CN112957459A - 基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒及其制备方法以及其用于制备纳米疫苗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒及其制备方法，具体为在超声条件下将阳离子脂质体溶液、流感病毒水性溶液、肿瘤细胞膜分散体以及聚乙烯醇水性溶液混合得到均匀混合液，所述混合液蒸发至干的残余物再溶解于超纯水或者DMEM培养基即可得到所述纳米颗粒。其中，流感病毒在体内可以激发全身免疫系统产生细胞因子风暴，并使在肿瘤治疗中具有重要作用的树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等被大量激活，随后大幅提高T细胞的增值效率；从肿瘤细胞膜可以获得包含促进肿瘤抗原特异性免疫反应所需的信号，启动T细胞，可用于控制肿瘤生长，所述基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒可全身性激活机体免疫功能，使肿瘤治疗更加高效。

Description

基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒及其制备方法以及其 用于制备纳米疫苗的用途
技术领域
本发明属于纳米制剂制备领域。更具体地，涉及一种基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
癌症是人类面临的最大挑战之一，现代医学已经跟癌症战斗了几十年，从最初对它的一无所知，到后来的手术切除，再到后来的放化疗以及靶向药，人类的治疗技术每迈进一步，癌细胞总能进一步找到藏身之处。近年来，我国肿瘤的发病率和死亡率不断走高，尤其是在城市居民中，癌症已成为威胁居民健康的头号杀手。免疫疗法是当今最火热的癌症治疗方式，被誉为癌症治疗的第三次革命，到目前为止，免疫治疗已经发展出了多种形式：靶向抗体、癌症疫苗、过继细胞疗法、溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂、细胞因子和免疫佐剂。免疫治疗主要通过激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织，从而达到治疗癌症的作用，是治疗肿瘤最有效的方法之一。在免疫治疗领域，以疫苗为基础的治疗方法是一种效果显著的治疗手段，因为疫苗疗法可以诱导和扩增针对抗原的免疫细胞，细菌类和病毒类疫苗已经拯救了数千万人类的性命。
但是肿瘤疫苗的研发和治疗效果并没有达到理想中的预期，原因是不同个体内的肿瘤细胞具有不同的抗原蛋白表达谱，而不同个体的免疫细胞也具有不同的免疫细胞应答谱，因此在疫苗的设计过程中抗原的选择方案难以统一，并且肿瘤细胞具有免疫逃逸能力，一旦个体的肿瘤细胞下调或沉默疫苗相关抗原，则会导致已经设计好的肿瘤疫苗很难再次发挥作用，因此，如何设计理想的肿瘤疫苗显得尤为重要。
发明内容
发明要解决的问题
基于背景技术部分所述的问题，本发明的目的在于设计并制备一种能够更高效治疗肿瘤的肿瘤疫苗。
用于解决问题的方案
本发明提供一种基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将阳离子脂质体溶解在有机溶剂中以形成约0.1-5mM的阳离子脂质体溶液；
(2)将聚乙烯醇(PVA，优选重均分子量85,000-124,000)溶解在水性溶剂中以形成约0.1-20mg/ml的聚乙烯醇水性溶液，其中所述的水性溶剂选自超纯水、DMEM(dulbecco'smodified eagle medium)培养基和磷酸缓冲盐溶液(PBS)或它们中的两种或更多种的混合物；
(3)将肿瘤细胞来源的细胞膜分散在极性有机溶剂中以成为肿瘤细胞膜分散体，其中每毫升分散体中包含约1×106个至1×107个肿瘤细胞来源的细胞膜；
(4)提供流感病毒水性溶液，其中每毫升包含约1×105个至1×106个流感病毒；
(5)在超声条件下将所述阳离子脂质体溶液、所述流感病毒水性溶液、所述肿瘤细胞膜分散体以及所述聚乙烯醇水性溶液混合得到均匀混合液，其中，阳离子脂质体的微摩尔数为a，流感病毒个数为b×106，肿瘤细胞来源的细胞膜个数为c×106，聚乙烯醇的毫克数为d，并且a:b＝约(0.2-10):1、优选的a:b＝约(1-8):1、优选的a:b＝约(2-6):1、优选的a:b＝约(3-5):1、更优选a:b＝约4:1；b:c＝约1:(0.1-6)、优选的b:c＝约1:(0.5-5)、优选的b:c＝约1:(1-4)、优选的b:c＝约1:(2-3)；b:d＝约1:(0.1-20)、优选的b: d＝约1:(1-18)、优选的b:d＝约1:(6-12)；
(6)将所述均匀混合液蒸发至干以形成残余物；
(7)将所述残余物分散在超纯水或者DMEM培养基中以形成基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒。
优选的，在步骤(5)中的所述超声条件为：温度T℃，功率M瓦，以持续K秒、停止L秒的周期持续超声N分钟，其中，约0℃＜T≤8℃、优选的约 1℃≤T≤7℃、优选的约2℃≤T≤6℃、优选的约3℃≤T≤5℃、更优选的T＝约4℃；约140瓦≤M≤210瓦、优选的约150瓦≤M≤200瓦、优选的约160瓦≤M≤190瓦、优选的约170瓦≤M≤180瓦；约0秒＜K≤5秒、优选的约1秒≤K≤4秒、优选的约2秒≤K≤3秒；约0秒＜L≤15秒、优选的约0秒＜L≤10 秒、优选的约0.2秒＜L≤8秒、优选的约0.5秒＜L≤6秒、优选的约1秒＜L≤4 秒；约0＜N≤30分钟、优选的约5分钟≤N≤25分钟、优选的约8分钟≤N≤20 分钟、优选的约10分钟≤N≤15分钟。
优选的，其中所述流感病毒选自已知能激活天然免疫的病毒毒株，优选自WSN病毒株、PR8病毒株、SeV病毒株或它们中的两种或更多种的混合物。
优选的，所述肿瘤细胞选自黑色素瘤B16F10细胞、乳腺癌4T1细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞或它们中的两种或更多种的混合物。
优选的，所述阳离子脂质体选自DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、 DTAB(溴化三甲基十二烷基铵)、TTAB(溴化三甲基十四烷基铵)、CATB (溴化三甲基十六烷基铵)、DDAB(溴化三甲基双十八烷基铵)、DOTMA (氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DOSPA(三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵)或它们中的两种或更多种的混合物。
优选的，步骤(1)中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、DMSO(二甲基亚砜)、MSM(二甲基砜)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMAC(二甲基乙酰胺)或它们中的两种或更多种的混合物。
优选的，步骤(3)中所述的极性有机溶剂选自DMSO、MSM、DMF、 DMAC或它们中的两种或更多种的混合物。
本发明还提供一种通过所述制备方法制备的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒。
本发明还提供如上所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒用于制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗的用途。
本发明还提供一种利用流感病毒和肿瘤细胞来源的细胞膜制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗的用途。在此方面，所述流感病毒和所述肿瘤细胞来源的细胞膜与上文关于“基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法”方面描述的流感病毒和肿瘤细胞来源的细胞膜具有相同的含义，并且关于它们明确指出的各自优选范围同样也适用于此。
发明效果
在根据本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒和由其制备的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗中，流感病毒可以激活全身免疫反应。流感病毒结构复杂，含有包膜、血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和 ss-RNA等成分，所以其作为异物在体内可以激发全身免疫系统产生细胞因子风暴(如干扰素、肿瘤坏死因子和各种白细胞介素等)，并使在抗肿瘤治疗过程中具有重要作用的树突状细胞(DC细胞，提呈肿瘤抗原)，巨噬细胞(吞噬肿瘤细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞，杀伤肿瘤细胞)等被大量激活，随后大幅提高T细胞的增值效率。
在根据本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒和由其制备的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗中，肿瘤细胞膜可以特异性激活肿瘤抗原特异性免疫反应。为了使大多数以免疫为基础的疫苗成功，必须调动具有正确肿瘤靶向特异性的T细胞亚群。当缺乏这种特异性时，为免疫系统提供处理和递呈的肿瘤抗原物质是刺激抗原特异性T细胞群的一种常见策略。从癌细胞中提取的细胞膜涂层，可以获得包含了促进肿瘤抗原特异性免疫反应所需的信号，启动T细胞，可用于控制肿瘤生长。
本发明的基于流感病毒和肿瘤细胞膜的复合纳米颗粒可全身性激活机体免疫功能，相对于传统肿瘤治疗方法，该策略使肿瘤治疗更加高效，另外本发明的基于流感病毒和肿瘤细胞膜的复合纳米颗粒产品具有优异的生物相容性，无副作用产生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是酶联免疫法检测空白和实施例1-7制备得到的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒激活树突状细胞的吸光度值图(通过TNF-α因子)。
图2是酶联免疫法检测空白和实施例1-7制备得到的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒激活树突状细胞的吸光度值图(通过IL-6因子)。
图3是激光粒度分析仪测量实施例2制备得到的(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒直径结果图。
图4是流式细胞仪测定激活树突状细胞的荧光图和被激活树突状细胞占所有检测细胞总量百分比的柱状图。
图5是流式细胞仪测定激活巨噬细胞的荧光图和被激活巨噬细胞占所有检测细胞总量百分比的柱状图。
图6为巨噬细胞被激活的免疫荧光图。
图7为小鼠肿瘤体积曲线图。
图8为小鼠生存率曲线图。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本公开的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，决不作为对本公开及其应用或使用的任何限制。本公开可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本公开透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本公开的范围。应注意到：除非另有说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、材料的组分、数字表达式和数值等应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。本公开中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％，±40％，±30％，±20％和±10％范围内。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明的实施例公开了一种基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法。
一、实验试剂与仪器
(1)表1为实验试剂与耗材
Figure RE-GDA0003019979100000061
(2)表2为实验仪器
Figure RE-GDA0003019979100000062
Figure RE-GDA0003019979100000071
二、制备根据本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒(实施例 1-7)
通用步骤：
利用以下步骤制备根据本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒，
1)称取DOTAP粉末，加入二氯甲烷后溶解，得到浓度为0.1-5mM的 DOTAP二氯甲烷溶液；
2)称取PVA粉末，加入超纯水后溶解，得到浓度0.1-20mg/mL的PVA 水溶液；
3)肿瘤细胞的培养和肿瘤细胞膜的提取
在37℃、5％二氧化碳的条件下对肿瘤细胞进行培养，培养基为含体积比为10％胎牛血清和1％青链霉素双抗溶液(以下简称双抗，其中青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml)的DMEM培养基，选择 T75细胞培养瓶中肿瘤细胞的细胞密度长到95％以上时收集细胞，600g离心 5min，用1ml 1×PBS缓冲液重悬洗涤，再次600g离心1min后即可进行肿瘤细胞膜的提取；
利用细胞膜提取试剂盒(碧云天P0033)对肿瘤细胞进行细胞膜提取，然后分散在DMSO中形成肿瘤细胞膜分散体，其中每毫升分散体中包含约 5×106个肿瘤细胞来源的细胞膜；
此处涉及的肿瘤细胞主要为小鼠黑色素瘤B16F10细胞和小鼠乳腺癌 4T1细胞，肿瘤细胞株可以通过商业购买渠道获得；此处其他可以获得肿瘤细胞膜的方法也都可以采用，本发明中优选采用试剂盒提取肿瘤细胞膜。
4)提供流感病毒的水性溶液
在37℃、5％二氧化碳的条件下对犬肾细胞MDCK(可以通过商业购买渠道获得)进行培养，培养基为含体积比为10％胎牛血清和1％双抗的DMEM 培养基，待细胞密度在85％以上时，用0.1MOI(感染复数)的流感病毒感染细胞，培养2h后换液，即由于细胞贴壁生长，流感病毒吸附在贴壁的MDCK细胞上，吸取原培养液，加入等体积的体积比为2％的胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，培养72-96h后3000rpm离心10min收集上清即为流感病毒，置于-80℃保存，分析后可确定其中每毫升包含约1×106个流感病毒；
此处涉及的流感病毒主要为WSN病毒株和病PR8毒株，一般情况下，病毒在中国科学院武汉病毒研究所微生物菌(毒)种保藏中心有保藏，在提交相关证明材料后，可以对病毒株进行索要。
5)在超声条件下将所述阳离子脂质体溶液、所述流感病毒水性溶液、所述肿瘤细胞膜分散体以及所述聚乙烯醇水性溶液混合得到均匀混合液，其中，阳离子脂质体的微摩尔数为a，流感病毒个数为b×106个，肿瘤细胞来源的细胞膜个数为c×106个，聚乙烯醇的毫克数为d，并且a:b＝约(0.2-10):1、 b:c约＝1:(0.01-6)、b:d＝约1:(0.1-20)；
另外，设置超声条件为：温度T℃，功率M瓦，以持续K秒、停止L 秒的周期持续超声N分钟，其中，约0℃＜T≤8℃、约140瓦≤M≤210瓦、约0秒＜K≤5秒、约0秒＜L≤15秒、约0＜N≤30分钟；
6)将得自步骤5)的所述均匀混合液蒸发至干以形成残余物，优选的0 可以用旋转蒸发仪在-20℃、80rpm旋蒸直至形成一层薄膜残余物；
7)将得自步骤6)的残余物分散在1ml超纯水(也可以为DMEM培养基)中装在EP管里，获得本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒。
以下为实施例表3：
Figure RE-GDA0003019979100000081
Figure RE-GDA0003019979100000091
从实施例表3可以看出，实施例2的制备条件可以看作基本制备条件，其它实施例都可以看作它的制备条件修改一项后的条件。例如实施例1只是与实施例2的肿瘤细胞来源的细胞膜个数(分散体体积)不同；实施例3 只是与实施例2使用的流感病毒种类不同；实施例4只是与实施例2使用的肿瘤细胞种类不同；实施例5只是与实施例2使用的超声条件不同；实施例6与实施例2对比，成2倍增加DOTAP的二氯甲烷溶液中DODAP微摩尔数a、PVA水性溶液中PVA毫克数b和肿瘤细胞膜分散体体积；实施例7 只是与实施例2对比，成3倍增加DOTAP的二氯甲烷溶液中DODAP微摩尔数a、PVA水溶液中PVA毫克数b和肿瘤细胞膜分散体体积。
三、ELISA(酶联免疫法)检测实施例1-7制备得到的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒对树突状细胞的激活
本发明中用到的树突状细胞的具体细胞系为树突状DC2.4细胞，可通过购买渠道获得，其他细胞系的树突状细胞也可以用于本发明。
本发明用ELISA检测基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒激活树突状细胞的原理为，激活的树突状细胞中含有IL-6和TNF-α两种因子，这两种因子在ELISA试剂盒中通过与试剂进行结合反应，最后通过酶标仪测定与这两种因子结合情况的吸光度值，吸光度值的大小直接反应这两种因子的数量多少，间接反应被基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒激活的树突状细胞的数量多少，相应反应了该实施例下所获得的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的数量多少和在肿瘤治疗方面的作用，同时也相应说明了该实施例的制备条件是相对优选的制备条件。
取T25细胞培养瓶中对数期生长的树突状细胞约5×106个，用12ml体积比为10％胎牛血清、1％双抗和1％谷氨酰胺(浓度为2mM)的DMEM培养基重悬调整细胞悬液浓度，在48孔板上每个孔加入250μl细胞悬液铺板，在37℃、5％二氧化碳的条件下对树突状细胞进行培养，待细胞密度在85％以上时，每孔各添加100ul实施例1至实施例7所得到的纳米颗粒溶液以及用作空白对照的1×PBS缓冲液，本实验中需要至少添加两次共16个孔，培养36h后每孔300g离心10min收集上清用于ELASA(酶联免疫法)检测，本发明中检测方法优选为试剂盒法，试剂盒为联科生物产品，分别为Mouse IL-6ELISAKit和Mouse TNF-αELISAKit，但是其它形式的ELASA检测也可以用于检测本发明的制备得到的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒对树突状细胞的激活。
具体实验结果如图1和2所示：
图1为空白对照和7个实施例Mouse TNF-αELISA实验结果图，其中横坐标为每个实施例，纵坐标为是酶标仪测出来的相对吸光度值，TNF-α因子含量越高，吸光度值越高，而空白对照吸光度值很低，本发明7个实施例的吸光度值是将空白对照的吸光度值作为1比较计算出来的。
如图1所示，吸光度值排名前三的分别为实施例3(66.641)、实施例5 (65.219)和实施例2(64.518)，以实施例2作为对比实施例，实施3例与实施例2相比只是将感染的流感病毒毒株从WSN病毒株替换为PR8病毒株，说明PR8病毒株在此相同制备条件下比WSN病毒株制备的(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒更多，其他类型流感病毒比如SeV病毒株，或者已知能激活天然免疫的流感病毒其中一种或两种或多种的混合物也可以用于制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒；实施例5与实施例2相比替换的是超声制备的条件，说明对于其他条件相同，4℃、功率175W，以持续1s、停1s，超声10min的超声制备条件能制备更多的(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒。
图2为空白对照和7个实施例Mouse IL-6ELISA实验结果图，其中横坐标为每个实施例，纵坐标为是酶标仪测出来的相对吸光度值，IL-6因子含量越高，吸光度值越高，而空白对照吸光度值很低，本发明7个实施例的吸光度值是将空白对照的吸光度值作为1比较计算出来的。
如图2所示，吸光度值排名前三的分别为实施例2(16.915)、实施例6 (11.895)、实施例5(11.815)，实施例6与实施例2相比成2倍增加DOTAP 的二氯甲烷溶液中DODAP微摩尔数、PVA水溶液中PVA毫克数和肿瘤细胞膜分散体体积；实施例5与实施例2相比替换的是超声制备的条件。
通过ELISA法帮助我们更好的确定基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的超声制备法的各种条件，包括：
1)超声破碎仪下，设置条件为T℃、开始K秒、停止L秒，功率M瓦，随后在超声条件下超声N分钟，其中约0℃＜T≤8℃、约140瓦≤M≤210 瓦、0秒＜K≤5秒、约0秒＜L≤15秒、约0＜N≤30分钟，T优选4℃， M优选175瓦≤M≤210瓦，K、L优选3秒、1秒或者1秒、1秒，N优选 10分钟。
2)超声条件下，阳离子脂质体的微摩尔数为a，流感病毒个数为b×106，肿瘤细胞膜分散体中含有c×106个肿瘤细胞来源的细胞膜，PVA的毫克数为 d，其中a:b＝约(0.2-10):1、b:c＝约1:(0.1-6)、b:d＝约1:(0.1-20)，优选的，a:b＝(1-3):1、b:c＝1:(0.5-3)、b:d＝1:(6-18)。
3)实施例4中采用了与实施例2不同的肿瘤细胞(乳腺癌4T1细胞)，其实本发明的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法中肿瘤细胞可以选自黑色素瘤B16F10细胞、乳腺癌4T1细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞中的一种或多种的混合物。
四、实施例2制备得到的(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的激光粒度分析仪结果图
如图3所示，其中横坐标为(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的水动力直径(单位nm)，纵坐标为相应水动力直径大小的粒子所占的百分比， (Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒在直径161nm-361nm间成正态分布，有超过50％的粒子直径范围在205nm-261nm之间。
五、流式细胞仪检测实施例2得到的(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒对树突状细胞的激活。
流式细胞仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。本发明用流式细胞仪检测得到的(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒对树突状细胞的激活的原理为，用荧光标记抗体，抗体特异性地结合细胞上对应的抗原，表达该抗原的细胞被标记上荧光，抗原表达多的细胞荧光强度强，从而间接反应了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒对树突状细胞的激活情况，相应的也就反应了该(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用。
1)取T25细胞培养瓶中对数期生长的树突状细胞约5×106个，用12ml 体积比为10％胎牛血清、1％双抗和1％谷氨酰胺的DMEM培养基重悬调整细胞悬液浓度，在6孔板上每个孔加入2ml细胞悬液铺板，置于37℃、5％ CO2培养箱使细胞贴壁，培养24小时；
2)在6孔板上其中的5孔中分别加入各1ml的1×PBS缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、含B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、含 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液继续培养48h，其中B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液都是按照实施例2的制备条件进行制备得到的，只是制备 B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入流感病毒的水性溶液，制备Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入肿瘤细胞膜分散体；
3)分别收集得到的树突状细胞后用100μl的1×PBS缓冲液洗三次(即弃掉培养基后用100μl的1×PBS缓冲液重悬，300rpm离心5min，反复进行三次)，然后用加了2％胎牛血清的PBS缓冲液稀释为1％的抗CD80-FITC(浓度为5μg/ml)抗体和抗CD83-PE抗体(浓度为2μg/ml)各100μl在4℃条件下染色30min；
4)之后用4℃条件下预冷的100μl的1×PBS缓冲液洗三次(方法同上)，用流式细胞仪检测细胞的荧光，设定为检测前10000个细胞，结果如图4所示。
图4中前5个小图分别反应了1×PBS缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒、(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒激活树突状细胞中表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况，随坐标轴越往右越往上表示荧光越强，其中所标的数字反应了所激活的细胞占所有检测细胞总量的百分比，最后一张柱状图是这5种情况下所激活的细胞百分比数量的柱状图，通过图可以看出(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒所激活的树突状细胞百分比(34.4％)远远大于其他颗粒，并且也大于B16F10@DOTAP纳米颗粒(百分比7.60％)和Flu@DOTAP纳米颗粒 (百分比7.18％)相加的结果，说明制备(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒方法中的流感病毒和肿瘤细胞膜起了协同作用，使得(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用远远优于单种原料制备的 B16F10@DOTAP纳米颗粒和Flu@DOTAP纳米颗粒。
六、流式细胞仪检测实施例2得到的(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒对巨噬细胞的激活。
原理同上，在此不赘述。
1)取T25细胞培养瓶中对数期生长的巨噬细胞RAW264.7(可通过购买渠道获得，其他系的巨噬细胞也可以用于本发明)约5×106个，用12ml 体积比为10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基重悬调整细胞悬液浓度，在6孔板上每个孔加入2ml细胞悬液铺板，置于37℃、5％CO2培养箱使细胞贴壁，培养24小时；
2)在6孔板上其中的5孔中分别加入各1ml的1×PBS缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、含B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、含 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液继续培养48h，其中B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液都是按照实施例2的制备条件进行制备得到的，只是制备 B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入流感病毒，制备 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入肿瘤细胞膜分散体；
3)收集细胞后用100μl的1×PBS缓冲液洗三次(方法同上)，然后用加了2％胎牛血清的1×PBS缓冲液稀释为1％的抗CD80-FITC抗体(浓度为 5μg/ml)和抗F4/80-APC抗体(浓度为2μg/ml)各100μl在4℃条件下染色 30min；
4)之后用4℃条件下预冷的100μl的1×PBS缓冲液洗三次(方法同上)，用流式细胞仪检测细胞的荧光，设定为检测前10000个细胞，结果如图5所示。
图5中前5个小图分别反应了PBS缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒、(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒激活的巨噬细胞中表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况，随坐标轴越往右越往上表示荧光越强，其中所标的数字反应了所激活的细胞占所有检测细胞总量的百分比，最后一张柱状图是这5种情况下所激活的细胞百分比数量的柱状图，通过图可以看出(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒所激活的巨噬细胞百分比(30.4％)远远大于其他颗粒，并且也大于B16F10@DOTAP纳米颗粒(百分比13.8％)和Flu@DOTAP纳米颗粒(百分比11.3％)相加的结果，说明制备(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒方法中的流感病毒和肿瘤细胞膜起了协同作用，使得(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用远远优于单种原料制备的B16F10@DOTAP纳米颗粒和Flu@DOTAP纳米颗粒。
七、巨噬细胞免疫荧光实验
本发明用倒置荧光显微镜检测得到的(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒对巨噬细胞的激活的原理为，用荧光标记抗体，抗体特异性地结合细胞上对应的抗原，表达该抗原的细胞被标记上荧光，拥有该荧光的细胞可以通过倒置荧光显微镜被观察到，激活的巨噬细胞越多，从倒置荧光显微镜中观察到的有荧光的地方和细胞越多，从而间接反应了(Flu+B16F10)@DOTAP 纳米颗粒对巨噬细胞的激活情况，相应的也就反应了该(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用。
1)取T25细胞培养瓶中对数期生长的巨噬细胞RAW264.7约5×106个，用12ml体积比为10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基重悬调整细胞悬液浓度，在48孔板上每个孔加入200μl细胞悬液铺板，置于37℃、5％CO2 培养箱使细胞贴壁，培养24小时；
2)在48孔板上其中的5孔中分别加入各200μl的PBS缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、含B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、含 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液继续培养24h，其中B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液、(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液都是按照实施例2的制备条件进行制备得到的，只是制备 B16F10@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入流感病毒，制备 Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入肿瘤细胞膜分散体；
3)上述5孔收集细胞后用100μl的1×PBS缓冲液洗三次(方法同上)，然后用加了2％胎牛血清的1×PBS缓冲液稀释为1％的抗CD80-FITC抗体(浓度为5μg/ml)和抗F4/80-APC抗体(浓度为2μg/ml)各100μl染色30min；
4)用100μl的1×PBS缓冲液洗三次(方法同上)，用倒置荧光显微镜观察细胞的荧光；
5)上述5孔每孔加20ul DAPI染色液对细胞核染色5min，加100μl的 1×PBS洗一遍，再使用倒置荧光显微镜观察。
倒置荧光显微镜观察到的荧光图如图6，图中每列从左至右分别为PBS 缓冲液、黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒和(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒五种用于对比的不同颗粒；每排从上至下分别为细胞核DAPI染色荧光图、抗CD80-FITC 抗体荧光图、抗F4/80-APC抗体荧光图以及上面三类图的合并图。
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色，这里用DAPI 染色主要是确定细胞核的位置(第一横排图的结果)。
从第二横排抗CD80-FITC抗体荧光图可以看出，PBS缓冲液情况下一点荧光也没有出现，黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒三种情况下也分别只观察到很少量的荧光，而(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒情况下出现大量荧光，比前面所有荧光的总和还多很多，说明了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒大量激活巨噬细胞的情况，这相应反应了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用。因为B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒两种颗粒的制备方法与(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒完全一样，只是制备B16F10@DOTAP纳米颗粒时未加入流感病毒，制备Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入肿瘤细胞膜分散体，这样反应了制备(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒方法中的原料流感病毒和肿瘤细胞膜起了协同作用，使得(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用远远优于单种原料制备的B16F10@DOTAP纳米颗粒和Flu@DOTAP纳米颗粒。
同样的，从第三横排抗F4/80-APC抗体荧光图可以看出，PBS缓冲液情况下一点荧光也没有出现，黑色素瘤B16F10细胞膜分散体、 B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒三种情况下也分别只观察到很少量的荧光，而(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒情况下出现大量荧光，比前面所有荧光的总和还多很多，因为B16F10@DOTAP纳米颗粒、 Flu@DOTAP纳米颗粒两种颗粒的制备方法与(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒完全一样，只是制备B16F10@DOTAP纳米颗粒时未加入流感病毒，制备Flu@DOTAP纳米颗粒的超纯水溶液时未加入肿瘤细胞膜分散体，这间接反应了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒激活的巨噬细胞的数量远远大于其他颗粒，也相应反应了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒在肿瘤治疗方面的作用比单一的颗粒(B16F10@DOTAP纳米颗粒、Flu@DOTAP纳米颗粒)强很多，甚至比二者加起来的效果也要强。
第四横排合并图也是相同的结果，在此不再赘述。
八、小鼠移植肿瘤模型建立实验
1)C57小鼠随机分成5组(每组n＝6)。
2)PBS组：在小鼠肌肉处注射50ul无菌1×PBS；
B16F10组:在小鼠的肌肉处注射50ul黑色素瘤B16F10细胞膜分散体；
B16F10@DOTAP组：在小鼠的肌肉处注射50ul B16F10@DOTAP纳米颗粒；
Flu@DOTAP组：在小鼠的肌肉处注射50ul Flu@DOTAP纳米颗粒；
(Flu+B16F10)@DOTAP组：在小鼠的肌肉处注射50ul(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒。
3)3天后，第2次注射，注射剂量相同。
4)7天后每组将一只小鼠解剖用于其他检测，另外5只小鼠将B16F10 细胞(约2×106个)皮下种植到C57小鼠的腹部，建立黑色素瘤模型。
5)随后每天监测肿瘤的体积大小和记录小鼠的数量。
其中肿瘤大小通过体外卡尺直接测量的方法来统计，统计如下表4，并以此表生成图7(作图软件为origin，生成图7时进行了平滑处理)：
Figure RE-GDA0003019979100000171
Figure RE-GDA0003019979100000181
结合表4和图7，可以清楚的看到，空白照PBS组中，因为PBS对肿瘤没有治疗作用，结果肿瘤大小14天内从52.52498mm3激增至7737.62mm3，增幅超过147倍；位于中间的三组(B16F10组、B16F10@DOTAP组、 Flu@DOTAP组)对肿瘤有一定治疗作用，肿瘤大小随时间(天数)变化的曲线基本接近，第14天时三组的肿瘤大小约是PBS组肿瘤大小的1/2；而 (Flu+B16F10)@DOTAP组对肿瘤的治疗作用最佳，可以控制肿瘤非常缓慢地变大，相对应(Flu+B16F10)@DOTAP组第14天时的肿瘤大小只有 B16F10@DOTAP组情况下的1/4、Flu@DOTAP组情况下的1/3以及PBS 组情况下的1/8左右，远远小于中间三组第14天时的肿瘤大小。 (Flu+B16F10)@DOTAP组的情况证明了(Flu+B16F10)@DOTAP纳米颗粒对肿瘤的治疗作用，可以延缓小鼠黑色素瘤的疾病进展，并相应延长小鼠的寿命。
小鼠数量随时间的变化统计生成下表5，并以此表生成图8：
Figure RE-GDA0003019979100000182
Figure RE-GDA0003019979100000191
结合表5和图8，可以很容易看出PBS组在第2天时，小鼠5只剩4只；在第9天时，小鼠4只剩3只；在第12天时，小鼠3只剩2只；在第15天时，小鼠3只剩2只；在第16天时，小鼠全部死亡。
同样的，B16F10组在第2天时，小鼠5只剩4只；在第15天时，小鼠4只剩3只；在第17天时，小鼠3只剩2只；在第18天时，小鼠全部死亡。
B16F10@DOTAP组在第2时，小鼠5只剩4只；在第14天时，小鼠4 只剩2只；在第19天时，小鼠2只剩1只；在第20天时，小鼠全部死亡。
Flu@DOTAP组第2天时，小鼠5只剩4只；在第1天时，小鼠4只剩 3只；在第16天时，小鼠3只剩2只；在第17天时，小鼠2只剩1只；在第18天时，小鼠全部死亡。
(Flu+B16F10)@DOTAP组虽然在第2天、第17天和第23天时各死亡一只小鼠，但是直到第24天还有两只小鼠存活，说明(Flu+B16F10) @DOTAP纳米颗粒对肿瘤的治疗作用，可以延缓小鼠黑色素瘤的疾病进展，并相应延长小鼠的寿命。
七、其他
本发明提供的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒制备方法，其中所述阳离子脂质体选自DOTAP、DTAB、TTAB、CATB、DDAB、DOTMA、 DOSPA中的一种或多种的混合物；
其中在步骤(1)中阳离子脂质体溶解于其中的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、DMSO、DMF、DMAC 中的一种或多种的混合物；
步骤(2)中PVA所溶解的水性溶剂选自纯水、DMEM培养基和PBS 缓冲液中的一种或多种的混合物；
步骤(3)中肿瘤细胞膜分散于其中的极性有机溶剂选自DMSO、MSM、 DMF、DMAC中的一种或多种的混合物；
本发明还提供所述的制备方法制备的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒以及该纳米颗粒用于制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗制剂的用途。
本发明还提供一种利用流感病毒和肿瘤细胞来源的细胞膜制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗的用途。
总之，本发明制备简单、方便、高效，制备的原料之一的细胞膜来源于肿瘤细胞加上另一原料流感病毒，数量充足、来源广泛，易于规模化生产，开拓了制备肿瘤疫苗的新途径，经济和社会效果显著。
应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将阳离子脂质体溶解在有机溶剂中以形成0.1-5mM的阳离子脂质体溶液；
(2)将聚乙烯醇溶解在水性溶剂中以形成0.1-20mg/ml的聚乙烯醇水性溶液，所述水性溶剂选自超纯水、DMEM培养基和磷酸缓冲盐溶液或它们中的两种或更多种的混合物；
(3)将肿瘤细胞来源的细胞膜分散在极性有机溶剂中以成为肿瘤细胞膜分散体，其中每毫升分散体中包含1×106个至1×107个肿瘤细胞来源的细胞膜；
(4)提供流感病毒水性溶液，其中每毫升包含1×105个至1×106个流感病毒；
(5)在超声条件下将所述阳离子脂质体溶液、所述流感病毒水性溶液、所述肿瘤细胞膜分散体以及所述聚乙烯醇水性溶液混合得到均匀混合液，其中，阳离子脂质体的微摩尔数为a，流感病毒个数为b×106，肿瘤细胞来源的细胞膜个数为c×106，聚乙烯醇的毫克数为d，并且a:b＝(0.2-10):1、b:c＝1:(0.1-6)、b:d＝1:(0.1-20)；
(6)将所述均匀混合液蒸发至干以形成残余物；
(7)将所述残余物分散在超纯水或者DMEM培养基中以形成基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述超声条件为：温度T℃，功率M瓦，以持续K秒、停止L秒的周期持续超声N分钟，其中，0℃＜T≤8℃、140瓦≤M≤210瓦、0秒＜K≤5秒、0秒＜L≤15秒、0＜N≤30分钟。
3.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其中所述流感病毒选自已知能激活天然免疫的病毒毒株，优选自WSN病毒株、PR8病毒株、SeV病毒株或它们中的两种或更多种的混合物。
4.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自黑色素瘤B16F10细胞、乳腺癌4T1细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞或它们中的两种或更多种的混合物。
5.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体选自DOTAP、DTAB、TTAB、CATB、DDAB、DOTMA、DOSPA或它们中的两种或更多种的混合物。
6.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、DMSO、MSM、DMF、DMAC或它们中的两种或更多种的混合物。
7.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的极性有机溶剂选自DMSO、MSM、DMF、DMAC或它们中的两种或更多种的混合物。
8.一种通过权利要求1至7中任意一项所述的制备方法制备的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米颗粒用于制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗的用途。
10.一种利用流感病毒和肿瘤细胞来源的细胞膜制备基于流感病毒的肿瘤联合免疫纳米疫苗的用途。
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