CN105079802A - 一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用,该促进剂的主要成分包括用免疫刺激剂和抗原分别修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物；或主要成分包括用免疫刺激剂和抗原联合修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。该促进剂利用纳米金良好的生物相容性和可调的表面理化性质等特点作为过继性DCs疫苗的靶向纳米载体，针对不同连接物的性质进行纳米材料形貌或粒径的筛选或有效组合，大大提高过继性DCs疫苗的局部或静脉输注下的淋巴器官归巢效率，为今后的临床筛选提供了新的思路。

Description

一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米免疫技术领域，特别是涉及一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂及其制备方法与应用。

背景技术

树突状细胞(Dendriticcell,DC)是目前发现功能最强大的控制一系列免疫应答的高度特异化的抗原呈递细胞(Antigenpresentingcell,APC)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如CD8⁺T细胞、细胞毒T细胞、CD4⁺辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及自然杀伤T(NKT)细胞。这些淋巴细胞的每一种都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如IFN-γ和CD4T细胞)的作用。DCs在体内外均能激发T细胞的增殖,诱导其产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)生成，并且是惟一能够激活幼稚T细胞的细胞类型，从而发挥抗肿瘤免疫效应。

DCs是免疫应答的核心，未成熟的DCs接受病原体相关分子模式(PAMPs)或危险信号刺激后分化成熟，成熟过程中DCs上调趋化因子受体7(CCR7)表达，获得淋巴细胞归巢能力，DCs的成熟度决定其迁移能力。一旦到达淋巴结T细胞区，成熟DCs在表达于CD4⁺T细胞表面的CD40L的刺激下“批准”后激活。CD40信号刺激，上调DCs表面共刺激分子，抗凋亡分子，上调IL-12的分泌，使DCs获得最佳激活CD8⁺T细胞的能力。

过继性细胞免疫治疗主要是通过给患者回输各种特异性与非特异性的免疫效应细胞发挥对患病细胞的杀伤作用，同时调节和增强机体的免疫功能，往往用于患者放、化疗或造血干细胞移植、器官移植后的辅助治疗上。因此，过继性树突状细胞输注作为日趋成熟的免疫疗法在肿瘤和慢性感染性疾病的防治中发挥越来越大的作用。

过继性DCs需经过抗原负载和活化成熟两个功能化阶段才可成为功能化的DCs疫苗。培养环境中的散在抗原可以通过胞饮作用一定程度地被过继性DCs摄取,这也是临床过继性DCs治疗过程中常用的抗原负载方法。这种粗放性的抗原负载方法虽然操作简便，但由于过继性DCs培养微环境中的较低的抗原丰度和抗原经胞饮途径本身的代谢特点使得DCs抗原负载效率大打折扣。影响过继性DCs功能化的另一关键因素是过继性DCs的激活和成熟程度。成熟的过继性DCs通过其表面表达的多种共刺激分子(如CD40,CD80,CD86等)和Th1类细胞因子(IL-12P⁷⁰,IL-1β，TNF-α等)诱导T细胞免疫激活，而未成熟的过继性DCs不仅不能活化T细胞,反而会使T细胞功能失活,诱导T细胞耐受。

目前，经FDA认证的细胞因子鸡尾酒(Cytokinecocktail，包括细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE₂)和改良细胞因子鸡尾酒(包括细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、和polyI：C)是刺激过继性DCs成熟最常用的促进剂。该促进剂能够显著提高过继性DCs的成熟度，包括共刺激分子的上调表达和某些促炎因子的分泌。但是，该促进剂最大的缺陷是其不能有效地促进过继性DCs分泌IL-12，而大量的文献证明过继性DCs激活T细胞很大程度上依赖于其IL-12的高分泌，这也是近几年过继性DCs治疗在临床上响应率低下(10–15％)的主要原因。

因此，开发有效的促进剂，最大程度地提高过继性DCs的抗原负载效率及激活成熟程度，促进过继性DCs在体内迁移及递呈抗原给T细胞的能力，从而诱发机体强烈的免疫应答，是提高其临床疗效的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂，主要成分包括用免疫刺激剂和抗原分别修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物；或主要成分包括用免疫刺激剂和抗原联合修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物；优选地，所述金纳米粒子为球形金纳米粒子、棒状金纳米粒子或立方体金纳米粒子。

所述球形金纳米粒子由以下方法制备得到：按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.01wt％)加热至110-130℃后迅速加入0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(1wt％)继续搅拌得到球形金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm。

所述棒状金纳米粒子由以下方法制备得到：

Ⅰ、按体积份数，将1份的氯金酸溶液(0.01mol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，100mmol/L)溶液混合均匀后，加入2.4份新鲜配置、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)并倒置混匀，静置于25℃水浴中陈化1-5h，得到金纳米种子溶液；

Ⅱ、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.01mol/L)、6份的硝酸银溶液(0.01mol/L)和6.4份的抗坏血酸溶液(0.01mol/L)依次加入到950份的CTAB溶液(0.01mol/L)中，再加入1-10份步骤Ⅰ得到的金纳米种子溶液，混匀，静置于25℃水浴中，陈化3h，得到棒状金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到棒状金纳米粒子。

所述免疫刺激剂-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选60-80nm；和/或金纳米粒子的含量为12.5μg/mL-37.5μg/mL，优选25μg/mL；或

按以下方法制备得到：用还原剂对巯基化CpG序列(5’-SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt-3’)进行脱二硫键预处理，再对金纳米粒子进行功能化修饰；

优选地具体步骤如下：

(1)、用pH＝8.0,0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将二硫苏糖醇(DTT)配制成浓度为0.1-0.2mol/L的DTT溶液,再加入0.25倍DTT溶液体积的CpG(100μmol/L)室温反应1h后完成脱二硫键，然后进行除杂；所述除杂是用核酸纯化柱进行；

(2)、将步骤(1)得到的除杂处理后的反应液与金纳米粒子混合，使CpG的终浓度为3-5μmol/L，室温振荡24h得到免疫刺激剂-纳米金复合物：CpG-球形纳米金复合物。

所述抗原-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选40-80nm；和/或金纳米粒子的含量为12.5μg/mL-37.5μg/mL，优选25μg/mL；或

按以下方法制备得到：抗原与金纳米粒子的偶联；

优选的具体步骤如下：

将经修饰的抗原与金纳米粒子混合至经修饰的抗原的终浓度为50-500μmol/L，室温下振荡孵育24h，得到抗原-纳米金复合物；

例如：当抗原为OVAp时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为：首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG)与金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为1mg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp至OVAp的终浓度为50μmol/L，室温振荡24h，得到OVAp-纳米金复合物备用；或

当抗原为mAGE-1时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为：构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1；将mAGE-1与金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为1-10mol，并室温保持1h，得到抗原-纳米金复合物：mAGE-1-纳米金复合物备用。

所述免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物是按以下方法制备得到：将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联得到；优选的具体步骤如下：将一定剂量(如终浓度50-500μmol/L)的抗原与免疫刺激剂-纳米金复合物等体积混合，室温下振荡孵育24h后3000-12000rpm转速离心10-20分钟，即得到免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。

将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与所述抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；优选地，金纳米粒子在促进剂中的含量为25-100μg/mL，更优选金纳米粒子在促进剂中的含量为25-75μg/mL，最优选金纳米粒子在促进剂中的含量为50μg/mL。

本发明的第二个目的在于提供制备上述促进剂的方法，用以下方法之一：

方法一包括：

①制备金纳米粒子；

②制备免疫刺激剂-纳米金复合物和制备抗原-纳米金复合物；

③促进剂纳米金鸡尾酒的调配：再将免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；

方法二包括：

①制备金纳米粒子；

②制备免疫刺激剂-纳米金复合物；

③免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联，即得。

具体的步骤为：

所述方法一和方法二中步骤①制备金纳米粒子的具体步骤为：

球形金纳米粒子的制备：按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.01wt％)加热至110-130℃后与0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(1wt％)混合，离心、浓缩得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm；或

棒状金纳米粒子的制备：Ⅰ、按体积份数，将1份的氯金酸溶液(0.01mol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，100mmol/L)溶液混合，再与2.4冰的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)混匀，静置于25℃水浴中陈化1-5h，得到金纳米种子溶液；Ⅱ、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.01mol/L)、6份的硝酸银溶液(0.01mol/L)和6.4份的抗坏血酸溶液(0.01mol/L)依次加入到950份的CTAB溶液(0.01mol/L)中，再加入1份步骤Ⅰ得到的金纳米种子溶液，混匀，静置于25℃水浴中陈化3h，浓缩后即得到棒状金纳米粒子；

所述方法一和方法二中步骤②制备免疫刺激剂-纳米金复合物的过程：

用还原剂对巯基化CpG序列(5’-SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt-3’)进行脱二硫键预处理，再对金纳米粒子进行功能化修饰；优选地具体步骤如下：

(1)、用pH＝8.0,0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将二硫苏糖醇(DTT)配制成浓度为0.1-0.2mol/L的DTT溶液,再加入0.25倍DTT溶液体积的CpG(100μmol/L)室温反应完成后进行除杂处理；

(2)、将步骤(1)得到的除杂处理后的反应液与金纳米粒子混合，使CpG的终浓度为3-5μmol/L，室温振荡24h得到免疫刺激剂-纳米金复合物；

所述方法一中步骤②制备抗原-纳米金复合物的过程：抗原与金纳米粒子的偶联；优选的具体步骤如下：将抗原与金纳米粒子混合至抗原的终浓度为50-500mg/mL，室温共振荡孵育24h，得到抗原-纳米金复合物；

例如：当抗原为OVAp时，制备抗原-纳米金复合物得到的是OVAp-纳米金复合物，具体步骤为：首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG，Mw＝5000)与金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为1mg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp至OVAp的终浓度为50μM，室温振荡24h，得到OVAp-纳米金复合物；或

当抗原为mAGE-1时，制备抗原-纳米金复合物得到的是mAGE-1-纳米金复合物，具体步骤为：构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1；将mAGE-1与金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为1-10μg/mL，并室温保持1h，得到mAGE-1-纳米金复合物；

所述方法一中步骤③促进剂纳米金鸡尾酒的调配：将步骤②所述免疫刺激剂-纳米金复合物与所述抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；优选地，金纳米粒子的含量为25-100μg/mL；更优选金纳米粒子在促进剂中的含量为25-75μg/mL，最优选金纳米粒子在促进剂中的含量为50μg/mL；

所述方法二中步骤③免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联：将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联得到；优选的具体步骤如下：将一定剂量(如终浓度50-500μmol/L)的抗原与免疫刺激剂-纳米金复合物等体积混合，室温下振荡孵育24h后以3000-12000rpm转速离心10-20分钟，即得到免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。

本发明的第三个目的在于提供上述促进剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌和胰腺癌等。

本发明提供了一种适用于树突状细胞过继性治疗的促进剂——纳米金鸡尾酒，该促进剂利用纳米金良好的生物相容性和可调的表面理化性质等特点作为过继性DCs疫苗的靶向纳米载体，针对不同连接物的性质进行纳米材料形貌或粒径的筛选或有效组合，大大提高过继性DCs疫苗的局部或静脉输注下的淋巴器官归巢效率(传统的DCs疫苗归巢效率﹤5％，本发明的过继性DCs疫苗归巢效率为40-60％)，为今后的临床筛选提供了新的思路。用本发明方法制备的纳米金鸡尾酒采用体外筛选和评价的方式确保了其对DCs体外刺激和功能化的效果，因此，在临床使用上可获得较好的预期。相比于其他采用金纳米促进剂直接进行免疫的纳米疫苗，由于只有吞噬到树突状细胞内部的少量金纳米颗粒(通常小于孵育量的10％)会进入到动物或人体内，因此具有更好的生物安全性，增加了该产品向临床推广及应用的可能性。

附图说明

图1所示为本发明制备出的球形金纳米粒子的透射电镜照片；

图2所示为本发明制备出的棒状金纳米粒子的透射电镜照片；

图3所示为本发明的纳米金鸡尾酒中金纳米粒子作为促进剂的粒径筛选结果(A：采用流式细胞术分出树突状细胞；B：不同粒径纳米金鸡尾酒功能化的DCs的抗原递呈效果；C：不同粒径纳米金鸡尾酒功能化的DCs促树突状细胞成熟的表面标志物的表达结果)；

图4所示为本发明的纳米金鸡尾酒中金纳米粒子加入量对抗原递呈的影响；

图5所示为本发明的纳米金鸡尾酒中金纳米粒子加入量对细胞因子分泌的影响；

图6所示为本发明的纳米金鸡尾酒中金纳米粒子加入量对其吞噬量的影响；

图7所示为本发明的纳米金鸡尾酒被DCs摄入后的透射电镜照片；

图8所示为用本发明纳米金鸡尾酒功能化的DCs作用于黑色素瘤小鼠后的生存率曲线；

图9所示为用本发明纳米金鸡尾酒功能化的DCs作用于肝癌小鼠后的肿瘤照片。

具体实施方式

近年来,随着纳米技术的飞速发展，纳米疫苗应运而生，并在生物医药和疫苗免疫领域表现出巨大的应用潜力。纳米疫苗即连接有辅助刺激分子(通常为TLR配基)和抗原肽的纳米材料，其可靶向激活在体DC或体外DC，并最终达到诱导抗原特异性T细胞反应的目的。发明人在探索过程中发现：与其他纳米材料相比，金纳米材料有如下显著特点：1)具备可调的表面理化性质；2)具有良好的生物相容性；3)可控制反应条件制备出多种形貌和大小的金纳米粒子。这些特点为金纳米材料成为理想的纳米疫苗奠定了坚实的基础。在本发明中，正是充分利用金纳米材料的以上特点，根据不同的连接刺激分子和抗原分子性质，优选出最佳的金纳米粒子形貌和粒径，开发或调配出由单一或多种金纳米粒子组成的纳米疫苗。目前为止，国际和国内有不少研究小组也正开展相关研究，但以金作为疫苗载体的相对少见，尤其是作为过继性DC疫苗的靶向纳米载体更是未见报道。除此之外，本发明中还涉及到针对不同连接物的性质进行纳米材料形貌或粒径的筛选或有效组合的策略，也是首次提出并实施。

本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂是用免疫刺激剂和抗原分别或联合修饰事先制备好的金纳米粒子(球形金纳米粒子、棒状金纳米粒子、立方体金纳米粒子等)后得到的产品，也称之为纳米金鸡尾酒。这是因为该促进剂具有鸡尾酒的一些性质，如是混合物、具有灵活性、可以按照需要自由调配等，于是形象地将该促进剂称为“纳米金鸡尾酒”。

以下以实施例详述本发明。本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理及基本概念，利用其它类似辅助刺激剂和抗原或者反应条件实现本发明所描述的“纳米金鸡尾酒”促进剂对树突状细胞、或者其他免疫细胞进行功能化。因此，这些修改或不同的应用都在本发明的覆盖范围之内。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例一、球形金纳米粒子的制备

将装有100mL0.01wt％氯金酸溶液的三口烧瓶置于油浴中搅拌加热至130℃，迅速加入0.4-3.0mL的1wt％柠檬酸钠溶液，并在该温度下保持搅拌半小时后，得到胶体溶液，以3000-12000rpm转速离心浓缩10-20min，弃上清，即得到球形金纳米粒子，如图1所示。从图1球形金纳米粒子的透射电镜照片中可以看出，该球形金纳米粒子的流体力学半径在10nm-90nm范围(金纳米粒子缩写为“AuNP+半径”形式，A-E分别为流体力学半径是15nm、30nm、40nm、60nm和80nm的球形金纳米粒子)，且分布较为均匀(图中标尺为200nm)。工业应用中，制备规模可等比例放大。

实施例二、棒状金纳米粒子的制备

Ⅰ、将0.25mL0.01mol/L的氯金酸溶液加入到7.5mL0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中，混匀后再加入0.6mL0.01mol/L新鲜配制、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液，来回倒置2分钟混匀，得到亮棕黄色的金纳米种子溶液。金纳米种子溶液静置于25℃水浴中陈化3h。

Ⅱ、将4mL10mmol/L的氯金酸溶液、0.6mL10mmol/L的硝酸银溶液与0.64mL0.01mol/L的抗坏血酸溶液依次加入到95mL0.01mol/L的CTAB溶液中，接着向其中加入0.1mL步骤Ⅰ陈化后的金纳米种子溶液，混匀，静置于25℃水浴中陈化3h，得到棒状金纳米粒子胶体溶液(原液)；以8000转/分转速下离心原液至少两次，每次10min，以去除过量CTAB，再次离心浓缩得到棒状金纳米粒子，如图2所示(图中标尺为100nm)。从图2棒状金纳米粒子的透射电镜照片中可以看出(A为原液浓缩40倍后的TEM图片，B为原液中的棒状金纳米粒子图片)该棒状金纳米粒子的长径比在2-3之间、且分布较为均匀。工业应用中，制备规模可等比例放大。

实施例三、CpG-OVAp球形纳米金鸡尾酒的制备

1、Toll样受体9(TLR9)通路刺激剂寡核苷酸单链(CpG)对球形金纳米粒子的功能化修饰：

(1)、还原剂二硫苏糖醇(DTT)对巯基化CpG序列(5’-SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt-3’)进行脱二硫键预处理：

用pH＝8.0,0.18mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)配制DTT浓度为0.125mol/L的DTT溶液160μL，将40μL100μmol/L的CpG加入DTT溶液中，室温下反应1h后过核酸纯化柱(GEHealthcareLifeScience,NAP^TM-5columes)进行脱盐等除杂处理。

(2)、CpG对球形金纳米粒子的功能化修饰：

将步骤(1)除杂处理后的反应液加入到实施例一得到的球形金纳米粒子中，使CpG的终浓度为3μmol/L，室温振荡24h得到CpG-球形纳米金复合物备用。

2、模式抗原OVA抗原肽(OVAantigenpeptide,简写作OVAp，OVA是卵清蛋白)对球形金纳米粒子的功能化修饰：即将半胱氨酸修饰的OVAp(如OVA_257-264抗原肽)与球形金纳米粒子偶联，操作如下：

首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG,Mw＝5000)与实施例一得到的球形金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为1mg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp，使OVAp的终浓度为50μM，室温振荡24h，得到OVAp-球形纳米金复合物备用。

3、纳米金鸡尾酒的调配：

将步骤1得到的CpG-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500μg/mL)和步骤2得到的OVAp-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500μg/mL)等体积混合均匀，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂——CpG-OVAp球形纳米金鸡尾酒。

实施例四、CpG-mAGE-1球形纳米金鸡尾酒的制备

1、TLR9通路刺激剂CpG对球形金纳米粒子的功能化修饰：

同实施例三中的步骤1，得到CpG-球形纳米金复合物备用。

2、mAGE-1(melanomaantigen-1,肿瘤抗原黑色素瘤抗原-1)对球形金纳米粒子的功能化修饰，即为mAGE-1与球形金纳米粒子的偶联：

构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1；将mAGE-1与实施例一得到的球形金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为50-100μg/mL，并在范德华力作用下室温保持1h，得到mAGE-1-球形纳米金复合物备用。

3、纳米金鸡尾酒的调配：

将步骤1得到的CpG-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500μg/mL)和步骤2得到的mAGE-1-球形纳米金复合物(其中金纳米粒子的含量为500μg/mL)等体积混合均匀，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂——CpG-mAGE-1球形纳米金鸡尾酒。

实施例五、CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒的制备

即是用肝癌细胞破碎裂解物修饰步骤1得到的CpG-棒状纳米金复合物，得到同时携带CpG和肿瘤抗原的双功能棒状金纳米粒子。

1、TLR9通路刺激剂CpG对棒状金纳米粒子的功能化修饰：

同实施例三中的步骤1，仅是将其中的实施例一得到的球形金纳米粒子换成实施例二得到的棒状金纳米粒子，得到CpG-棒状纳米金复合物备用。

2、肝癌细胞破碎裂解物的获得：

采用反复冻融法获得小鼠Hep1-6肿瘤细胞系的全抗原：首先用胰酶消化获得体外培养的Hep1-6单细胞悬液，200g离心15min后用PBS重悬细胞(1×10⁷个/mL),60℃水浴加热1h；水浴后细胞悬液迅速浸入液氮中速冻，10min后取出，室温融化，离心(2000rpm,20min)收取上清，反复加热、速冻、融化和离心5-6次后，得到肝癌细胞破碎裂解物。

3、纳米金鸡尾酒的调配：

将步骤2得到的肝癌细胞破碎裂解物与步骤1得到的CpG-棒状纳米金复合物等体积混合(其中细胞破碎裂解物终浓度为100-1000μg/mL)，室温下振荡孵育24h后离心分离(离心转速随采用的纳米金粒子大小而变化，粒子越大，离心转速越低)，即得到本发明的可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂——CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒。

在体外实验中，细胞对于金纳米粒子较为合适的吞噬粒径在40nm-60nm范围内，但考虑到修饰后的纳米金鸡尾酒其表面的理化性质会发生改变，包括所带电荷、流体力学半径等均会发生改变，因此在具体的实验过程中，应通过后续的促进效果对纳米金载体进行筛选。

实验例一：金纳米粒子流体力学半径的筛选

按实施例一的方法制备得到一系列流体力学半径在10-90nm的球形金纳米粒子，按实施例二的方法制备得到一系列长径比在2-3之间，粒径分布均匀的棒状金纳米粒子；再按照实施例三和实施例五的方法得到一系列金纳米粒子流体力学半径不同的CpG-球形纳米金复合物、CpG-棒状纳米金复合物、OVAp-球形纳米金复合物、mAGE-1-球形纳米金复合物。

用流式细胞检测方法分别检测CpG-球形纳米金复合物和CpG-棒状纳米金复合物对DCs成熟的促进效果及OVAp-球形纳米金复合物和mAGE-1-球形纳米金复合物进入DCs后的抗原递呈情况。金纳米粒子根据电感耦合等离子光谱法(ICP)检测结果进行定量，每1×10⁶个/mL未成熟的DCs中加入50μg/mL金纳米粒子。以CpG-球形纳米金复合物和OVAp-球形纳米金复合物为例，37℃，5％CO₂孵箱中孵育48h后，所得到的流式细胞检测结果见图3(金纳米粒子缩写为“AuNP+半径”形式，图3中A为DCs分群鉴定的流式结果，B为不同粒径OVAp-球形纳米金复合物抗原递呈效率的结果，C为不同粒径CpG-球形纳米金复合物促进DCs成熟表面标志物表达的流式结果)。可见，在本体系实验条件下，与金纳米粒子结合后的CpG-球形纳米金复合物比单独的CpG促进DCs成熟表面标志物表达的流式结果要好(见图C中的52.3％和55.8％)；与金纳米粒子结合后的OVAp-球形纳米金复合物比单独的OVAp抗原递呈效率高(见图B中20.7％和30.5％)。CpG-球形纳米金复合物中对DCs的促成熟效果最优的球形金纳米粒子的流体力学半径为80nm，而OVAp-球形纳米金复合物中对抗原肽的递呈最合适的球形金纳米粒子的流体力学半径为60nm。因此确定：CpG-纳米金类复合物中对DCs的促成熟效果较好的球形金纳米粒子的流体力学半径为60-80nm，抗原类/蛋白类纳米金复合物中对抗原肽的递呈较好的球形金纳米粒子的流体力学半径为40-80nm。

实验例二、金纳米粒子加入量的筛选

将实验例一种优选的流体力学半径分别为80nm和60nm的CpG-球形纳米金复合物和OVAp-球形纳米金复合物以“鸡尾酒”的混合形式同时加入到骨髓诱导未成熟DCs中，考察不同金纳米粒子含量(相同的刺激剂及抗原修饰量)对免疫活化效果的影响，见图4-图7，如DCs中抗原递呈情况(如图4)、上清中各细胞因子分泌(图5)、不同剂量下DCs对金纳米粒子吞噬量(图6)及DCs摄入后的透射电镜照片(图7，其中A1和A2分别是A左侧和右侧虚线区域的放大图，B1和B2分别是B左侧和右侧虚线区域的放大图)，将金纳米粒子含量分为低剂量(12.5μg/mL)、中剂量(25μg/mL)、高剂量(37.5μg/mL)和超高剂量(50μg/mL)四个组。

如图4及图5所示，在纳米金鸡尾酒的调配中，中剂量的纳米金鸡尾酒(两种复合物中金纳米粒子含量均分别为25μg/mL)能够获得更高的抗原递呈效率及更优的细胞因子分泌效果。在此剂量下，虽然DCs吞噬金纳米粒子剂量不高(如图6)，两种复合物中金纳米粒子含量均分别为25μg/mL时，吞噬剂量不到1μg/mL，即不足2％)，但金纳米粒子可以更多地进入溶酶体中，如图7所示，更有利于溶酶体途径的抗原交叉递呈。因此，纳米金鸡尾酒中金纳米粒子的含量在12.5μg/mL-37.5μg/mL时，对DCs的促成熟效果较好，在25μg/mL时对DCs的促成熟效果最好。

实验例三、用本发明纳米金鸡尾酒进行功能化的DCs对黑色素瘤的作用

将实施例四得到的纳米金鸡尾酒以25μg/mL金纳米粒子的剂量加入到1×10⁶个/mL未成熟DCs中，37℃，5％CO₂孵箱中孵育48h后，用PBS溶液离心洗涤三次，得到功能化的DCs。给接种了黑色素瘤两周的小鼠(体重20-25g)以3×10⁶功能化的DCs/只的剂量进行功能化DCs细胞回输，得到的小鼠生存率曲线如图8所示。图中可以看出，接种10天、30天和40天后，用本发明纳米金鸡尾酒输注的小鼠存活率始终为100％，而使用游离抗原和佐剂(游离抗原和佐剂分别为与本发明组等量的游离OVAp和CpG)输注的小鼠在这三个时间段的存活率分别是100％、75％和不到50％，使用未成熟DCs输注的小鼠在这三个时间段的存活率分别是不到90％、50％和不到20％。可见，纳米金鸡尾酒功能化DCs的输注显著延长了黑色素瘤小鼠的荷瘤存活时间，显示了较好的抗原特异性抗肿瘤效果。

实验例四、用本发明纳米金鸡尾酒进行功能化的DCs对肝癌的作用

将实施例五得到的CpG-肝癌细胞破碎裂解物棒状纳米金鸡尾酒以50μg/mL金纳米粒子的剂量为加入到1×10⁶个/mL未成熟DCs中，37℃，5％CO₂孵箱中孵育48h后，采用PBS溶液离心洗涤三次，得到功能化的DCs。

给皮下接种了肝癌细胞Hep1-6(5×10⁵个/只)两周的C57BL小鼠(体重20-25g)以3×10⁶功能化的DCs/只的剂量间隔两周(2w)进行了两次功能化DCs细胞回输，然后将肿瘤剥离下来，照片如图9所示。可见，使用游离抗原和佐剂促进(同实验例三)的DCs治疗组，相比未成熟DCs治疗组(空白组)，移植瘤大小无显著变化，而使用本发明纳米金鸡尾酒促进的DCs治疗组移植瘤明显变小，变小至空白组的10％，显示了较好的抗肿瘤效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种可提高过继性树突状细胞功能化过程的促进剂，其特征在于，主要成分包括用免疫刺激剂和抗原分别修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物；或主要成分包括用免疫刺激剂和抗原联合修饰金纳米粒子得到的免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物；优选地，所述金纳米粒子为球形金纳米粒子、棒状金纳米粒子或立方体金纳米粒子。

2.根据权利要求1所述促进剂，其特征在于，所述球形金纳米粒子由以下方法制备得到：按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.01wt％)加热至110-130℃后迅速加入0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(1wt％)继续搅拌得到球形金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm。

3.根据权利要求1所述促进剂，其特征在于，所述棒状金纳米粒子由以下方法制备得到：

Ⅰ、按体积份数，将1份的氯金酸溶液(0.01mol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，100mmol/L)溶液混合均匀后，加入2.4份新鲜配置、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)并倒置混匀，静置于25℃水浴中陈化1-5h，得到金纳米种子溶液；

Ⅱ、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.01mol/L)、6份的硝酸银溶液(0.01mol/L)和6.4份的抗坏血酸溶液(0.01mol/L)依次加入到950份的CTAB溶液(0.01mol/L)中，再加入1-10份步骤Ⅰ得到的金纳米种子溶液，混匀，静置于25℃水浴中，陈化3h，得到棒状金纳米粒子胶体溶液，离心浓缩后即得到棒状金纳米粒子。

4.根据权利要求1-3任一所述促进剂，其特征在于，所述免疫刺激剂-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选60-80nm；和/或金纳米粒子的含量为12.5μg/mL-37.5μg/mL，优选25μg/mL；或

按以下方法制备得到：用还原剂对巯基化CpG序列(5’-SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt-3’)进行脱二硫键预处理，再对金纳米粒子进行功能化修饰；

优选地具体步骤如下：

(1)、用pH＝8.0,0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将二硫苏糖醇(DTT)配制成浓度为0.1-0.2mol/L的DTT溶液,再加入0.25倍DTT溶液体积的CpG(100μmol/L)室温反应1h后完成脱二硫键，然后进行除杂；所述除杂是用核酸纯化柱进行；

(2)、将步骤(1)得到的除杂处理后的反应液与金纳米粒子混合，使CpG的终浓度为3-5μmol/L，室温振荡24h得到免疫刺激剂-纳米金复合物：CpG-球形纳米金复合物。

5.根据权利要求1-4任一所述促进剂，其特征在于，所述抗原-纳米金复合物中金纳米粒子的粒径为15-80nm，优选40-80nm；和/或金纳米粒子的含量为12.5μg/mL-37.5μg/mL，优选25μg/mL；或

按以下方法制备得到：抗原与金纳米粒子的偶联；

优选的具体步骤如下：

将经修饰的抗原与金纳米粒子混合至经修饰的抗原的终浓度为50-500μmol/L，室温下振荡孵育24h，得到抗原-纳米金复合物；

例如：当抗原为OVAp时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为：首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG)与金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为1mg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp至OVAp的终浓度为50μmol/L，室温振荡24h，得到OVAp-纳米金复合物备用；或

当抗原为mAGE-1时，制备抗原-纳米金复合物的具体步骤为：构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1；将mAGE-1与金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为1-10mol，并室温保持1h，得到抗原-纳米金复合物：mAGE-1-纳米金复合物备用。

6.根据权利要求1-5任一所述促进剂，其特征在于，所述免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物是按以下方法制备得到：将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联得到；优选的具体步骤如下：将一定剂量(如终浓度50-500μmol/L)的抗原与免疫刺激剂-纳米金复合物等体积混合，室温下振荡孵育24h后3000-12000rpm转速离心10-20分钟，即得到免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。

7.根据权利要求1-5任一所述促进剂，其特征在于，将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与所述抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；优选地，金纳米粒子在促进剂中的含量为25-100μg/mL，更优选金纳米粒子在促进剂中的含量为25-75μg/mL。

8.制备权利要求1-7任一所述促进剂的方法，其特征在于，用以下方法之一：

方法一包括：

①制备金纳米粒子；

②制备免疫刺激剂-纳米金复合物和制备抗原-纳米金复合物；

③促进剂纳米金鸡尾酒的调配：再将免疫刺激剂-纳米金复合物和抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；

方法二包括：

①制备金纳米粒子；

②制备免疫刺激剂-纳米金复合物；

③免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联，即得。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，具体的步骤为：

所述方法一和方法二中步骤①制备金纳米粒子的具体步骤为：

球形金纳米粒子的制备：按体积份数，将100份的氯金酸溶液(0.01wt％)加热至110-130℃后与0.4-3.0份的柠檬酸钠溶液(1wt％)混合，离心、浓缩得到球形金纳米粒子；优选地，所述球形金纳米粒子的流体力学半径在10-90nm；或

棒状金纳米粒子的制备：Ⅰ、按体积份数，将1份的氯金酸溶液(0.01mol/L)与30份的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，100mmol/L)溶液混合，再与2.4冰的硼氢化钠溶液(0.01mol/L)混匀，静置于25℃水浴中陈化1-5h，得到金纳米种子溶液；Ⅱ、按体积份数，将40份的氯金酸溶液(0.01mol/L)、6份的硝酸银溶液(0.01mol/L)和6.4份的抗坏血酸溶液(0.01mol/L)依次加入到950份的CTAB溶液(0.01mol/L)中，再加入1份步骤Ⅰ得到的金纳米种子溶液，混匀，静置于25℃水浴中陈化3h，浓缩后即得到棒状金纳米粒子；

所述方法一和方法二中步骤②制备免疫刺激剂-纳米金复合物的过程：

用还原剂对巯基化CpG序列(5’-SH-AAAAA-Spacer9-tccatgacgttcctgacgtt-3’)进行脱二硫键预处理，再对金纳米粒子进行功能化修饰；优选地具体步骤如下：

(1)、用pH＝8.0,0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液将二硫苏糖醇(DTT)配制成浓度为0.1-0.2mol/L的DTT溶液,再加入0.25倍DTT溶液体积的CpG(100μmol/L)室温反应完成后进行除杂处理；

(2)、将步骤(1)得到的除杂处理后的反应液与金纳米粒子混合，使CpG的终浓度为3-5μmol/L，室温振荡24h得到免疫刺激剂-纳米金复合物；

所述方法一中步骤②制备抗原-纳米金复合物的过程：抗原与金纳米粒子的偶联；优选的具体步骤如下：将抗原与金纳米粒子混合至抗原的终浓度为50-500mg/mL，室温共振荡孵育24h，得到抗原-纳米金复合物；

例如：当抗原为OVAp时，制备抗原-纳米金复合物得到的是OVAp-纳米金复合物，具体步骤为：首先将巯基化聚乙二醇(SH-PEG，Mw＝5000)与金纳米粒子混合至SH-PEG的终浓度为1mg/mL，室温共孵育约0.5h，然后加入OVAp至OVAp的终浓度为50μM，室温振荡24h，得到OVAp-纳米金复合物；或

当抗原为mAGE-1时，制备抗原-纳米金复合物得到的是mAGE-1-纳米金复合物，具体步骤为：构建重组质粒，体外纯化获得mAGE-1；将mAGE-1与金纳米粒子混合至mAGE-1的终浓度为1-10μg/mL，并室温保持1h，得到mAGE-1-纳米金复合物；

所述方法一中步骤③促进剂纳米金鸡尾酒的调配：将步骤②所述免疫刺激剂-纳米金复合物与所述抗原-纳米金复合物按体积比(1-3)：(3-1)混合均匀即得；优选地，金纳米粒子的含量为25-100μg/mL，更优选金纳米粒子在促进剂中的含量为25-75μg/mL，最优选金纳米粒子在促进剂中的含量为50μg/mL；

所述方法二中步骤③免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联：将所述免疫刺激剂-纳米金复合物与抗原偶联得到；优选的具体步骤如下：将一定剂量(如终浓度50-500μmol/L)的抗原与免疫刺激剂-纳米金复合物等体积混合，室温下振荡孵育24h后以3000-12000rpm转速离心10-20分钟，即得到免疫刺激剂-抗原-纳米金复合物。

10.权利要求1-7任一所述促进剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌和胰腺癌等。