도의 3가지 실험의 결과를 나타낸다. 도 4B, CD8+ PBMC 결합 M1 테트라머의 퍼센트는 반복된 자극과 나노-aAPC의 증가 용량(좌측 패널)에 따라 증가한다. 테트라머-양성 세포(우측 패널)의 총 수는 자극의 횟수 및, 초기 전구체 집단의 800배까지 확장하는 입자 용량에 따라 유사하게 증가한다.
도 5A-B. 양자점 나노-aAPC의 합성 및 특징. 도 5A, 양자점(Qdot) 나노-aAPC를, 1:1 비율의 가용성 MHC-Ig 이량체(신호 1) 및 항-CD28 항체(신호 2)를 중합체-피복된 양자점 입자의 표면에 아비딘-비오틴 매개 커플링(avidin-biotin mediated coupling)시켜 작제하였다. 도 5B, 전체 CD8+ T 세포 내 양자점 나노-aAPC 확장. 7일째 확장 배수는 용량 의존적이며, 항원-특이적이다. 비-동족 입자들은 임의의 확장을 유도하지 않았으나, 최고 용량의 동족 양자점 aAPC는 CTL의 14.6배의 확장을 유도하였다.
도 6A-B. 나노-aAPC는 생체 내 종양 거부를 매개한다. 도 6A, 양자점 aAPC. B16 종양을 0일째에 피하주입하고, 같은 날에 나이브 pMEL T 세포를 주입하였다. 다음날, 양자점 aAPC를 정맥내(IV)로 주입하였다. 종양 크기를 지정된 일자에 표면적(mm2)으로 측정하고, 우측에 곡선하 면적(area under curve: AUC)으로 도시하였다. pMEL T 세포 및 동족 양자점 aAPC로 처리된 마우스(검은 막대)는, 비처리된 마우스(흰색), T 세포 단독으로 처리된 마우스(연한 회색), 및 T 세포 + 비-동족 양자점 aAPC로 처리된 마우스(체크무늬)(그룹 당 4마리 마우스)와 비교하여 적은 종양 성장을 보였다. 주목할만한 점은 비-동족 양자점 aAPC와 비교하여 처리군에 대해서, 전체 실험에 걸쳐서, AUC(p<0.02)로 특징지어진다는 점이다. 도 6B, 철-덱스트란 aAPC. 나이브 pMEL T 세포를 7일째에 정맥내로 주입하였다. 다음날, 양자점 aAPC를 우측면에 정맥내 또는 피하(sc) 중의 하나로 주입하였다. B16 종양을 0일째에 우측면에 피하(sc)로 주입하였다. 처리된 마우스의 팔에 정맥내 또는 피하 종양 주입 후 4일째에 추가 주입을 하여 4개의 처리군을 형성하였다: 비-동족 aAPC 정맥내(6일째) 이후 피하 (4일째) 주입(체크무늬), 동족 aAPC 정맥내 이후 정맥내 주입(연한 회색), 동족 aAPC 정맥내 이후 피하 주입(진한 회색), 및 동족 aAPC 피하 주입 이후 다시 피하 주입(검은색). pMEL T 세포 및 동족 철-덱스트란 aAPC 정맥내/피하주입 또는 피하주입/피하주입으로 처리된 마우스(채워진 사각형)는 비-동족 aAPC(군 당 7마리 마우스, AUC에 대해 * p<0.01)와 비교하여 적은 종양 성장을 나타냈다.
도 7A. T 세포 증식 후 세기가 감소하는 염료인 CFSE는 활성화된 세포 (CD44 혼합됨)를 포함하는 T 세포 집단이 6 ng의 마이크로- 또는 나노-aAPC 기반 자극에 반응하여 증식하지만, 나이브 CD44 로우 세포는 증식하지 않음을 도시한다. 도 7B. 마이크로- 및 나노-aAPC를, 동등한 확장 배수 (약 17배)를 유도하는 용량으로 CD8+ (활성화됨) 세포에 적정시, 나노-aAPC는 나이브 T 세포를 확장할 수 없다.
도 8A. 강화된 T 세포 활성화를 위한 자성 농축 전략(magnetic enrichment strategy)의 개략도. 낮은 빈도수(low frequency)의 전구체 세포는 관심의 특정 항원을 운반하는 나노-aAPC에 결합된다. 항원-특이적 세포는 이후 확장을 강화시키면서 양성적 자성 선택(positive magnetic selection)에 의해 강화된다. 도 8B. 항원 특이적 T 세포의 빈도수(y 축)는 나노-aAPC를 사용하는 자성 강화에 의해 강화된다. 도 8C. 강화후 나노-aAPC 매개된 확장 7일 후 항원 특이적 세포의 증가된 빈도수. 도 8D. 상보적인 접근방법으로서, 세포는 나노-aAPC에 예비-결합후 자기장에서 활성화된다. 자기장에서의 배양은 세포 증식을 향상(boosting)시킨다. 도 8E. 활성화 후 3일째 CFSE 염색은 활성한지 1 내지 3시간 후 향상을 유도하는 자성을 도시한다. 도 8F, 이는, 고려된 모든 용량에서 향상을 제공하는 자성 자극과 함께 활성후 7일째 측정된 강화된 확장을 유도한다.
도 9A 내지 9G. 나이브 세포 및 활성화된 세포에 결합한 나노-aAPC. 도 9A, MHC-Ig 이량체 및 동시-자극성 항-CD28을 철-덱스트란 나노입자에 커플링시킴으로써 나노-aAPC을 합성하는 개략도. 도 9B, 8 ng의 Db-GPl00를 나타내는 나노-aAPC로 자극한 후 3일째 CFSE 희석에 의해 측정된 나이브(좌측) 및 활성화된(우측) pmel T 세포의 증식. 자극되지 않은 대조군은 회색으로 나타내었다. 도 9C, 나노-aAPC 자극 후 7일째에 나이브(적색) 및 활성화된(청색) 세포의 확장 배수. 활성화된 T 세포와 비교하여 나이브 세포 (*, p < 0.01)에서 8 ng 이하의 MHC-Ig 유도된 최소 증식을 나타내는 나노-aAPC. 도 9D, 2C T 세포(한쌍의 스튜던트의 t-시험에서 p<0.02의 유의한 차이를 나타내는 반감기)에 결합된 Kb-SIY 나노입자의 분리. 표 1을 참조한다. 도 9E, 분리 데이터(터키(tukey) 사후-시험으로 ANOVA에 의한 p<0.05, 표 1 참조)로부터 추정된 나이브(적색) 및 활성화된 (청색) 세포를 이용하여 Kb-SIY 이량체(MHC-Ig) 및 Kb-SIY 나노입자(입자) 사이에 형성된 평균 TCR-MHC 접점. 도 9F, 나이브(적색) 및 활성화된 (청색) 세포(2가지 방식의 ANOVA에 의한 p<0.0001)에 대한 증가 용량의 나노-aAPC(제시된 총 MHC-Ig에 의해 측정됨)의 평형 결합. 도 9G, 증가된 평형 결합 및 입자 역방향-속도(off-rate)을 설명하는 결합 모델: 나이브 세포는 활성화된 세포보다 비드당 적은 접점으로 많은 비드를 결합한다.
도 10A-G. 자기장에 의해 유도된 aAPC 및 CD3ε의 클러스터링(clustering). 도 10A-C, 자성-유도된 클러스터링의 개략도. 도 10D, 자기장의 부재 또는 존재하에 나노-aAPC 결합(시간 0)후 즉시 및 배양후 aAPC 및 CD3 집합체. 세포를, LFA-1 (녹색), 나노-aAPC (적색) 상의 MHC-Ig, 및 CD3ε (마젠타: magenta)에 대한 항체로 표지하였다. 배양전 세포(시간 0, 왼쪽 상단), 비-동족 입자로 배양된 세포 (비-동족, 오른쪽 상단), 동족 나노-aAPC로 배양된 세포(자성 없음, 왼쪽 아래), 및 자기장 내 동족 나노-aAPC로 배양된 세포 (자성, 오른쪽 아래)에 대한 대표 이미지를 도시한다. 도 10E, 집합체 검출은 시간 0에서의 그룹 (좌측에서 2개) 및 자성 그룹(우측에서 2개)으로부터의 대표적인 이미지를 도시한다. 흰색 윤곽은 알고리즘으로 식별된 CD3 클러스터(마젠타)의 경계를 나타낸다. 도 10F, 클러스터 검출 알고리즘(15개 세포/그룹)으로 식별된 평균 클러스터 면적. 자성 없는 그룹은 시간 0 (*, 평균 차이 0.22 μm2)보다 상당히 큰 클러스터를 가지며, 자성 그룹은 시간 0 (**, 평균 차이 0.46 μm2, 터키 사후-시험을 이용한 ANOVA에 의한 p < 0.0001) 및 자성 없는 그룹(**, 평균 차이는 0.24 μm2) 둘 다보다 상당히 큰 클러스터를 가졌다. 도 10G, 무-자성 그룹 내 세포는 시간 0 (*, 평균 차이 5.8 클러스터)보다 세포당 적은 클러스터를 가지며, 자성 그룹 세포는 무-자성(**, 평균 차이 1.9 클러스터, 터키 사후-시험을 이용한 ANOVA에 의한 p < 0.0001) 그룹보다 세포당 적은 클러스터를 가진다.
도 11A-G. 자성-강화된 나노-aAPC 자극은 체외(in vitro)에서 강력한 T 세포 증식을 유도한다. 도 11 A, 0.2 T 외부자기장의 존재(적색) 또는 부재(검은색)하에 나노-aAPC로 자극후 3일째에 CFSE 희석에 의한 Pmel T 세포 증식. 도 11B, 자극 후 7일째 A에 기술된 샘플의 확장 배수. 도 11C, 0-24 시간 동안 5 ng MHC-Ig 용량의 나노-aAPC 및 0.2 T 자기장으로 배양된 Pmel T 세포. 3일째 CFSE 희석으로 평가된 증식. 도 11D, 자극 후 7일째 C로부터 샘플의 확장 배수. (*, 터키 사후-시험을 이용한 ANOVA에 의한 p<0.001). 도 11E, 5 ng MHC-Ig 용량의 나노-aAPC 및 24시간 동안 두께를 증가시킨 네오디뮴 자석에 의해 발생된 증가하는 최대 강도 (0.15-0.225 T)의 자기장으로 배양된 Pmel T 세포. 도 11F, 자극 후 7일째에 E로부터 샘플의 증식 (* 무-자성보다 더 큼, ** 0.15 T 자성보다 더 큼, 터키 사후-시험을 이용한 ANOVA에 의한 p<0.001). 도 11G, 24시간 동안 0.2 T 자기장의 존재 또는 부재하에 Kb-Trp2 나노-aAPC로 자극한 후 야생형 마우스로부터 내인성 CD8+ 림프구의 항원-특이적 확장. 7일후, 집단을, 동족 Kb-Trp2 (맨 윗줄) 또는 비-동족 Kb-SIINF (아래 줄) MHC-Ig 이량체로 염색시켰다.
도 12A-F. 생체내 자성-강화된 T 세포 확장 및 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)의 증가된 효능. 도 12A, 입양 면역요법 모델의 개략도. Thy1.1+pmel TCR 형질전환 마우스로부터의 CD441o, CD8+ T 세포를 야생형 Thy1.2+ B6 마우스 수용체(그룹당 6마리 마우스)로 입양 전달하기 직전에 자기장 및 나노-aAPC(총 5 ng의 MHC-Ig)의 부재 또는 존재하에 24시간 동안 체외에서 자극시켰다. 도 12B, 전달 후 7일째 비장 및 전달 후 21일째 림프절로부터의 Thy1.1 세포의 대표 빈도수. 도 12C, Thyl.l+ 세포의 빈도수는, 무-자성(회색) 및 무-자극(흰색)된 나노 aAPC 7일 및 21일째에 두 가지 방식의 ANOVA에 의한 처리 효과에 대해 p<0.001)와 비교하여 자기장(적색)에서 나노-aAPC로 자극된, T 세포가 주어진 마우스에서 상당히 높았다. 도 12D, 모든 기관 내 총 Thyl.l+ 세포는 7일 및 21일째에 합해졌다. 5배 이상의 세포가, 7일 (스튜던트의 t-시험에 의한 p < 0.05)째에 나노-aAPC 단독 그룹 보다, 나노-aAPC + 자성 그룹에서 관찰되었으나, 21일 (p = 0.15)째에는 유의성에는 도달하지 못하였다. 도 12E, 기존 종양을 자기장으로 처리하여 입양 면역요법을 강화시키는 개략도. SC 종양은 0일째에 투여되었고, 9일째에 부분적인 골수억제, 및 자기장에서의 나노-aAPC (총 5 ng의 MHC-Ig)(적색) 또는 무-자성의 나노-aAPC (검은색) 중의 하나로 24시간 동안 자극시킨 CD441o, CD8+ pmel T 세포를 10일째에 전달시켰다. T 세포 단독(회색) 및 미처리된(채워지지 않음) 그룹을 대조군(그룹 당 8마리 마우스)으로 사용하였다. 도 12F, 미-자성 그룹 및 대조군(두가지 방식의 ANOVA에 의한 처리 효과에 대해 p<0.0001)과 비교하여, 자성-강화된 나노-aAPC 활성화된 T 세포의 처리는 종양 성장을 약화시킨다. 화살표는 입양 전달의 시점(10일)을 나타낸다. 마우스는 죽었거나, 종양이 150 mm2 보다 더 큰 경우 검열하였다. 상기 처리는 T 세포+나노-aAPC + 자성 그룹(만텔-콕스(Mantel-Cox) 로그-순위 시험에 의해 p<0.001)에서 생존 증가를 유도하였다.
도 13A-D. 형광에 의해 나노-aAPC 및 마이크로-aAPC 에 결합한 단백질의 특징. 도 13A, 나노입자에 결합된 항체 및 대조군의 평균 형광 강도 (MFI). 나노-aAPC 및 마이크로-aAPC (세포규격) 입자를, 과량의 모노클로날 항-마우스 IgG1 (MHC-Ig에 대해) 및 PE로 컨쥬게이션된 항-항체와 30분 동안 배양시킨 다음, 자성 칼럼에서 세척하였다. 입자에 결합한 형광 항체는 검출가능한 백그라운드 샘플(background sample)이며, 이는, 항-IgGl (항체 없음)으로 염색되지 않는 마이크로- 및 나노- 입자, 및 단백질에 결합되지 않으면서 항-IgGl (공백(blank))으로 염색된 입자를 포함한다. 용액 내 단백질 농도는 IgGl-PE 표준 곡선과 비교하여 결정되었다. 항-IgGl에 대한 형광이 도시되었으며, 3가지 실험을 나타낸다. HD - 고밀도. LD - 저밀도. 도 13B, 용액 내 입자는 항체 형광을 간섭하지 않는다. 가용성 항-IgGl PE 항체를 적정시키고 형광에 대해 측정하였다. 가용성 항체가 공백 마이크로- 및 나노-입자의 존재하에 측정되는 경우, 유사한 형광 방출이 관찰되었다. 도 13C, 자성 칼럼을 충분히 세척하여 자유 항체를 제거하였다. 세척을 3회(분획 3)한 후, 백그라운드에 대한 형광은 검출되지 않는다. 0.63 ug/ml 자유 항체의 형광을 비교를 위해 제공한다. 도 13D, 나노입자 농도를, 405 nm에서 철 흡광도로 특징지어진다. 입자 농도는 나노입자 추적 분석에 의해 결정되었다. 나노입자를 적정하여 흡광도를 측정하고, 표준 곡선을 계산하여 입자 농도를 결정한다.
도 14A-E. 마이크로-aAPC에 의해 유도된 pMEL T 세포 증식. 도 14A, CD 8+ pMEL 비장세포는 메모리표현형, CD44 양성 세포 (좌측에, CD8의 퍼센트로 나타내어지는 대표 퍼센트)의 집단을 포함한다. CD441o 나이브 세포는 자성 농축 칼럼에서 항-CD44 항체로 비-접촉 음성 선택 농축에 의해 분리되었다. 도 14B, 마이크로-aAPC (진한 적색 및 청색 라인) 및 나노-aAPC (연한 적색 및 청색 라인)으로 3일 동안 자극되거나 또는 무자극(회색 라인)에 의한 CFSE 희석에 의해 나이브 CD441o (좌측) 및 활성화된 (우측) 세포의 증식. 마이크로- 및 나노-aAPC를, 동등한 총량의 MHC-Ig (8 ng)을 나타내는 용량으로 사용하였다. 나노-aAPC 데이터를 도 1로부터 재-생산한다. 도 14C, 지시된 용량의 마이크로-aAPC 자극 후 7일째에 나이브(적색) 및 활성화된(청색) 세포의 증식. 도 14D, 마이크로-aAPC 유도된 자극에 대한 MHC-Ig 밀도의 효과. 고밀도 (HD, 청색) 및 저밀도 (LD, 적색) 마이크로-aAPC를, 총 MHC-Ig (4-16 ng)에 대해 표준화시켰다. 밀도에 대해 표 1을 참조한다. 활성화 후 3일째 CFSE 희석에 의해 평가된 증식. 도 14E, 활성 후 7일째에 도 14D에서 도시된 샘플의 확장 배수를 도시하는 3개 실험의 대표도.
도 15A-D. 도 15A, 동족 2C T 세포에 결합하는 Kb-SIY 나노입자. 활성화된 세포에 결합, 나이브, CD441o 분리된 2C T 세포(나이브, 적색, MFI 179) 및 대조군 비-동족 CD441o pmel T 세포(비-특이적 결합, 회색, MFI 21)와 비교하여 펩타이드 활성(활성화됨, 청색, MFI 89) 후 7일째. 결합은, 세포에 결합된 Alexa 647 표지된 입자의 평균 형광 강도로 특징지어진다. 도 15B, 형광 항-TCRβ로 측정된, 나이브 세포 (MFI 137) 및 활성화된 세포 (MFI 128)의 표면 TCR 발현.도 15C, 활성화된 세포 (진한 청색) 및 나이브 세포 (진한 적색)로부터 Kb-SIY MHC-Ig 이량체의 해리. 활성화된(연한 청색) 및 나이브(연한 적색) 세포로부터 나노-aAPC의 해리를, 비교를 위해 도 1로부터 재생산한다. 도 15D, 자기장 내 배양하기 전(적색) 및 배양 후 1시간(검은색) 후 나이브 CD44 로우 세포(CD44 low)에 결합된 나노-aAPC의 해리 곡선. 해당 도면은 2개 실험을 나타낸다.
도 16A-E. 자기장 내 마이크로-aAPC에 의한 TCR 클러스터링 및 확장. 도 16A, 자기장 내 마이크로-aAPC 응집. 자기장을 적용하기 전 (좌측) 및 적용 후 (우측)에 도시된 마이크로-aAPC (적색)의 대표적인 공초점 이미지(representative confocal image). 도 16B, 마이크로-aAPC 자성 응집은 CD3 응집을 유도하지 않는다. 세포를, LFA-1 (녹색), 마이크로-aAPC (적색)상의 MHC-Ig, 및 CD3ε(마젠타) 에 대한 항체로 표지하였다. 마이크로-aAPC는 모든 3개의 채널, 특히, 적색 및 마젠타 채널에서 자동-형광을 나타내었다. 동족 마이크로-aAPC (무-자성)로 배양된 세포, 마이크로-aAPC와 비접촉 (위) 및 접촉(아래)한 세포, 및 자기장(자성)에서 동족 나노-aAPC으로 배양된 세포에 대해 대표적 이미지들이 도시된다. 도 16C, 클러스터 검출 알고리즘(20 개의 세포/그룹, 입자와 접촉하는 세포 및 비접촉하는 세포 사이를 공평하게 분배함)으로 식별된 세포당 평균 클러스터 면적 및 클러스터. 대조군 샘플은 배양 직전(시간 0) 세포 및 비-동족 마이크로입자로 배양된 세포 (비-동족) (ANOVA에 의한 p>0.05)를 포함한다. 도 16D, 0.2 T 자기장의 존재(적색) 및 부재(검은색) 하에 3일 동안 마이크로-aAPC의 5 ng (좌측) 및 10 ng (우측) MHC-Ig 용량으로 배양된 Pmel T 세포. 4일째 CFSE 희석으로 평가된 증식. 도 16E, 자극 후(두가지 방식의 ANOVA에 의한 p>0.05) 7일째 0.2 T 자기장의 존재 및 부재하에 마이크로-aAPC의 용량을 증가시켜 배양된 pmel T 세포의 확장 배수.
도 17. 네오디뮴 디스크 자성 (Neodynium Disk Magnet)에 의한 배양에서 발생된 자기장 강도. FEMM(유한 요소법 자기학) 소프트웨어로 유한 요소 분석에 의해 추정된 배양 내 자기장 강도의 밀도 플롯. 두께 3/4", 1/2", 및 1/4"의 디스크 자성(마젠타)을 사용하여 0.225 T, 0.200 T 및 0.150 T 이하의 자기장을 각각 생성하였다.
면역요법(immunotherapy)은 질환을 치료하는 면역 세포의 활성 및 확장을 포함한다. 세포독성(CD8+) 림프구(CTL) 반응의 유도는 치료에 있어서 매력적으로 다가오는데, 그 이유는 CTL이 주어진 종양 항원 또는 병원균에 특이적이고, 강력한 반응을 생성하도록 수개의 로그(log)로 확장하며, 질환 (1)의 재발을 방지할 수 있는 장기간 메모리를 생성하기 때문이다. CTL은 직접적으로 생체 내에서 활성화될 수 있거나, 생체외에서 확장될 수 있고, 환자에게 입양적으로 전달될 수 있다(3, 4).
세포독성 림프구에 자극 신호를 전달하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)는 생체내 및 생체외 면역요법의 강력한 도구이다. 따라서, 지금까지, 입자-기반 aAPC는 T세포 활성 단백질을 직경이 수 마이크론인 강성 지지체(rigid support)에 커플링시킴으로써 합성되어왔다. 예를 들면, 본 발명자는 앞서 2개의 필수적이고 충분한 T 세포 활성 신호을 전달하는 단백질을 커플링시킴으로써 세포 규격의 4.5 μm 직경("마이크로스케일") 비드-기반 T 세포 확장 플랫폼(platform)을 개발하였다 (5, 6). T 세포 활성에 요구되는 APC 상에 존재하는 신호들은, TCR (7)에 결합하는 주요 조직적합성 복합체(Histocompatibility Complex: MHC)의 맥락에서 존재하는 동족 항원 펩타이드(cognate antigenic peptide)인 신호 1; 및 T 세포 반응을 조절하는 공자극 수용체(co-stimulatory receptor)의 그룹인 신호 2를 포함한다. 이러한 시스템의 일부 구현예에서, 신호 1은 특이적 펩타이드(MHC-Ig)로 로딩된 키메라 MHC-면역글로불린 이량체에 의해 부여되고, 신호 2는 B7.1 (T 세포 수용체 CD28에 대한 천연 리간드) 또는 C28에 대한 활성 항체 중의 하나이다. 두 단백질 모두는 마이크로스케일 (4.5 μm) 비드의 표면에 직접적이고 화학적으로 커플링시켜 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 생성한다.
그러나, 마이크로스케일 aAPC에는 몇 가지 단점이 있다. 큰 비드는 모세혈관상(capillary bed)에 정착(lodge)하여 정맥내 주입시 조직 손상을 유도할 수 있다. 피하 주입시, 마이크론-크기 비드는 대부분의 T 세포가 거주하는 림프절로 쉽게 운반되지 않는다(8, 9). 또한, 마이크론-크기 비드는 세망내피계(reticulo-endothelial system)의 대식세포에 의해 우선적으로 삭제되는 것으로 알려져 있다 (10, 11).
본 개시내용은 다양한 나노스케일 aAPC (나노-aAPC)를 제공함으로써 이들 제한을 극복한다. 우리의 지식대로, 이는 T 세포 증식을 유도하는 나노스케일 비드-기반 aAPC의 첫번째 기재이다. 나노입자는 항원 또는 약물 섭취를 평가하여 왔으나; aAPC 플랫폼(aAPC platform)은 나노입자-세포 계면에서 발생하는 특정 세포 표면 수용체-리간드 상호작용을 요구한다. 연구를 통해서, 직경 2 마이크론을 초과하는 비드만이 T 세포 증식을 유도할 수 있는 것으로 제안되어 왔으나 (16, 17); 더 작은 크기 입자, 예를 들면, 양자점 나노결정과의 작업은 TCR-MHC 상호작용의 생물물리학적 관점을 연구하는 시약의 사용에 초점을 맞추고 있다 (15). 최근의 연구를 통하여, 직접 시험하는 경우, 증식이 보고된 경우가 없이, 단기간 기능적 반응을 유도하는데 있어서 마이크로비드보다 나노입자가 훨씬 덜 효율적인 것이 입증되어왔다 (18).
이에 따라, 본원에 기재된 나노-aAPC가, TCR 유전자변형 마우스 비장세포 및 인간 폴리클로날 말초혈액 T 세포 모두에서 항원-특이적 T 세포 증식을 유도하는 것을 예상하지 못하였다. 자극된 T 세포는 재공격후 IFNγ를 탈과립(degranulate)시키고 생산시키는 강력한 이펙터 표현형을 갖는다. 또한, 본원에 기재된 나노스케일 aAPC는 마우스 흑색종 모델에서 생체내 주입시 종양 제거를 매개한다.
아래 작업예에 기재된 구현예에 제한되지는 않을지라도, 이들 구현예는 2가지 구현예의 나노-aAPC를 설명한다: (1) 직경이 50 내지 100 nm인 생체적합한 철-덱스트란 상자성 비드; 및 (2) 직경이 20 nm 미만인 아비딘-피복된 양자점 나노결정체. 이들 구현예에서, 신호 1은 펩타이드-MHC 복합체에 의해 제공되고, 신호 2는 B7.1-Ig 또는 항-CD28에 의해 제공된다.
나노-aAPC는 신규 입자-기반 면역요법 전략의 탐구를 허용한다. 위에 기재된 바와 같이, 마이크로스케일 aAPC는 너무 커서 림프관에 의해 전달될 수 없고, 피하 주입시 주입 부위에 남아있다. 정맥내 주입시, 마이크로스케일 aAPC는 모세혈관상에 정착한다. 실제로, 마이크로스케일 비드의 빈약한 통행(poor trafficking)은 aAPC가 최적 면역요법을 위해 통행해야만하는 연구를 배제하였다. 나노-aAPC의 통행 및 생체분포는 마이크로스케일 aAPC보다 훨씬 효율적이기 쉬우며, 이에 따라, 생체내 면역요법 전략의 새로운 탐구를 허용할 것이다.
예를 들면, aAPC가 보다 효율적인 2개의 잠재적인 부위로는, 나이브 및 메모리 T 세포가 거주하는 림프절, 및 종양 그 자체이다. 직경이 약 50 내지 100 nm인 나노입자는 림프관에 의해 흡수될 수 있고 림프절로 수송될 수 있으며 (8, 30), 이에 따라 T 세포의 큰 풀에 대한 접근이 가능할 수 있다. 아래 실시예에 기재된 바와 같이, 나노-aAPC의 피하주입은 대조군 또는 정맥내 주입된 비드보다 적은 종양 성장을 야기한다. 이는 최적의 생체내 T 세포 확장에서 가상 메커니즘으로서 세포외 공간에서 림프절로의 나노-aAPC의 배수(drainage)를 암시한다. 또한, 나노스케일 전달 비히클은 빈약하게 형성된 종양 혈관으로인해 강화된 투과성 보유 효과 (Enhanced Permeability Retention effect)를 통해 종양에 우선적으로 축적된다 (45, 46). 동일 반응계에서 면역자극 신호를 제공함으로써, 종양 미세 환경에서 aAPC는 암 면역요법에서 가장 두드러진 장애물 중의 하나인, 면역억제 종양 미세환경을 해결할 수 있다 (47).
일부 구현예에서, 나이브 T 세포 반응의 자극은, 나노-aAPC를 환자에게 투여한 후 클러스터링시킴으로써 달성될 수 있다. 2개의 전략이 아래 실시예 7에 기재되어 있으며, 기타 전략이 사용될 수 있다. 제1 전략에서, 자성 나노-aAPC 비드를 사용하여 자극 전에 항-종양, 항원-특이적 T 세포를 강화시켰다. 이러한 설명에 얽매이지 않고, 우리는 이러한 강화가 사이토카인 이용가능성을 증가시키고, 생체외 T 세포 확장에 더 나은 환경을 제공한다고 생각한다. 제2 전략에서, 자성 나노-aAPC 비드 및 T 세포는 자기장에서 배양되었으며, 이는 나노-aAPC 매개된 활성을 향상시킨다. 이러한 전략은 상업적으로 이용가능한 세포 강화 칼럼을 기준으로 하는 생체외 배양 시스템의 개발을 요구하였으며, 이는 단기간 세포 배양 또는 자성-유도 활성을 의도하지는 않는다. 또한, 클러스터링은, 예를 들면, 나노-aAPC를 "덮는(cap)" 제2 항체 또는 비드를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 나노-aAPC 또는 올리고머화된 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 또는 나노-aAPC 표면에 대한 항체) 상에 단백질에 대한 가교결합 항체를 사용하여 클러스터링을 달성할 수 있다.
항원-특이적 T 세포 및 항체-특이적 B 세포 각각의 생체외 확장을 위한 나노-aAPC의 사용은 다수의 중요한 장점을 갖는다. 나노-aAPC는 재생가능한 항원 제시 또는 항체 유도 활성을 달성할 수 있으며, 큰 환자 집단에 대해서 사용할 수 있다. 나노-aAPC를 사용하는 방법은 수지상 세포를 사용하는 방법과 비교하여 항원-특이적 T 세포의 생체외 확장 공정을 현저하게 간결화하고 단축시키며, 치료학적 사용에 적합한 수로 전구체 T 또는 B 세포의 확장을 유도할 수 있다. 또한, 나노-aAPC는 전구체 T 또는 B 세포 분리를 한 단계에서 항원-특이적 자극과 결합시킬 수 있다.
T 세포 수용체는 T 세포 수용체를 자극시키고 이후 siRNA와 같은 내부세포 카고를 전달시키는 나노-aAPC에 대한 가능성을 제안하며, 관여(engagement)한 후 내부화된다(40).
TCR-MHC 상호작용은 세포7에 존재하는 MHC 및 세포-크기의 MHC-피복된 입자8 -11 에 대해 광범위하게 연구하였으나, 세포-나노입자 계면에서 수용체-리간드 상호 작용은 잘 설명되지 않았었다.12 아래 및 특정 실시예에 기재된 바와 같이, 나노입자 결합 및 세포 활성은 막 공간 조직(membrane spatial organization)에 민감하며, 이는 특히 T 세포 활성 동안 중요하고, 자기장을 사용하여 클러스터-기반 나노입자를 조작하여 활성을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성은 지속적으로 강화된 나노스케일 TCR 클러스터링 13-16의 상태를 유도하고, 아래 기재된 바와 같이, 나노입자는 큰 입자가 존재하지 않는 방식의 이러한 클러스터링에 민감하다.
또한, TCR 클러스터와의 나노입자 상호작용은 수용체 유인(receptor triggering)을 강화시키는데 이용할 수 있다. T 세포 활성은 T 세포-APC 접촉 부위의 주변에서 초기에 형성되어 내부로 이주하는 가로지르는 수백개의 나노미터 "시그널링 클러스터(signaling cluster)"와 함께, 시그널링 단백질17을 응집시켜 매개된다.18 아래 기재된 바와 같이, 외부 자기장을 사용하여, TCR에 결합하는 상자성 나노-aAPC의 응집을 구동할 수 있으며, 이는 TCR 클러스터의 응집 및 나이브 T 세포의 강화된 활성을 야기한다.
자기장은 상자성 입자에 적절히 강한 힘을 발휘할 수 있도록 하지만, 이와 달리 생물학적으로 불활성하여, 입자 거동을 제어하기 위한 강력한 도구로 만든다.19 ,20 아래 기재된 방법에서, 상자성 나노-aAPC에 결합된 T 세포는 외부적으로 적용된 자기장의 존재하에 활성화된다. 나노-aAPC는 스스로 자화(magnetize)되며, 자기장 공급원 및 자기장 내 나노입자 근처 둘 다에 당겨지면서,20 ,21 비드를 유도하고, 이에 따라 TCR 응집은 aAPC-매개 활성을 향상시킨다.
아래 특정 실시예에서 입증된 바와 같이, 나노-aAPC는 나이브 T 세포와 비교하여 이미 활성화된 세포에서 보다 많은 TCR과 결합하고 더 큰 활성을 유도한다. 또한, 외부 자기장을 적용시켜 나이브 세포 상의 나노-aAPC 응집을 유도하여 생체외 및 이후 생체내 입양 전달 둘 다에서 T 세포 증식을 강화시킨다. 중요하게는, 흑생종 입양 면역요법 모델에서, 자기장에서 나노-aAPC에 의해 활성화된 T 세포는 종양 제거를 매개한다. 이에 따라, 적용된 자기장을 사용하여 나이브 T 세포 집단의 활성을 허용하며, 그렇지 않으면 자극에 빈약하게 반응한다. 이는 나이브 T 세포가, 장기간의 강한 T 세포 반응을 생성하는 더 큰 증식 용량 및 더 나은 능력으로 암 면역 요법43 -45에 대한 보다 차별화된 아류형(subtype)에 비해 보다 효과적임을 나타내는 것으로서, 면역요법의 중요한 특징이다. 따라서, 본 개시내용은 나노-aAPC를 T 세포의 자기장 강화된 활성에 커플링시켜 나이브 전구체로부터 확장된 항원-특이적 T 세포의 수율 및 활성을 증가시켜 감염성 질환, 암, 또는 자가 면역 질환을 가진 환자를 위한 세포 요법을 향상시키거나, 면역억제된 환자에게 예방학적 보호를 제공하는 신규 접근법을 제공한다.
나노-aAPC
달리 언급되지 않는 한, "나노-aAPC"는 적어도 하나의 림프구-효과 분자 및 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하는 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함한다. 선택적으로는, 항원은 항원 결합 클레프트에 결합될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한 일부 구현예에서, "나노-aAPC"는 적어도 하나의 T 세포 작용 분자 및 적어도 하나의 항원 결합 클레프트를 포함하는 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함한다. 선택적으로는, 항원은 항원 결합 클레프트에 결합될 수 있다.
나노-aAPC를 사용하여 항체 형성을 자극할 수 있다. 이들 구현예(본원에 또한, "항체-유도 나노-aAPC"로 언급됨)에서, 나노-aAPC는 적어도 하나의 B 세포 작용 분자(예를 들면, 아래 기재된 CD40 리간드, 사이토카인, 또는 사이토카인 분자 복합체) 및 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하거나 또는 B 세포의 표면 상에서 MHC-항원 복합체에 관여하는 적어도 하나의 분자 복합체를 포함한다.
나노입자
나노입자는 예를 들면, 철, 니켈, 알루미늄, 구리, 아연, 카드뮴, 티탄, 지르코늄, 주석, 납, 크롬, 망간, 및 코발트와 같은 금속; 산화 알루미늄, 산화 크롬, 산화철, 산화 아연, 및 산화 코발트와 같은 금속 산화물과 수화 산화물; 마그네슘, 알루미늄, 아연, 납, 크롬, 구리, 철, 코발트 및 니켈과 같은 금속 실리케이트; 청동, 황동, 스테인레스 스틸 등과 같은 합금으로 제조될 수 있다. 나노입자는 또한 셀룰로즈, 세라믹, 유리, 나일론, 폴리스티렌, 고무, 플라스틱, 또는 라텍스와 같은 비-금속 또는 유기 재료로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자는 금속 및 비-금속 또는 유기 화합물, 예를 들면, 메타크릴레이트- 또는 스티렌-피복된 금속 및 실리케이트 피복된 금속의 조합을 포함한다. 기재 물질(base material)은 물리적 또는 화학적 특성을 변경시키는 제제와 도핑될 수 있다. 예를 들면, 희토류 산화물은 알루미노실리케이트(aluminosilicate) 유리에 포함되어 고밀도를 갖는 상자성 유리 물질을 생성할 수 있다 (문헌 참고: White & Day, Key Engineering Materials Vol. 94-95, 181-208, 1994). 일부 구현예에서, 나노입자는 셀룰로오스, 덱스트란 등과 같은 생분해성 유기 물질을 포함하거나 생분해성 유기 물질로 이루어질 수 있다. 상업적으로 이용가능한 적합한 입자는 예를 들면, 니켈 입자[노바멧 스페셜티 프로덕트사 (Novamet Specialty Products, Inc., Wyckoff, N.J.)에 의해 시판되는 타입 123, VM 63, 18/209 A, 10/585A, 347355 및 HDNP; 스펙스사(Spex, Inc.)의 08841R; 알드리치(Aldrich)사의 01509BW), 스테인레스 스틸 입자[아메텍(Ametek)사의 P316L], 아연 더스트 (알드리치사), 팔라듐 입자[존 매티 일렉(John Matthey Elec)의 D13A17], 및 TiO2, SiO2, 또는 MnO2 입자(알드리치사)를 포함한다.
입자의 밀도는 입자가 샘플 현탁액을 통해 세포보다 훨씬 빠르게 별도로 가라앉도록 선택될 수 있다. 이에 따라, 입자는 높은 밀도의 물질로 구성되어 세포 분리 및 입자의 조작을 용이하게 하는 것이 바람직하다. 이러한 입자의 사용으로 입자를 중력하에 정착시켜 항원-특이적 T 세포, T 세포 전구체, B 세포 전구체, B 세포 또는 기타 세포로부터 입자를 분리하는 것이 용이해진다.
일부 구현예에서, 단백질이 나노입자의 표면에 결합되기 전에 나노입자는 피복된다. 피복 화학물질이 선택되면, 나노입자의 표면이 활성화되어 특정 단백질 분자의 특정 부착을 허용할 수 있다. 이에 따라, 피복은 다양한 T 세포 또는 B 세포 집단 또는 T 또는 B 전구체 세포 집단과의 최적 반응성 및 생체적합성의 관점에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 피복 화학물질이 무엇이든지 사용하여 더 나은 활성 화학에 대한 적합한 매트릭스를 제공한다. 수많은 이러한 피복이 당해분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 나노입자는 인간 혈청 알부민, 트리스(3-머캅토프로필)-N-글리실아미노)메탄 (미국 특허 제6,074,884호), 젤라틴-아미노덱스트란(미국 특허 제5,466,609호), 또는 아미노산 단독 중합체 또는 랜덤 공중합체로 피복될 수 있다.일부 구현예에서, 폴리(글루탐산, 리신, 티로신)[6 : 3 : 1]을 포함하는 랜덤 아미노산 공중합체를 사용하고; 이러한 공중합체는 시그마 케미칼 회사의 제품 번호 P8854으로 이용가능하다. 이는 6부 글루탐산, 3부 라이신, 및 1부 타이로신의 비로 글루탐산, 라이신, 및 타이로신을 포함하는 아미노산의 선형 랜덤 중합체이다. 일부 구현예에서, 아미노산 공중합체는 1부 타이로신에 대해 4부 라이신의 비로 라이신 및 타이로신을 포함하여 사용된다. 일부 구현예에서, 아미노산 공중합체는 1부 알라닌에 대해 1부 라이신의 비로 라이신 및 알라닌을 포함하여 사용된다.
일부 구현예에서, 나노입자를 합성 중합체로 피복한 다음, 합성 중합체는 T 또는 B 세포 작용 분자, 항원 제시 복합체, 또는 B 세포 표면 면역글로불린 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체에 관여하는 분자 복합체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 단백질 분자에 연결되기 전에 활성화된다.
일부 구현예에서, 실리카로 피복된 나노입자가 특히, 니켈 표면 (특히, 입자)에 매우 적합하다. 실리카 표면은 보다 일반적으로 사용되는 유기 고분자 표면에 비해 몇가지 장점을 갖는다. 전체 표면을 덮는 실라놀 잔기와 함께 상당히 균일하고 화학적으로 특성되며, 화학적이고 열적으로 안정하며, 단백질 및 기타 생분자를 부착하기 위한 트리에톡시실란의 아미노- 또는 에톡시-유도체와 안정적인 공유 커플링이 가능하다. 실란 유도체는 전체 표면을 덮어 표면 상의 특이적 상호작용 및 비-특이적 상호작용을 고도로 조절하는 2차 중합체의 단일층을 형성할 수 있다. 다양한 고체 지지체를 실리카로 피복하는 방법은 미국 특허 제2,885,399; 및 Birkmeyer et al., Clin Chem. 1987 Sep;33(9): 1543-7에 개시되어 있다. 예를 들면, 나노입자는 메타규산나트륨, 알루민산 나트륨, 및 붕산의 용액으로 배양시켜 표면 상에 침착되는 중합된 실리카를 형성할 수 있다. 실리카를 피복하는 다른 방법은 규산 나트륨을 나노입자와 혼합하고 pH를 95°C에서 황산으로 낮춘 다음 물로 세척하는 것이다. 문헌 참고(미국 특허 제2,885,366호; Eagerton, KONA 16, 46-58, 1998). 예를 들면, 니켈 표면은 0.2 N NaSO4 용액 중에 먼저 나노입자를 분산시키고 용액을 95°C에서 가열시킴으로써 피복될 수 있다. pH는 NaOH로 10으로 조절한다. 이후, 황산 중의 규산 나트륨을 가한 다음, 0.5 시간 동안 95°C에서 혼합한다. 지지체를 증류수로 수회 세척한다. 피복의 정도는 질산 분해(nitric acid digestion)에 대한 지지체의 저항을 측정함으로써 결정될 수 있다. X-선 분산을 기준으로하여 표면 화학 성분에 대한 ESCA 분석을 사용하여, 활성 잔기로 표면 피복 및 실란화(silanation)의 정도에 대한 정보를 제공하는 지지체 표면의 원소 조성물을 수득할 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자 상의 표면 매트릭스는 산화알루미늄과 같이 비-독성 금속산화물로 피복된 니켈 표면을 "보호"함으로써 제공된다. 기타 피복하는 방법은 나노입자의 표면에 산화알루미늄과 같은 금속 산화물을 증착시키는 방법을 포함한다. 산화알루미늄은, 단백질 컨쥬게이션(protein conjugation)에 작용할 수 있는 낮은 비-특이적 결합 특성을 갖는 불활성 표면을 제공하기 때문에 유용한 매트릭스이다.
산화알루미늄 피복은 비정질의 산화알루미늄의 연속적인 박막이 나노입자 위로 알루니륨 졸-겔을 증발시킨 다음, 공기 중 베이킹(baking)시켜 산화물을 형성하함으로써 형성되는 졸-겔 과정과 같은 다수의 방법으로 제공될 수 있다. 문헌 참고(Ozer et al, SPIE 3789, 77-83, 1999). 기타 구현예에서, 통상적인 물리적 기상 증착 기술(Smidt, Inter Mat Rev 35, 21-27, 1990) 또는 화학적 기상 증착(Koh 등., Thin Solid Films 304, 222-24, 1997)을 사용할 수 있다. 니켈 나노입자를 사용하는 경우, 이러한 피복의 두께를 조절하여 니켈 침출(nickel leaching)을 최소화하면서 충분한 안정성을 제공할 수 있다. 니켈 밀봉(sealing)의 성공은 니켈 이온의 화학적 정량법에 의해 시험될 수 있다. 나노입자는 다양한 완충제 및 생물학적 유체로 다양한 온도에서 배양될 수 있고, 이들 배지에서 니켈 이온의 수준을 측정할 수 있다.
표면 피복의 완전성(completeness)은 표면 침출법을 통해 결정될 수 있다. 예를 들면, 니켈 나노입자의 표면은 유리 또는 기타 비-반응성 금속으로 완전히 피복될 경우, 나노입자는 산성 조건하에 니켈 침출에 내성적이다. 예를 들면, 피복된 니켈 나노입자의 공지된 질량은 10% 질산에서 배양될 수 있고, 24시간 동안 관찰될 수 있다. 니켈이 용액에 용해되면, 녹색으로 변한다. 미처리된 니켈은 용액을 즉시 녹색으로 변화시킨다. 표면 상에 산화니켈층을 갖는 니켈 나노입자는 약 20분에 용액을 녹색으로 변화시킨다. 위에 기재된 실리카의 층으로 피복된 나노입자는 8시간 넘게 질산에 내성적이며, 이는 두꺼운 층의 실리카가 표면상에 증착되는 것을 나타낸다. 또한, 나노입자는 B 또는 T 세포 활성(아래에 기재됨)에 사용된 배양 조건과 유사한 세포 배양 배지에서 지지체를 배양시킴으로써 수성 조건에서 시험될 수 있다. 용액 내로 침출된 니켈의 양은 원자 흡수 분광법으로 측정될 수 있다.
목적하는 경우, 나노입자는 피복되기 전에 전처리될 수 있다. 예를 들면, 나노입자를 전처리하여, 지지체를 살균하고 탈발열(depyrogenate)시킬 수 있을 뿐만 아니라, 지지체의 표면 상에 산화층을 생성할 수 있다. 이러한 전처리는 금속성 나노입자를 사용하는 경우에 특히 유익하다. 일부 구현예에서, 전처리는 약 2-6시간 동안, 바람직하게는 약 5시간 동안, 약 200 내지 350°C, 바람직하게는 약 250°C의 범위 내 온도에서 니켈 나노입자를 가열하는 단계를 포함한다.
흡착 또는 공유 결합을 포함하는 직접적인 화학 결합에 의해 분자는 나노입자에 직접적으로 부착될 수 있다. 문헌 참고(Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996). 분자 자체는 친핵기, 이탈기, 또는 친전자기를 포함하여 다수의 화학 작용기로 직접적으로 활성화될 수 있다. 작용기를 활성화시키는 것은 알킬 및 아실 할라이드, 아민, 설프하이드릴(sulfhydryl), 알데히드, 불포화 결합, 하이드라지드(hydrazide), 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 케톤, 및 화학적 결합을 위해 활성화하는 공지된 기타 그룹을 포함한다. 대안적으로는, 분자는 소분자-커플링제를 사용하여 나노입자에 결합될 수 있다. 커플링제의 비-제한적인 예는 카보디이미드, 말레이미드, N-히드록시 숙신이미드 에스테르, 비스클로로에틸아민, 글루타르알데히드, 애니하이드라이드(anyhydride) 등과 같은 이작용 알데히드를 포함한다. 기타 구현예에서, 분자는, 당해분야에 잘 공지된 비오틴스트렙타비딘 결합 또는 커플링과 같은 친화성 결합을 통해 나노입자에 커플링될 수 있다. 예를 들면, 스트렙타비딘은 공유 부착 또는 비-공유 부착에 의해 나노입자에 결합될 수 있고, 비오티닐화된 분자는 당해분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 문헌 참고(Hermanson, 1996).
나노입자에 대한 공유 결합을 고려하면, 지지체는, 전형적으로 링커를 통해 적합한 반응물에 공유 부착하는데 이용가능한 하나 이상의 화학 잔기 또는 작용기를 함유하는 중합체로 피복될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 중합체는 적절한 링커를 통해 분자를 공유적으로 커플링하는데 이용가능한 라이신의 ε-아미노기와 같은 기를 가질 수 있다. 또한, 본 개시내용은 제2 피복을 나노입자에 배치시켜 이들 작용기를 제공하는 조건을 고려한다.
활성 화학을 사용하여 나노입자의 표면에 분자의 특이적이고 적합한 부착을 허용할 수 있다. 단백질을 작용성기에 부착하는데 사용될 수 있는 다수의 방법이 존재한다; 문헌 참고(Hermanson, 1996). 예를 들면, 일반적인 가교제 글루타르알데히드를 사용하여, 2단계 공정에서 단백질 아민기를 아민화된 나노입자 표면에 부착할 수 있다. 생성된 결합은 가수분해적으로 안정적이다. 기타 방법으로는 단백질 상의 아민과 반응하는 n-하이드로-숙신이미도 (NHS) 에스테르를 함유하는 가교제, 아민-, 술프히드릴-, 또는 히스티딘- 함유 단백질과 반응하는 활성 할로겐을 함유하는 가교제, 아민 또는 술프히드릴기와 반응하는 에폭사이드, 말레이미드기 및 술프히드릴기 사이의 콘쥬게이션(conjugation)을 함유하는 가교제의 사용, 및 펜던트 슈가(pendant sugar) 잔기의 과요오드산염 산화후 환원성 아민화에 의한 단백질 알데히드기의 형성을 포함한다.
일부 구현예에서, 3-아미노프로필트리에톡시실란을 사용하여 단백질 분자를 실리카 피복에 부착한다 (Weetall & Filbert, Methods Enzymol. 34, 59-72, 1974).이 화합물은 표면을 보다 소수성으로 만드는 동시에 실리카 표면과 안정적인 공유결합을 형성한다. 실란화 반응(silanation reaction)은 낮은 pH 수성 배지에서 수행될 수 있으며, 이는 콘쥬게이션을 위해 이용가능한 아미노기를 가진 단층을 형성시키는 것으로 알려져있다. 단백질은 호모이작용적 커플링제(homobifunctional coupling agent) 글루타르알데히드를 통해 또는 SMCC와 같은 헤테로이작용성 제제에 의해 부착될 수 있다. 단백질 부착 후, 나머지 표면-연관 커플링제는 다양한 단백질, 친수성 중합체, 및 아미노산으로 배양시킴으로써 활성화될 수 있다. 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜은 특히 적절한데, 그 이유는 이들이 단백질 및 세포가 고체상에 비-특이적으로 결합하는 것을 차단하기 때문이다.
일부 구현예에서, 아미노실란화(aminosilanation)을 사용하여 산화알루미늄-피복된 나노입자의 표면을 활성화시킨다. 문헌 참고(미국 특허 제4,554,088호, 1985). 산화알루미늄 피복된 나노입자의 표면을 활성화시키는 다른 방법은 glu-lys-tyr 트리펩타이드와 같이 강하게 접착하는 중합체를 흡착하는 것이다. 트리펩타이드 중합체는, 호모이작용성 가교제, 예를 들면, 디플루오로디니트로벤젠을 이용하는 반응, 또는 글루타르알데히드를 이용하는 반응에 의해 라이신 아민을 통해 활성화시킬 수 있다. 이후, 단백질은 활성화된 표면에 직접적으로 부착될 수 있다.
나노입자 표면에 특이적 단백질을 부착하는 것은 단백질의 직접적인 커플링 또는 간접적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 특정 단백질은 스스로 직접적인 부착 또는 콘쥬게이션을 부여하는 반면, 기타 단백질 또는 항체는 항-마우스 IgG 또는 스트렙타비딘과 같은 링커 또는 스페이서 단백질에 결합시 더 나은 기능적 활성을 유지한다. 바람직한 경우, 링커 또는 부착 단백질을 사용할 수 있다.
동일한 나노입자 상의 특정 단백질의 비는 항원 또는 항체 제시(presentation)에서 나노입자의 유효성을 증가시키기 위하여 변할 수 있다. 예를 들면, 항-CD28 (신호 2)에 대한 A2-Ig (신호 1)의 최적의 비는 다음과 같이 시험될 수 있다. 나노입자는 30: 1, 10: 1, 3: 1, 1 : 1, 0.3: 1; 0.1 : 1, 및 0.03: 1과 같은 다양한 비로 A2-Ig 및 항-CD28과 커플링된다. 지지체에 커플링된 단백질의 총량은 일정유지(예를 들면, 150 mg/ml의 입자들)하거나 또는 변할 수 있다. 사이토킨 방출 및 성장과 같은 이펙터 기능이 T 세포 활성 및 분화 보다 신호 1 대 신호 2에 대한 상이한 요건을 가질 수 있기 때문에 이들 기능들은 별개로 검정(assay)될 수 있다.
나노입자들은, 지지체가 생성되어 발생하는 첨가 및 반응을 평가하기 위한 몇가지 분석 검정에 의해 특징지어질 수 있다. 이들은 아민 및 알데히드와 같은 작용기에 대한 검정, 및 특정 유형의 단백질 분자의 결합을 위한 검정을 포함한다. 또한, 작용기 검정을 사용하여 나노입자의 생물학적 활성을 평가할 수 있다. 나노입자의 표면에 결합된 단백질의 양은 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 결합된 단백질은 280 nm의 흡광도를 사용하여 반응 용액으로부터 제거되는 단백질의 양을 결정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 이러한 실시예에서, 나노입자에 첨가하기 전 및 후에 반응 용액의 단백질 함량은 280 nm의 흡광도로 측정하고 비교한다. 임의의 세척 용액 내 함유된 단백질의 양은 또한 측정되며 후반응 용액(post reaction solution)에서 측정된 양에 더해진다. 이의 차이는 나노입자의 표면에 결합된 양을 나타낸다. 상기 방법을 사용하여 상이한 반응 조건의 결합 효율에 대해 빠르게 스크리닝 할 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자에 결합된 단백질의 양은 표지된 항원 및 항체의 결합 검정에 의해 보다 직접적인 검정으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 다양한 농도의 항체-콘쥬게이션된 나노입자는 일정한 농도의 HRP-표지된 항원 또는 염소-항-마우스 IgG로 배양될 수 있다. 이러한 지지체는 완충액에서 세척되어 미결합 표지된 단백질이 제거된다. OPD 기질을 사용하는 지지체-연관 HRP를 측정하여 결합 표지된 단백질의 농도를 제공한다. HRP-표지된 항체는 상업적으로 수득될 수 있거나 또는 문헌(Avrameas & Ternync, Immunochemistry 8, 1175-79, 1971)의 글루타르알데히드 방법을 사용하여 HRP로 표지될 수 있다.
위에 기재된 방법들은 공유 결합된 단백질 및 비-공유 결합된 단백질 둘 다를 측정한다. 2개 유형의 결합들 사이를 구별하기 위해서, 나노입자를 6 M 염화구아니딘 또는 8 M 요소와 같은 강한 카오트로프(chaotrope)로 세척할 수 있다. 비-특이적 결합은 이들 조건에 의해 방해되고, 나노입자를 세척하는 단백질의 양은 280 nm의 흡광도에 의해 측정될 수 있다. 결합된 단백질의 총량 및 카오트로프로 세척된 양 사이의 차이는 단단히 결합되고 공유 부착되기 쉬운 단백질의 양을 나타낸다.
나노입자의 배열은 형상에서 불규칙한 것부터 구형인 것까지 변할 수 있고/있거나, 평평하지 않거나 불규칙한 표면인 것부터 매끄러운 표면인 것까지 변할 수 있다. 바람직한 나노입자의 특징은 ATR이 제조되고/되거나 사용될 특정 조건에 따라 선택될 수 있다.
나노입자들은 균일한 또는 다양한 크기를 가질 수 있다. 입자 크기 분포는, 예를 들면, 동적 광산란(dynamic light scattering)을 사용하여 편리하게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 나노입자는 2 내지 500 nm의 평균 입자 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
2-3 nm, 2-4 nm, 2-5 nm, 2-6 nm, 2-7 nm, 2-8 nm, 2-9 nm, 2-10 nm, 2-11 nm, 2-12 nm, 2-13 nm, 2-14 nm, 2-15 nm, 2-16 nm, 2-17 nm, 2-18 nm, 2-19 nm, 2-20 nm, 2-21 nm, 2-22 nm, 2- 23 nm, 2-24 nm, 2-25 nm, 2-26 nm, 2-27 nm, 2-28 nm, 2-29 nm, 2-30 nm, 3-4 nm, 3-5 nm, 3-6 nm, 3-7 nm, 3-8 nm, 3-9 nm, 3-10 nm, 3-11 nm, 3-12 nm, 3-13 nm, 3-14 nm, 3-15 nm, 3-16 nm, 3-17 nm, 3-18 nm, 3-19 nm, 3-20 nm, 3-21 nm, 3-22 nm, 3-23 nm, 3-24 nm, 3-25 nm, 3-26 nm, 3-27 nm, 3-28 nm, 3-29 nm, 3-30 nm, 4-5 nm, 4-6 nm, 4-7 nm, 4-8 nm, 4-9 nm, 4-10 nm, 4-11 nm, 4-12 nm, 4-13 nm, 4-14 nm, 4-15 nm, 4-16 nm, 4-17 nm, 4-18 nm, 4-19 nm, 4-20 nm, 4-21 nm, 4-22 nm, 4-23 nm, 4-24 nm, 4-25 nm, 4-26 nm, 4-27 nm, 4-28 nm, 4-29 nm, 4-30 nm, 5-6 nm, 5-7 nm, 5-8 nm, 5-9 nm, 5-10 nm, 5-11 nm, 5-12 nm, 5-13 nm, 5-14 nm, 5-15 nm, 5-16 nm, 5-17 nm, 5-18 nm, 5-19 nm, 5-20 nm, 5-21 nm, 5-22 nm, 5-23 nm, 5-24 nm, 5-25 nm, 5-26 nm, 5-27 nm, 5-28 nm, 5-29 nm, 5-30 nm, 6-7 nm, 6-8 nm, 6-9 nm, 6-10 nm, 6-11 nm, 6-12 nm, 6-13 nm, 6-14 nm, 6-15 nm, 6-16 nm, 6-17 nm, 6-18 nm, 6-19 nm, 6-20 nm, 6-21 nm, 6-22 nm, 6-23 nm, 6-24 nm, 6-25 nm, 6-26 nm, 6-27 nm, 6-28 nm, 6-29 nm, 6-30 nm, 7-8 nm, 7-9 nm, 7-10 nm, 7-11 nm, 7-12 nm, 7-13 nm, 7-14 nm, 7-15 nm, 7-16 nm, 7-17 nm, 7-18 nm, 7-19 nm, 7-20 nm, 7-21 nm, 7-22 nm, 7-23 nm, 7-24 nm, 7-25 nm, 7-26 nm, 7-27 nm, 7-28 nm, 7-29 nm, 7-30 nm, 8-9 nm, 8-10 nm, 8-11 nm, 8-12 nm, 8-13 nm, 8-14 nm, 8-15 nm, 8-16 nm, 8-17 nm, 8-18 nm, 8-19 nm, 8-20 nm, 8-21 nm, 8-22 nm, 8-23 nm, 8-24 nm, 8-25 nm, 8-26 nm, 8-27 nm, 8-28 nm, 8-29 nm, 8-30 nm, 9-10 nm, 9-11 nm, 9-12 nm, 9-13 nm, 9-14 nm, 9-15 nm, 9-16 nm, 9-17 nm, 9-18 nm, 9-19 nm, 9-20 nm, 9-21 nm, 9-22 nm, 9-23 nm, 9-24 nm, 9-25 nm, 9-26 nm, 9-27 nm, 9-28 nm, 9-29 nm, 9-30 nm, 10-11 nm, 10-12 nm, 10-13 nm, 10-14 nm, 10-15 nm, 10-16 nm, 10-17 nm, 10-18 nm, 10-19 nm, 10-20 nm, 10-21 nm, 10-22 nm, 10-23 nm, 10-24 nm, 10-25 nm, 10-26 nm, 10-27 nm, 10-28 nm, 10-29 nm, 10- 30 nm, 11-12 nm, 11-13 nm, 11-14 nm, 11-15 nm, 11-16 nm, 11-17 nm, 11-18 nm, 11-19 nm, 11-20 nm, 11-21 nm, 11-22 nm, 11-23 nm, 11-24 nm, 11-25 nm, 11-26 nm, 11-27 nm, 11-28 nm, 11-29 nm, 11-30 nm, 12-13 nm, 12-14 nm, 12-15 nm, 12- 16 nm, 12-17 nm, 12-18 nm, 12-19 nm, 12-20 nm, 12-21 nm, 12-22 nm, 12-23 nm, 12-24 nm, 12-25 nm, 12-26 nm, 12-27 nm, 12-28 nm, 12-29 nm, 12-30 nm, 13-14 nm, 13-15 nm, 13-16 nm, 13-17 nm, 13-18 nm, 13-19 nm, 13-20 nm, 13-21 nm, 13- 22 nm, 13-23 nm, 13-24 nm, 13-25 nm, 13-26 nm, 13-27 nm, 13-28 nm, 13-29 nm, 13-30 nm, 14-15 nm, 14-16 nm, 14-17 nm, 14-18 nm, 14-19 nm, 14-20 nm, 14-21 nm, 14-22 nm, 14-23 nm, 14-24 nm, 14-25 nm, 14-26 nm, 14-27 nm, 14-28 nm, 14- 29 nm, 14-30 nm, 15-16 nm, 15-17 nm, 15-18 nm, 15-19 nm, 15-20 nm, 15-21 nm, 15-22 nm, 15-23 nm, 15-24 nm, 15-25 nm, 15-26 nm, 15-27 nm, 15-28 nm, 15-29 nm, 15-30 nm, 16-17 nm, 16-18 nm, 16-19 nm, 16-20 nm, 16-21 nm, 16-22 nm, 16- 23 nm, 16-24 nm, 16-25 nm, 16-26 nm, 16-27 nm, 16-28 nm, 16-29 nm, 16-30 nm, 17-18 nm, 17-19 nm, 17-20 nm, 17-21 nm, 17-22 nm, 17-23 nm, 17-24 nm, 17-25 nm, 17-26 nm, 17-27 nm, 17-28 nm, 17-29 nm, 17-30 nm, 18-19 nm, 18-20 nm, 18- 21 nm, 18-22 nm, 18-23 nm, 18-24 nm, 18-25 nm, 18-26 nm, 18-27 nm, 18-28 nm, 18-29 nm, 18-30 nm, 19-20 nm, 19-21 nm, 19-22 nm, 19-23 nm, 19-24 nm, 19-25 nm, 19-26 nm, 19-27 nm, 19-28 nm, 19-29 nm, 19-30 nm, 20-21 nm, 20-22 nm, 20- 23 nm, 20-24 nm, 20-25 nm, 20-26 nm, 20-27 nm, 20-28 nm, 20-29 nm, 20-30 nm, 21-21 nm, 21-22 nm, 21-23 nm, 21-24 nm, 21-25 nm, 21-26 nm, 21-27 nm, 21-28 nm, 21-29 nm, 21-30 nm, 22-23 nm, 22-24 nm, 22-25 nm, 22-26 nm, 22-27 nm, 22- 28 nm, 22-29 nm, 22-30 nm, 23-24 nm, 23-25 nm, 23-26 nm, 23-27 nm, 23-28 nm, 23-29 nm, 23-30 nm, 24-25 nm, 24-26 nm, 24-27 nm, 24-28 nm, 24-29 nm, 24-30 nm, 25-26 nm, 25-27 nm, 25-28 nm, 25-29 nm, 25-30 nm, 26-27 nm, 26-28 nm, 26- 29 nm, 26-30 nm, 27-28 nm, 27-29 nm, 27-30 nm, 28-29 nm, 28-30 nm, 또는 29-30 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 의 평균 입자 직경을 갖는다: 25-500 nm+/-5 nm, 25-500 nm+/-10 nm, 25-500 nm+/-15 nm, 25-500 nm+/-20 nm, 25-500 nm+/-25 nm, 25-500 nm+/-30 nm, 25-500 nm+/-35 nm, 25-500 nm+/-40 nm, 25-500 nm+/-45 nm, 또는 25-500 nm+/-50 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는, 다음의 평균 입자 직경을 갖는다: 25-30 nm, 25-35 nm, 25-40 nm, 25-45 nm, 25-50 nm, 25-55 nm, 25-60 nm, 25-70 nm, 25-75 nm, 25-80 nm, 25-90 nm, 25-95 nm, 25-100 nm, 25-125 nm, 25-150 nm, 25-200 nm, 25- 300 nm, 25-400 nm, 30-35 nm, 35-40 nm, 35-45 nm, 35-50 nm, 35-55 nm, 35-60 nm, 35-70 nm, 35-75 nm, 35-80 nm, 35-90 nm, 35-95 nm, 35-100 nm, 35-125 nm, 35-150 nm, 35-200 nm, 35-300 nm, 35-400, 35-500 nm, 40-45 nm, 35-50 nm, 45-55 nm, 45-60 nm, 45-70 nm, 45-75 nm, 45-80 nm, 45-90 nm, 45-95 nm, 45-100 nm, 45-125 nm, 45-150 nm, 45-200 nm, 45-300 nm, 45-400, 45-500 nm, 50-55 nm, 50-60 nm, 50-70 nm, 50-75 nm, 50-80 nm, 50-90 nm, 50-95 nm, 50-100 nm, 50-125 nm, 50-150 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400, 50-500 nm, 55-60 nm, 55-70 nm, 55-75 nm, 55-80 nm, 55-90 nm, 55-95 nm, 55-100 nm, 55-125 nm, 55-150 nm, 55-200 nm, 55-300 nm, 55-400, 55-500 nm, 60-70 nm, 60-75 nm, 60-80 nm, 60-90 nm, 60-95 nm, 60-100 nm, 60-125 nm, 60-150 nm, 60-200 nm, 60-300 nm, 60-400, 60-500 nm, 65-70 nm, 65-75 nm, 65-80 nm, 65-90 nm, 65-95 nm, 65-100 nm, 65-125 nm, 65-150 nm, 65-200 nm, 65-300 nm, 65-400, 65-500 nm, 70-75 nm, 70-80 nm, 70-90 nm, 70-95 nm, 70-100 nm, 70-125 nm, 70-150 nm, 70-200 nm, 70-300 nm, 70-400, 70-500 nm, 75-80 nm, 75-90 nm, 75-95 nm, 75-100 nm, 75-125 nm, 75-150 nm, 75-200 nm, 75-300 nm, 75-400, 75-500 nm, 80-90 nm, 80-95 nm, 80-100 nm, 80-125 nm, 80-150 nm, 80-200 nm, 80-300 nm, 80-400, 80-500 nm, 85-90 nm, 85-95 nm, 85-100 nm, 85-125 nm, 85-150 nm, 85-200 nm, 85-300 nm, 85-400, 85-500 nm, 90-95 nm, 90-100 nm, 90-125 nm, 90-150 nm, 90-200 nm, 90-300 nm, 90-400, 90-500 nm, 100-125 nm, 100-150 nm, 100-200 nm, 100-300 nm, 100-400, 100-500 nm, 125-150 nm, 125-200 nm, 125-300 nm, 125-400, 125-500 nm, 150-200 nm, 150-300 nm, 150-400, 150-500 nm, 175-200 nm, 175-300 nm, 175-400, 175-500 nm, 200-300 nm, 200-400, 200-500 nm, 300-400, 300-500 nm, 또는 400-500 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25-30 nm+/-5 nm, 25-35 nm+/-5 nm, 25-40 nm+/-5 nm, 25-45 nm+/-5 nm, 25-50 nm+/-5 nm, 25-55 nm+/-5 nm, 25-60 nm+/-5 nm, 25-70 nm+/-5 nm, 25-75 nm+/-5 nm, 25-80 nm+/-5 nm, 25-90 nm+/-5 nm, 25-95 nm+/-5 nm, 25-100 nm+/-5 nm, 25-125 nm+/-5 nm, 25-150 nm+/-5 nm, 25-200 nm+/-5 nm, 25-300 nm+/-5 nm, 25-400 nm+/-5 nm, 30-35 nm+/-5 nm, 35-40 nm+/-5 nm, 35-45 nm+/-5 nm, 35-50 nm+/-5 nm, 35-55 nm+/-5 nm, 35-60 nm+/-5 nm, 35-70 nm+/-5 nm, 35-75 nm+/-5 nm, 35-80 nm+/-5 nm, 35-90 nm+/-5 nm, 35-95 nm+/-5 nm, 35-100 nm+/-5 nm, 35-125 nm+/-5 nm, 35-150 nm+/-5 nm, 35-200 nm+/-5 nm, 35-300 nm+/-5 nm, 35-400, 35-500 nm+/-5 nm, 40-45 nm+/-5 nm, 35-50 nm+/-5 nm, 45-55 nm+/-5 nm, 45-60 nm+/-5 nm, 45-70 nm+/-5 nm, 45-75 nm+/-5 nm, 45-80 nm+/-5 nm, 45-90 nm+/-5 nm, 45-95 nm+/-5 nm, 45-100 nm+/-5 nm, 45-125 nm+/-5 nm, 45-150 nm+/-5 nm, 45-200 nm+/-5 nm, 45-300 nm+/-5 nm, 45-400, 45-500 nm+/-5 nm, 50-55 nm+/-5 nm, 50-60 nm+/-5 nm, 50-70 nm+/-5 nm, 50-75 nm+/-5 nm, 50-80 nm+/-5 nm, 50-90 nm+/-5 nm, 50-95 nm+/-5 nm, 50-100 nm+/-5 nm, 50-125 nm+/-5 nm, 50-150 nm+/-5 nm, 50-200 nm+/-5 nm, 50-300 nm+/-5 nm, 50-400, 50-500 nm+/-5 nm, 55-60 nm+/-5 nm, 55-70 nm+/-5 nm, 55-75 nm+/-5 nm, 55-80 nm+/-5 nm, 55-90 nm+/-5 nm, 55-95 nm+/-5 nm, 55-100 nm+/-5 nm, 55-125 nm+/-5 nm, 55-150 nm+/-5 nm, 55-200 nm+/-5 nm, 55-300nm+/-5 nm, 55-400, 55-500 nm+/-5 nm, 60-70 nm+/-5 nm, 60-75 nm+/-5 nm, 60-80 nm+/-5 nm, 60-90 nm+/-5 nm, 60-95 nm+/-5 nm, 60-100 nm+/-5 nm, 60-125 nm+/-5 nm, 60-150 nm+/-5 nm, 60-200 nm+/-5 nm, 60-300 nm+/-5 nm, 60-400, 60-500 nm+/-5 nm, 65-70 nm+/-5 nm, 65-75 nm+/-5 nm, 65-80 nm+/-5 nm, 65-90 nm+/-5 nm, 65-95 nm+/-5 nm, 65-100 nm+/-5 nm, 65-125 nm+/-5 nm, 65-150 nm+/-5 nm, 65-200 nm+/-5 nm, 65-300 nm+/-5 nm, 65-400, 65-500 nm+/-5 nm, 70-75 nm+/-5 nm, 70-80 nm+/-5 nm, 70-90 nm+/-5 nm, 70-95 nm+/-5 nm, 70-100 nm+/-5 nm, 70-125 nm+/-5 nm, 70-150 nm+/-5 nm, 70-200 nm+/-5 nm, 70-300 nm+/-5 nm, 70-400, 70-500 nm+/-5 nm, 75-80 nm+/-5 nm, 75-90 nm+/-5 nm, 75-95 nm+/-5 nm, 75-100 nm+/-5 nm, 75-125 nm+/-5 nm, 75-150 nm+/-5 nm, 75-200 nm+/-5 nm, 75-300 nm+/-5 nm, 75-400, 75-500 nm+/-5 nm, 80-90 nm+/-5 nm, 80-95 nm+/-5 nm, 80-100 nm+/-5 nm, 80-125 nm+/-5 nm, 80-150 nm+/-5 nm, 80-200 nm+/-5 nm, 80-300 nm+/-5 nm, 80-400, 80-500 nm+/-5 nm, 85-90 nm+/-5 nm, 85-95 nm+/-5 nm, 85-100 nm+/-5 nm, 85-125 nm+/-5 nm, 85-150 nm+/-5 nm, 85-200 nm+/-5 nm, 85-300 nm+/-5 nm, 85-400, 85-500 nm+/-5 nm, 90-95 nm+/-5 nm, 90-100 nm+/-5 nm, 90-125 nm+/-5 nm, 90-150 nm+/-5 nm, 90-200 nm+/-5 nm, 90-300 nm+/-5 nm, 90-400, 90-500 nm+/-5 nm, 100-125 nm+/-5 nm, 100-150 nm+/-5 nm, 100-200 nm+/-5 nm, 100-300 nm+/-5 nm, 100-400, 100-500 nm+/-5 nm, 125-150 nm+/-5 nm, 125-200 nm+/-5 nm, 125-300 nm+/-5 nm, 125-400, 125-500 nm+/-5 nm, 150-200 nm+/-5 nm, 150-300 nm+/-5 nm, 150-400, 150-500 nm+/-5 nm, 175-200 nm+/-5 nm, 175-300 nm+/-5 nm, 175-400, 175-500 nm+/-5 nm, 200-300 nm+/-5 nm, 200-400, 200-500 nm+/-5 nm, 300-400, 300-500 nm+/-5 nm, 또는 400-500 nm+/-5 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25-30 nm+/-10 nm, 25-35 nm+/-10 nm, 25-40 nm+/-10 nm, 25-45 nm+/-10 nm, 25-100 nm+/-10 nm, 25-105 nm+/-10 nm, 25-60 nm+/-10 nm, 25-70 nm+/-10 nm, 25-75 nm+/-10 nm, 25-80 nm+/-10 nm, 25-90 nm+/-10 nm, 25-95 nm+/-10 nm, 25-100 nm+/-10 nm, 25-125 nm+/-10 nm, 25-150 nm+/-10 nm, 25-200 nm+/-10 nm, 25-300 nm+/-10 nm, 25-400 nm+/-10 nm, 30-35 nm+/-10 nm, 35-40 nm+/-10 nm, 35-45 nm+/-10 nm, 35-100 nm+/-10 nm, 35-105 nm+/-10 nm, 35-60 nm+/-10 nm, 35-70 nm+/-10 nm, 35-75 nm+/-10 nm, 35-80 nm+/-10 nm, 35-90 nm+/-10 nm, 35-95 nm+/-10 nm, 35-100 nm+/-10 nm, 35-125 nm+/-10 nm, 35-150 nm+/-10 nm, 35-200 nm+/-10 nm, 35-300 nm+/-10 nm, 35-400, 35-1000 nm+/-10 nm, 40-45 nm+/-10 nm, 35-100 nm+/-10 nm, 45-105 nm+/-10 nm, 45-60 nm+/-10 nm, 45-70 nm+/-10 nm, 45-75 nm+/-10 nm, 45-80 nm+/-10 nm, 45-90 nm+/-10 nm, 45-95 nm+/-10 nm, 45-100 nm+/-10 nm, 45-125 nm+/-10 nm, 45-150 nm+/-10 nm, 45-200 nm+/-10 nm, 45-300 nm+/-10 nm, 45-400, 45-1000 nm+/-10 nm, 50-105 nm+/-10 nm, 50-60 nm+/-10 nm, 50-70 nm+/-10 nm, 50-75 nm+/-10 nm, 50-80 nm+/-10 nm, 50-90 nm+/-10 nm, 50-95 nm+/-10 nm, 50-100 nm+/-10 nm, 50-125 nm+/-10 nm, 50-150 nm+/-10 nm, 50-200 nm+/-10 nm, 50-300 nm+/-10 nm, 50-400, 50-1000 nm+/-10 nm, 55-60 nm+/-10 nm, 55-70 nm+/-10 nm, 55-75 nm+/-10 nm, 55-80 nm+/-10 nm, 55-90 nm+/-10 nm, 55-95 nm+/-10 nm, 55-100 nm+/-10 nm, 55-125 nm+/-10 nm, 55-150 nm+/-10 nm, 55-200 nm+/-10 nm, 55-300 nm+/-10 nm, 55-400, 55-1000 nm+/-10 nm, 60-70 nm+/-10 nm, 60-75 nm+/-10 nm, 60-80 nm+/-10 nm, 60-90 nm+/-10 nm, 60-95 nm+/-10 nm, 60-100 nm+/-10 nm, 60-125 nm+/-10 nm, 60-150 nm+/-10 nm, 60-200 nm+/-10 nm, 60-300 nm+/-10 nm, 60-400, 60-1000 nm+/-10 nm, 65-70 nm+/-10 nm, 65-75 nm+/-10 nm, 65-80 nm+/-10 nm, 65-90 nm+/-10 nm, 65-95 nm+/-10 nm, 65-100 nm+/-10 nm, 65-125 nm+/-10 nm, 65-150 nm+/-10 nm, 65-200 nm+/-10 nm, 65-300 nm+/-10 nm, 65-400, 65-1000 nm+/-10 nm, 70-75 nm+/-10 nm, 70-80 nm+/-10 nm, 70-90 nm+/-10 nm, 70-95 nm+/-10 nm, 70-100 nm+/-10 nm, 70-125 nm+/-10 nm, 70-150 nm+/-10 nm, 70-200 nm+/-10 nm, 70-300 nm+/-10 nm, 70-400, 70-1000 nm+/-10 nm, 75-80 nm+/-10 nm, 75-90 nm+/-10 nm, 75-95 nm+/-10 nm, 75-100 nm+/-10 nm, 75-125 nm+/-10 nm, 75-150 nm+/-10 nm, 75-200 nm+/-10 nm, 75-300 nm+/-10 nm, 75-400, 75-1000 nm+/-10 nm, 80-90 nm+/-10 nm, 80-95 nm+/-10 nm, 80-100 nm+/-10 nm, 80-125 nm+/-10 nm, 80-150 nm+/-10 nm, 80-200 nm+/-10 nm, 80-300 nm+/-10 nm, 80-400, 80-1000 nm+/-10 nm, 85-90 nm+/-10 nm, 85-95 nm+/-10 nm, 85-100 nm+/-10 nm, 85-125 nm+/-10 nm, 85-150 nm+/-10 nm, 85-200 nm+/-10 nm, 85-300 nm+/-10 nm, 85-400, 85-1000 nm+/-10 nm, 90-95 nm+/-10 nm, 90-100 nm+/-10 nm, 90-125 nm+/-10 nm, 90-150 nm+/-10 nm, 90-200 nm+/-10 nm, 90-300 nm+/-10 nm, 90-400, 90-1000 nm+/-10 nm, 100-125 nm+/-10 nm, 100-150 nm+/-10 nm, 100-200 nm+/-10 nm, 100-300 nm+/-10 nm, 100-400, 100-1000 nm+/- 10 nm, 125-150 nm+/-10 nm, 125-200 nm+/-10 nm, 125-300 nm+/- 10 nm, 125-400, 125-1000 nm+/- 10 nm, 150-200 nm+/-10 nm, 150-300 nm+/-10 nm, 150-400, 150-1000 nm+/-10 nm, 175-200 nm+/-10 nm, 175-300 nm+/-10 nm, 175-400, 175-1000 nm+/-10 nm, 200-300 nm+/-10 nm, 200-400, 200-1000 nm+/-10 nm, 300-400, 300-1000 nm+/-10 nm, 또는 400-1000 nm+/-10 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25-30 nm+/-15 nm, 25-35 nm+/-15 nm, 25-40 nm+/-15 nm, 25-45 nm+/-15 nm, 25-150 nm+/-15 nm, 25-155 nm+/-15 nm, 25-60 nm+/-15 nm, 25-70 nm+/-15 nm, 25-75 nm+/-15 nm, 25-80 nm+/-15 nm, 25-90 nm+/-15 nm, 25-95 nm+/-15 nm, 25-100 nm+/-15 nm, 25-125 nm+/-15 nm, 25-150 nm+/-15 nm, 25-200 nm+/-15 nm, 25-300 nm+/-15 nm, 25-400 nm+/-15 nm, 30-35 nm+/-15 nm, 35-40 nm+/-15 nm, 35-45 nm+/-15 nm, 35-150 nm+/-15 nm, 35-155 nm+/-15 nm, 35-60 nm+/-15 nm, 35-70 nm+/-15 nm, 35-75 nm+/-15 nm, 35-80 nm+/-15 nm, 35-90 nm+/-15 nm, 35-95 nm+/-15 nm, 35-100 nm+/-15 nm, 35-125 nm+/-15 nm, 35-150 nm+/-15 nm, 35-200 nm+/-15 nm, 35-300 nm+/-15 nm, 35-400, 35-1500 nm+/-15 nm, 40-45 nm+/-15 nm, 35-150 nm+/-15 nm, 45-155 nm+/-15 nm, 45-60 nm+/-15 nm, 45-70 nm+/-15 nm, 45-75 nm+/-15 nm, 45-80 nm+/-15 nm, 45-90 nm+/-15 nm, 45-95 nm+/-15 nm, 45-100 nm+/-15 nm, 45-125 nm+/-15 nm, 45-150 nm+/-15 nm, 45-200 nm+/-15 nm, 45-300 nm+/-15 nm, 45-400, 45-1500 nm+/-15 nm, 50-155 nm+/-15 nm, 50-60 nm+/-15 nm, 50-70 nm+/-15 nm, 50-75 nm+/-15 nm, 50-80 nm+/-15 nm, 50-90 nm+/-15 nm, 50-95 nm+/-15 nm, 50-100 nm+/-15 nm, 50-125 nm+/-15 nm, 50-150 nm+/-15 nm, 50-200 nm+/-15 nm, 50-300 nm+/-15 nm, 50-400, 50-1500 nm+/-15 nm, 55-60 nm+/-15 nm, 55-70 nm+/-15 nm, 55-75 nm+/-15 nm, 55-80 nm+/-15 nm, 55-90 nm+/-15 nm, 55-95 nm+/-15 nm, 55-100 nm+/-15 nm, 55-125 nm+/-15 nm, 55-150 nm+/-15 nm, 55-200 nm+/-15 nm, 55-300 nm+/-15 nm, 55-400, 55-1500 nm+/-15 nm, 60-70 nm+/-15 nm, 60-75 nm+/-15 nm, 60-80 nm+/-15 nm, 60-90 nm+/-15 nm, 60-95 nm+/-15 nm, 60-100 nm+/-15 nm, 60-125 nm+/-15 nm, 60-150 nm+/-15 nm, 60-200 nm+/-15 nm, 60-300 nm+/-15 nm, 60-400, 60-1500 nm+/-15 nm, 65-70 nm+/-15 nm, 65-75 nm+/-15 nm, 65-80 nm+/-15 nm, 65-90 nm+/-15 nm, 65-95 nm+/-15 nm, 65-100 nm+/-15 nm, 65-125 nm+/-15 nm, 65-150 nm+/-15 nm, 65-200 nm+/-15 nm, 65-300 nm+/-15 nm, 65-400, 65-1500 nm+/-15 nm, 70-75 nm+/-15 nm, 70-80 nm+/-15 nm, 70-90 nm+/-15 nm, 70-95 nm+/-15 nm, 70-100 nm+/-15 nm, 70-125 nm+/-15 nm, 70-150 nm+/-15 nm, 70-200 nm+/-15 nm, 70-300 nm+/-15 nm, 70-400, 70-1500 nm+/-15 nm, 75-80 nm+/-15 nm, 75-90 nm+/-15 nm, 75-95 nm+/-15 nm, 75-100 nm+/-15 nm, 75-125 nm+/-15 nm, 75-150 nm+/-15 nm, 75-200 nm+/-15 nm, 75-300 nm+/-15 nm, 75-400, 75-1500 nm+/-15 nm, 80-90 nm+/-15 nm, 80-95 nm+/-15 nm, 80-100 nm+/-15 nm, 80-125 nm+/-15 nm, 80-150 nm+/-15 nm, 80-200 nm+/-15 nm, 80-300 nm+/-15 nm, 80-400, 80-1500 nm+/-15 nm, 85-90 nm+/-15 nm, 85-95 nm+/-15 nm, 85-100 nm+/-15 nm, 85-125 nm+/-15 nm, 85-150 nm+/-15 nm, 85-200 nm+/-15 nm, 85-300 nm+/-15 nm, 85-400, 85-1500 nm+/-15 nm, 90-95 nm+/-15 nm, 90-100 nm+/-15 nm, 90-125 nm+/-15 nm, 90-150 nm+/-15 nm, 90-200 nm+/-15 nm, 90-300 nm+/-15 nm, 90-400, 90-1500 nm+/-15 nm, 100-125 nm+/-15 nm, 100-150 nm+/-15 nm, 100-200 nm+/-15 nm, 100-300 nm+/-15 nm, 100-400, 100-1500 nm+/-15 nm, 125-150 nm+/-15 nm, 125-200 nm+/-15 nm, 125-300 nm+/-15 nm, 125-400, 125-1500 nm+/-15 nm, 150-200 nm+/-15 nm, 150-300 nm+/-15 nm, 150-400, 150-1500 nm+/-15 nm, 175-200 nm+/-15 nm, 175-300 nm+/-15 nm, 175-400, 175-1500 nm+/-15 nm, 200-300 nm+/-15 nm, 200-400, 200-1500 nm+/-15 nm, 300-400, 300-1500 nm+/-15 nm, 또는 400-1500 nm+/-15 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25-30 nm+/-20 nm, 25-35 nm+/-20 nm, 25-40 nm+/-20 nm, 25-45 nm+/-20 nm, 25-200 nm+/-20 nm, 25-205 nm+/-20 nm, 25-60 nm+/-20 nm, 25-70 nm+/-20 nm, 25-75 nm+/-20 nm, 25-80 nm+/-20 nm, 25-90 nm+/-20 nm, 25-95 nm+/-20 nm, 25-100 nm+/-20 nm, 25-125 nm+/-20 nm, 25-150 nm+/-20 nm, 25-200 nm+/-20 nm, 25-300 nm+/-20 nm, 25-400 nm+/-20 nm, 30-35 nm+/-20 nm, 35-40 nm+/-20 nm, 35-45 nm+/-20 nm, 35-200 nm+/-20 nm, 35-205 nm+/-20 nm, 35-60 nm+/-20 nm, 35-70 nm+/-20 nm, 35-75 nm+/-20 nm, 35-80 nm+/-20 nm, 35-90 nm+/-20 nm, 35-95 nm+/-20 nm, 35-100 nm+/-20 nm, 35-125 nm+/-20 nm, 35-150 nm+/-20 nm, 35-200 nm+/-20 nm, 35-300 nm+/-20 nm, 35-400, 35-2000 nm+/-20 nm, 40-45 nm+/-20 nm, 35-200 nm+/-20 nm, 45-205 nm+/-20 nm, 45-60 nm+/-20 nm, 45-70 nm+/-20 nm, 45-75 nm+/-20 nm, 45-80 nm+/-20 nm, 45-90 nm+/-20 nm, 45-95 nm+/-20 nm, 45-100 nm+/-20 nm, 45-125 nm+/-20 nm, 45-150 nm+/-20 nm, 45-200 nm+/-20 nm, 45-300 nm+/-20 nm, 45-400, 45-2000 nm+/-20 nm, 50-205 nm+/-20 nm, 50-60 nm+/-20 nm, 50-70 nm+/-20 nm, 50-75 nm+/-20 nm, 50-80 nm+/-20 nm, 50-90 nm+/-20 nm, 50-95 nm+/-20 nm, 50-100 nm+/-20 nm, 50-125 nm+/-20 nm, 50-150 nm+/-20 nm, 50-200 nm+/-20 nm, 50-300 nm+/-20 nm, 50-400, 50-2000 nm+/-20 nm, 55-60 nm+/-20 nm, 55-70 nm+/-20 nm, 55-75 nm+/-20 nm, 55-80 nm+/-20 nm, 55-90 nm+/-20 nm, 55-95 nm+/-20 nm, 55-100 nm+/-20 nm, 55-125 nm+/-20 nm, 55-150 nm+/-20 nm, 55-200 nm+/-20 nm, 55-300 nm+/-20 nm, 55-400, 55-2000 nm+/-20 nm, 60-70 nm+/-20 nm, 60-75 nm+/-20 nm, 60-80 nm+/-20 nm, 60-90 nm+/-20 nm, 60-95 nm+/-20 nm, 60-100 nm+/-20 nm, 60-125 nm+/-20 nm, 60-150 nm+/-20 nm, 60-200 nm+/-20 nm, 60-300 nm+/-20 nm, 60-400, 60-2000 nm+/-20 nm, 65-70 nm+/-20 nm, 65-75 nm+/-20 nm, 65-80 nm+/-20 nm, 65-90 nm+/-20 nm, 65-95 nm+/-20 nm, 65-100 nm+/-20 nm, 65-125nm+/-20 nm, 65-150 nm+/-20 nm, 65-200 nm+/-20 nm, 65-300 nm+/-20 nm, 65-400, 65-2000 nm+/-20 nm, 70-75 nm+/-20 nm, 70-80 nm+/-20 nm, 70-90 nm+/-20 nm, 70-95 nm+/-20 nm, 70-100 nm+/-20 nm, 70-125 nm+/-20 nm, 70-150 nm+/-20 nm, 70-200 nm+/-20 nm, 70-300 nm+/-20 nm, 70-400, 70-2000 nm+/-20 nm, 75-80 nm+/-20 nm, 75-90 nm+/-20 nm, 75-95 nm+/-20 nm, 75-100 nm+/-20 nm, 75-125 nm+/-20 nm, 75-150 nm+/-20 nm, 75-200 nm+/-20 nm, 75-300 nm+/-20 nm, 75-400, 75-2000 nm+/-20 nm, 80-90 nm+/-20 nm, 80-95 nm+/-20 nm, 80-100 nm+/-20 nm, 80-125 nm+/-20 nm, 80-150 nm+/-20 nm, 80-200 nm+/-20 nm, 80-300 nm+/-20 nm, 80-400, 80-2000 nm+/-20 nm, 85-90 nm+/-20 nm, 85-95 nm+/-20 nm, 85-100 nm+/-20 nm, 85-125 nm+/-20 nm, 85-150 nm+/-20 nm, 85-200 nm+/-20 nm, 85-300 nm+/-20 nm, 85-400, 85-2000 nm+/-20 nm, 90-95 nm+/-20 nm, 90-100 nm+/-20 nm, 90-125 nm+/-20 nm, 90-150 nm+/-20 nm, 90-200 nm+/-20 nm, 90-300 nm+/-20 nm, 90-400, 90-2000 nm+/-20 nm, 100-125 nm+/-20 nm, 100-150 nm+/-20 nm, 100-200 nm+/-20 nm, 100-300 nm+/-20 nm, 100-400, 100-2000 nm+/-20 nm, 125-150 nm+/-20 nm, 125-200 nm+/-20 nm, 125-300 nm+/-20 nm, 125-400, 125-2000 nm+/-20 nm, 150-200 nm+/-20 nm, 150-300 nm+/-20 nm, 150-400, 150-2000 nm+/-20 nm, 175-200 nm+/-20 nm, 175-300 nm+/-20 nm, 175-400, 175-2000 nm+/-20 nm, 200-300 nm+/-20 nm, 200-400, 200-2000 nm+/-20 nm, 300-400, 300-2000 nm+/-20 nm, 또는 400-2000 nm+/-20 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25-30 nm+/-25 nm, 25-35 nm+/-25 nm, 25-40 nm+/-25 nm, 25-45 nm+/-25 nm, 25-250 nm+/-25 nm, 25-255 nm+/-25 nm, 25-60 nm+/-25 nm, 25-70 nm+/-25 nm, 25-75 nm+/-25 nm, 25-80 nm+/-25 nm, 25-90 nm+/-25 nm, 25-95 nm+/-25 nm, 25-100 nm+/-25 nm, 25-125 nm+/-25 nm, 25-150 nm+/-25 nm, 25-200 nm+/-25 nm, 25-300 nm+/-25 nm, 25-400 nm+/-25 nm, 30-35 nm+/-25 nm, 35-40 nm+/-25 nm, 35-45 nm+/-25 nm, 35-250 nm+/-25 nm, 35-255 nm+/-25 nm, 35-60 nm+/-25 nm, 35-70 nm+/-25 nm, 35-75 nm+/-25 nm, 35-80 nm+/-25 nm, 35-90 nm+/-25 nm, 35-95 nm+/-25 nm, 35-100 nm+/-25 nm, 35-125 nm+/-25 nm, 35-150 nm+/-25 nm, 35-200 nm+/-25 nm, 35-300 nm+/-25 nm, 35-400, 35-2500 nm+/-25 nm, 40-45 nm+/-25 nm, 35-250 nm+/-25 nm, 45-255 nm+/-25 nm, 45-60 nm+/-25 nm, 45-70 nm+/-25 nm, 45-75 nm+/-25 nm, 45-80 nm+/-25 nm, 45-90 nm+/-25 nm, 45-95 nm+/-25 nm, 45-100 nm+/-25 nm, 45-125 nm+/-25 nm, 45-150 nm+/-25 nm, 45-200 nm+/-25 nm, 45-300 nm+/-25 nm, 45-400, 45-2500 nm+/-25 nm, 50-255 nm+/-25 nm, 50-60 nm+/-25 nm, 50-70 nm+/-25 nm, 50-75 nm+/-25 nm, 50-80 nm+/-25 nm, 50-90 nm+/-25 nm, 50-95 nm+/-25 nm, 50- 100 nm+/-25 nm, 50-125 nm+/-25 nm, 50-150 nm+/-25 nm, 50-200 nm+/-25 nm, 50- 300 nm+/-25 nm, 50-400, 50-2500 nm+/-25 nm, 55-60 nm+/-25 nm, 55-70 nm+/-25 nm, 55-75 nm+/-25 nm, 55-80 nm+/-25 nm, 55-90 nm+/-25 nm, 55-95 nm+/-25 nm, 55-100 nm+/-25 nm, 55-125 nm+/-25 nm, 55-150 nm+/-25 nm, 55-200 nm+/-25 nm, 55-300 nm+/-25 nm, 55-400, 55-2500 nm+/-25 nm, 60-70 nm+/-25 nm, 60-75 nm+/- 25 nm, 60-80 nm+/-25 nm, 60-90 nm+/-25 nm, 60-95 nm+/-25 nm, 60-100 nm+/-25 nm, 60-125 nm+/-25 nm, 60-150 nm+/-25 nm, 60-200 nm+/-25 nm, 60-300 nm+/-25 nm, 60-400, 60-2500 nm+/-25 nm, 65-70 nm+/-25 nm, 65-75 nm+/-25 nm, 65-80 nm+/-25 nm, 65-90 nm+/-25 nm, 65-95 nm+/-25 nm, 65-100 nm+/-25 nm, 65-125 nm+/-25 nm, 65-150 nm+/-25 nm, 65-200 nm+/-25 nm, 65-300 nm+/-25 nm, 65-400, 65-2500 nm+/-25 nm, 70-75 nm+/-25 nm, 70-80 nm+/-25 nm, 70-90 nm+/-25 nm, 70- 95 nm+/-25 nm, 70-100 nm+/-25 nm, 70-125 nm+/-25 nm, 70-150 nm+/-25 nm, 70- 200 nm+/-25 nm, 70-300 nm+/-25 nm, 70-400, 70-2500 nm+/-25 nm, 75-80 nm+/-25 nm, 75-90 nm+/-25 nm, 75-95 nm+/-25 nm, 75-100 nm+/-25 nm, 75-125 nm+/-25 nm, 75-150 nm+/-25 nm, 75-200 nm+/-25 nm, 75-300 nm+/-25 nm, 75-400, 75-2500 nm+/-25 nm, 80-90 nm+/-25 nm, 80-95 nm+/-25 nm, 80-100 nm+/-25 nm, 80-125 nm+/-25 nm, 80-150 nm+/-25 nm, 80-200 nm+/-25 nm, 80-300 nm+/-25 nm, 80-400, 80-2500 nm+/-25 nm, 85-90 nm+/-25 nm, 85-95 nm+/-25 nm, 85-100 nm+/-25 nm, 85-125 nm+/-25 nm, 85-150 nm+/-25 nm, 85-200 nm+/-25 nm, 85-300 nm+/-25 nm, 85-400, 85-2500 nm+/-25 nm, 90-95 nm+/-25 nm, 90-100 nm+/-25 nm, 90-125 nm+/- 25 nm, 90-150 nm+/-25 nm, 90-200 nm+/-25 nm, 90-300 nm+/-25 nm, 90-400, 90- 2500 nm+/-25 nm, 100-125 nm+/-25 nm, 100-150 nm+/-25 nm, 100-200 nm+/-25 nm, 100-300 nm+/-25 nm, 100-400, 100-2500 nm+/-25 nm, 125-150 nm+/-25 nm, 125-200 nm+/-25 nm, 125-300 nm+/-25 nm, 125-400, 125-2500 nm+/-25 nm, 150- 200 nm+/-25 nm, 150-300 nm+/-25 nm, 150-400, 150-2500 nm+/-25 nm, 175-200 nm+/-25 nm, 175-300 nm+/-25 nm, 175-400, 175-2500 nm+/-25 nm, 200-300 nm+/- 25 nm, 200-400, 200-2500 nm+/-25 nm, 300-400, 300-2500 nm+/-25 nm, 또는 400- 2500 nm+/-25 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 224, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
50+/-5 nm, 75+1-5 nm, 100+/-5 nm, 125+/-5 nm, 150+/-5 nm, 175+/-5 nm, 200+/-5 nm, 225+/-5 nm, 250+/-5 nm, 275+/-5 nm, 300+/-5 nm, 325+/-5 nm, 350+/-5 nm, 375+/-5 nm, 400+/-5 nm, 425+/-5 nm, 450+/-5 nm, 475+/-5 nm, 또는 500+/-5 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
50+/-10 nm, 75+/-10 nm, 100+/-10 nm, 125+/-10 nm, 150+/-10 nm, 175+/-10 nm, 200+/-10 nm, 225+/-10 nm, 250+/-10 nm, 275+/-10 nm, 300+/-10 nm, 325+/-10 nm, 350+/-10 nm, 375+/-10 nm, 400+/-10 nm, 425+/-10 nm, 450+/-10 nm, 475+/-10 nm, 또는 500+/-10 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
50+/-15 nm, 75+/-15 nm, 100+/-15 nm, 125+/-15 nm, 150+/-15 nm, 175+/-15 nm, 200+/-15 nm, 225+/-15 nm, 250+/-15 nm, 275+/-15 nm, 300+/-15 nm, 325+/-15 nm, 350+/-15 nm, 375+/-15 nm, 400+/-15 nm, 425+/-15 nm, 450+/-15 nm, 475+/-15 nm, 또는 500+/-15 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
50+/-20 nm, 75+/-20 nm, 100+/-20 nm, 125+/-20 nm, 150+/-20 nm, 175+/-20 nm, 200+/-20 nm, 225+/-20 nm, 250+/-20 nm, 275+/-20 nm, 300+/-20 nm, 325+/-20 nm, 350+/-20 nm, 375+/-20 nm, 400+/-20 nm, 425+/-20 nm, 450+/-20 nm, 475+/-20 nm, 또는 500+/-20 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
50+/-25 nm, 75+/-25 nm, 100+/-25 nm, 125+/-25 nm, 150+/-25 nm, 175+/-25 nm, 200+/-25 nm, 225+/-25 nm, 250+/-25 nm, 275+/-25 nm, 300+/-25 nm, 325+/-25 nm, 350+/-25 nm, 375+/-25 nm, 400+/-25 nm, 425+/-25 nm, 450+/-25 nm, 475+/-25 nm, 또는 500+/-25 nm.
일부 구현예에서, 나노입자는 다음의 평균 입자 직경을 갖는다:
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125 nm.
양자점
일부 구현예에서, 나노입자는 양자점(quantum dot)이다. 양자점은 전자기 에너지에 노출되는 경우, 차례로 에너지를 방출하는 벌크 반도체(bulk semiconductor)와 유사한 특성을 갖는 개별 나노입자이다. 양자점은 크기와 조성의 변화를 통해 적외선 영역, 가시광선, 및 심지어 자외선 범위에서 에너지에 민감하도록 가공될 수 있다. 또한, 이들은 각각 빛 또는 에너지 중의 하나를 생산하는 축광 또는 태양광 중의 하나로 설계될 수 있다.
콜로이드 반도체 양자점은 용액에 용해된 전구체 화합물로부터 전형적으로 합성되며, 종종 전구체, 유기 계면활성제 및 용매를 포함하는 3개의 성분 시스템에 기초한다. 전형적인 공정에서, 원하는 온도로 반응 매질을 가열하면, 전구체는 단량체로 화학적으로 전환한다. 일단 모노머가 충분히 높은 과포화 수준에 도달하면, 양자점은 핵 생성 과정을 통하여 성장을 시작한다. 성장 과정 동안 온도는 양자점 성장에 대한 최적 조건을 결정하는 인자들 중의 하나이다. 일반적으로, 온도는 합성 과정 동안 원자의 재배열 및 어닐링(annealing)을 허용하도록 충분히 높아야한다. 그러나, 온도는 결정 성장을 억제할만큼 너무 높아서는 안된다. 양자점의 성장과정에서 종종 조절되는 추가적 요소는 단량체 농도이다. 양자점의 성장 과정은 2개의 상이한 체제, "포커싱" 및 "디포커싱(defocusing)"에서 종종 발생한다. 높은 단량체 농도에서, 임계 크기(양자점이 성장하지도 수축하지도 않는 크기)는 매우 작아서, 거의 모든 입자가 성장한다. 이 체제에서, 상대적인 비율의 성장은 더 작은 입자의 성장을 촉진하며, 이는 "포커스(focus)"를 제공하고 입자 크기에 대한 높은 정도의 모노-분산도를 제공한다. 사이즈 포커싱(size focusing)은, 존재하는 평균 양자점 크기가 임계 크기보다 항상 조금 더 크도록 단량체 농도가 유지되는 경우에 최적화되도록 고려된다. 단량체 농도가 성장 동안 감소되면, 임계 크기는 존재하는 평균 크기보다 더 커지며, 분포는 오스트발트 숙성 (Ostwald ripening)으로 알려진 공정의 결과로서 "디포커싱"된다.
다수의 상이한 반도체 이원(binary) 및 삼원(ternary) 양자점을 생산하는 콜로이드 방법이 존재한다. 콜로이드 방법에 의해 생산된 양자점의 예는 카드뮴 셀레나이드 (CdSe), 카드뮴 황화물 (CDS), 인듐 비소 (InAs), 및 인듐 포스파이드 (InP) 카드뮴-텔루르-설파이드 (CdTeS)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
양자점을 포함하는 원자의 수는 100 내지 100,000일 수 있고, 전형적으로는, 다음 범위의 직경을 가질 수 있다:
2 내지 20 nm (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 1 1.5, 12.5, 13.5, 14.5, 15.5, 16.5, 17.5, 18.5, 19.5, 20.5, 2-3 nm, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-11, 2-12, 2-13, 2-14, 2-15, 2-16, 2-17, 2-18, 2-19, 2-20, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 17-18, 17-19, 17-20, 18-19, 18-20, 19-20 nm).
일부 구현예에서, 양자점 물질은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 탄소, 콜로이드 금, 게르마늄, 인듐 비소, 안티몬화 인듐, 갈륨 비소화물, 갈륨 질화물, 카드뮴/셀레늄/텔루라이드, 납, 산화 납, 황화 납, 납 셀레나이드, 인듐 갈륨 포스파이드, 실리콘, 콜로이드 은, 수은 카드뮴 텔루라이드, 철, 산화철, 코발트, 그래핀(graphene), 란탄, 세륨, 탄산 스트론튬, 망간, 산화 망간, 산화 니켈, 백금, 리튬, 티탄산 리튬, 탄탈륨, 구리, 팔라듐, 몰리브덴, 탄화 붕소, 탄화 규소, 탄화 티탄, 산화 텅스텐, 알루미늄, 니오븀, 툴륨 (thulium), 질화 알루미늄, 주석, 산화 알루미늄, 산화 주석, 안티몬, 디스프로슘 (dysprosium), 파세오다이늄(paseodynium), 산화안티몬, 에르븀(erbium), 레늄(rhenium), 바륨, 루테늄, 베릴륨, 사마륨, 산화 비스무트, 붕소, 가돌리늄, 질화 붕소, 산화 바나듐, 스트론튬, 이테르븀, 지르코늄, 다이아몬드 (C), 실리콘 (Si), 게르마늄 (Ge), 실리콘 카바이드 (SiC), 실리콘-게르마늄 (SiGe), 안티몬화 알루미늄(AlSb), 알루미늄 비소화물 (AlAs), 질화 알루미늄 (AlN), 인화 알루미늄 (AlP), 질화 붕소 (BN), 인화 붕소 (BP), 붕소 아세나이드 (BAs), 안티몬화 갈륨 (GaSb), 갈륨 비소 (GaAs), 질화 갈륨 (GaN), 갈륨 포스파이드(GaP), 안티몬화 인듐(InSb), 인듐 비소화물 (InAs), 질화 인듐(InN), 인화 인듐 (InP), 알루미늄 갈륨 비소화물 (AlGaAs, AlxGa1-xAs), 인듐 갈륨 비소화물 (InGaAs, InxGa1 - xAs), 인듐 갈륨 포스파이드 (InGaP), 알루미늄 인듐 비소화물 (AlInAs), 안티몬화 알루미늄 인듐(AlInSb), 비소화 갈륨 질화물 (GaAsN), 인화 갈륨 비소화물(GaAsP), 알루미늄 갈륨 질화물 (AlGaN), 알루미늄 갈륨 포스파이드 (AlGaP), 인듐 갈륨 질화물 (InGaN), 비화 인듐 안티모나이드 (InAsSb), 인듐 갈륨 안티모나이드(InGaSb), 알루미늄 갈륨 인듐 포스파이드(AlGaInP, 또는 InAlGaP, InGaAlP, 및 AlInGaP), 알루미늄 갈륨 비소화 포스파이드(AlGaAsP), 인듐 갈륨 비소화 포스파이드(InGaAsP), 알루미늄 인듐 비소화 포스파이드(AlInAsP), 알루미늄 갈륨 비소화 질화물(AlGaAsN), 인듐 갈륨 비소화, 질화물(InGaAsN), 인듐 알루미늄 비소화 질화물(InAlAsN), 갈륨 비소화 안티몬화 질화물(GaAsSbN), 갈륨 인듐 질화 비소화 안티몬화물(GaInNAsSb), 갈륨 인듐 비소화 안티몬화 포스파이드(GaInAsSbP), 카드뮴 셀레나이드 (CdSe), 황화 카드뮴 (CdS), 카드뮴 텔루라이드(CdTe), 산화 아연(ZnO), 아연 셀레나이드(ZnSe), 황화 아연(ZnS), 아연 텔루라이드(ZnTe), 카드뮴 아연 텔루라이드(CdZnTe, "CZT"), 수은 카드뮴 텔루라이드 (HgCdTe), 수은 아연 텔루라이드 (HgZnTe), 수은 아연 셀레나이드 (HgZnSe), 염화 제일 구리 (CuCl), 납 셀레나이드 (PbSe), 납 황화물 (PbS), 납 텔루라이드 (PbTe), 주석 황화 (SnS), 주석 텔루라이드 (SnTE), 납 주석 텔루라이드 (PbSnTe), 탈륨 주석 텔루라이드 (Tl2SnTe5), 탈륨 게르마늄 텔루라이드 (Tl2GeTe5), 비스무트 텔루라이드 (Bi2Te3), 카드뮴 포스파이드 (Cd3P2), 카드뮴 비소 (Cd3As2), 안티몬화 카드뮴 (CD3Sb2), 인화 아연(Zn3P2), 아연 비소화물 (Zn3As2), 아연 안티몬화 (Zn3Sb2), 납 (II) 요오다이드 (PbI2), 이황화 몰리브덴 (MOS2), 갈륨 셀레나이드 (GaSe), 주석 설파이드 (SnS), 황화 비스무트(Bi2S3), 구리 인듐 갈륨 셀레나이드 (CIGS), 백금 실리사이드 (PtSi), 비스무트(III)요오다이드 (BiI3), 수은 (II) 요오다이드 (HgI2), 탈륨 (I) 브로마이드 (TlBr), 이산화 티탄:아나타제 (TiO2), 산화구리(I) (Cu2O), 산화구리(II) (CuO), 이산화 우라늄 (UO2), 삼산화 우라늄(UO3) 등이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 양자점에 적합한 물질은 펜타센, 안트라센 및 루브렌을 포함하는 유기 반도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 양자점에 적합한 물질은 망간-도핑된 인듐 비소화물 및 갈륨 비소화물, 망간 도핑된 인듐 안티몬화물, 망간- 및 철-도핑된 산화인듐, 망간 도핑된 산화 아연, 및 크롬 도핑된 질화 알루미늄, 철- 도핑된 이산화 주석, n형 코발트-도핑된 산화 아연, 코발트-도핑된 이산화 티타늄(루틸 및 아나타제 둘 다), 크롬-도핑된 루틸, 철-도핑된 루틸 및 철-도핑된 아나타제, 니켈-도핑된 아나타제 및 망간-도핑된 이산화 주석과 같은 자성 반도체를 포함한다.
양자점은 다양한 기술을 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들면, 양자점은, 제2 밴드갭(band gap)의 제2 물질로 둘러싸인 제1 밴드갭을 갖는 제1 물질의 영역을 생성함으로써 형성될 수 있는데, 여기서 제2 밴드갭은 제1 밴드갭보다 크다. 이러한 공정에 의해 생산된 예시적인 양자점은, 아연 셀레나이드(ZnS) 쉘로 둘러싸인 카드뮴 셀레나이드(CdSe) 코어를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로는, 자기-조립된 양자점은, 하나의 물질이 격자 정합(lattice match)되지 않는 기판 상에 성장하는 경우, 분자빔 에피탁시(molecular beam epitaxy: MBE) 및 유기금속 기상 에피탁시(MOVPE) 동안 특정 조건 하에 자발적으로 핵을 생성한다. 성장층 및 기판 사이 생성된 스트레인(strain)은 2차원의 "습윤층(wetting layer)"의 상부에 밀착시켜 스트레인된 섬(coherently strained island)을 생성한다. 결과적으로 상기 섬은 쉘에 의해 둘러싸여 양자점을 형성할 수 있다.
또한, 개별 양자점은 원격으로 도핑된 양자우물 또는 반도체 헤테로 구조에 존재하는 2차원 전자 또는 정공 가스로부터 생성될 수 있다. 이러한 경우에, 표면은 포토레지스트의 박층으로 피복된다. 이후, 측면 패턴은 전자빔 리소그래피(electron beam lithography)에 의해 레지스트(resist)에서 한정된다. 이러한 패턴은 이후, 에칭(etching) 또는 전자 가스와 전극 사이에 외부 전압을 적용시키는 금속 전극(리프트-오프 공정)을 증착시킴으로써 전자 또는 정공으로 전달될 수 있다.
또한, 양자점은 우물의 두께에 있어서 단층 변동(monolayer fluctuation)으로 인해 양자우물 구조에서 형성될 수 있다. 대안적으로는, 양자점은 초음파 에어로졸 열분해 (UAP)에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 양자점은 예를 들면, 인듐/갈륨/포스파이드, 실리콘, 갈륨 비소화물, 카드뮴 텔루라이드, 구리 인듐 갈륨 셀레나이드, 인듐 갈륨 질화물, 탄소, 콜로이드 금, 콜로이드 은, 유기 물질, 예를 들어 중합체 풀러렌 이종 접합 (예를 들면, P3HT + C60), 유기 나노결정 태양 전지(예를 들면, 카드뮴 셀레나이드, 또는 카드뮴 텔루라이드), 염료 감응형 전지(예를 들면, 염료 및 티탄 옥사이드 또는 노벨륨 옥사이드), 또는 직렬 전지(tandem cell)(예를 들면, 구리 프탈로시아닌 + C60)로 형성되는 내부반도체 코어; 예를 들어, 아연 셀레나이드 또는 다른 적절한 재료로 형성되는 쉘(shell); 예를 들어, PEG의 지질 또는 다른 적절한 재료로 형성되는 피복; 및 비오틴, 스트렙타비딘(streptavadin), 접착 단백질, 비타민, 유기 및 무기 화합물, 탄수화물, 앱타머(aptamer), 아미노산, 지질, 히알루론산 또는 기타 적당한 단백질로 형성되는 생체기능적 물질(biofunctional material)을 포함한다.
항원 제시 복합체
항원 제시 복합체는 항원 결합 클레프트를 포함하고, T 세포 또는 T 세포 전구체를 제시(presentation) 하기 위한 항원에 결합할 수 있다. 항원 제시 복합체는 예를 들면, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 기능적 항원 결합 클레프트를 포함하는 융합 단백질, MHC 클래스 I 또는 클래스 II "분자 복합체" (아래 기재됨), 또는 CD1 패밀리의 멤버(예를 들어, CDla, CDlb, CDlc, CDld, 및 CDle)와 같은 비-표준 MHC-유사 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자 복합체이다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자 복합체는 다수의 유용한 특징을 갖는다. 예를 들면, 이들 분자 복합체는 면역글로불린 척추에 의해 제공된 안정성 및 분비 효율을 기준으로 매우 안정하고 생산하기 쉽다. 또한, Fc 부위의 면역글로불린을 변경시킴으로써, Fc 부위에 의해 제공된 생물학적 기능을 기준으로 상이한 생물학적 기능을 분자에 제공할 수 있다. 한 유형의 면역글로불린 유전자의 Fc 부위를 다른 유형으로 치환시키는 기술은 당해 분야에 알려져 있다.
"MHC 클래스 I 분자 복합체"는 미국 특허 제6,268,411호에 기재된다. "MHC 클래스 I 분자 복합체"는 면역글로불린 중쇄의 말단에서 형태적으로 온전한 방식으로 형성된다 (개략적인 도식을 위한 문헌 참고: 미국 특허 제6,268,411호의 도 1A).항원 펩타이드가 결합하는 MHC 클래스 I 분자 복합체는 항원-특이적 림프구 수용체(예를 들면, T 세포 수용체)에 안정적으로 결합할 수 있다.
MHC 클래스 I 분자 복합체는 적어도 2개의 융합 단백질을 포함한다. 제1 융합 단백질은 제1 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제1 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 제2 융합 단백질은 제2 MHC 클래스 Iα 쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 연관되어, 2개의 MHC 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트를 포함하는 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성한다. 면역글로불린 중쇄는 IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2β, IgG2α, IgE, 또는 IgA의 중쇄일 수 있다. 바람직하게는, IgG 중쇄를 사용하여 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성한다. 다가 MHC 클래스 I 분자 복합체가 바람직한 경우, IgM 또는 IgA 중쇄를 사용하여 5가 또는 4가 분자를 각각 제공할 수 있다. 또한, 다수의 면역글로불린 중쇄를 사용하여, 기타 원자가를 갖는 MHC 클래스 I 분자 복합체를 작제할 수 있다. MHC 클래스 I 분자 복합체의 작제는 미국 특허 제6,268,411호에 상세하게 기재되어 있다.
"MHC 클래스 II 분자 복합체"는 미국 특허 제6,458,354호, 미국 특허 제6,015,884호, 미국 특허 제6,140,113호, 및 미국 특허 제6,448,071호에 기재된다. MHC 클래스 II 분자 복합체는 적어도 4개의 융합 단백질을 포함한다. 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제1 및 2개의 제2 융합 단백질은 연관되어 MHC 클래스 II 분자 복합체를 형성한다. 각각의 제1 융합 단백질의 MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인 및 각각의 제2 융합 단백질의 MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인은 MHC 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트를 형성한다.
면역글로불린 중쇄는 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2β, IgG2α, IgE, 또는 IgA의 중쇄일 수 있다. 바람직하게는, IgGl 중쇄를 사용하여 2개의 항원 결합 클레프트를 포함하는 2가 분자 복합체를 형성한다. 선택적으로는, 중쇄의 가변 영역을 포함할 수 있다. IgM 또는 IgA 중쇄를 사용하여 5가 또는 4가 분자 복합체를 각각 제공할 수 있다. 또한, 다수의 면역글로불린 쇄를 사용하여, 기타 원자가를 갖는 분자 복합체를 작제할 수 있다.
MHC 클래스 II 분자 복합체의 융합 단백질은 면역글로불린 쇄 및 MHC 클래스 II 폴리펩타이드의 세포외 도메인 사이에 삽입된 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열의 길이는, 항원 결합 및 수용체 가교결합의 정도를 조절하는데 요구된 유연성에 따라 변할 수 있다. 또한, MHC 클래스 II 폴리펩타이드의 세포외 도메인이 추가 링커 영역없이 면역글로불린 분자에 직접적이고 공유 부착되도록 작제물을 설계할 수 있다.
링커 영역이 포함되는 경우, 본 영역은 적어도 3개 내지 30개를 초과하지 않는 아미노산을 바람직하게 함유할 것이다. 보다 바람직하게는, 링커는 약 5개 내지 20개를 초과하지 않는 아미노산으로; 가장 바람직하게는, 링커는 10개 미만의 아미노산이다. 일반적으로, 링커는 짧은 글리신/세린 스페이서로 구성되지만, 임의의 아미노산을 사용할 수 있다. 면역글로불린 중쇄를 MHC 클래스 IIβ 쇄의 세포외 도메인에 연결시키는데 바람직한 링커는 GLY-GLY-GLY-THR-SER-GLY (서열번호 1)이다. 면역글로불린 경쇄를 MHC 클래스 IIα 쇄의 세포외 도메인에 연결시키는데 바람직한 링커는 GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER (서열번호 2)이다.
T 세포 작용 분자
"T 세포 작용 분자"는 전구체 T 세포 또는 항원-특이적 T 세포에 작용하는 생물학적 효과를 갖는 분자이다. 이러한 생물학적 효과는 예를 들면, 전구체 T 세포의 CTL 내로의 분화, 헬퍼 T 세포(예를 들면, Th1, Th2), 또는 조절성 T 세포; T 세포의 증식; 및 T 세포 사멸의 유도를 포함한다. 이에 따라, T 세포 작용 분자는 T 세포 공자극 분자, 접착 분자, T 세포 성장 인자, 조절성 T 세포 유도 분자, 및 세포사멸-유도 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 나노-aAPC는 이러한 분자를 적어도 하나 포함하고; 선택적으로는, 나노-aAPC는 이러한 분자를 적어도 2개, 3개, 또는 4개 조합하여 포함한다.
T 세포 공자극 분자는 항원-특이적 T 세포의 활성에 기여한다. 이러한 분자는 CD28 (항체를 포함함), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT에 특이적으로 결합하는 분자, HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
나노-aAPC에 유용한 접착 분자를 사용하여 T 세포 또는 T 세포 전구체에 나노-aAPC를 접착시키는 것을 매개할 수 있다. 유용한 접착 분자는, 예를 들면, ICAM-1 및 LFA-3를 포함한다.
T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 준다. T 세포 성장 인자의 예는 사이토카인(예를 들면, 인터루킨, 인터페론) 및 초항원(superantigen)을 포함한다. 바람직한 경우, 사이토카인은 융합 단백질을 포함하는 분자 복합체에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 사이토카인 분자 복합체는 적어도 2개의 융합 단백질을 포함할 수 있다: 제1 사이토카인 및 면역글로불린 중쇄를 포함하는 하나의 제1 융합 단백질 및 제2 사이토카인 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하는 하나의 제2 융합 단백질. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 연관되어 사이토카인 분자 복합체를 형성한다. 다른 구현예에서, 사이토카인 분자 복합체는 적어도 4개의 융합 단백질을 포함한다: (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) 제1사이토카인을 포함하는 2개의 제1 융합 단백질 및 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 제2사이토카인을 포함하는 2개의 제2 융합 단백질. 2개의 제1 및 2개의 제2 융합 단백질은 연관되어 사이토카인 분자 복합체를 형성한다. 하나의 유형의 사이토카인 분자 복합체 내 제1 및 제2 사이토카인은 동일하거나 상이할 수 있다. 특히 유용한 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, 및 감마인터페론을 포함한다.
초항원은 강력한 T 세포 마이토겐(mitogen)이다. 초항원은 클래스 II 주요 조직적합성 (MHC) 분자에 1차 결합한 다음, 이원 복합체로서 Vβ-특이적 방식으로 T 세포 항원 수용체(TCR)에 결합하여 T 세포분화(mitogenesis)를 자극한다. 초항원은 포도상구균 장독소(예를 들면, 미국 특허 제5,859,207호에 기재된 SEA 및 이의 활성 부분; 미국 특허 제5,519,114호에 기재된 SEB, SEC, SED 및 SEE 레트로바이러스 초항원 (미국 특허 제5,519,114호); 연쇄상구균의 화농 외독소(SPE), 황색 포도상구균 독성 쇼크 증후군 독소 (TSST-1), 연쇄상구균 미토겐 외독소(SME) 및 연쇄상구균 초항원(SSA) (미국 제2003/0039655호); 및 미국 제2003/0036644호 및 미국 제2003/0009015호에 기재된 초항원과 같은 박테리아 장독소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조절성 T 세포 유도 분자는 조절성 T 세포의 분화 및/또는 유지를 유도하는 분자이다. 이러한 분자는 TGFβ, IL-10, 인터페론-α, 및 IL-15을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 참고 문헌(미국 제2003/0049696호, 미국 특허 제2002/0090724호, 미국 특허 제2002/0090357호, 미국 특허 제2002/0034500호, 및 미국 제2003/0064067호).
세포사멸-유도 분자는 세포사멸을 야기한다. 세포사멸-유도 분자는 독소[예를 들면, 리신 A 쇄, 돌연변이 슈도모나스 외독소, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 스트렙토니그린(streptonigrin), 보아마이신(boamycin), 사포린(saporin), 겔로닌(gelonin), 및 포크위드 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein)], TNFα, 및 Fas 리간드를 포함한다.
항원
다양한 항원은 항원 제시 복합체에 결합될 수 있다. 항원의 본성은 사용되는 항원 제시 복합체의 유형에 좌우된다. 예를 들면, 펩타이드 항원은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트에 결합될 수 있다. 비-표준적 MHC-유사 분자를 사용하여, 인지질, 탄수화물 복합체 등 (예를 들면, 미콜산 및 리포아라비노만난과 같은 박테리아막 성분)과 같은 비-펩타이드 항원을 제시할 수 있다. 본원에 사용된 "항원"은 "항원 펩타이드"를 또한 포함한다.
면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 펩타이드는 항원 제시 복합체에 결합될 수 있다. 항원 펩타이드는 종양-관련 항원, 자기 항원, 동종항원(alloantigen), 및 감염원의 항원을 포함한다.
"종양-연관된 항원"은 유래되는 종양에 의해 독점적으로 발현되고, 다수의 종양에서 발현되지만 정상 성인 조직[종양태아 항원 (oncofetal antigen)]에서 발현되지 않는 종양 항원을 공유하는 고유한 종양 항원, 및 종양이 발생하는 정상 조직에 의해 또한 발현되는 조직-특이적 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원은 예를 들면, 배아 항원, 비정상적 번역후 변형(abnormal post-translational modification)을 갖는 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양 유전자 또는 종양 억제제의 산물, 융합 단백질, 또는 종양바이러스 단백질일 수 있다.
다양한 종양-연관된 항원이 당해분야에 공지되어 있으며, 이들 다수는 상업적으로 이용가능하다. 종양태아 항원 및 배아 항원은 암배아 항원 (carcinoembryonic antigen) 및 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein) (대개는 배아를 발달시키는데 고도로 발현되지만, 간 및 결장 각각의 종양에 의해 빈번하게 고도로 발현됨), MAGE-1 및 MAGE-3 (흑색종, 유방암, 및 신경교종에서 발현됨), 태반 알칼리 포스파타제 시알릴-루이스 X (placental alkaline phosphatase sialyl-Lewis X) [선암 (adenocarcinoma)에서 발현됨], CA-125 및 CA-19 (위장, 간, 및 부인과 종양에서 발현됨), TAG-72 (대장 종양에서 발현됨), 상피 당단백질 2 (epithelial glycoprotein 2) (다수의 암종에서 발현됨), 췌장 종양배아 항원, 5T4 (위암에서 발현됨), 알파페토단백질 수용체(alphafetoprotein receptor) (다수의 종양 유형, 특히, 유방 종양에서 발현됨), 및 M2A (생식 세포 종양에서 발현됨)을 포함한다.
종양-연관된 분화 항원은 티로시나제(흑색종에서 발현됨) 및 특정 표면 면역글로불린(림프종에서 발현됨)을 포함한다.
돌연변이된 종양 유전자 또는 종양-억제된 유전자 산물은 다수의 종양 유형에서 발현되는 Ras 및 p53, Her-2/neu (유방암 및 부인과 암에서 발현됨), EGF-R, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 망막아세포종 유전사 산물, myc (폐암과 연관됨), ras, p53, 유방종양과 연관된 비돌연변이, MAGE-1, 및 MAGE-3 (흑색종, 폐암, 및 기타 암과 연관됨)을 포함한다.
융합 단백질은 크롬 골수성 백혈병에서 발현되는 BCR-ABL을 포함한다.
종양바이러스 단백질은 경부암종에서 발견되는 HPV 유형 16, E6 및 E7을 포함한다.
조직-특이적 항원은 멜라노트랜스페린 (melanotransferrin) MUC 1 (췌장암과 유방암에서 발현됨); CD10(일반적인 급성 림프구성 백혈병 항원 또는 CALLA라고 공지되어 있음) 또는 표면 면역글로불린 (B 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); IL-2 수용체, T 세포 수용체, CD45R, CD4+/CD8+ (T 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨)의 α 쇄; 전립선-특이적 항원 및 전립선산-포스파타제(전립선 암종에서 발현됨); GP 100, 멜란A/마트-1(MelanA/Mart-1), 티로시나제, gp75/브라운, BAGE, 및 S-100 (흑색종에서 발현됨); 사이토케라틴(각종 암종에서 발현됨); 및 CD19, CD20 및 CD37 (림프종에서 발현됨)을 포함한다.
또한, 종양-연관된 항원은 변경된 당지질 및 당단백질 항원, 예를 들면, 뉴라민산-함유 글리코스핑고지질(glycosphingolipid) (예를 들어, GM2와 GD2, 흑색종 및 일부 뇌종양에서 발현됨); 혈액 그룹 항원, 특히 암종에서 비정상적으로 발현 될 수 있는 T와 시알릴화(sialylated) Tn 항원; 및 뮤신, 예를 들면, CA-125, CA-19-9 (난소암에서 발현됨) 또는 불충분하게 글리코실화된(underglycosylated) MUC-1(유방암, 췌장암에서 발현됨)을 포함한다.
조직-특이적 항원은 상피 막 항원(다수의 상피세포암에서 발현됨), CYFRA 21-1(폐암에서 발현됨), Ep-CAM(PAN-암종에서 발현됨), CA125(난소 암에서 발현됨) 온전한 모노클로날 면역글로불린 또는 경쇄 단편(골수종에서 발현됨) 또는 베타 서브유닛을 포함한다.
"자기 항원(autoantigen)"은 유기체가 면역 반응을 생성하는 유기체 자체의 "자기 항원(self antigen)"이다. 자기항원은 굿파스처(Goodpasture) 증후군, 다발성 경화증, 그레이브스(Graves') 병, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병, 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 에디슨 병, 피부염 포진, 소아 지방변증(celiac disease), 및 하시모토 갑상선염과 같은 자가면역질환에 포함된다.
당뇨병-관련된 자기항원은 인슐린, 글루타민산 탈탄산효소(GAD) 및 기타 섬세포 자기항원(islet cell autoantigen), 예를 들면, ICA 512/IA-2 단백질 티로신 포스파타제, ICA12, ICA69, 인슈린 전구물질(preproinsulin) 또는 이의 면역학적 활성 단편 (예를 들면, 인슐린 B-쇄, A 쇄, C 펩타이드 또는 이의 면역학적 활성 단편), HSP60, 카르복시펩티다제 H, 페리페린(peripherin), 강글리오사이드 (ganglioside) (예를 들면, GM1-2, GM3) 또는 이의 면역학적 활성 단편을 포함한다.
황반변성-연관 자기항원은 보체경로분자(complement pathway molecule) 및 RPE, 맥락막(choroid), 및 망막(retina), 비트로넥틴(vitronectin), β 크리스탈린(crystalline), 칼레티쿨린(calreticulin), 세로트랜스페린(serotransferrin), 케라틴(keratin), 피루베이트 카복실라제(pyruvate carboxylase), C1, 및 빌린(villin) 2로부터의 다양한 자기항원을 포함한다.
기타 자기항원은 뉴클레오솜(nucleosome) (히스톤 및 DNA를 포함하는 입자); 리보핵산단백질 (RNP) 입자 (RNP 입자에서 특별 기능을 매개하는 RNA 및 단백질을 함유함), 및 이중 가닥 DNA를 포함한다. 기타 자기항원은 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide: MOG), 마이엘린-연관 당단백질 (MAG), 마이엘린/올리고덴드로사이트 기반 단백질 (MOBP), 올리고덴드로사이트 특이적 단백질 (Osp), 마이엘린 기반 단백질(MBP), 단백질지질 아포단백질(PLP), 갈락토스 세레브로시드 (GalC), 당지질, 스핑고지질 (sphingolipid), 인지질, 강글리오사이드 및 기타 신경세포 항원을 포함한다.
"동종항원"은 동일 종의 다른 멤버(member)에 의해 항원으로서 검출되는 대립 유전자(allele)의 직접 또는 간접 산물이다. 이러한 대립유전자의 직접 산물은 인코딩된 폴리펩타이드를 포함하고; 간접 산물은 대립유전자-인코딩된 효소에 의해 합성된 다당류 및 지질을 포함한다. 동종항원은 클래스 I 및 클래스 II 항원을 포함하는 메이저 및 마이너 조직적합성 항원(인간에서 HLA로 알려져있음), ABO, 루이스기, T 세포 및 B 세포의 항원, 및 단핵구/내피세포 항원과 같은 혈액 그룹 항원을 포함한다. HLA 특이성은 A(예를 들면, Al- A74, 특히, A1, A2, A3, A11, A23, A24, A28, A30, A33), B (예를 들면, B1-B77, 특히, B7, B8, B35, B44, B53, B60, B62), C (예를 들면, C1-C11), D (예를 들면, D1-D26), DR (예를 들면, DR1, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8, 및 DR11), DQ (예를 들면, DQ1-DQ9), 및 DP (예를 들면, DP1-DP6)를 포함한다.
"감염원의 항원"은 원생 동물, 세균, 진균(단세포 및 다세포 모두), 바이러스, 프리온, 세포 내 기생동물, 기생충 및 면역 반응을 유도할 수 있는 기타 감염제의 성분을 포함한다.
박테리아 항원은 그람 양성 구균, 그람 양성 바실러스, 그람 음성 박테리아, 혐기성 세균, 예를 들면, 악티노마이세타세아에(Actinomycetaceae)와 유기체, 바실라세아에(Bacillaceae)와 유기체, 바르토넬라세아에(Bartonellaceae)와 유기체, 보르데텔라에(Bordetellae)와 유기체, 캅토파가세아에(Captophagaceae)와 유기체, 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)와 유기체, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)와 유기체, 레지오넬라세아에(Legionellaceae)와 유기체, 마이크로코카세아에(Micrococcaceae)와 유기체, 마이코박테리아세아에(Mycobacteriaceae)와 유기체, 노카르디아세아에(Nocardiaceae)와 유기체, 파스퇴르엘라세아에(Pasteurellaceae)와 유기체, 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae)와 유기체, 스피로카에타세아에(Spirochaetaceae)와 유기체, 비브리오아세아에(Vibrionaceae)와 유기체 및 악티네토박터(Acinetobacter)속 유기체, 브루셀라(Brucella)속 유기체, 캄필로박터(Campylobacter)속 유기체, 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)속 유기체, 에윙겔라(Ewingella)속 유기체, 프란시셀라(Francisella)속 유기체, 가드네렐라(Gardnerella)속 유기체, 헬리코박터(Helicobacter)속 유기체, 레비네아(Levinea)속 유기체, 리스테리아(Listeria)속 유기체, 스트렙토바실러스(Streptobacillus)속 유기체 및 트로페리마(Tropheryma)속 유기체를 포함한다.
원생동물 감염인자의 항원은 말라리아원충(malarial plasmodia), 리슈마니아(Leishmania) 종, 트리파노소마(Trypanosoma) 종 및 주혈흡충(Schistosoma) 종을 포함한다.
진균 항원은 아스페르길루스(Aspergillus), 블라스토미세스(Blastomyces), 칸디다(Candida), 콕시디오이데스(Coccidioides), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 파라콕시시오이데스(Paracoccicioides), 스포로트릭스(Sporothrix), 털곰팡이(Mucorales)목의 유기체, 코롬마이코시스 (choromycosis) 및 진균을 유도하는 유기체 및 백선균(Trichophyton), 소포자균(Mcrosporum), 에피더모피톤(Epidermophyton) 및 말라세지아( Malassezia) 속의 유기체의 항원을 포함한다.
프리온의 항원은 스크래피(scrapie), 소 해면상 뇌증(BSE), 고양이 해면상 뇌증, 쿠루(kuru), 크로이츠 펠트-야콥병 (Creutzfeldt- Jakob) (CJD), 게르스트만-스트라슬러-샤인커(Gerstmann-Strassler- Scheinker) 질환 (GSS), 및 치명적인 가족성 불면증(fatal familial insomnia (FFI))를 야기하는 프리온의 시알로당단백질 PRP(sialoglycoprotein PRP) 27-30을 포함한다.
항원 펩타이드가 수득될 수 있는 세포내 기생충은 클라미디아세아에(Chlamydiaceae), 마이코플라즈마타세아에(Mycoplasmataceae), 아콜레플라즈마타세아에(Acholeplasmataceae), 리케차(Rickettsiae), 및 콕시엘라(Coxiella) 및 에를리시아(Ehrlichia) 속의 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
항원 펩타이드는 장내기생충(helminthes), 예를 들면, 선충류(nematodes), 흡충류(trematodes), 또는 촌충류(cestodes)로부터 수득될 수 있다.
바이러스 펩타이드 항원은 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 유두종 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 폭스 바이러스(poxvirus), HIV, 인플루엔자 바이러스, 및 CMV의 바이러스 펩타이드 항원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특히 유용한 바이러스 펩타이드 항원은 HIV 단백질, 예를 들면, HIV 개그 단백질(HIV gag protein) (멤브레인 앵커링 (membrane anchoring: MA) 단백질, 코어 캡시드 (core capsid: CA) 단백질 및 뉴클레오캡시드(NC) 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), HIV 폴리머라제, 인플루엔자 바이러스 매트릭스 (M) 단백질, 및 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질, B형 간염 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 코어 단백질(HBcAg), E형 간염 단백질(HBeAg), B형 간염 DNA 중합 효소, C형 간염 항원 등을 포함한다.
항원 제시 복합체에 대한 결합 항원
항원 펩타이드를 포함하여 항원은 미국 특허 제6,268,411호에 기재된 바와 같이 능동적으로 또는 수동적으로 항원 제시 복합체의 항원 결합 클레프트에 결합될 수 있다. 선택적으로는, 항원 펩타이드는 펩타이드 결합 클레프트에 공유결합될 수 있다.
목적하는 경우, 펩타이드 테더(peptide tether)를 사용하여 항원 펩타이드를 펩타이드 결합 클레프트에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 다수의 클래스 I MHC 분자의 결정 분석(crystallographic analyse)에서, β2M의 아미노 말단이 MHC 펩타이드 결합 클레프트에 거주하는 항원 펩타이드의 카복실 말단으로부터 약 20.5 옹스트롬만큼 떨어져있어 매우 근접함을 나타내고 있다. 이에 따라, 길이가 약 13개의 아미노산인 상당히 짧은 링커 서열을 사용하여 펩타이드를 β2M의 아미노산 말단에 연결시킬 수 있다. 서열이 적절한 경우, 펩타이드는 MHC 결합 그루브(MHC binding groove)에 결합될 것이다(미국 특허 제6,268,411호).
B 세포 작용 분자
"B 세포 작용 분자"는 B 세포 또는 B 세포 전구체 상의 생물학적 효과를 갖는 분자, 예를 들면, 증식 또는 항체 형성을 유도하는 분자이다. 이러한 분자는 CD40 리간드뿐만 아니라, 위에 기재된 바와 같은 사이토카인 및 사이토카인 분자 복합체를 포함한다. 사용된 사이토카인 분자의 유형에 따라, B 세포는 특정 유형의 항체를 생산하도록 격려될 수 있다. 예를 들면, IL-4는 IgE의 생성을 유도하는 반면, IL-5는 IgA의 생성을 유도한다.
항체-유도 나노-aAPC 상에서 사용되는 분자 복합체
항체 유도 나노-aAPC 상에서 사용되는 분자 복합체는 B 세포 표면 면역글로불린에 관여하거나 또는 B 세포의 표면 상에 MHC-항원 복합체에 관여하는 복합체이다. B 세포 표면 면역글로불린에 관여하는 분자 복합체는 나노-aAPC 표면에 복합된 항원을 포함한다. B 세포의 표면 상의 MHC-항원 복합체에 관여하는 분자 복합체는 T 세포 수용체(TCR) 및 TCR 분자 복합체를 포함한다. 나노-aAPC를 유도하는 항체는 이러한 분자 복합체의 1개 또는 2개 형태(즉, B 세포 표면 면역글로불린 관여 또는 MHC-항원 관여 형태)를 포함할 수 있다.
임의의 특정 항원에 대해 특이적인 TCR은 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 클로닝(cloning)될 수 있다. 문헌 참고(미국 제2002/0064521호). 클로닝된 항원-특이적 TCR은 상기와 같이 사용할 수 있거나, 아래 기재된 TCR 분자 복합체를 형성하도록 사용될 수 있다.
"TCR 분자 복합체"는 미국 특허 제6,458,354호, 미국 특허 제6,015,884호, 미국 특허 제6,140,113호, 및 미국 특허 제6,448,071호에 기재되어 있다. TCR 분자 복합체는 적어도 4개의 융합 단백질을 포함한다. 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) TCR α 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 및 (ii) TCR β 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 선택적으로는, 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) TCR γ 쇄의 세포외 도메인을 포함하고, 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 및 (ii) TCR δ 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 제1 및 제2 융합 단백질은 연관되어 TCR 분자 복합체를 형성한다. 각각의 제1 융합 단백질의 TCR 쇄의 세포외 도메인 및 각각의 제2 융합 단백질의 TCR 쇄의 세포외 도메인은 항원 인식 클레프트(antigen recognition cleft)를 형성한다.
면역글로불린 중쇄는 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2β, IgG2α, IgE, 또는 IgA의 중쇄일 수 있다. 바람직하게는, IgGl 중쇄를 사용하여 2개의 항원 인식 클레프트를 포함하는 2가 TCR 분자 복합체를 형성한다. 선택적으로는, 중쇄의 가변 영역을 포함할 수 있다. IgM 또는 IgA 중쇄를 사용하여 5가 또는 4가 TCR 분자 복합체를 각각 제공할 수 있다. 또한, 다수의 면역글로불린 쇄를 사용하여, 기타 원자가를 갖는 TCR 분자 복합체를 작제할 수 있다.
TCR 분자 복합체의 융합 단백질은 TCR 폴리펩타이드의 면역글로불린 쇄 및 TCR 폴리펩타이드의 세포외 도메인 사이에 삽입된 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열의 길이는, 항원 결합 및 가교결합의 정도를 조절하는데 요구된 유연성에 따라 변할 수 있다. 또한, TCR 폴리펩타이드의 세포외 도메인이 추가 링커 영역없이 면역글로불린 분자에 직접적이고 공유 부착되도록 작제물을 설계할 수 있다. 링커 영역이 포함되는 경우, 이러한 영역은 적어도 3개 내지 30개를 초과하지 않는 아미노산을 바람직하게 함유할 것이다. 보다 바람직하게는, 링커는 약 5개 내지 20개를 초과하지 않는 아미노산으로; 가장 바람직하게는, 링커는 10개 미만의 아미노산이다. 일반적으로, 링커는 짧은 글리신/세린 스페이서로 구성되지만, 임의의 아미노산을 사용할 수 있다. 면역글로불린 중쇄를 TCR α 또는 γ쇄의 세포외 도메인에 연결시키는데 바람직한 링커는 GLY-GLY-GLY-THR-SER-GLY (서열번호 1)이다. 면역글로불린 경쇄를 TCR β 또는 δ쇄의 세포외 도메인에 연결시키는데 바람직한 링커는 GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER (서열번호 2)이다.
나노-aAPC를 사용하여 특정 세포 집단을 유도하고 확장시키는 방법
항원-특이적 T 세포의 유도 및 확장
본 개시내용은 CTL, 헬퍼 T 세포, 및 조절성 T 세포를 포함하는 항원-특이적 T 세포의 형성 및 확장을 유도하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 다수의 전구체 T 세포를 포함하는 분리된 제제를, 항원이 항원 결합 클레프트에 결합하는 나노-aAPC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 나노-aAPC로 제제를 배양시켜 집단 내 전구체 세포를 유도시킴으로써 항원을 인식하는 항원-특이적 T 세포를 형성한다. 항원-특이적 T 세포는 아래 기재된 바와 같이, 전구체 T 세포를 나노-aAPC를 배양시킴으로써 수득될 수 있거나, 또는 통상적인 방법, 예를 들면, 수지상 세포로 배양시키는 방법으로 수득될 수 있거나, 또는 당해분야에 공지된 기타 유형의 인공 항원 제시 세포로 배양시키는 방법으로 수득될 수 있다.
전형적으로는, 제1 세포 집단 내에 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트는, 전구체 T 세포가 CD3에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지만, 항원 제시 복합체를 포함하지는 않는 입자와 배양되는 경우 형성되는 항원-특이적 T 세포의 수 또는 퍼센트보다 더 크다.
나노-aAPC를 사용하는 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 항원 제시 복합체, 결합된 항원, 및 T 세포 작용 분자의 임의의 조합물이 사용될 수 있다. 예를 들면, 나노-aAPC는 하나 이상의 T 세포 공자극 분자(동일하거나 상이함), 하나 이상의 조절성 T 세포 유도 분자(동일하거나 상이함), 하나 이상의 접착 분자(동일하거나 상이함), 및/또는 하나 이상의 T 세포 성장 인자(동일하거나 상이함)를 포함할 수 있다. 유사하게는, 나노-aAPC는 임의의 결합의 항원이 결합할 수 있고, 동일하거나 상이한, 하나 이상의 항원 제시 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 몇몇의 상이한 흑색종-연관된 항원(예를 들면, 임의의 또는 모든 티로시나제(tyrosinase), MAGE-1, MAGE-3, GP-100, 멜란-A/마트-1 (Melan A/Mart-1), gp75/브라운, BAGE, 및 S-100)은 하나 이상의 나노-aAPC 상에 항원 제시 복합체에 결합될 수 있다.
전구체 T 세포는 환자 또는 적합한 도너로부터 수득될 수 있다. 도너는 환자와 일란성 쌍생아일 필요가 없거나 심지어 환자와 관련이 없을 수도 있다. 그러나, 바람직하게는 도너 및 환자는 적어도 하나의 HLA 분자를 공유한다. 전구체 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직 및 종양을 포함하여 다수의 공급원(source)으로부터 수득될 수 있다. 선택적으로는, 당해분야에 이용가능한 T 세포주가 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 전구체 T 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같이 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득된다. 예를 들면, 개인의 순환 혈액으로부터 전구체 T 세포는 성분 채집술(apheresis) 또는 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)에 의해 수득될 수 있다. 성분 채집술의 산물은 전형적으로 T 세포 및 전구체 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 성분 채집술로 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 이후 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 매질에 세포를 놓는다. 세척 단계는, 당해분야에 공지된 방법, 예를 들면, 제조업자의 지시에 따라 반-자동 "관류" 원심분리기(예를 들면, 코베 2991 세포 처리기(Cobe 2991 cell processor)를 사용하여 달성될 수 있다. 세척후, 세포를, 예를 들면, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS와 같은 다수의 생체적합성 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 선택적으로는, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거할 수 있으며, 세포를 배양 배지에 직접적으로 재현탁할 수 있다. 원하는 경우, 전구체 T 세포를 적혈구를 용해시키고 단핵구를 파괴하여, 예를 들면, 퍼콜 ™ 구배(PERCOLL™ gradient)를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 분리시킬 수 있다.
선택적으로는, 항원-특이적 T 세포를 포함하는 세포 집단은, 제1 세포 집단 내에 항원-특이적 T 세포의 수에 대하여 항원-특이적 T 세포의 증가된 수를 포함하는 제2 세포 집단을 형성하는데 충분한 시간의 주기 동안 동일한 나노-aAPC 또는 제2 나노-aAPC와 배양되도록 지속될 수 있다. 전형적으로는, 이러한 배양은 3 내지 21일, 바람직하게는 7 내지 10일 동안 수행된다.
적합한 배양 조건(배양 배지, 온도 등)은 DC 또는 인공 항원 제시 세포를 사용하여 항원-특이적 T 세포의 형성을 유도하기 위한 당해분야에 공지된 조건 뿐만 아니라, T 세포 또는 T 세포 전구체를 배양하는데 사용되는 조건을 포함한다. 문헌 참조(Latouche 및 Sadelain, Nature Biotechnol. 18, 405-09, April 2000; Levine et al., J. Immunol. 159, 5921-30, 1997; Maus 외, Nature Biotechnol. 20, 143-48, February 2002). 아래 특정 실시예를 또한 참조한다.
증식성 신호의 크기를 평가하기 위해, 항원-특이적 T 세포 집단을 CFSE로 표지하고 세포 분열의 속도 및 수를 분석할 수 있다. T 세포를, 항원이 결합되는 나노-aAPC로 자극한 1 내지 2회 후 CFSE로 표지할 수 있다. 이러한 시점에서, 항원-특이적 T 세포는 2 내지 10%의 총 세포 집단을 나타내어야 한다. 항원-특이적 T 세포는, 항원-특이적 T 세포의 분열 속도 및 수를 CFSE 손실에 의해 이후 수행될 수 있도록 항원-특이적 염색을 사용하여 검출될 수 있다. 자극후 다양한 시점(예를 들면, 12, 24, 36, 48, 및 72시간)에서, 세포를 항원 제시 복합체 염색 및 CFSE 둘 다에 대해 분석할 수 있다. 항원이 결합되지 않은 나노-aAPC로의 자극을 사용하여 증식의 기준 수준을 결정할 수 있다. 선택적으로는, 증식이 당해분야에 공지된, 3H-티미딘(H-thymidine)의 삽입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다.
배양은 나노-aAPC로 다양한 양의 시간(예를 들면, 0.5, 2, 6, 12, 36 시간 및 연속 자극) 동안 자극될 수 있다. 고도로 농축된 항원-특이적 T 세포 배양에서 자극 시간의 영향을 평가할 수 있으며, 조건은 큰 퍼센트(예를 들면, 50, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%)의 나노-aAPC가 세포 손실 거의 없이 회수될 수 있는 조건이 식별될 수 있다. 이후, 항원-특이적 T 세포는 배양으로 다시 재위치시켜 당해분야에 공지된 바와 같은 세포 성장, 증식율, 세포사멸에 대한 영향, 다양한 이펙터 기능에 대해 분석될 수 있다. 이러한 조건은 목적하는 항원-특이적 T 세포 반응에 따라 변할 수 있다.
항원-특이적 T 세포의 검출
T 세포 전구체의 확장, 활성 및 분화에 대한 나노-aAPC의 효과는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 임의의 다수의 방식으로 검정될 수 있다. 기능을 신속하게 측정하는 것은, 각각의 유형의 T 세포에 특이적인 마커를 검출함으로써 배양물에서 CTL의 증가, 헬퍼 T 세포, 또는 조절성 T 세포를 측정함으로써 증식 검정을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 마커는 당해분야에 공지되어 있다. CTL은 사이토카인 생성을 위하거나 또는 크롬 방출 검정을 사용하는 세포융해 활성을 위한 검정에 의해 검출될 수 있다.
나노- aAPC -유도된/확장된 항원-특이적 T 세포 상의 귀소 수용체(homing receptor)의 분석
적절한 이펙터 기능을 갖는 항원-특이적 T 세포를 생성시키는 것에 추가하여, 항원-특이적 T 세포 효능에 대한 다른 매개변수(parameter)는, T 세포가 병리 부위에 통행(traffic)을 허용하는 귀소 수용체의 발현이다 (Sallusto et al., Nature 401, 708-12, 1999; Lanzavecchia & Sallusto, Science 290, 92-97, 2000). 적절한 귀소 수용체의 부재는 만성 CMV 및 EBV 감염의 환경(setting)에서 시사되어 왔다 (Chen et al., Blood 98, 156-64, 2001). 또한, 항원-특이적 T 세포를 확장하기 위한 전문적 APC 및 비전문적 APC를 사용하는데 있어서 주목되는 하나의 차이는 적절한 귀소 수용체의 발현으로, 이는 생체내 역기능적 CTL의 존재를 설명할 수 있다 (Salio et al., J. Immunol. 167, 1188-97, 2001).
예를 들면, 이펙터 CTL 효능은 귀소 수용체의 다음 표현형인 CD62L+, CD45RO+, 및 CCR7-에 연결되어 왔다. 이에 따라, 나노-aAPC-유도된 및/또는 확장된 CTL 집단은 이들 귀소 수용체의 발현으로 특징지을 수 있다. 귀소 수용체 발현은 초기 자극 조건에 연결된 복합체 특성이다. 짐작하건대, 이는 사이토카인 환경 뿐만 아니라 공자극 복합체 둘 다에 의해 조절된다. 연루되어 있는 하나의 중요한 사이토카인은 IL-12 (문헌 참조: Salio et al., 2001)이다. 아래 논의된 바와 같이, 나노-aAPC는 개별적으로 분리된 성분(예를 들면, T 세포 이펙터 분자 및 항원 제시 복합체)을 다양화시켜 생물학적 결과 매개변수를 최적화시키는 잠재성을 제공한다. 선택적으로는, IL-12와 같은 사이토카인은 항원-특이적 T 세포 집단에서 귀소 수용체 프로파일에 영향을 주는 초기 유도 배양물에 포함될 수 있다.
유도되고/되거나 확장된 항원-특이적 T 세포 집단 내 역방향-속도(off-rate)의 분석
제2 면역 반응의 진화는 TCR "역방향-속도"의 분석에 의해 결정되는 친화성에 중점을 두고 연관되어 있다 (Savage et al., Immunity 10, 485-92, 1999; Busch et al., J. Exp. Med. 188, 61-70, 1998; Busch & Pamer, J. Exp. Med. 189, 701-09, 1999). TCR 역방향-속도의 감소(즉, 증가된 TCR 친화성을 결과로 함)는 작은 양의 항원 및 관심있는 T 세포 집단의 생물학적 효능을 인식하는데 있어서 증가된 능력과 밀접하게 관련되어 있는 매개변수이다. 역방향-속도는 나노-aAPC-매개된 자극의 크기 및/또는 기간을 다양화시킴으로써 최적화할 수 있다.
기타 세포로부터의 항원-특이적 T 세포의 분리
항원에 결합된 항원-특이적 T 세포는 결합되지 않은 세포로부터 분리될 수 있다. 자기농축혈장(magnetic enrichment), 혈장사혈(plasmapheresis), 유동세포 계측법(flow cytometry), 또는 차동 원심분리(differential centrifugation)를 포함하여, 당해분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 이러한 분리를 달성할 수 있다. 하나의 구현예에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 기간 동안, 비드, 예를 들면, 항-CD3/항-CD28-콘쥬게이션된 비드, 예를 들면, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T를 사용하여 배양시킴으로써 분리된다.
바람직한 경우, 항원-특이적 T 세포의 부분모집단(subpopulation)은 존재할 수 있는 기타 세포로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, T 세포의 특이적 부분모집단, 예를 들면, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 분리될 수 있다. 하나의 방법은 음성적으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지시된 모노클로날 항체의 칵테일(cocktail)을 사용하는 음성 자기 면역부착(magnetic immunoadherence) 또는 유동세포 계측법을 통해 세포를 분류 및/또는 선택하는 방법이다. 예를 들면, 음성적 선별에 의해 CD4+ 세포를 강화시키기 위해서, 모노클로날 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 전형적으로 포함한다.
항원-특이적 조절성 T 세포를 마커 Foxp3를 사용하여 기타 세포로부터 검출하고/하거나 분리할 수 있다. 시간 주기는 30분 내지 36시간 또는 10 내지 24 시간일 수 있거나 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간 또는 적어도 24시간일 수 있다. 배양시간을 늘려서 기타 세포 유형과 비교하여 많지 않은 수의 T 세포가 존재하는 임의의 상황에서 T 세포를 분리할 수 있으며, 예를 들면, 종양 조직 또는 면역손상된 개별로부터 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 분리할 수 있다.
항체-생산 B 세포의 유도 및 확장
본 개시내용은 또한, 항체-생산 B 세포의 형성을 유도하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 다수의 전구체 B 세포를 포함하는 분리된 제제를 나노-aAPC를 유도하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 제제를 나노-aAPC를 유도하는 항체와 배양시켜 집단 내 전구체 세포를 유도시켜 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 항체-생산 B 세포를 형성한다. 전형적으로는, 제1 세포 집단 내 항체-생성 B 세포의 수 또는 퍼센트 중의 하나는, 전구체 B 세포가 비-특이적 자극, 예를 들면, 피토헤마글루틴(phytohemagglutinin: PHA), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide :LPS), 또는 포크위드(pokeweed)로 배양되는 경우 형성되는 항체-생산 세포의 수 또는 퍼센트보다 더 크다. 항체 유도 나노-aAPC가 사용되는 본원에 개시된 임의의 구현예에서, B 세포 작용 분자 및 B 세포 표면 면역글로불린 또는 B 세포 표면 상의 MHC-항원 복합체에 관여하는 복합체의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
전구체 B 세포는 환자 또는 적절한 도너로부터 수득할 수 있다. 도너 및 환자는 관련될 필요가 없으나, 적어도 하나의 HLA 분자를 바람직하게 공유한다. 대안적으로는, 당해 분야에 이용가능한 B 세포주가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 전구체 B 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같이 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득된다. 예를 들면, 개인의 순환 혈액으로부터 전구체 B 세포는 논의된 바와 같은 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술에 의해 수득될 수 있다.
B 세포 또는 이의 전구체는 당해분야의 공재된 방법을 사용하여 배양될 수 있다. 예를 들면, 문헌 참조(Schultze et al., J. Clin. Invest. 100, 2757-65, 1997; von Bergwelt-Baildon et al., Blood 99, 3319-25, 2002). 또한, 이러한 조건은 나노-aAPC를 유도하는 항체와 B 세포 전구체를 배양시키는데 적합하다.
선택적으로는, 항체-생산 B 세포를 포함하는 세포 집단은, 제1 세포 집단 내에 항체-생산 B 세포의 수에 대하여 항체-생산 B 세포의 증가된 수를 포함하는 제2 세포 집단을 형성하는데 충분한 시간의 주기 동안 나노-aAPC를 유도하는 동일한 항체 또는 나노-aAPC를 유도하는 제2 항체 중의 하나와 배양되도록 지속될 수 있다. 전형적으로는, 이러한 배양은 3 내지 21일, 바람직하게는 7 내지 10일 동안 수행된다.
나노-aAPC를 유도하는 항체와 B 세포 사이에 상호작용 기간의 최적화
상기 논의된 T 세포 자극에 관하여, 항체-생산 B 세포의 집단을 유도 또는 확장하는데 필요한 자극의 기간은, 정상적으로, 특히, 인공적인 비-생분해가능한 표면을 나노-aAPC에 사용하는 경우, 발생하는 것과는 상이할 수 있다. 이에 따라, 나노-aAPC에 의한 자극은 일자가 아닌 시간별로 잠재적으로 수행될 수 있다. 나노-aAPC를 유도하는 다양한 항체 및 전구체 또는 항체-생산 B 세포 사이의 상호작용 기간은 항원-특이적 T 세포에 대해 논의된 바와 같은 유사한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
항체-생산 B 세포의 검출
B 세포 전구체의 확장, 활성 및 분화에 있어서 항체-생산 나노-aAPC의 효과를 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다수의 방법으로 검정할 수 있다. 기능의 신속한 결정은 B 세포-특이적 마커를 검출함으로써, 또는 특이적 항체 생산을 위한 검정을 통해 증식 검정을 사용하여 달성될 수 있다.
자기장 및 나노- aAPC를 사용하여 특이적 T 세포 집단을 유도 및 확장하는 방법
본 개시내용은 자기장에서 CTL, 헬퍼 T 세포, 및 조절성 T 세포를 포함하여 항원-특이적 T 세포의 형성 및 확장을 유도하는 방법을 제공한다. 나노입자 플랫폼은 생체내 투여 및 세포 요법에 매우 적합한데, 그 이유는 나노입자 플랫폼이 마이크로 입자와 비교하여, 세포와 공-주입시 조직 경색이나 염증을 유발하기가 쉽지 않으며,37 예를 들어, 철-덱스트란 나노입자는 GMP-등급 제형에서 이용가능하기 때문이다.
이들 방법들 중 일부 변형은 폴리클로날 T 세포의 분리 집단을 다수의 나노-aAPC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 나노-aAPC는 상자성이며, 표면 상에 (l) 적어도 하나의 T 세포 작용 분자 및 (ii) 적어도 하나의 항원 제시 복합체를 포함한다. 항원 제시 복합체는 항원 결합 클레프트를 포함하고, 항원 결합 클레프트는 항원을 포함한다. 폴리클로날 T 세포의 분리된 집단을 충분한 강도의 자기장에서 항원-특이적 T 세포의 집단, 즉, 항원 결합 클레프트에 결합된 항원에 특이적인 T 세포를 생성하는데 충분한 시간 동안 나노-aAPC와 접촉시킨다. 이후, 나노-aAPC에 결합된 항원-특이적 T 세포의 집단은 예를 들면, 자기농축칼럼(magnetic enrichment column), 유동세포 계측법(flow cytometry), 또는 차동 원심분리(differential centrifugation)를 사용하여 분리하여 환자에게 투여할 수 있다. 자기 농축 후 주입을 사용하여 세포를 분리하는 방법은 당해분야에 공지되어 있으며,38 ,39 임의의 이들 방법은 개시된 방법을 수행하는데 사용될 수 있다.
개시된 방법의 기타 변형은, 다수의 나노-aAPC를 환자에게 투여한 다음 자기장을 환자 또는 환자의 목적하는 타겟 영역(예를 들면, 종양 또는 국소 감염)에 적용시키는 단계를 포함한다. 자기장을 사용하여 상자성 입자의 통행의 지시 및 생체내 입자-표지된 세포는 당해분야에 공지되어 있으며40 -42, 임의의 이들 방법을 사용하여 나노-aAPC를 목적하는 타겟 영역에 지시 적용할 수 있다.
특정 생리학적 상태에 있는 세포를 바람직하게 자극하기 위한 자기장 및 나노입자를 사용하는 방법
본 개시내용은 상이한 생리학적 상태에 있는 타겟 세포(예를 들면, 나이브 대 미리 활성화된 T 세포)에 대해 나노입자, 예를 들면 자성 나노입자를 사용하여 타겟 세포 집단을 자극시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, 도 9C에 도시되고 아래 특정 실시예에 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 32 ng 용량의 MHC를 제공하는 나노-aAPC를 주(week)를 기준으로 20- 내지 30배로 나이브 및 미리 활성화된 T 세포 둘 다를 자극한다. 그러나, 8 ng 또는 3.2 ng의 MHC에서, 활성화된 T 세포 만이 자극되었다. 이에 따라, 예를 들면, 3.2 내지 8 ng 용량의 MHC을 포함하는 나노-aAPC를 사용하여 집단 내 나이브 T 세포에 영향을 미치지 않고 T 세포 집단 내 미리 활성화된 T 세포를 자극시킬 수 있다.
3.2-8 ng MHC 대 32 ng MHC를 포함하는 나노-aAPC의 차별적 효과를 사용하여 나노-aAPC 결합을 분리하고, T 세포를 T 세포의 활성으로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, T 세포의 집단은 나이브 T 세포에 대해 강화된 집단을 남기는 예를 들면, CD44에 대한 항체를 사용하여 미리 활성화된 T 세포가 실질적으로 결손(depletion)될 수 있다. 3.2-8 ng MHC를 포함하는 나노-aAPC를 이러한 집단에 결합시키는 것은 나이브 T 세포를 활성화시키는 것이 아니라, 이의 정제를 허용할 것이다. 이후, 결합된 나노-aAPC를 포함하는 나이브 T 세포는 나노입자를 응집시키는 당해분야에 공지된 다양한 기술에 의해 활성화될 수 있다. 자성 나노입자의 경우에, 이는 예를 들면, T 세포-나노-aAPC 복합체를 자기장에 노출시킴으로써 달성될 수 있다.
동일한 접근법을 사용하여 예를 들면, B 세포 및 줄기 세포를 예로 포함하지만 이에 제한되지는 않는 기타 세포에 대한 치료제로서 분리하고, 특징화되며, 사용할 수 있다. 상이한 생리학적 상태에 있는 집단의 세포를 구별하여 활성화시킬 나노입자의 표면 상의 최적 리간드 밀도 (또는, 대안적으로, 이러한 리간드를 포함하는 나노입자의 용량)은, 아래 실시예 9에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 세포 집단에 따라, 리간드는 예를 들면, 항체 또는 항체의 일부, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 탄수화물, 지질, 또는 주어진 수용체 (예를 들어, EGF, PDGF)에 대한 천연 리간드 모두 또는 이의 일부, 화학 물질(예를 들면, 크롬 염 또는 FKBP 결합 도메인과 같은 이뮤노필린 분자 수용체(immunophilin molecule receptor)에 결합하는 1가의 합성 리간드), 단일 항 -인테그린 Fab 단편, RGD 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
약제학적 제제
나노-aAPC, 뿐만 아니라 이러한 나노-aAPC를 사용하여 수득된 항원-특이적 T 세포 또는 항원-특이적 B 세포를 포함하는 약제학적 제제는 환자에게 직접적으로 주입시키기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 약제학적 제제는, 조성물을 환자에게 전달시키는데 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 식염수, 완충된 식염수(예를 들면, 인산염 완충 식염수), 또는 인산 완충된 식염수 글루코스 용액을 함유한다.
면역치료학적 방법
투여 경로
나노-aAPC, 뿐만 아니라 나노-aAPC를 사용하여 수득된 항원-특이적 T 세포 또는 항체-특이적 B 세포는, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 림프내 투여, 및 종양내 투여를 포함하여 임의의 적절한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 환자는 인간 및 동물 환자(veterinary patient) 둘 다를 포함한다.
치료학적 방법
나노-aAPC를 사용하여 당해 분야에 공지된 진단 및 치료 방법에 사용될 수 있는 치료학적으로 유용한 수의 항원-특이적 T 세포 또는 항체-생산 B 세포를 생성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 참조(WO 01/94944; 미국 제2002/0004041호; 미국 특허 제5,583,031호; 미국 제2002/0119121호; 미국 제2002/0122818호; 미국 특허 제5,635,363호; 미국 제2002/0090357호; 미국 특허 제6,458,354호; 미국 제2002/0034500호).
특히, 항원-특이적 T 세포 또는 항체-생산 B 세포를 사용하여 전염병, 암, 또는 자가 면역 질환을 가진 환자를 치료하거나, 또는 면역억제된 환자에게 예방적 보호(prophylactic protection)를 제공할 수 있다.
치료될 수 있는 감염성 질환은 박테리아, 바이러스, 프리온, 진균, 기생물 및 장내 기생충 등에 의해 야기된 질환을 포함한다. 이러한 질환은 AIDS, 간염, CMV 감염, 및 이식후 림프증식성 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder: PTLD)을 포함한다. CMV는 예를 들면, 장기 이식 환자에서 발견된 가장 일반적인 바이러스 병원균이고, 골수 또는 말초혈액줄기세포 이식을 겪는 환자에서 질병률 및 치사율의 주요 원인이다 (Zaia, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4, 603- 23, 1990). 이는 이들 환자의 면역손상된 상태로 인한 것으로, 혈청양성 환자 내 잠재 바이러스의 재활성 및 혈청음성 환자 내 기회감염을 허용한다. 현재 치료는 항바이러스 화합물, 예를 들면, 단점을 갖는 강시클로버(gancyclovir)을 사용하는 것에 초점을 맞추고 있으며, 가장 중요한 점은 약물-내성적 CMV를 개발하는데 있다. 이들 치료에 있어서 유용한 대안책은 이식 시술을 시작하기 전에 환자 또는 적절한 도너로부터 유래된 바이러스-특이적 CTL의 생성을 포함하는 예방학적 면역치료 요법이다.
PTLD는 이식 환자의 중요한 분획에서 발병하며, 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein- Barr virus: EBV) 감염으로부터 야기된다. EBV 감염은 미국 내 약 90%의 성인 환자에 존재하는 것으로 여겨진다 (Anagnostopoulos & Hummel, Histopathology 29, 297-315, 1996). 활성 바이러스 복제 및 감염은 면역 시스템에 의해 점검되어 유지되지만, CMV의 경우에서와 같이 이식 요법에 의해 면역 손상된 개인은 T 세포 집단을 조절하는 것을 잃어버리고 바이러스 재활성을 허용한다. 이는 이식 프로토콜에 대해 심각한 장애를 나타낸다. 또한, EBV는 다양한 혈액암 및 비-혈액암 내 종양 촉진에 포함될 수 있다. 또한, EBV와 인두암종간에 강한 연관성이 존재한다. 이에 따라, EBV-특이적 T 세포를 이용하는 예방학적 치료는 현재 요법에 대한 훌륭한 대안을 제공한다.
처리될 수 있는 암은 흑색종, 암종, 예를 들면, 결장, 십이지장, 전립선, 유방, 난소, 도관, 간, 췌장, 신장, 자궁, 위, 이형성 구강 점막, 용종증, 침습적 구강 암, 비-소세포 폐 암종, 전이 및 편평상피 세포 비뇨기 암종 등; 신경계 종양, 예를 들면, 신경 모세포종, 신경 교종 등; 혈액 악성 종양, 예를 들면, 만성 골수성 백혈병, 소아 급성 백혈병, 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphomas), 만성 림프구성 백혈병, 악성 피부 T 세포, 균 상식 육종(mycosis fungoides), 비-MF 피부 T 세포 림프종, 림프종양(lymphomatoid papulosis), T 세포 풍부 피부 림프 증식, 수포성 유 천포창(bullous pemphigoid), 원반 모양 홍반 루푸스(discoid lupus erythematosus), 편평 태선(lichen planus) 등을 포함한다. 예를 들면, 문헌 참조(Mackensen et al., Int. J. Cancer 86, 385- 92, 2000; Jonuleit et al, Int. J. Cancer 93, 243-51, 2001; Lan et al, J. Immunotherapy 24, 66-78, 2001; Meidenbauer et al., J. Immunol. 170(4), 2161-69, 2003).
처리될 수 있는 자가면역질환은 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 유형 I 당뇨, 다발성 경화증, 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 건선, 중증 근무력증, 굿파스처(Goodpasture) 증후군, 그레이브스(Graves') 병, 심상성 천포창, 에디슨 병, 피부염 포진, 소아 지방변증(celiac disease), 및 하시모토 갑상선염을 포함한다.
항원-특이적 헬퍼 T 세포를 사용하여 대식세포를 활성화시키거나, B 세포를 활성화시켜 예를 들면, 감염질환 및 암을 치료하는데 사용될 수 있는 특정 항체를 생성할 수 있다. 또한, 항체-생산 B 세포 스스로가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
항원-특이적 조절성 T 세포를 사용하여 면역억제 효과를 달성하는데, 예를 들면, 이식 환자에서 그래프트(graft) 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하거나, 또는 자가면역 질환, 예를 들면, 상기 나열된 질환, 또는 알레르기를 치료 또는 예방할 수 있다. 조절성 T 세포의 사용은 예를 들면, 미국 제2003/0049696호, 제2002/0090724호, 제2002/0090357호, 제2002/0034500호, 및 제2003/0064067호에 개시되어 있다. T 세포 작용 분자가 세포사멸-유도 분자인 나노-aAPC를 사용하여 면역 반응을 억제할 수 있다.
용량
항원-특이적 T 세포는 범위 체중 당 약 5-10 x 106　CTL/kg (약 7 x 108 CTL/처리) 내지 약 3.3 x 109 CTL/m2 (약 6 x 109 CTL/처리)의 범위의 용량으로 환자에게 투여할 수 있다 (Walter 외, New England Journal of Medicine 333, 1038-44, 1995; Yee 외, J Exp Med 192, 1637-44, 2000). 다른 구현예에서, 환자는 정맥내로 투여된 용량 당 103, 5 x 104, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 109, 5 x 109, 또는 1010 세포를 받을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 환자는 예를 들면, 200μl 환약(bolus) 내 8 x 106 또는 12 x 106 세포를 인트라노달 주입(intranodal injection)으로 투여받을 수 있다. 나노-aAPC의 용량은 용량당 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 109, 5 x 109, 또는 1010 나노-aAPC을 포함한다.
동물 모델
다수의 뮤린 모델은 종양 처리에 대한 입양 면역요법 프로토콜을 평가하는데 이용가능하다. 특히 2개의 모델이 흑색종 치료를 평가하는데 적합하다. 하나의 모델은 BML과 같이 피하이식된 인간 흑색종 라인(subcutaneous implanted human melanoma line)을 지니고 있는 인간/SCID 마우스를 사용한다. 이러한 모델에서, 생체외 확장된 마트-1-특이적 CTL의 전달은 종양의 개시 및/또는 성장을 지연시킨다. 제2 모델은 뮤린 A2-형질변환 마우스 및 AAD로 불리워지는 HLA-A2-유사 분자로 형질감염되었던 뮤린 B16 흑색종을 사용한다. 또한 A2-형질변환의 근거가 되는 이러한 분자는 뮤린 알파3 도메인에 융합된 알파 1-2 도메인에서의 인간 HLA-A2이다. 이들 형질변환 마우스를 사용하여, 뮤린 B16- AAD 흑색종은 티로시나제 및 gp100으로부터 유래된 잘 정의된 A2-제한 흑색종 에피토프에 걸쳐 거부에 민감하다.
키트
나노-aAPC는 키트에 제공될 수 있다. 나노-aAPC에 적절한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함하는 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 멸균 접근 포트(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 선택적으로는, 하나 이상의 상이한 항원은 나노-aAPC에 결합되거나 또는 별개로 제공될 수 있다.
또한, 키트는 인산염-완충 식염수, 링거액, 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 또한, 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지를 포함하여 최종 사용자에게 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다. 키트는 또한 예를 들면, 다른 활성제, 예를 들면, 화학 요법제 또는 항감염 제를 가지거나, 또는 최종 사용자에 의해 나노-aAPC의 항원 제시 복합체를 결합할 수 있는 특정 항원을 함유하는 제2 또는 제3 용기를 포함 할 수 있다.
또한, 키트는 항원-특이적 T 세포 또는 항체-생산 B 세포 유도 또는 확장, 예를 들면, 특정 마커 단백질, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자 복합체, TCR 분자 복합체에 대한 항체, 항-클로노타입(anticlonotypic) 항체 등의 정도 및 효능을 평가하는 시약을 함유할 수있다.
또한, 키트는 다양한 치료 프로토콜에서 키트 내 나노-aAPC을 사용하여, 항원-특이적 T 세포를 유도하고, 항원-특이적 T 세포를 확장시키는 방법에 대한 기록 지시를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 패키지 삽입물은 미승인된 초안 패키지 삽입물일 수 있거나, 또는 식품의약품국 (FDA) 또는 기타 규제 기관에 의해 승인된 패키지 삽입물일 수 있다.
당해분야의 숙련가는 특허청구범위의 범위내에 있으면서 상기한 구현예의 다수의 변형 및 치환이 존재함을 인식할 것이다.
실시예 1
실시예 2 내지 7에 대한 물질 및 방법
마우스 및 시약. 2C TCR Rag-/- 형질전환된 마우스를 C57/BL6 백그라운드 상에서 번식시켜 이형접합체로서 유지시켰다. pMEL TCR/Thy1a Rag-/- 형질전환된 마우스를 니콜라스 레스티포(Nicholas Restifo)(미국 메릴랜드주 베데스다 국립위생연구소)로부터 받았으며, 동형접합체(homozygote)로서 유지하였다. C57BL/6j 마우스는 잭슨 실험실[미국 메릴랜드주 바 하버(Bar Harbor)]로부터 구입하였다. 모든 마우스를 존스 홉킨스 대학의 임상시험심사위원회에 따라 유지하였다. 형광표지된 모노클로날 항체는 바이오레전드(BioLegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였다.
MHC -Ig 이량체의 제조. 가용성 MHC-Ig 이량체, Kb-Ig 및 Db-Ig를 제조한 다음, (48)에 기재된 펩타이드로 로딩하였다. 간략하게는, Kb-Ig 분자를 알칼리 조건(pH 11.5)에 스트리핑함으로써 펩타이드로 로딩한 다음, 50배 과량의 펩타이드의 존재하에 리폴딩(refolding)하였다. Db-Ig 분자는 약산성 조건(pH 6.5)에 따라 스트리핑하고 50 배 몰 과량의 펩타이드와 2배 몰 과량의 인간 β2-마이크로 글로불린의 존재 하에서 리폴딩되었다. 인간 A2-Ig는 과량의 M1 펩타이드(49)의 존재하에 수동적으로 로딩하였다. 펩타이드 "SIY" (SIYRYYGL, 서열번호 3; 합성적), "SIIN" [SIINFEKL, 서열번호 4; 오브알부민 단백질(ovalbumin protein)로부터 유래됨], "GP100" (KVPRNquantum dotWL, 서열번호 5; 멜라닌세포 GP100 단백질로부터 유래됨), "ASN" [ASNENMETH, 서열번호 6; 인플루엔자 A 핵단백질(Influenza A nucleoprotein)로부터 유래됨], 및 "M1" (GILGFVFTL, 인플루엔자 A M1 단백질로부터 유래됨)은 겐스크립트[Genscript: 미국 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway)]로부터 구입하였다. 단백질 농도는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 표지함으로써 결정하였다.
입자 제조 및 특성. 나노스케일 철-덱스트란 aAPC를 2가지 방법 중의 하나로 제조하였다. 2 μΜ 비오티닐화된 MHC-Ig 이량체 및 등몰 농도(equimolar concentration)의 비오티닐화된 항-CD28 항체를, 4℃에서 적어도 1 시간 동안 가볍게 교반시키면서 100μL의 항-비오틴 밀테나이(Miltenyi) 미세 입자[밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec)]와 배양시켰다. 미결합된 단백질을 MS 자기 농축 칼럼(밀테나이 바이오텍)을 사용하여 세척하였다. 입자 농도는 베크만 쿨터 AD340 플레이트 판독기(Beckman Coulter AD340 plate reader)를 사용하여 405 nm의 흡광도에 의해 측정되었다.
선택적으로는, MHC-Ig 이량체 및 B7.1-Ig를 생분해성 입자(밀테나이 바이오텍)에 직접적으로 화학적으로 커플링시켰다. 총 단백질 함량은 브래드포드 검정(Bradford Assay)으로 평가하였다. 달리 명시되지 않는 한, "철-덱스트란 aAPC"는 항-비오틴 커플링보다는 MHC와 B7.1에 직접적으로 화학적으로 커플링되는 입자를 의미한다.
나노스케일 양자점 aAPC는 5μM 비오티닐화된 MHC-Ig 이량체 및 등몰 농도의 비오티닐화된 항-CD28 항체를 100 μL의 1 μM 스트렙타비딘 피복된 양자점(라이프 테크놀로지)으로 2시간 동안 4℃에서 배양시킴으로써 제조하였다. 양자점을 세척하고, 300,000 분자량을 컷오프(cutoff)시켜 사르토리우스 비바스핀 막(Sartorius Vivaspin Membrane)을 사용하여 농축시켰다. 양자점 농도는 베크만 쿨터 AD340 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm의 흡광도에 의해 측정되었다.
나노입자 추적 분석. 민감한 CCD 카메라가 장착된 나노사이트(Nanosight) LM 10을 사용하여 NTA에 의해 철-산화물 aAPC를 특성화하였다. 50 μL의 희석된 나노입자 용액을 405 nm 레이저 공급원에 연결되는 샘플 챔버에 로딩시켰다. 분산하는 센트로이드(입자)의 브라운 운동 추적을 포함하는 60초 동영상은 NTA 소프트웨어 (버전 2.0)을 사용하여 기록되었다. 이러한 영상은 권고되는 바와 같이 게인(gain), 흐림 및 밝기를 수동으로 조정하여 제조업자 권장 자동 설정을 사용하여 처리하였다. 나노입자 용액을 인산염 완충 식염수에 희석시켜 샘플 농도를 5 x 1012 입자 mL-1로 조절하였다.
체외 세포 확장. 마우스 세포 배양을 위해, 세포는 균질화된 마우스 비장으로부터 저장성 용해에 의해 RBC를 결손시켜 수득하였다. 세포 독성 림프구를 밀테나이 바이오텍사 (독일 쾰른)의 CD8 비-접촉식 분리 키트 및 자기 농축 컬럼을 사용하여 분리하고, 필요한 경우 37℃에서 15 분 동안 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester: CFSE)로 표지한 다음, 광범위하게 세척하였다. 지시된 투여량에서 백만 CD8 + T 세포 및 입자를, T 세포 인자로 보충된 완전한 RPMI 배지에서 4일 내지 7 일 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 혼합시키고 배양시킨 다음, 사이토카인 칵테일을 인간 혈장 (5)으로부터 회수하였다. CFSE 형광은 BD 팩스칼리버 유동 계측법(FacsCalibur flow cytometer)을 사용하여 4일째에 측정되고 플로우조(FlowJo) (TreeStar)에서 분석하였다.
인간 세포 배양을 위해, 건강한 HLA * 0201 양성 도너로부터 PBMC를 제조 업체의 프로토콜 (GE 헬스케어)에 따라 피콜-페이크 플러스 기울기 원심분리(Ficoll-Paque PLUS gradient centrifugation)에 의해 분리하였다. CD8+ T 세포는 상기 CD8+ T 세포의 음성 선택 키트 (밀테나이 바이오텍)을 사용하여 신선한 PBMC로부터 추가로 정제 하였다. 유동 세포 계측법에 의해 측정된 CD8+ T 세포의 순도는 95 %보다 높았다. 지시된 투여량에서 3백만 CD8+ T 세포 및 입자는 T 세포 인자로 보충된 완전 RPMI 배지에서 최대 14일 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 혼합하고 배양하였다. 자극 후 7 일째에, T 세포를 수확하고, 계수한 다음, 동일 T 세포: 나노-aAPC 밀도로 리플레이팅(replating)했다. 항원 특이성을 제조업체의 프로토콜에 따라 HLA-M1-특이적인, A*0201 PE 또는 APC 테트라머 (베크만 쿨터)를 사용하여 측정하였다.
세포내 사이토카인 염색법. 초기 자극 후 7일째에, T 세포 기능 활성은 펩타이드-펄스된 C57Bl/6j 비장세포로 다시 시험하여 평가하였다. 비장 세포는 37℃에서 2 시간 동안 지시된 펩타이드 농도로 펄싱(pulsing)한 다음, 세척하였다. 200,000 T 세포는 0.2 μL 골지플러그(GolgiPlug), 0.2 μL의 골지스탑(GolgiStop), 항-CD107a-fitC [미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 BD 바이오사이언시즈 (BD Biosciences)]의 존재하에 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 4 시간 동안 200,000 비장세포를 이용하여 완전한 RPMI에서 배양하였다. 세포를 세척하고, 제조자의 지시에 따라서 BD 사이토픽스/사이토펌 키트(BD Cytofix/Cytoperm kit) (BD 바이오사이언시스)를 사용하여 고정한 다음, 항-IFNγ PE (바이오레전드)로 염색하였다. 사이토카인 염색은 유동 세포 계측법에 의해 평가하였고, 사이토카인 기능적 세포의 빈도수(frequency)는 플로우조에서 비자극 대조군과 비교하여 평가 하였다.
생체 내에서 피하 종양 성장에 대한 나노- aAPC의 효과. 양자점 aAPC 실험에 대하여, T 세포 또는 aAPC 치료를 받지 않은 대조군 마우스를 제외하고, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스에게, 2 x 106 나이브 CD8+ pMEL T 세포를 꼬리 정맥 주사로 입양적으로 이식하였다. 같은 날, B16 흑색종 세포(2 X 105)를 오른쪽 측면에 피하 주입하였다. 다음 날, 마우스를 그룹 당 5마리로, 20μL 동족 양자점 aAPC, 20μL 비-동족 양자점 aAPC 중의 하나, 또는 20 μL PBS로 처리하였다. 마우스를 3, 4일 및 5일째에 30,000 단위 복강 IL-2로 처리하였다. 종양의 크기가 약 200 mm2 가 되는 지점에서 동물을 안락사시키기 전까지, 디지털 캘리퍼(digital caliper)를 사용하여 2일 간격으로 종양 성장을 모니터링 하였다.
철 덱스트란 aAPC 실험을 위해, 2 x 106 나이브 CD8 + pMEL T 세포를 이전과 같이 입양 전달하였다. 4일후, 치료 그룹의 마우스에 25 μL 동족 HD 나노-aAPC를 정맥내(iv) 또는 피하(sc) 중의 하나로 그룹 당 8 마리씩 투여하였다. 3일 후, aAPC를 피하(sc) 또는 정맥내(iv) 중의 하나로 주입하였다. B16 흑색종 세포 (2 x 105)를 4일 후 피하로 주입한 다음, 종양후 4일 째에 동측면(ipsilateral flank) 상에, 정맥내 또는 피하 중의 하나로 두 번째 aAPC를 주입하였다. 종양 추적 및 동물 안락사 과정을 위와 같이 진행하였다.
실시예 2
철 덱스트란 나노-aAPC는 T 세포 확장을 유도한다
나노 크기의 철-산화물 코어, 밀테나이사에 의해 제조된 덱스트란 피복된 입자는 광범위한 특성 및 생체적합성으로 인해 나노입자 플랫폼으로 선정되었다 (21-23). 나노스케일 aAPC을 생산하기 위해서, 적절한 펩타이드(신호 1)와 키메라 B7.1-Ig 융합 단백질(신호 (2))로 로딩된 수용성 이량체 MHC-Ig를 입자 표면에 대해 1:1 비율로 공유 커플링하였다 (도 1A). 대안적으로는, 항-비오틴 피복된 철-덱스트란 입자에 비오티닐화된 MHC-Ig 및 항-CD28을 커플링시킴으로써 입자를 제조하였다 (도 1B).
철 덱스트란 aAPC는 나노입자 추적 분석 (NTA, 도 1C)를 사용하여 단분산(monodispersion)되고 직경이 50 내지 100 nm를 가짐을 확인하였다. 입자를 8.3 nm의 농도 (5 X 1012 입자 ml-1에 상당함)에서 현탁시킨 다음, 이후의 모든 부피는 이 농도에서의 입자들을 참조한다. 커플링 반응 중에 존재하는 단백질 양을 적정함으로써, 본 발명자는 브래드포드 검정(Bradford Assay)에 의해 측정된 고밀도 (HD, 65 μg 단백질/입자의 mL) 또는 저밀도 (LD, 16 μg 단백질/입자의 mL) 단백질을 제시하는 입자를 합성하였다.
aAPC-유도된 T 세포 확장을 평가하기 위해, 본 발명자는 2개의 TCR 형질전환된 마우스 모델을 이용하였다: MHC 클래스 I H2-Kb의 문맥(context)에서 제시된 SIY 펩타이드를 인식하는 수용체를 운반하는 2C 마우스, 및 MHC 클래스 I H2-Db의 문맥에서 제시된 흑색종 분화 항원 GP100로부터 유래된 펩타이드를 인식하는 pMEL 마우스. 4개 유형의 항-비오틴 커플링된 철-덱스트란 입자는, 위에 기재된 동족 펩타이드 또는 비-동족 펩타이드(Kb에 대한 SIIN, Db에 대한 ASN) 중의 하나로 로딩된 Kb 또는 Db 중의 하나를 제시하며, 제조되었다. T 세포는 입자와 함께 배양하고, 증식은 7일 후에 평가되었다. 2C 세포만이 Kb-SIY 입자의 존재 하에서 증식되고 pMEL 세포만이 Db-GP100 입자의 존재하에만 증식되기 때문에 입자-기반 확장은 항원-특이적이다 (도 2A). 또한, 신호 1 및 신호 2 둘 다는 최적 확장을 위해 요구되었으며, MHC-Ig 또는 CD28 중의 하나를 단독으로 운반하는 항-비오틴 입자들은 강력한 T 세포 증식을 유도하는데 효과적이지 않았다 (도 2B).
APC에 의해 제시된 항원의 양 (24, 25) 및 밀도 (26, 27) 둘 다는 증식과 세포 사멸과 같은 다운스트림 T 세포 거동(downstream T cell behavior)에 영향을 미치며, 이에 따라, 상기 양 및 밀도는 aAPC 자극에 대한 중요한 매개변수가 될 수 있다. HD 및 LD 입자를 사용하여 T 세포의 확장에 대한 항원 밀도의 효과를 평가하였으며, 두 세트의 입자는 항원 용량의 효과를 평가하기 위해 적정하였다. 증식은, 생명 염료 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 자극 후 3일째 특이적으로 특징화되었다. CFSE는 각 라운드의 T 세포 분열로 희석하고, 이에 따라 분열은 CFSE 형광의 절반-배(one half-fold) 감소로 나타난다. 자극 후 7일째, T 세포를 계수하여 증식과 사멸 사이에 전체 균형관계를 특징지었다.
HD 및 LD 입자 모두는 용량-의존적 방식으로 pMEL T 세포 증식을 유도 할 수 있었다 (도 2C). CFSE 희석에 의해 측정된 바와 같이, HD 입자는, 1 백만 세포 당, 1, 5, 및 20 μL의 입자에 대해 각각 79 %, 98 %, 99 %의 세포로 증식을 유도하는 반면, 동일한 양의 LD 입자는 4 %, 40 % 및 93 %의 세포로 증식을 유도하였다. 7일째, HD 및 LD 입자는 확장을 유발하는 데 필요한 약 5μL의 LD 입자 및 0.5 μL 미만의 HD 입자의 최소 임계 값으로, 약 5 내지 30 배의 T 세포의 전체 확장을 유도했다(도 2D). 두 CFSE 증식 및 세포 계수는 주어진 양의 입자에서, HD 나노-aAPC가 LD보다 더 큰 확장을 유도한 것을 입증하였다. 예를 들면, 5μL의 입자에서, HD 입자는 21 배의 확장을 유도한 반면에, LD 입자가 단지 7 배의 확장을 유도하였다.
HD 입자상의 증가된 양의 단백질이 증식 장점에 대한 충분한 설명 여부를 평가하기 위해서, LD 및 HD 입자를 동등한 단백질 농도에서 T 세포와 배양하였다(즉, 주어진 농도의 HD보다 LD 입자는 약 5배 더 크다). 일단 aAPC를 단백질 농도에 대해 표준화시킨 다음, HD 및 LD 입자를 3일 째(도 2E)에 CFSE 희석에서 측정한 유사한 확장 또는 7일 째(도 2F)에 전체 확장을 유도하였다. 예를 들면, 20 μL의 LD 입자 또는 3.5 μL의 HD 입자 모두가 3일 째에 세포의 94 %, 및 성장 7 일 이후 약 17 배의 확장으로 증식을 유도하였다. 이에 따라, 평가된 항원 용량 및 밀도에서, 확장은 aAPC 상에 제시된 총 단백질로 구동되었으나, 입자 용량 또는 단백질 밀도에 의해서는 구동되지 않았다.
실시예 3
나노 aAPC는 강력한 T 세포 이펙터 표현형을 유도한다
충분한 수의 항원 특이적 T 세포의 생성이 면역요법의 중요한 목표이다. 그러나 CTL은 특정 자극 조건(28)하에서 아네르기(anergic) 또는 심지어 억제될 수 있으며, 이에 따라, 확장된 림프구는 탈과립 마커 CD107a의 표면 발현에 의해 나타낸 바와 같이, 또한, IFNγ 같은 중요한 이펙터 사이토카인을 생산하고, 세포 독성 과립을 분비하는 능력에 대해 평가되어야 한다. 나노-aAPC 유도된 자극 후 CTL 기능을 평가하기 위해, 전체 CD8 + CTL을 세 개의 다른 입자 농도로 자극 하였다: 동량의 단백질을 제시하고 이에 따라 동등한 약 10 배의 확장을 유도하는 3.5 μL의 HD 및 20 μL의 LD 입자, 및 약 17 배의 증식을 유도하는 20 μL의 HD 입자 (도 3A). 입자-기반 자극 후 7일 째, CTL을 수확하고, 펩타이드-펄싱된 비장 세포와 재-시험시켜 세포내 사이토카인 검정에 의해 기능적 반응(functional response)을 평가하였다.
기능성 반응은 강력하였으며, 모든 세 개의 입자 용량에 대해 동등하였다. 모든 그룹의 CTL은 고용량의 펩타이드로 재-시험시 세포의 90%가 탈과립하며 높은 수준의 CD107a를 발현하였다 (도 3B). 마찬가지로, 세 그룹 모두는 높은 수준의 IFNγ 반응을 나타내었다(도 3C). T 세포에 대한 입자의 비와 입자 상의 단백질 농도는 CTL 확장의 정도에 영향을 미치는 반면, 생성된 T 세포는 입자 용량에 관계없이 유사하고 강한 이펙터 표현형을 나타내었다.
또한, 이펙터 표현형은 CD44과 CD62L 발현을 측정함으로써 평가 하였다. 활성화 후, T 세포는 CD44을 상향 조절(upregulation)한다. 높은 CD62L 발현을 유지하는 세포의 서브유닛은, "센트럴 메모리" T 세포 (Tcm)로 불리워지며, 높은 증식 능력을 가진다. CD62L을 하향 조절(downregulation)하는 나머지 세포는, "이펙터 메모리"(Tem)이라 불리워지며, 조직에 통행되고, 강력한 이펙터 반응을 위해 준비가 되었으나, 재-시험시 증식에 대한 능력은 떨어졌다. 이들 T 세포 표현형은 생체 내에서 메모리 발전(memory development)을 입증하였으나, 생체 외에서 활성화된 세포는 유사한 표현형을 나타내며 생체 내 메모리 형성에 대한 모델로서 역할을 수행할 수 있다. 나노-aAPC 자극된 T 세포 배양에 대한 대표적인 염색 패턴은 도 3E에 도시되어있다. HD 및 LD 두 입자는 강력한 CD44의 상향 조절을 유도하였다(도 3F). 낮은 용량의 입자는 51%와 36% Tem를 각각 생성하는 2 μL의 LD 및 2 μL의 HD와 함께 높은 비율의 CD62Llo CD44hi Tem 세포를 생성하였다. Tem 세포의 비율은 용량 의존적 방식에서는 감소하였으나 검사된 모든 배양물은 나이브, Tcm, 및 Tem 세포를 함유하였다.
실시예 4
내인성 인간 T 세포 반응의 나노-aAPC 확장
항원-특이적 전구체 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 낮은 빈도수, 이종 집단으로 존재한다. 따라서, 면역 요법은 궁극적으로 내생 전구체의 폴리클로날 풀(polyclonal pool)에서 항원-반응성 CTL의 확장에 좌우된다.
항-비오틴 철-덱스트란 aAPC는 인플루엔자 단백질 M1(신호 1) 및 항-CD28 (신호 2)로부터 유래된 면역우성 T 세포 에피토프와 함께 로딩된 인간 HLA 대립유전자 A2를 함유하여 합성되었다. PBMC를 증가된 용량의 나노-aAPC로 배양시킨 다음, 항원 특이적 T 세포 확장은 두 개의 연속적인 자극 후 테트라머 염색에 의해 평가되었다(도 4).
자극 전, 말초 혈액내 M1 특정 전구체 빈도수는 0.4 % 특정 CD8 + PBMC와 함께 낮았다(도 4A, 맨 윗줄). 1주(중간줄) 또는 2주(아랫줄) 동안 나노 aAPC로 배양하는 것은 항원 특이적 T 세포의 백분율에서 용량-의존적 증가를 야기하였다. 이들 데이터는 도 4B에 요약되어있다. 가장 높은 용량(300 μL)의 나노-aAPC는 1주 후 항원-특이적 T 세포의 44 %까지 유도하였으나, 2주 후 80 %까지 유도하였다(좌측 패널). 이는 가장 높은 입자 용량에서 1주 후 150 배 확장 및 2주 후 800 배로 확장과 함께, 총량의 항원-특이적 T 세포(우측 패널)에서 용량-의존적 증가와 연관되었다. 이에 따라, 나노-aAPC는 작은 내인성 전구체 집단으로부터 항원-특이적 T 세포의 큰 집단을 유도하였다.
실시예 5
양자점 나노-aAPC
더 작은 스케일에서 나노-aAPC 기반의 자극을 평가하고, 나노-aAPC가 플랫폼-독점(platform-exclusive)이 아님을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 상업적으로 이용 가능한 양자점 코어, 라이프 테크놀로지스사의 직경이 20 nm 미만인 아비딘 피복된 나노 결정을 수득하였다. 비오틴 표지 된 이량체 Db-GP100 (신호 1) 및 항-CD28 항체 (신호 2)를 1:1 몰비로 나노 결정 표면에 결합시켜 양자점 나노-aAPC를 형성하였다 (도 5A).
양자점 aAPC는 생체외에서 용량-의존적, 항원 특이적 T 세포의 확장을 유도하였다 (도 5B). 평가된 최고 용량에서, T 세포는 7일 후 14.6 배 확대되었으나, 비-동족 대조군 양자점 aAPC로 자극된 T 세포는 확장되지 않았다.
실시예 6
나노-aAPC의 생체내 프라임 종양 거부(Prime Tumor Rejection)
흑색종 피하주입된 마우스 모델이, 생체 내에서 직접 주입시 면역요법을 위한 나노스케일 aAPC의 효능을 증명하기 위해 선택되었다. 양자점-aAPC를 평가하기 위해, 나이브 TCR 형질전환 pMEL CTL은 야생형 B6 마우스에 입양 전달되었고, 같은 날 마우스를 오른쪽 측면에 피하 주입된 B16 흑색종 세포로 시험하였다(도 6, 상단). 다음 날, 20 μL의 동족 양자점 aAPC 또는 20 μL의 비-동족 양자점 aAPC 중의 하나 또는 대조군으로서 PBS를 마우스에 주입하였다. 양자점 aAPC의 단일 주입은 종양 성장을 상당히 약화시켰다(도 6A, 아래). 16일 후, 마우스를 T 세포로 처리하고, 동족 양자점 aAPC는, T 세포 + 비동족 aAPC 처리된 마우스에 대한 111.1 mm2 +/-29.4, T 세포 단독에 대한 141.1 mm2 +/- 9.6, 및 비처리된 마우스에 대해 133.1 mm2 +/-7.6과 비교하여, 22.1 mm22.3의 평균 종양 크기와 함께 최저 종양 부담을 가졌다. 실험 경로에 걸친 전체 종양 성장은 곡선하 면적(AUC)으로 요약하였다. 동족 양자점-aAPC로 처리된 마우스는, AUC에 의한 전체 종양 성장(33.1 mm2 +/- 7.8)이 대조군인 비-동족 aAPC로 처리된 마우스(373.6 mm2 +/- 227.0)보다 상당히 적었다(P = 0.028).
전술한 바와 같이, 림프절에서 종양 또는 T 세포 풀에 통행하는 나노-aAPC의 능력은 나노-aAPC 면역요법의 중요한 장점일 수 있다. 입자 투여 경로는 비드 통행(trafficking)에 영향을 미치기 쉬우며, 예를 들어, 피하 증착된 비드는 림프관을 통해 림프절로 드레인(drain)될 수 있다 (30). aAPC의 투여 경로뿐만 아니라 철 덱스트란 aAPC의 생체 내 효능의 영향을 테스트하기 위해, 입자는 pMEL 입양 전달 후 삼일 째에 정맥 또는 피하로 주입되었다. B16 종양을 4일 후 우측면에 피하주입하고, aAPC의 2차 주입을 종양 후 4일째에 동측면 상에 iv(정맥) 또는 sc(피하) 중의 하나로 실시하였다. 이에 따라, 세 가지 치료 그룹이 있었다. iv(정맥) 비드 주입을 2회 받은 마우스, iv(정맥) 1회 sc(피하) 1회 주입을 받은 마우스, 및 sc(피하) 2회 주입을 받은 마우스 (도 6B, 위). 비-동족 aAPC가 주입된 대조군 마우스는 iv(정맥) 1회 및 sc(피하) 1회 주입을 받았다.
세개의 처리 그룹 모두는 대조군 비드로 주입된 마우스보다 적은 종양 성장을 나타냈다 (도 6B, 아래). 16일 후, sc(피하) 1회 iv(정맥) 1회(sc/iv) 주입으로 처리된 마우스는 최저 종양 성장 (48.0 mm2 +/- 31.16)을 나타내었으며, 그 다음으로는 sc/sc(피하/피하) 처리된 마우스 (73.7 mm2 +/- 37.44), iv/iv(정맥/정맥) 처리된 마우스 (89.4 mm2 +/- 69.5), 처리하지 않은 마우스 (88.4 mm2 +/- 17.8) 및 비-동족 처리된 마우스(113 mm2 +/- 39.4) 순이었다. 실험의 전체 경로에 걸쳐, sc/iv (피하/정맥내) 처리된 마우스 (AUC 52.6 mm2 +/- 29.7) 및 sc/sc (피하/피하) 처리된 마우스(AUC 73.1 mm2 +/- 36.1)는 대조군 마우스(AUC 162.7 mm2　+/- 77.6)보다 상당히 적은 (P <0.02) 종양 성장을 보여주었다 IV(정맥)으로 2회 주입처리된 마우스는 대조군 보다 적은 종양(AUC 103.0 +/- 86.1)을 나타내었으나, 중요한 역가(threshold) (p = 0.19)에는 도달하지 못하였다. 따라서, 적어도 하나의 용량의 피하 전달된 나노-aAPC로 처리된 마우스는, 대조군보다 상당히 적은 종양을 가졌다.
실시예 7
나이브 T 세포의 자극
생물 물리학 MHC-Ig 역방향-속도 검정을 사용하여, 나노-aAPC는 활성 T 세포와 비교하여 나이브로부터 보다 신속하게 분리되고, 이는 활성화된 세포와의 접점(16 내지 20) 보다 나이브 세포와의 더 적은 접점(8 내지 10)를 만드는 aAPC을 제안한다. 유도된 TCR 클러스터링 (Lillemeier 외., Nature Immunology 11, 90-96, 2010) 및 멤브레인 재편성(James 외. Nature 487, 64-69, 2012)이 T 세포 활성을 구동하는 것으로 생각되기 때문에, 나노-aAPC는 마이크로-aAPC보다 나이브 T 세포를 자극하는데 있어서 덜 효과적인 것은 놀라운 일은 아니다. 10만 T 세포 당 동등한 용량의 6 ng MHC-Ig에서, 나노-aAPC는 나이브 세포 단독이 아닌, 나이브 및 메모리 세포의 혼합 집단을 자극하는 반면, 마이크로-aAPC는 동등하게 두 집단을 자극할 수 있다 (도 7A). 나노 입자의 용량은 6배 (데이터는 도시하지 않음) 증가되면, 나노-aAPC는 나이브 T 세포 활성을 유도할 수 있다. 상기 용량의 나노- 및 마이크로-aAPC를 활성화된 세포에서 동일한 17 배 확장을 유도하도록 적정하는 경우, 마이크로-aAPC는 상기 용량에서 나이브 세포의 확장을 유도하였으나, 나노-aAPC는 유도하지 않았다 (도 7B).
그러나, 최적 T 세포 면역 요법은 면역 고갈을 피하기 위해 나이브 T 세포의 활성을 요구할 수 있다 (Besser, Clinical Cancer Research 16, 2646-55, 2010). 따라서 본 발명자들은 나이브 세포의 나노-aAPC 매개된 활성을 강화하기 위한 두 가지 접근법을 사용했다. 먼저 본 발명자들은 항원-특이적 전구체를 강화하면 aAPC 매개된 활성을 부스팅하면서 활성화된 T 세포에 이용가능한 IL-7 및 IL-15 등과 같은 면역-자극 사이토카인의 양을 증가시키는 것으로 가설을 세웠다. 상자성인 나노-aAPC는 4℃에서 야생형 T 세포에 결합된 다음, 자성 칼럼 상에 양성 선택을 사용하여 강화되었다(도 8A). 이는 활성 후 7일째에 Kb-TRP2 특이적 T 세포 집단의 확장을 이끌었다 (도 8B). 본 발명자들은 이는 T 세포를 동시에 강화하고 활성할 수 있는 aAPC의 제1 기재임을 믿고 있다.
두번째로는, 본 발명자들은 TCR 클러스터링을 증진하고 활성화를 유발시키기 위해 자성-유도된 비드 클러스터링을 사용하였다. 나이브 T 세포의 확장을 유발하지 않는 나노-aAPC의 저용량에서, 자기장 내 T 세포 활성화는 PMEL T 세포에 상당한 증식 장점을 부여하였다 (도 8C). 자석-강화 활성은 자기장 내 적어도 30분의 배양을 요구(데이터는 제시하지 않음)하였고, 네오디뮴 디스크 자석 및 밀테나이 바이오텍사에서 판매된 자기 농축 컬럼 둘 다에 효과적이었다. 이는 T 세포 활성화를 강화시키기 위한 신규한 방법을 제안하고, 나노-aAPC가 TCR-MHC 상호 작용을 통하여 직접적으로 T 세포를 활성화시킬 뿐만 아니라 자성을 통해 나노-aAPC를 조절하는데 사용될 수 있음을 제안한다. 이는 이러한 스케일에서의 TCR 입자의 상호 작용에 의존하며, 더 큰 aAPC로는 실현가능하지 않다. 중요한 점은, 나노-aAPC는 신호 1, 신호 2, 및 자기 부스팅을 위한 상자성 코어를 제공하여야 하며, 이는 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)에 대한 이전 나이브 T 세포의 확장을 위해 독특하고 신규한 시약을 제공한다는 점이다.
참조문헌
Figure 112015098609440-pct00001
Figure 112015098609440-pct00002
Figure 112015098609440-pct00003
Figure 112015098609440-pct00004
실시예 8. 실시예 9 내지 13에 대한 물질 및 방법
마우스 및 시약. 2C TCR 형질전환된 마우스를 C57/BL6 백그라운드 상에서 번식시켜 이형접합체로서 유지시켰다. Pmel TCR/Thy1a Rag-/- 형질전환된 마우스를 니콜라스 레스티포(Nicholas Restifo)(미국 메린랜드주 베네스다 국립위생연구소)로부터 받았으며, 동형접합체로서 유지하였다. C57BL/6j 마우스는 잭슨 실험실(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 모든 마우스를 존스 홉킨스 대학의 임상시험심사위원회에 따라 유지하였다. 형광표지된 모노클로날 항체는 바이오레전드(BioLegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였다.
MHC-Ig 이량체 및 나노-aAPC의 제조. 가용성 MHC-Ig 이량체, Kb-Ig 및 Db-Ig를 제조한 다음, 펩타이드로 로딩하였으며8, 보충방법을 참조하라. 나노-aAPC는 기재된 바와 같이 MHC-Ig 이량체 및 항-CD28 항체(37.51; 바이오레전드)를 MACS 마이크로비드 (밀테나이 바이오텍)에 직접 컨쥬게이션시켜 제조하였다.3 보충 방법에 기재된 바와 같이 나노 입자에 결합된 단백질을 형광으로 측정 하였다.
체외 세포 확장. 세포는 균질화된 마우스 비장과 림프절로부터 RBC의 저장성 용해에 의해 수득하였다. 세포 독성 림프구는 밀테나이 바이오텍(독일 쾰른)으로부터 CD8 비-접촉식 분리 키트 및 자기 농축 컬럼을 사용하여 분리하였다. CD44-비오틴 항체를 CD44lo, 나이브 세포를 분리하기 위해 주요 칵테일에 첨가하였다 적용 가능하다면, 세포는 37 ℃에서 15 분간 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지하고 이후, 광범위하게 세척하였다.
CD8+ T 세포와 나노-aAPC을 지시된 용량에서 혼합하고, T 세포 인자 (TF), 자극된 인간 PBMC에서 수확된 조절 배지의 사이토카인이 풍부한 칵테일이 보충된 완전 RPMI 배지에서 4 내지 7일 동안 24-웰 편평-바닥 또는 96-웰 둥근 바닥 플레이트서 배양하였다.46 지시된 경우, 배양 플레이트는 길이가 1/4 내지 3/4 인치 사이의 두 개의 네오디뮴 N52 디스크 자석(K & J Magnetics, Jamison, PA) 사이에 고정되었다. CFSE 형광은 BD 팩스칼리버 유동 계측법(FacsCalibur flow cytometer)을 사용하여 지시된 시점에서 측정되고 플로우조(FlowJo) (TreeStar)에서 분석 하였다. 확장 배수를 자극후 7 일째에 세포 계수로 평가하였다. 내인성 항원-특이적 세포의 확장은 활성 후 7일째에 400 nM 형광 표지된 MHC-Ig 이량체로 염색하여 평가하였다.
입자 결합 검정. 평형 입자 결합 검정을 위해, CD8+ T 세포를, FACS 세척 완충액(PBS + 2 % FCS + 0.05 % 나트륨 아지드) 중 107 세포/ml의 농도로 4 ℃에서 배양 하였다. 30 μL 분취량의 세포를 60-90 분 동안 형광 표지된 MHC-Ig 이량체를 함유하는 나노입자의 농도를 변화시키면서 혼합하였다. 세척 후, 세포-결합된 형광성을 유동 세포 계측법에 의해 측정하고, MCF(평균 채널 형광)을 플로우조를 사용하여 산출하였다.
입자 역방향-속도 분석 검정에 대해, 세포 및 포화용량의 나노 입자 또는 가용성 MHC-Ig 이량체를 상기한 바와 같이 정상 상태(steady state)에 결합하였다. MCF는 0 시점에서 측정한 다음, 재-결합을 방지하도록 과량의 클론형 1B2 차단 항체를 첨가하였다. MCF를 지정된 시점에서 측정하고, 효과적인 역방향-속도를 그래프 패드 프리즘 (GraphPad Prism)(미국 캘리포니아주 La Jolla)에서 지수형 붕괴(exponential decay)에 대해 산출하였다. 세포-입자 접점을 표 2에 기재된 바와 같이 추정하였다.
현미경. T 세포를 4 ℃에서 60 분간 나노-aAPC에 결합시켰다. 이후, 세포를 네오디뮴 N52 디스크 자석에 의해 발생된 자기장의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 96 웰 플레이트로 옮겼다. 30 분 후, 세포를 세척하고 알렉사(Alexa) 488 항-LFA1, 모노클로날 PE 항-마우스 IgG1, 및 알렉사 647 항-CD3ε으로 4℃에서 염색하였다. 샘플을 세척하고, 2 % 파라포름알데히드로 즉시 고정시켰다. 존스 홉킨스 대학의 의학 현미경 시설(Medicine Microscopy Facility)에서 100 배율로 Zeiss LSM 510 META(독일, Oberkochen, Zeiss) 레이저 스캐닝 공 초점으로 이미지를 수득하였다. CD3ε 클러스터 크기는 빌트인 입자 분석기를 사용하여 이미지제이(ImageJ) (국립위생연구소)에 기록된 입자 검출 알고리즘을 사용하여 측정하였다.
MHC -Ig 이량체의 제조. 가용성 MHC-Ig 이량체, Kb-Ig 및 Db-Ig를 제조한 다음, 문헌(Schneck, J. P.; Slansky, J. E.; O'Herrin, S. M.; Greten, T. F. Monitoring Antigen- Specific T Cells Using MHC-Ig Dimers. Curr. Protoc. Immunol. 2001, Chapter 17, Unit 17.2)에 기재된 바와 같이 펩타이드로 로딩하였다. 간략하게는, Kb-Ig 분자를 알칼리 조건(pH 11.5)에 스트리핑함으로써 펩타이드로 로딩한 다음, 50배 초과하는 펩타이드의 존재하에 리폴딩(refolding)하였다. Db-Ig 분자는 약산성 조건(pH 6.5)에 따라 스트리핑하고 50 배 몰 과량의 펩타이드와 2배 몰 과량의 인간 β2-마이크로글로불린의 존재 하에서 리폴딩되었다 (Chiu, Y.-L.; Schneck, J. P.; Oelke, M. HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient Ex Vivo Expansion of Human CTL. J. Vis. Exp. 2011, 1-5). 펩타이드 SIY (SIYRYYGL, 합성; 서열번호 3), SIIN (SIINFEKL, 오브알부민 단백질으로부터 유래됨; 서열번호 4), GP100 (KVPRNQDWL, 멜라닌세포 GP100 단백질로부터 유래됨; 서열번호 5) 및 ASN (ASNENMETH, 인플루엔자 A 핵단백질로부터 유래됨; 서열번호 6)은 겐스크립트[Genscript: 미국 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway)]로부터 구입하였다. 단백질 농도는 크기 배제 고농도 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 표지함으로써 결정하였다.
마이크로- aAPC 합성. 마이크로-aAPC를, 단백질을 4.5 μm 다이날(Dynal) 자기 마이크로 비드 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 라이프 테크놀로지사)에 직접 화학 커플링시킴으로써 전술(Oelke, M.; Schneck, J. P. Overview of a HLA-Ig Based "Lego-Like System" for T Cell Monitoring, Modulation and Expansion. Immunol. Res. 2010, 47, 248-56) 한 바와 같이 제조하였다. 초기 커플링 단계에서, 25 μg의 항-비오틴 항체[미국 미주리주, 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)]를 0.1 M 붕산 나트륨 완충액 중에 1억 마이크로 비드에 첨가하였다. 자기 칼럼에서 세정한 후, 비오틴 표지된 MHC-Ig 및 CD28을 등몰의 양으로 가하여 aAPC를 형성하였다.
나노입자 추적 분석. 민감한 CCD 카메라가 장착된 나노사이트(Nanosight) LM10을 사용하여 NTA에 의해 나노-aAPC의 크기 분포를 특징화하였다. 50 μL의 희석된 나노입자 용액을 405 nm 레이저 공급원에 연결되는 샘플 챔버에 로딩시켰다. 분산하는 센트로이드(입자)의 브라운 운동 추적을 포함하는 60초 동영상은 NTA 소프트웨어 (버전 2.0)을 사용하여 기록되었다. 이러한 영상은 권고된 바와 같이 게인(gain), 흐림 및 밝기를 수동으로 조정하여 제조업자 권장된 자동 설정을 사용하여 처리하였다. 나노입자 용액을 인산염 완충 식염수에 희석시켜 샘플 농도를 5x 1012 입자 mL-1로 조절하였다.
마이크로- aAPC 현미경. T 세포는 마이크로-aAPC와 함께 배양하고, 1 분 동안 1,000 RPM에서 회전시켜 세포 및 입자를 패킹한 다음, 4℃에서 60 분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 네오디뮴 N52 디스크 자석에 의해 발생된 자기장의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 96 웰 플레이트로 옮겼다. 30 분 후, 세포를 세척하고 알렉사488 항-LFA1, 모노클로날 PE 항-마우스 IgG1, 및 알렉사 647 항-CD3ε으로 4℃에서 염색하였다. 샘플을 세척하고, 2 % 파라포름알데히드로 즉시 고정시켰다. 존스 홉킨스 대학의 의학 현미경 시설(Medicine Microscopy Facility)에서 100 배율로 Zeiss LSM 510 META(독일, Oberkochen, Zeiss) 레이저 스캐닝 공 초점으로 이미지를 수득하였다. CD3ε 클러스터 크기는 빌트인 입자 분석기를 사용하여 이미지제이(ImageJ) (국립 보건원)에 기록된 입자 검출 알고리즘을 사용하여 측정하였다. 입자에 결합된 세포에 대한 입자 자동-형광(auto-fluorescense)을 수동으로 제거하였다.
생체 내 T 세포의 확장 및 피하 종양의 성장 억제에 대한 나노- aAPC의 효과. CD441o, CD8+ 세포를, 상기한 바와 같이 자기 농축 컬럼을 사용하여 pmel 비장 및 림프절로부터 분리하고 자기장의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 활성화시켰다. 1 x 106 Thy1.1+ pmel 세포를 B6 Thy 1.2+ 야생형 호스트 (N = 그룹 당 6마리 마우스)로 입양 전달하였다. 입양 전달한 날과 입양 전달한 후에 마우스를 30,000 단위 복강 IL-2로 처리하였다. 입양 전달 후 7일 및 20일째에, 그룹 당 3마리의 마우스를 희생시키고 림프구를 말초 혈액, 비장, 및, 사타구니, 자궁 경부 및 겨드랑이 림프절에서 분리한 후, 항-Thy1.1 항체로 염색하였다.
종양 거부 실험(tumor rejection experiment)을 상기와 같이 수행하되, 3 x 105 B16 흑색종 세포를, T 세포 입양 전달하기 10일 전에 피하 주입하였다. 일시적 림프구 감소(Transient lymphopenia)는 MSD 노르디온 감마 세포 듀얼 Cs137 공급원(Nordion Gammacell dual Cs137 source) (존스 홉킨스 분자 이미징 센터)로 입양 전달하기 하루 전에 치사 조사(sublethal irradiation) (500 cGy)로 유도하였으며, 여기서 조사 유도된 림프구 감소가 면역억제 숙주 세포를 제거하고, 백혈병 사이토카인(lymphotrophic cytokine)에 대한 경쟁을 감소시키며35, 임상 시험에서 흑색종에 대한 면역 요법의 효과를 상당히 강화시키는36 것으로 생각된다. 종양의 크기가 약 150 mm2 가 되는 지점에서 동물을 안락사 시키기 전까지 디지털 캘리퍼(digital caliper)를 사용하여 2일 간격으로 종양 성장을 모니터링 하였다.
실시예 9. 나노-aAPC는 활성화된 T 세포를 우선적으로 자극한다
T 세포 자극은 내인성 APC에 의해 전달된 2개의 활성 신호를 요구한다: 신호 1, TCR을 결합하는 MHC의 문맥에서 제시된 동족 항원 펩타이드, 및 신호 2, T 세포 반응을 조절하는 다수의 공-자극 수용체 중의 하나. 키메라 MHC-Ig 이량체(신호 1) 및 항-CD28 항체(신호 2)를, 광범위한 특성 및 생체적합성으로 인하여 나노스케일 입자 플랫폼으로서 선정된 50 내지 100 nm의 상자성 철 덱스트란 나노입자와 커플링시킴으로써 22 나노-aAPC를 합성하였다 (도 9A). 입자에 커플링된 23 단백질은 관심 단백질에 대하여 형광 항체로 표지함으로써 특징화하였다 (도 13). 나노-aAPC는, 각각 96 ± 10 및 92 ± 12 단백질/μm2의 단백질 밀도에 대하여 입자당 13 ± 3 MHC-Ig 이량체 및 12 ± 5 항-CD28 항체를 제시한다 (도 1).
Figure 112015098609440-pct00005
마이크로-aAPC (세포-크기) 및 나노-aAPC의 표면에 MHC-Ig 및 항-CD28의 양 및 밀도. 단백질을 도 13에 도시된 대로 기재된 바와 같이 정량화하였으며, 입자 농도는 계수(마이크로-aAPC) 또는 나노입자 추적 분석(나노-aAPC)에 의해 결정하였다. 고밀도(HD) 및 저밀도(LD) 입자를 합성기간 동안 입자 당 단백질의 양을 변화시킴으로써 합성하였다. 신호 1 나노입자를 항-CD28 없이 합성하였다.
나이브 세포 대 미리 활성화된 T 세포의 자극을 비교하기 위해, 본 발명자들은 pmel TCR 또는 2C TCR 형질변형된 마우스 중의 하나로부터 분리된 CD44 결손된 나이브 CD8+ 비장 세포를 사용하였다 (도 14A). 이 기술은, 한정된 항원 특이성을 갖는 진정한 나이브 T 세포를 분리시키도록 하였으나, 이전 작업3 및 기타 작업 24, 25은 형질전환된 마우스에서 발견된 세포 CD44 음성 및 CD44 높은 나이브 및 메모리가 혼합된 집단에 의존하였다. 활성화된 세포는 가용성 펩타이드, pmel T 세포에 대한 GP100 및 2C T 세포에 대한 SIY를 이용하여 CD8+ 비장 세포를 7일 동안 자극시킴으로써 생성하였다.
8 ng 총 MHC-Ig를 제시하는 낮은 용량의 나노-aAPC로 자극 후 3일째에, 나이브 pmel T 세포는 CFSE, 각각의 세포 분할로 희석된 중요한 염료에 의해 측정된 바와 같이 증식하지 않았다(도 9B, 좌측). 그러나, 동일한 용량에서, 활성화된 세포는 강하게 증식하였다(도 9B, 우측). 나노-aAPC 적정은, 나이브 세포가 활성화된 세포(1.5 ng 미만의 총 MHC-Ig)보다 나노-aAPC-유도된 증식(8 내지 10 ng의 총 MHC-Ig)에 대해 더 높은 임계값을 가지는 것임을 나타내었다(도 9C).
aAPC 크기에 대한 대조군으로서, 본 발명자들은 세포 크기 4.5 μm 직경의 철 덱스트란 마이크로-aAPC로 유도된 T 세포 증식을 평가하였다. 마이크로-aAPC는 3 일째 CFSE 희석(도 14B)에 의하여 측정한 바와 같이, 나노-aAPC보다 낮은 용량(1.5 내지 8 ng MHC-Ig)에서 나이브 T 세포 증식을 유도하였으며, 7 일째 약 10 내지 20 배 확장하였다(도 14C).
이에 따라, 활성화된 세포는 나노- 및 마이크로-aAPC에 동등하게 반응하는 반면, 나이브 세포는 나노-aAPC 기반 자극에 대해 더 높은 임계 값을 가진다. 이러한 차이는 마이크로- 및 나노-aAPC 간의 단백질 밀도 차이에 의해 구동되는 것이 아니며, 나노입자-기반 aAPC 보다 더 높은 밀도(HD) 및 더 낮은 밀도(LD)를 갖는 마이크로-aAPC가, 총 MHC-Ig에 대해 표준화되는 경우 동일한 증식을 유도하기 때문이다 (도 14D 및 도 14E). 반응은 입자 크기에 민감하기 때문에, 본 발명자는 반응의 차이가 나이브 세포 대 활성화 세포 상에서 TCR 나노 클러스터와 나노 입자의 상호 작용에서의 차이에 기인하는 것이라고 가설을 세웠다.
실시예 10. 나노- aAPC는 나이브 세포보다 활성화된 세포에 더 많은 TCR을 결합한다
TCR에 결합하는 나노입자를 조사하기 위해, 본 발명자들은 나노 입자 함유 MHC-Ig를 단독으로 합성하였고, 이에 따라 항-CD28의 결합 기여를 제거하였다. 결합 실험은 나노입자 함유 동족 MHC-Ig을 특이적으로 결합하고 낮은 백그라운드를 갖는 나이브 세포 및 활성화 T 세포에 대해 수행하였다 (도 7A).
나노 입자는 나이브 세포 및 활성화된 세포에 평행하게 결합한 다음, 재-결합을 방지하기 위해 항-클로노타입 1B2 차단 항체를 첨가하였다. 나노 입자는 활성화 세포(984초 ± 221의 반감기) 보다 나이브 세포(531초 ± 149의 반감기)로부터 더 빨리 분리됨을 나타내었다 [한 쌍의 스튜던트 t-시험(paired Student's t-test)(p<0.02)] (도 9D, 표 2).
Figure 112015098609440-pct00006
A역방향-속도(off-rate) 실험은 나이브 또는 활성화된 2C TCR 형질변형된 T 세포를 APC-표지된 MHC-Ig 또는 APC-표지된 나노입자 함유 Kb-SIY 단독으로 배양시킴으로써 수행되었다. 4℃에서 1 시간 동안 배양 한 후, 세포를 세척하고 시점 0 형광 측정을 수행하고, 1B2, 항-클로노타입 항체를 가해, 재결합하는 것을 방지하였다. 형광 측정은 다음 2~10분 간격으로 반복하였다. 역방향-속도는 그래프패드 프리즘 일차원 지수 조정(exponential fit)으로부터 계산하였다.
B반감기는 칼럼 A 에서 역방향-속도로부터 유래되었다. 활성화된 세포에 결합된 입자는 나이브 세포에 결합된 입자보다 상당히 더 긴 반감기(한 쌍의 t-시험에 의해 ** P<0.02, 여기서 측정은 실험에 의해 쌍으로 되었다)를 가졌다. 3가지 실험을 각 조건에 대해 수행하였다.
C개별 MHC-Ig의 비결합은 이량체 또는 입자 중 하나에서 포아송(Poisson) (일명 무-메모리 또는 지수)과정으로서 확률적으로 모델링될 수 있다. 속도 상수 r을 갖는 포아송 프로세스에 대해서, n번째 이벤트의 출발 시간은 형상 매개변수 n 및 단일-이벤트 속도 상수 r을 갖는 감마 분포에 의해 특징화된다:
Figure 112015098609440-pct00007
이러한 분포의 평균 E[t] = n/r. MHC-Ig 이량체가 나이브 T 세포와 하나의 접점을 만든다고 가정하면 (Fahmy, T. M.; Bieler, J. G.; Edidin, M.; Schneck, J. P. Increased TCR Avidity after T Cell Activation: a Mechanism for Sensing Low- Density Antigen. Immunity 2001, 14, 135-43), r은 나이브 세포(8.9 x 10-3) 상의 MHC-Ig의 역방향-속도로부터 추정될 수 있다. 이에 따라, 임의의 주어진 조건에 대해, E[t]는 나이브 또는 활성 세포 상에서 MHC-Ig 이량체 또는 입자의 반감기(t1/2)로부터 유도되고, r은 가정된 상수이다. TCR-MHC 접점의 수는 n으로서 추정된다:
Figure 112015098609440-pct00008
진정한 접점의 수는 이 추정값보다 높기 쉬울 것 같으며, MHC-Ig는 나이브 세포와 하나를 초과하는 접점을 만들기 쉬울 것 같다.
분리 속도를 사용하여 세포 및 다가 리간드 사이의 접점의 수를 추정하는데 사용할 수 있으며, 더 많은 접점은 더 낮은 분리를 유도한다.26 세포로부터의 나노입자 분리는, 매개변수를 도출하고 접근법을 확인하는데 사용된 가용성 MHC-Ig 이량체의 분리와 함께, 지수확률과정으로서 모델링된다 (상세한 설명은 표 2를 참조한다). 단일 TCR-MHC 접점의 역방향-속도는 효과적으로 일가인 나이브 세포(도 7C)에 대한 가용성 MHC-Ig 이량체 결합을 위해 측정하였다.13 예상한 것처럼, MHC-Ig 이량체는 1.7 추정 접점(도 9E)을 유도하며 활성화된 세포로부터 보다 느리게 분리되었으며, 이전 보고와 일치한다.13,26
나이브 세포로부터의 나노입자 분리는 자유 MHC-Ig(도 7C)보다 상당히 느리며, 나이브보다 활성화된 세포로부터 2배 더 느리다. 이에 따라, 나노-aAPC는 나이브 세포와 추정 6.8 접점을 가지며, 이는 활성화된 세포 상의 약 2배(12.6)와 비교된다(도 9E, 표 2). 이들 수는 각각 나노-aAPC의 표면에 부착된 11% 및 22%의 MHC-Ig 이량체를 나타낸다.
활성화된 세포는 넓은 범위의 입자 농도에 걸쳐서 나이브 세포 보다 평행에서 2배 적은 나노입자에 결합되었다(도 9F). 이러한 차이는 나이브 세포 및 활성화된 T 세포 상에서 동등한, T 세포 수용체 발현으로 인한 것이 아니며 (도 7B), 이는 입자당 증가된 TCR-MHC 접점이 더 적은 이용가능한 TCR을 유도하며, 결합을 억제하고 개별 클러스터에 결합하는 총량의 나노입자를 제한함을 의미한다.
또한, 결합된 총 나노-aAPC의 2배 증가 및 나이브 세포에 관여하는 TCR-MHC 접점의 2배 감소는 도 9G에 개략적으로 도시된 결합 모델을 제안한다. 나이브 세포는 세포-나노입자 접촉 이전에 작은 스케일의 TCR 클러스터로 인해 더 적은 MHC 접점을 활용하는 더 많은 나노-aAPC에 결합한다. 대조적으로, 활성화된 세포는 각각의 입자가 더 많은 TCR과 접점을 만들기 때문에 더 적은 나노입자와 결합한다.
실시예 11. 자기장은 aAPC 및 TCR/CD3의 응집을 추진한다
나노-aAPC가 나노스케일 TCR 클러스터에 결합한다는 가설을 기반으로, 본 발명자들은 TCR 클러스터 응집을 제어하는 나노입자 결합, 및 이에 따른 T 세포의 활성의 장점을 이용하였다. 외인성 자계를 사용하여 나이브 세포에 결합된 상자성 나노-aAPC의 응집을 추진시켰다. 나노-aAPC를 나이브 T 세포에 4℃에 결합한 다음, 0.2 T의 최대자기강도를 생성하는 2개의 네오디뮴 디스크 자석 사이에서 37℃에서 배양시켜, 외부자계에서 상자성 철-덱스트란 aAPC가, TCR의 응집을 추진하면서 자기적으로 분극되고 서로를 당기는지 여부27에 대하여 결정하였다(도 10A-C).
클러스터 형성을 공초점 현미경으로 평가하였다. 4℃에서 결합하고 1시간 후, 본 발명자들은 세포를 염색하고 즉시(시점 0) 고정시키거나, 또는 세포를 자기장의 부재 또는 존재 하에 37℃ 배양기로 30분 동안 옮겼다. 이후, 세포를 LFA-1 (녹색)에 대한 항체, 대조군으로서 사용된 접착 분자; CD3ε (마젠타), TCR과 연관된 신호 성분; 및 MHC-Ig (적색)을 이용하여 염색하여 나노-aAPC를 시각화하였다 최종적으로는 세포를 고정시켜 이미지화하였다.
37℃에서 배양하기 전에, aAPC 및 CD3ε은, 세포 표면을 거쳐 확산되어 분포된 작은 클러스터와 함께, 막 상에 반점 패턴으로 분포되었다 (0 시점, 도 10D 좌측 상단). LFA-1는 세포를 거쳐 균일하게 분포되었다. LFA-1 및 CD3ε 염색 패턴은 비-동족 Kb-SIINF 입자로 30분 배양한 후 0 시점에서의 것과 동일하였다(비-동족, 도 10D, 우측 상단). 자기장의 부재에서, 동족 나노-aAPC를 이용하여 배양하는 것은 LFA-1, aAPC, 또는 CD3ε 중의 하나의 분포를 대폭 변경하지는 않았다(무-자성, 도 10D, 좌측 아래). 그러나, 자기장에서 30분 후 나노-aAPC의 큰 응집이 막에 형성되었다 (자성, 도 10D 우측 아래). 나노-aAPC의 이들 클러스터는 CD3ε의 유사한 크기의 클러스터와 공동 국소화(co-localized)되었다. 대조 분자 LFA-1는 막을 가로지르는 확산 패턴을 유지하는데, 이는 CD3ε 응집이 aAPC의 연관에 기인한 것임을 나타낸다.
aAPC로 유도된 응집의 크기 및 수를 특성화하기 위해서, 입자-식별 프로그램은 이미지제이에서 개발되었다. 이 프로그램은 0 시점 세포(도 10E 좌측)로부터 클러스터, 및 자기장(도 10E 우측)에 의해 유도된 더 큰 응집을 식별할 수 있도록, 즉 확산하고 중단할 수 있었다.
자기장에서의 배양은, 나노-aAPC 단독으로 하는 배양 후에서 보여지는 것보다 TCR 응집을 상당히 증가시켰으며, 세포에 대한 더 큰 CD3 복합체 응집을 유도하였다. 37℃에서 배양하기 전에 평균 클러스터 면적은 0.30 ± 0.03 μm2이었으며, 이는 비-동족 나노-aAPC로 배양후 변화되지 않았다(도 10F). aAPC 단독은 클러스터 크기를 0.52 ± 0.06 μm2 (p<0.001)의 평균으로 증가시켰다. 또한, 클러스터링은 자기장에서 0.73 ± 0.11 μm2의 평균 크기로 강화되었다(무-자성과 비교하여 p<0.001). 세포당 클러스터의 평균 수는 시점 0에서의 6.5 ± 0.6에서 자기장이 있는 경우 3.0 ± 0.2로 감소하였다(도 10G). 자기장에서 배양후 나노-aAPC 분리 속도는 증가하지 않았으며(도 7F), 이는 응집 형성이 TCR/MHC 접점의 증가와 연관되어 있지 않고, 오히려 aAPC에 결합된 TCR 나노클러스터의 응집과 연관되어 있음을 암시한다.
또한, 외부 자기장의 영향을 마이크로-aAPC를 사용하여 연구하였다 (도 8A). 자기장의 적용으로 마이크로-aAPC 응집을 추진하였으나, 마이크로-aAPC의 응집은 세포 상의 TCR/CD3의 응집과 연관되어 있지 않다. T 세포 상의 CD3 클러스터는 자기장의 부재하에 마이크로-aAPC로 배양시 면적 내 0.39 ± 0.03 μm2이었고, 자기장의 존재하에 마이크로-aAPC로 배양시 0.37 ± 0.03 μm2이었으며(도 8B-C), 이는 T 세포가 마이크로-aAPC로 자극시 자기장이 CD3 클러스터링을 강화시키지 않음을 나타낸다. 이는 TCR 나노클러스터와 비교하여 큰 크기의 마이크로입자 때문일 것이다.
요약하면, 자기장에 의해 유도된 마이크로-가 아닌 나노-aAPC 응집은 TCR/CD3 응집 크기에서 2배의 증가 및 세포 당 응집의 수에서 2배 감소를 유도하였다. 수용체 응집은 T 세포 활성에 강하고 충분한 신호인 것으로 알려져 있기 때문에28, 본 발명자들은 T 세포 증식에 대한 자성-유도된 TCR 클러스터링의 효과를 시험하였다.
실시예 12. 자기장 내 활성은 나이브 T 세포의 증식을 강화시킨다
나노-aAPC에 의한 T 세포의 활성이 자기장 내 배양에 의해 강화되는지 여부를 평가하기 위해서, CFSE-표지된 pmel T 세포를 Db-GP100 나노-aAPC의 증가시킨 용량으로 배양한 다음 외부 자기장의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 나이브 T 세포를 최소 증식을 유도하는 나노-aAPC의 용량에서 자기장 내에 증식시켰다 (도 11A). 나노-aAPC 함유 5 ng MHC-Ig로 배양한 후, 배양 내 29%의 세포가 자기장 내 89%의 세포와 대비하여 증식하였다. 7일째 증식은 무-자성 대조군과 비교하여 최대 4배 더 증가하였다 (도 11B). 나노-aAPC가 부재한 자기장 내 배양은 T 세포 증식을 유도하지 않았다.
대조적으로, 자기장 내 마이크로-aAPC를 이용한 배양은 무-자기장 대조군과 비교하여 강화된 T 세포 확장을 유도하지 않았으며, 이는 CFSE 희석 3일 및 7일째 증식 둘 다에서 측정하였다 (도 8D-E).
자성 비드 클러스터링을 앞서 사용하여 기타 시스템에서 기계적 응력29 및 수용체 클러스터링21 , 27 둘 다의 효과를 연구하였고, 하나의 규칙이 TCR의 기계적 촉발을 위하여 제안되었다.30 ,31 그러나, 자기장 내 마이크로-aAPC는 나노-aAPC보다 더 큰 기계적 힘을 송신하기 쉽지만 TCR 응집 또는 강화된 증식을 유도하지는 않기 때문에, 나노-aAPC로 보여지는 자성-강화된 증식 효과는 기계적 수용체 "풀링(pulling)"보다 수용체 응집에 기인한 것 같다.
나노-aAPC에 의한 최적 확장에 요구되는 자기장 자극의 기간 및 강도는, 다양한 크기의 네오디뮴 자석의 첨가 및 제거에 의해 평가되었다. 자기장 내 1 내지 3시간(도 11C-11D) 및 0.2 T 이상의 자기장 강도(도 11E-3F; 도 13)는 1주 후 10배의 T 세포 확장을 추진하였다.
또한, 자기장 강화된 aAPC 자극은 내인성, 폴리클로날 T 세포 집단으로부터 항원-특이적 T 세포의 확장을 강화시켰다. 본 발명자들은 Trp2 흑색종 항원에 대해 특이적인 Trp2 펩타이드로 로딩된 Kb-Ig 이량체를 함유하는 나노-aAPC를 합성하였다. 야생형 B6 마우스로부터 CD 8+ 비장세포를 제한된 용량의 aAPC로 배양한 다음, 7일 후 항원-특이적 T 세포를 분석하였다. 나노-aAPC 단독 확장은 이러한 용량에서, 0.70% Trp2-특이적 세포를 유도하였으며, 이는 동족 Kb-Trp2 결합을 비-동족 Kb-SIINF 결합 과 비교함으로써 결정되었다(도 11G). 그러나, 자기장에서 T 세포와 배양시, aAPC는 단독 일주(a single week) 후 약 3.4% 항원-특이적 T 세포를 생성하였다(도 11G). 이는 자기장에서 10 x 106 전구체 세포의 풀로부터 생성된 약 37,000 ± 3,900 Trp-2 특이적 세포를 야기하며, 이는 자기장의 부재시 6700 ± 630와 대비된다(약 5.5배 차이, 스튜던트 t 시험에 의한 p<0.01). 1천만 당 대략 10-800로 추정되는 CD8 전구체 빈도수와 함께32, 이는 자기장이 있는 배양에서 450 내지 3,600배 확장을 암시하며, 생체내 바이러스 감염으로 나타난 1000배 전구체 확장과 비교가능하다.33
실시예 13. 자기장은 입양 면역요법에 대한 T 세포 활성을 강화시켰다
항원-특이적 세포의 자극을 강화시키는 잠재성을 위하여 생체내 입양 전달하기 전에 자기장 강화된 aAPC 자극을 연구하였다. Thy1.1+ pmel T 세포는 자기장의 존재 또는 부재하에 aAPC로 생체외에서 활성화되었으며, 야생형, Thy1.2+ 수용체 마우스 내로 입양 전달되었다(개략도 12A 참조). 입양 전달 후 7일 또는 21일 째에, 마우스를 희생시킨 다음 입양 전달된 Thy1.1+ 세포에 대해 평가하였다.
자기장 강화된 나노-aAPC 자극으로, 전달된 T 세포 집단의 강력한 확장이 야기되었다. 7일째에, 비장 내 3.1%의 T 세포는 자기장에서 자극된 T 세포에 대한 Thy1.1+ 이었으며, 이와 대비하여 자기장이 없이 aAPC로 자극된 세포에 대해서는 0.6%이었으며, 입양 전달 전에 자극되지 않은 비처리된 T 세포 단독에 대해서는 0.2%이었다 (p<0.01, 도 12B-C). 7일째 비장에서 최대 퍼센트의 세포가 수확되었다(도 12C). 시험된 모든 기관 내 총 Thy1.1+ 세포는 7일째에 자기장 강화된 그룹(도 12D)에 대해서 약 1 x 106에 도달하였으며, 이에 비해, 무-자성 그룹에 대해서는 2x 105 미만이었다. 이러한 5배 강화는 생체 외에서 보여진 강화와 대략 일치하였다. 더 적은 세포가 21일째에 나타났지만, 자기장 내 aAPC에 의해 활성화된 T 세포는 림프절내 검출가능한 집단 (0.15%)을 성립하였고, 이에 비해, aAPC 단독으로 활성된 T 세포는 0.04%를 나타내었고, 전혀 자극되지 않은 세포는 0.01%를 나타내었다 (p<0.05, 도 12B-D).
자기장 강화된 T 세포 자극의 기능적 결과를, B16 흑색종, 면역 거부에 대한 높은 임계값을 갖는 불완전 면역원성 종양의 처리에 의하여 연구하였다.34 Pmel T 세포를, 종양 주입 후 10일에 확립된 피하 B16 종양을 갖는 마우스로 입양 전달(도 12E)하고, 입양 면역요법에 대한 표준 접근법에 따라 입양 전달 하기 하루 전에 마우스의 치사 조사(500 cGy)에 의해 일시적 림프구 감소를 유도하였다.35,36
자기장에서 aAPC에 의해 활성화된 종양-특이적 T 세포는 비처리 대조군, T 세포 단독 및 자기장 없이 aAPC에 의해 자극된 T 세포와 비교하여 종양 성장을 강하게 억제시켰다(p<0.0001 2가지 방식의 아노바에 의한 치료 효과, 도 12F). 18일째, 자기장 강화된 T 세포로 처리된 마우스는 비처리된 또는 무-자성 T 세포 처리된 마우스보다 8배 내지 10배 작은 종양을 가졌다. 유사하게는, 자기장 강화된 T 세포는 주입 후 28일째에 마우스의 6/8이 생존하였으며, 4/8이 검출가능한 종양을 갖지 않았으면서 숙주 생존률을 상당히 향상시켰다[p<0.001, 만텔-콕스(Mantel-Cox), 도 12F].
참조 문헌
Figure 112015098609440-pct00009
Figure 112015098609440-pct00010
Figure 112015098609440-pct00011
Figure 112015098609440-pct00012

Claims (87)

  1. T 세포 집단을 자기장의 존재하에 나노-스케일 인공 항원 제시 세포 (나노-aAPCs)와 인큐베이션하는 단계를 포함하는, T 세포를 활성화하는 시험관내 방법이며, 여기서 나노-aAPCs는
    상자성체(paramagnetic) 나노입자,
    상기 나노입자 표면 상의 적어도 하나의 T 세포 공자극(costimulatory) 분자, 및
    적어도 하나의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 펩타이드 결합 클레프트 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 펩타이드 결합 클레프트를 포함하는 적어도 하나의 항원-제시 복합체
    를 포함하고, 항원 펩타이드가 상기 MHC에 결합함으로써 항원-특이적 T 세포를 활성화시키는 것인 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노입자가 직경 2 내지 500 nm인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 나노입자가 직경 50 내지 100 nm인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 나노-aAPC에 결합하지 않은 세포로부터 항원-특이적 T 세포를 자기 농축(magnetic enrichment)을 이용하여 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항원 펩타이드가 종양-연관된 항원의 펩타이드, 자기항원(autoantigen)의 펩타이드, 동종 항원(alloantigen)의 펩타이드, 또는 감염원 항원(infectious agent antigen)의 펩타이드인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 항원 펩타이드가 종양-연관된 항원인 방법.
  7. 제1항에 있어서, T 세포 공자극 분자가 CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, CD28에 특이적으로 결합하는 항체, HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, T 세포 공자극 분자가 CD28에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  9. 제7항에 있어서, T 세포 공자극 분자가 CD80 (B7-1)인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 활성화된 T 세포가 세포독성 T 세포인 방법.
  11. 제1항에 있어서, T 세포 집단이 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직 또는 종양 조직으로부터 수득된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, T 세포 집단이 성분 채집술(apheresis) 또는 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)에 의해 수득된 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 활성화된 T 세포가 환자에게 투여되기 위한 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 환자가 암, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환을 가지거나, 면역억제된 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, T 세포 집단이 상기 환자로부터 수득된 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, T 세포 집단이 상기 환자가 아닌 도너(donor)로부터 수득된 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, T 세포 집단이 나노-aAPCs와 3일 내지 21일 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, T 세포 집단이 나노-aAPCs와 3일 내지 10일 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, T 세포 집단이 자기장의 존재하에 10분 내지 3일 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 항원-특이적 T 세포가 자성 칼럼 상에서 양성 선택된 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 항원-제시 복합체가, 면역글로불린 중쇄에 각각 융합된 제1 및 제2 MHC 클래스 I α 쇄를 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 항원-제시 복합체가, 면역글로불린 중쇄에 각각 융합된 제1 및 제2 MHC 클래스 IIα 쇄, 또는 제1 및 제2 MHC 클래스 IIβ 쇄를 포함하는 것인 방법.
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