KR102060858B1 - 효모 세포벽 입자를 사용하는 백신 전달 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 백신을 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 특히 예방용 및 치료용 백신을 제조하는 데 유용하다.

Description

효모 세포벽 입자를 사용하는 백신 전달 시스템 {VACCINE DELIVERY SYSTEMS USING YEAST CELL WALL PARTICLES}
본 발명은 일반적으로 효모 세포벽 입자를 포함하는 조성물, 및 백신을 전달하기 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 특히 예방용 및 치료용 백신을 제조하는 데 유용하다.
백신은 대상체에게 투여되었을 때 특정 질환에 대한 면역학적으로 매개되는 저항성을 유도하는 생물학적 물질 또는 제제이다. 백신은 지난 200년 동안 감염성 질환 및 비감염성 질환을 퇴치하는 데 널리 사용되어 왔다.
백신은 대상체의 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원인 면역원을 포함한다. 대식세포 및 단핵 포식세포계의 다른 세포를 비롯한, 항원 제시 세포는 항원 입자를 활발하게 포식하고, 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 대식세포는 단핵구로부터 유래된 조직내 세포이다. 이어서, 상기 단핵구/대식세포에 의해 포식된 미생물은 리소좀/파고솜에서 좀 더 작은 항원 부분으로 소화된다. 생성된 항원은 면역계의 체액성 및 세포성 아암에의 제시를 위해 표면으로 다시 돌아간다. 따라서, 단핵구/대식세포는 숙주에서 병원체에 대한 비특이적 및 특이적 방어, 둘 모두에서 중요한 역할을 하기 때문에 특히 관심 대상이 된다.
수지상 세포 또한 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 발현하는 항원 제시 세포이다. 통상의 수지상 세포 이외에도, 진피 수지상 세포는 피부 면역계의 중요한 구성원이다. 이는 진피 수지상 세포가 다량의 MHC 클래스 II 분자를 보유하고, 이에 따라 매우 강령한 항원 제시 세포로서의 역할을 하기 때문이다.
이상적인 백신은 실제로는 감염을 확립시키지 않고, 또한 MHC 클래스 I 경로를 억제시키지 않으면서, 병원성 구조체의 신속한 흡수 및 전달을 모방한다.
최근, 많은 연구는 생물학적 물질의 치료 효과를 개선시키기 위해 생물학적 물질의 단핵구성 기원의 세포로의 표적화된 전달에 초점을 맞추어 오고 있다. 미소구/마이크로입자, 리포솜, 나노입자, 덴드리머, 니오좀, 및 탄소 나노튜브를 비롯한 많은 비히클이 상기 목적을 위해 사용될 수 있다고 보고되었다. 지속적 전달, 장기화된 작용 기간, 용량 감소 및 유해한 부작용 감소, 및 상기의 새로운 전달 접근법에의 환자의 순응도 개선을 달성하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌 [Jain et al., Expert Opin . Drug Deliv . 10(3): 353-367 (2013)]).
효모 세포벽 입자는 천연 공급원인 효모로부터 유래된 글루칸 쉘에 의해 형성된 중공 다공성 미소구 구조 때문에 바람직한 전달 비히클 중 하나가 된다 (문헌 [Soto et al., Journal of Drug Delivery 2012 (2011)]). 효모 세포벽 입자는 각종 물질, 예컨대, 핵산, 단백질, 및 영상화 리포터를 전달하는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Bioconjug . Chem . 19(4): 840-848 (2008)]; 및 [Figueiredo et al., Chemical Communications 47: 10635-10637 (2011)]을 참조할 수 있다.
관련 기술분야에서는 극소량의 외인성 물질에 의한 MHC 제시를 위해 외인성 단백질, 에피토프, 항원, 펩티드, 및/또는 핵산을 포함하는 백신을 효율적으로 전달함으로써 면역화를 개선시키는 것이 여전히 요구되고 있다. 추가로, 관련 기술분야에서는 전달 효율을 개선시키고, 생물학적 물질의 양을 감소시킴으로써 단핵구성 기원의 세포를 표적화하는 동일한 또는 증가된 효능 수준을 달성하는, 생물학적 물질을 전달하기 위한 효모 세포벽 입자를 제공하는 것이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시켜 준다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 입자 및 (ii) 입자 내에 적재된 외인성 생물학적 물질, 예컨대, 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함하는, 백신을 전달하기 위한 조성물에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 백신은 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도하는 항원을 포함한다. 바람직하게, 항원 또는 그의 단편은 최종적으로 클래스 I MHC 분자 또는 클래스 II MHC 분자 상에 제시된다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 그의 단편, 또는 핵산은 단백질, 펩티드, 에피토프, 항원, DNA, RNA, cDNA, 및 그의 면역원성 단편 또는 서브유니트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 백신은 생백신, 사백신, 또는 약독화 백신이다. 추가의 다른 실시양태에서, 백신은 재조합 백신이다.
일부 실시양태에서, 입자는 소화성 또는 생체분해성 입자이다. 중공 내부 구조 또는 다공성 구조를 가지는, 본 발명에 적합한 입자는 합성 입자이거나, 또는 천연 공급원으로부터 유래된 것이다. 예시적인 입자로는 효모 세포벽 입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적재된 입자를 투여하기 전 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 또는 약 1시간 동안 단리된 수지상 세포와 함께 인큐베이션시킨다. 바람직하게, 수지상 세포는 8일 이하 동안 단리된 미성숙 세포이다. 다른 실시양태에서, 적재된 입자는 수지상 세포 집단과의 사전 인큐베이션 없이 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 애주번트, 부형제, 및/또는 보존제를 추가로 포함한다. 특정 백신에 적합한 애주번트, 부형제 및/또는 보존제를 선택하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 안에 있다.
바람직한 실시양태에서, 소량의 하나 이상의 면역 반응 증강 애주번트가 조성물에 첨가된다. 하나 이상의 애주번트 첨가는 백신의 면역원성 효과를 증가시킨다. 보편적으로 사용되는 애주번트는 단백질, 펩티드, 핵산 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 애주번트는 모노포스포릴 지질 A, CpG 올리고뉴클레오티드 (예컨대, CpG DNA), 폴리 I:C, 폴리 ICLC, 강력한 MHC II 에피토프 펩티드, 베타 글루칸, 및 수지상 세포 자극 시토카인, 예컨대, IL-12 및 IFN-γ 뿐만 아니라, DC 성숙 시토카인, 예컨대, IL-4 및 GM-CSF를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 애주번트는, 수지상 세포를 활성화시키고, T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 더욱 강력한 생성을 추가로 자극시키기 위해 DC를 성숙시키고 수지상 세포 상의 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 분자이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 면역 반응 증강 애주번트의 양은 약 10 ng 이상, 약 50 ng 이상, 약 100 ng 이상, 약 200 ng 이상, 약 300 ng 이상, 약 400 ng 이상, 약 500 ng 이상, 약 600 ng 이상, 약 700 ng 이상, 약 800 ng 이상, 약 900 ng 이상, 약 1 ㎍ 이상, 약 5 ㎍ 이상, 약 10 ㎍ 이상, 약 15 ㎍ 이상, 약 20 ㎍ 이상, 약 25 ㎍ 이상, 약 30 ㎍ 이상, 약 35 ㎍ 이상, 약 40 ㎍ 이상, 약 45 ㎍ 이상, 약 50 ㎍ 이상, 약 60 ㎍ 이상, 약 70 ㎍ 이상, 약 80 ㎍ 이상, 약 80 ㎍ 이상, 약 90 ㎍ 이상, 또는 약 100 ㎍ 이상이다. 한 실시양태에서, 애주번트의 양은 조성물의 1-10%를 나타낸다. 애주번트의 양은 수지상 세포 상의 수용체, 예컨대, 톨-유사 수용체를 자극시키는 데 충분한 양이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 대상체의 진피에 상기 개시된 바와 같은, (i) 입자 및 (ii) 입자 내에 적재된, 외인성 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함하는 조성물을 직접 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 백신을 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 진피 수지상 세포는 적재된 입자를 포식하여 백신에 대한 면역 반응을 일으킨다.
추가의 또 다른 관련된 측면에서, 본 발명은 (i) 생물학적 물질을 입자 내로 적재하여 적재된 입자를 제조하는 단계; (ii) 생물학적 물질이 적재된 입자를 동결건조시키는 단계; 및 (iii) 생물학적 물질이 적재된 입자를 수지상 세포와 함께 인큐베이션시키는 단계를 포함하고, 여기서, 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함하고, 여기서, 적재된 입자를 수지상 세포와 함께 인큐베이션시킴에 따라 수지상 세포는 적재된 입자를 포식하게 되는 것인, 생물학적 물질이 적재된 입자를 함유하는 인큐베이션된 수지상 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (iii) 이전에 (a) 생물학적 물질이 적재된 입자를 용액 중에 재현탁시키는 단계, 및 (b) 재현탁된 용액을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함한다. 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 단계 (iii)은 (a) 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자에 첨가하는 단계, (b) 효모 세포벽 입자를 인큐베이션시키는 단계, (c) 효모 세포벽 입자를 동결건조시키는 단계, 및 (d) 효모 세포벽을 세척하는 단계를 포함하고, 여기서, 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함하고, 여기서, 단계 (b)-(c)는 단계 (b) 반복 이전에 물을 효모 세포벽 입자에 첨가하는 단계와 함께 1회 이상 반복된다.
구체적인 실시양태에서, 단계 (iii)은 (a) 백신이 적재된 입자를 수지상 세포와, 약 1:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1, 및 약 100:1을 비롯한, 약 1:1 내지 약 100:1의 비로 접촉시키는 단계; (b) 백신이 적재된 입자를 수지상 세포와 함께 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시키는 단계, 및 (c) 수지상 세포를 수집하고, 상기 세포를 세척하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명은 (i) 입자 및 (ii) 입자 내에 적재된, 외인성 생물학적 물질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 생물학적 물질은 상기 개시된 바와 같은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함하는 것인, 감염성 질환 및 비감염성 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
구체적인 실시양태에서, 감염성 질환으로는 현재 백신 자극성 방어 면역 반응에 감수성인 바이러스 매개성, 박테리아 매개성, 또는 기생충 질환, 또는 본 발명으로 개선될 수 있는 현 백신 기술에 미미하게 감수성인 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 비감염성 질환으로는 공지된 및 비공지된 면역원성 종양 연관 항원에 대한 유사한 방어 면역 반응을 생성함으로써 일어나는 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 효모 세포벽 입자 및 실리케이트를 포함하는 조성물로서, 효모 세포벽 입자는 실리케이트로 "캡핑"함으로써 변형된 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 효모 세포벽 입자 내에 적재된 외인성 생물학적 물질을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 포함된 조성물은 생물학적 물질이 적재된, 및 임의적으로 하나 이상의 애주번트가 적재된 효모 세포벽 입자를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 애주번트가 효모 세포벽 입자 내에 적재된다. 추가로, 적합한 부형제 및/또는 보존제가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 적합한 애주번트, 부형제 및/또는 보존제를 선택하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 안에 있다. 바람직하게, 실리케이트는 오르토실리케이트, 예컨대, 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라프로필오르토실리케이트, 또는 테트라부틸오르토실리케이트의 4개의 산소 화합물 각각에 부착된 임의의 유기 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 생물학적 물질로는 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 또는 그의 단편, 또는 핵산은 단백질, 펩티드, 에피토프, 항원, DNA, RNA, cDNA, 및 그의 면역원성 단편 또는 서브유니트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 소량의 하나 이상의 면역 반응 증강 애주번트 또한 효모 세포벽 입자 내로 적재되거나, 적재된 YCWP와 함께 투여된다. 하나 이상의 애주번트를 YCWP 내부로 첨가함으로써 조성물의 면역원성 효과는 증가된다. 보편적으로 사용되는 애주번트로는 소분자 화합물, 단백질, 펩티드, 핵산 및 탄수화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 애주번트는 수지상 세포를 성숙시키고, 수지상 세포를 활성화시키고, T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 더욱 강력한 생성을 추가로 자극시키기 위해 수지상 세포 상의 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 분자이다. 예시적인 애주번트로는 모노포스포릴 지질 A, CpG 올리고뉴클레오티드 (예컨대, CpG DNA), 폴리 I:C, 폴리 ICLC, 강력한 MHC II 에피토프 펩티드, 베타 글루칸, 및 수지상 세포 자극 시토카인, 예컨대, IL-12, IL-15 및 IFN-γ, 이미퀴모드 뿐만 아니라, DC 성숙 시토카인, 예컨대, IL-4 및 GM-CSF를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 면역 반응 증강 애주번트의 양은 약 10 ng 이상, 약 50 ng 이상, 약 100 ng 이상, 약 200 ng 이상, 약 300 ng 이상, 약 400 ng 이상, 약 500 ng 이상, 약 600 ng 이상, 약 700 ng 이상, 약 800 ng 이상, 약 900 ng 이상, 약 1 ㎍ 이상, 약 5 ㎍ 이상, 약 10 ㎍ 이상, 약 15 ㎍ 이상, 약 20 ㎍ 이상, 약 25 ㎍ 이상, 약 30 ㎍ 이상, 약 35 ㎍ 이상, 약 40 ㎍ 이상, 약 45 ㎍ 이상, 약 50 ㎍ 이상, 약 60 ㎍ 이상, 약 70 ㎍ 이상, 약 80 ㎍ 이상, 약 80 ㎍ 이상, 약 90 ㎍ 이상, 또는 약 100 ㎍ 이상이다. 한 실시양태에서, 애주번트의 양은 조성물의 1-10% (w/w)를 나타낸다. 애주번트(들)의 양은 수지상 세포 상의 수용체, 예컨대, 톨-유사 수용체를 자극시키는 데 충분한 양이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 효모 세포벽 입자 및 실리케이트를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 효모 세포벽 입자가 실리케이트에 의해 "캡핑"되도록 암모니아의 존재하에서 효모 세포벽 입자를 실리케이트와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 실리케이트는 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라프로필오르토실리케이트, 또는 테트라부틸오르토실리케이트이다.
또 다른 관련된 측면에서, 본 발명은 대상체에게 (i) 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자; 및 (ii) 입자 내에 적재된, 생물학적 물질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 생물학적 물질을 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 조성물은 진피 수지상 세포가 적재된 입자를 포식하여 생물학적 물질에 대한 면역 반응을 일으키도록 대상체의 진피에 직접 투여된다. 생물학적 물질이 적재되고, 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자를 포함하는 조성물을 단핵구성 기원의 세포가 포식하고, 이로써, 적절한 항원 제시를 위한 성숙 수지상 세포로의 분화가 촉진된다.
추가의 또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 (i) 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자 내로 적재하여 적재된 입자를 제조하는 단계; (ii) 적재된 입자를 실리케이트로 캡핑하는 단계, (iii) 캡핑된, 적재된 입자를 동결건조시키는 단계; 및 (iv) 캡핑된, 적재된 입자를 단핵구성 기원의 세포, 예컨대, 수지상 세포 전구체(pre-dendritic cell), 수지상 세포 또는 부분적으로 분화된 수지상 세포와 함께 인큐베이션시키는 단계로서, 여기서, 인큐베이션시킴으로써 단핵구성 기원의 세포가 캡핑된, 적재된 입자를 포식하게 되는 것인 단계를 포함하는, 생물학적 물질이 적재되고, 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자를 함유하는 세포 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 단핵구성 기원의 세포는 수지상 세포이고, 생물학적 물질은 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적인 실시양태에서, 캡핑된, 적재된 효모 세포벽 입자를 합유하는 수지상 세포를 제조하는 상기 방법의 적재 단계는 (a) 희석제 중에 효모 세포벽 입자 및 생물학적 물질을 현탁시키고, 생물학적 물질이 효모 세포벽 입자에 의해 흡착될 수 있도록 하는 기간, 예컨대, 약 2시간 동안 인큐베이션시키는 단계, 및 (b) 현탁액을 동결건조시켜 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자 내에 적재하는 단계를 포함한다. 필요할 경우, 단계 (a) 및 (b)는 적재 효율을 증가시키기 위해 1회 이상 반복된다.
구체적인 실시양태에서, 캡핑된, 적재된 효모 세포벽 입자를 함유하는 단리된 수지상 세포를 제조하는 상기 방법의 인큐베이션 단계는 (a) 캡핑된, 적재된 입자를 수지상 세포와 약 1:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1, 및 약 100:1을 비롯한, 약 1:1 내지 약 100:1의 비로 접촉시키는 단계; (b) 캡핑된, 적재된 입자를 수지상 세포와 함께 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시키는 단계, 및 (c) 수지상 세포를 수집하고, 상기 세포를 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 수지상 세포 제조 공정을 도시한 것이다.
도 2는 종양 용해물 제조 공정을 도시한 것이다.
도 3은 효모 세포벽 입자 제조 공정을 도시한 것이다.
도 4는 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자 내로 적재하는 공정을 도시한 것이다.
도 5는 백신 입자가 적재된 수지상 세포 제조 공정을 도시한 것이다.
도 6a는 1x106개의 B16 종양 세포 IV 접종 후 21일째, 백신 접종을 받지 않은 마우스의 폐를 도시한 것이다 (검은색 반점은 흑색종 전이이다). 도 6b는 1x106개의 B16 종양 세포 IV 접종 후 21일째, 백신 접종을 받은 마우스의 폐를 도시한 것이며, 여기서, 상기 마우스는 간단하게 종양 시험접종 3일 전에 혼합된 종양 용해물 및 효모 세포벽 입자로 백신 접종을 받았다. 도 6c는 1x106개의 B16 종양 세포 IV 접종 후 21일째, 백신 접종을 받은 마우스의 폐를 도시한 것이며, 여기서, 상기 마우스는 종양 시험접종 3일 전에 종양 용해물이 적재된 효모 세포벽 입자로 백신 접종을 받았다.
도 7은 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자의 구조를 도시한 것이다. 규소는 더 짙은 회색으로 표시되어 있는 반면, 더 옅은 회색은 탄소를 나타낸다. 도 8A는 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS)의 구조를 보여주는 것이다. 도 8B는 그들 OH 기 사이에서 H-결합을 형성하는 반응 혼합물 (에틸오르토실리케이트) 중 암모니아에 의해 개시된 TEOS의 부분적 가수분해 생성물을 보여주는 것이다. 도 8C는 H-결합된 에틸오르토실리케이트 분자로부터의 물 손실로부터 생성된 실라놀 축합 생성물을 보여주는 것이다. 이 반응은 중합체성 실리케이트 발생시에 계속된다. 도 8D의 구조 기는 중합체성 실리케이트 구조와 효모 세포벽 입자의 β-글루칸 구조의 1급 히드록실 기 사이의, β-글루칸 결합의 1급 히드록실 기와 중합체성 실리케이트 구조 사이의 유사한 H-결합을 보여주는 것이다. 도 8E는 실라놀 축합으로부터 발생하는 효모 세포벽 입자와 중합체성 실리케이트 사이에 생성된 공유 결합 형성, 및 이로써 이루어지는 적재된 효모 세포벽 입자의 캡핑을 보여주는 것이다.
도 8은 각 마우스 군: 오직 B16 흑색종 종양 세포만을 IV 주사를 맞은 "대조군" 군; B16 흑색종 종양 세포를 IV 주사를 맞고, B16 종양 용해물이 적재된, 캡핑되지 않은 YCWP의 진피간(interdermal) 주사를 맞은 "일반 YCWP" 군; B16 흑색종 종양 세포를 IV 주사를 맞고, B16 종양 용해물이 적재된, 실리케이트로 캡핑된 YCWP의 진피간 주사를 맞은 "Si 캡핑된 YCWP" 군; B16 흑색종 종양 세포를 IV 주사를 맞고, B16 종양 용해물, 및 CpG 올리고뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A를 비롯한 애주번트가 적재된, 캡핑되지 않은 YCWP의 진피간 주사를 맞은 "일반 YCWP + AD" 군, 및 B16 흑색종 종양 세포를 IV 주사를 맞고, B16 종양 용해물, 및 CpG 올리고뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A를 비롯한 애주번트가 적재된, 실리케이트로 캡핑된 YCWP의 진피간 주사를 맞은 "Si 캡핑된 YCWP + AD" 군의 생존율(%)을 도시한 것이다.
본원에서는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법을 참조한다. 상기의 공지 방법들이 기재되어 있는, 간행물 및 다른 자료는 마치 전부 기재된 것처럼 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
정의
수치 값 및 범위와 관련하여 "약"이라는 용어는 포함되는 수치가 본원에 기재된 정확한 수치로 제한되는 것이 아니고, 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 실질적으로 제시된 범위 내의 범위를 지칭하고자 한다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "약"이라는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이며, 이는 그가 사용되는 문맥내에서 어느 정도 달라지게 될 것이다. 예를 들어, "약"이란, 상기 용어 다음에 오는 특정 수치 값의 ±10%를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "대상체" 또는 "환자"란, 백신 치료를 필요로 하는 임의의 동물을 의미힌다. 예를 들어, 대상체는 백신으로 치료 또는 예방될 수 있는 병태를 앓거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "대상체" 또는 "환자"는 인간을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량" 및 "치료 수준"이라는 어구는 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 생물학적 물질 또는 백신이 투여되는 목적인 특이 반응을 제공하는 백신 투여량 및 대상체에서 본원에 기술된 조성물의 혈장 농도를 각각 의미한다. 단지 편의상, 예시적인 투여량, 전달량, 치료학상 유효량 및 치료 수준은 하기에서 성인 인간 대상체를 기준으로 제공된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 대상체 및/또는 병태/질환을 치료하기 위하여 필요할 경우, 표준 관행에 따라 상기 양을 조정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "캡핑하는" 또는 "캡핑된"이라는 용어는, 효모 세포벽 입자 내에 적재된 생물학적 물질이 그 안에 유지되도록 또는 포획 상태로 남아 있도록, 예컨대, 망사형 네트와 같은 중합체성 구조가 효모 세포벽 입자를 커버 또는 코팅하고 있다는 것을 의미한다. 중합체성 구조는 실리케이트, 예컨대, 테트라알킬오르토실리케이트에 의해 형성될 수 있다.
백신
"면역화"라는 용어는 대상체가 보통은 백신을 받음으로써 특정 병태, 질환 또는 질환들에 대해 방어되는 과정을 의미한다.
"백신"이라는 용어는, 예컨대, 주사에 의해, 경구 투여에 의해, 또는 에어로졸 투여에 의해 대상체 체내에서 면역 반응을 유도하는 생물학적 물질 또는 생성물이다. 백신은 1종 이상의 활성 성분, 예컨대, 면역 반응을 유도하는 항원, 및 추가 성분, 예컨대, 애주번트, 접합체, 보존제, 및 희석제, 안정제 등을 비롯한 다른 부형제를 포함한다.
백신 적용에 유용한 예시적인 항원으로는 알레르겐, 바이러스 항원, 박테리아 항원 및 기생충 유래의 항원을 포함한다. 감염성 질환을 예방 및 치료하기 위해서는 박테리아 항원 및 바이러스 항원이 바람직하다. 적합한 바이러스 항원으로는 HIV, EBV , HBV, HCV, CMV, 및 헤르페스 바이러스를 포함한다. 추가로, 독소 (보통은 박테리아에 의해 생산되는 것)가 항원으로서 사용될 수 있다. 비감염성 질환, 예컨대, 암의 경우, 바람직한 항원으로는 종양 연관 항원을 포함하며 (통상의 기술자는 그에 대해 잘 알고 있을 것이다 (예컨대, 암배아성 항원, 전립샘 특이 막 항원, 흑색종 항원, 선암종 항원, 백혈병 항원, 림프종 항원, 육종 항원, MAGE-1, MAGE-2, MART-1, 멜란(Melan)-A, p53, gp 100, 결장 암종과 연관된 항원, 유방 암종과 연관된 항원, 예컨대, HER2 및 맘모글로빈 A, Muc1, Trp-2, 텔로머라제, PSA 및 신장 암종과 연관된 항원)), 항원 또는 항원성 단편의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 입자에는 종양 세포 용해물이 적재된다.
생물학적 물질
본 발명에 포함되는 생물학적 물질로는 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 투여시, 대상체의 면역원성 반응을 일으키는 단백질의 단편, 예컨대, 임의 길이의 펩티드, 에피토프, 또는 단백질의 서브유니트가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
최근, 핵산, 예컨대, DNA, RNA, cDNA 또는 그의 단편 또한 백신으로서 사용된다. 일반적으로, DNA는 감염체의 DNA로부터 추출된 후, 전기천공, 유전자 총 등에 의해 대상체에게 전달하기 이전에 유전자 조작에 의해 변형/증강된다.
본 발명의 생물학적 물질은 야생형 생 병원체일 수 있다. 그리고, 바람직하게, 항원은 불활성화 또는 약독화 형태의 것, 예컨대, 사멸 바이러스, 박테리아 조각, 및 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 서브유니트 또는 면역원성 기능성 단편이다. 더욱 바람직하게, 생물학적 물질은 질병을 유발하지는 않지만, 대상체의 면역 반응을 효과적으로 일으킬 수 있고, 특정 질환의 추후 감염으로부터 대상체를 보호한다.
효모 세포벽 입자의 공극 크기는 약 30 nm 이상이고, 따라서, 회전 반경이 30 nm 이하인 임의의 분자/물체가 효모 세포벽 입자 내에 적재될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 크기가 30 nm 미만인 일부 바이러스 또는 바이러스 입자 (예컨대, 담배 모자이크 바이러스) 뿐만 아니라, 종양 용해물을 비롯한, 다른 항원도 효모 세포벽 입자 내에 적재될 수 있다.
애주번트
조성물이 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 진피로 직접적으로 투여되었을 때, 어떤 애주번트도 포함하지 않는 조성물 투여와 비교하여 면역 반응이 애주번트에 의해 증강되도록 면역 반응을 증강시키는 애주번트로서 다수의 면역 반응 증강제가 조성물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 물질이 적재된 입자를 포함하는 조성물을 수지상 세포와 함께 인큐베이션시키면, 애주번트는 상기 애주번트로부터의 임의의 전신 효과는 크게 감소시키면서, 수지상 세포에 대해서는 증가된 효과를 보인다. 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다.
조성물이 대상체에게, 예를 들어, 대상체의 진피로 직접적으로 투여되었을 때, 어떤 추가의 애주번트도 포함하지 않는 조성물 투여와 비교하여 면역 반응이 애주번트에 의해 증강되도록 면역 반응을 증강시키는 애주번트로서 다수의 면역 반응 증강제가 효모 세포벽 입자 내의 적재를 위해 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 효모 세포벽 입자에 생물학적 물질을 적재하고, 적재된 효모 세포벽 입자 또한 수지상 세포와 함께 인큐베이션시키면, 애주번트는 상기 애주번트로부터의 임의의 국소화된 또는 전신 효과는 크게 감소시키면서, 수지상 세포에 대해서는 증가된 효과를 보인다.
본 발명에 적합한 하나 이상의 애주번트를 선택하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 안에 있다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리 I:C, 폴리 ICLC, 강력한 MHC II 에피토프 펩티드, 및 수지상 세포 자극 시토카인, 예컨대, IL-12, IL-2, 및 GM-CSF가 본 발명의 우수한 애주번트 후보물질이다.
적합한 애주번트는 수지상 세포를 성숙시키고, 수지상 세포를 활성화시키고, T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 더욱 강력한 생성을 추가로 자극시키기 위해 수지상 세포 상의 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 분자이다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리 I:C, 폴리 ICLC, 강력한 MHC II 에피토프 펩티드, 및 수지상 세포 자극 시토카인, 예컨대, IL-12, IL-2, 및 GM-CSF, 소분자, 예컨대, 이미퀴모드는 본 발명의 우수한 애주번트 후보물질이다.
입자
본원에 기술된 바와 같이, "입자"는 그 안에 백신을 함유할 수 있고, 또한 백신이 구조체로부터 빠져 나갈 수 있도록 하는 임의의 중공 및 다공성 구조체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 입자의 크기는 약 0.5 내지 약 5 ㎛로, 이는 대략적으로 입자가 단핵구, 예컨대, 수지상 세포에 의해 섭취될 수 있도록 하는 박테리아의 크기와 유사한 크기이다. 구체적인 실시양태에서, 입자의 크기는 약 0.5 내지 약 1 ㎛이다. 구체적인 실시양태에서, 입자의 크기는 약 0.5 내지 약 2.5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 입자는 입자 크기가 약 0.5 내지 약 5 ㎛인 한, 글리칸 네트워크를 가지는 임의의 입자일 수 있다.
바람직하게, 입자는 소화성 또는 생체분해성 입자이다. 일부 실시양태에서, 입자는 특정 형상 또는 물질로 제한되지 않지만, 입자가 수지상 세포를 비롯한, 단핵구에 의해 포식될 수 있도록 허용하는, 중공 또는 다공성 구조를 가지는 임의의 형상, 크기, 또는 물질일 수 있다.
효모 세포벽 입자
또 다른 실시양태에서, 입자는, 입자가 그 안에 생물학적 물질을 캡슐화하는 중공 또는 다공성 구조를 가지도록 하는, 효모 세포벽으로부터 제조된, 효모 세포벽 입자 YCWP이다. 생물학적 물질은 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, YCWP는 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 제조된다. 또 다른 실시양태에서, YCWP의 크기는 대략 단핵구성 포식세포계의 세포 및 다른 포식성 세포가 전형적으로 섭취하는 미생물 구조의 크기와 유사하다. 구체적인 실시양태에서, YCWP는 약 1-25 ㎛, 바람직하게, 1-5 ㎛, 5-10 ㎛, 10-15 ㎛, 15-20 ㎛, 15-25 ㎛, 또는 20-25 ㎛이다. 예를 들어, YCWP는 약 20 ㎛이다.
한 실시양태에서, YCWP는 (a) 효모를 현탁시켜 현탁액을 제조하고, (b) 상기 현탁액을 인큐베이션시키고, (c) 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, (d) 생성된 YCWP를 회수함으로써 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (a)-(d)는 1, 2, 3 또는 4회 이상 반복된다.
또 다른 실시양태에서, YCWP는 (a) 효모를 용액 중에 현탁시켜 제1 현탁액을 제조하고, (b) 제1 현탁액을 인큐베이션시키고, (c) 제1 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, (d) 생성된 펠릿을 현탁시켜 제2 현탁액을 제조하고, (e) 제2 현탁액을 인큐베이션시키고, (f) 제2 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, (g) 생성된 펠릿을 세척하여 YCWP를 회수함으로써 제조된다. 또 다른 실시양태에서, YCWP를 멸균시킨다.
구체적인 실시양태에서, 효모를 1 M NaOH를 비롯한, NaOH 중에 현탁시킨다. 구체적인 실시양태에서, 제1 현탁액을 약 80℃에서 약 1시간 동안 또는 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 구체적인 실시양태에서, 원심분리는 약 10분 동안 약 2,000x중력으로, 또는 10분 동안 약 2,000x중력으로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 펠릿을 약 pH 4.5 또는 pH 4.5의 물을 비롯한, 물 중에 현탁시킨다. 구체적인 실시양태에서, 제2 현탁액을 약 55℃에서 약 1시간 동안, 또는 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 구체적인 실시양태에서, 펠릿을 1, 2, 3 또는 4회 이상 물 중에서 세척한다. 구체적인 실시양태에서, 펠릿을 1회 세척한다.
또 다른 실시양태에서, 펠릿 세척 후, YCWP를 이소프로판올 및/또는 아세톤을 사용하여 멸균시킨다. 구체적인 실시양태에서, 공지된 다른 알콜이 적절하다. 구체적인 실시양태에서, 멸균 후, YCWP는 완전하게 건조될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, YCWP는 건조된 후, 재현탁된다. 구체적인 실시양태에서, YCWP는 PBS, 예컨대, 1 X PBS 중에 재현탁된다.
또 다른 실시양태에서, 사용 전 YCWP 보관을 위해, 생물학적 물질을 YCWP 내로 적재하기 이전에 및/또는 실리케이트로 캡핑하기 이전에, YCWP를 건조한 후, 이어서, 냉동시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, YCWP를 동결건조시키고, 약 4℃ 이하에서 보관한다. 구체적인 실시양태에서, YCWP를 동결건조시키고, 4℃에서 보관한다. 생물학적 물질은 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다.
생물학적 물질이 적재된 입자
입자, 예를 들어, 효모 세포벽 입자에 생물학적 물질, 예컨대, 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합이 적재된다. 한 실시양태에서, 생물학적 물질 및 입자, 예를 들어, 효모 세포벽 입자의 현탁액을 함께 인큐베이션시키고, 생물학적 물질이 입자 내부의 중공 내로 침투될 수 있도록 함으로써 생물학적 물질이 입자 내로 적재된다.
또 다른 실시양태에서, 입자 또는 효모 세포벽 입자를 생물학적 물질과 함께 인큐베이션시키거나, 또는 그에 생물학적 물질을 적재한 후, 그 조합물을 동결건조시켜 입자 내의 무수 백신을 생성한다. 동결건조시킴으로써, 생물학적 물질은 입자 내에 포획되고, 단핵구, 예컨대, 수지상 세포에 의해 포식될 준비를 갖추게 된다. 구체적인 실시양태에서, 동결건조는 입자 내에 생물학적 물질을 포획하는 데 사용되는 유일한 기전이다. 구체적인 실시양태에서, 포획은 생물학적 물질이 입자로부터 빠져 나가지 못하게 차단하는 별도의 성분에 의해, 예를 들어, 물리적 포획, 소수성 결합, 임의의 다른 결합에 의해 일어나는 것은 아니다. 구체적인 실시양태에서, 포획은 동결건조시 발생할 수 있는 임의의 부착 이외에 생물학적 물질을 입자에 가교결합시키거나, 또는 달리 부착시킴으로써 일어나는 것이 아니다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 구체적으로 리소좀을 피하는 데 도움을 주는 임의의 추가 성분을 포함하지 않는다. 생물학적 물질은 예를 들어, 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생물학적 물질은 효모 세포벽 입자 내로 혼입된다. 구체적인 실시양태에서, YCWP의 개수는 약 1x109개이고, 생물학적 물질의 부피는 약 50 ㎕이다. 구체적인 실시양태에서, 인큐베이션은 약 4℃에서 약 1시간 동안 또는 1시간 미만 동안 진행된다. 일부 실시양태에서, YCWP 및 생물학적 물질의 조합물은 2시간 미만 동안에 걸쳐 또는 약 2시간 동안에 걸쳐 동결건조된다.
또 다른 실시양태에서, 적재된 효모 세포벽 입자는 실리케이트로 캡핑된다. 구체적으로, 일부 실시양태에서, 적재된 YCWP는 암모니아의 존재하에서 YCWP를 실리케이트, 예컨대, 테트라알킬오르토실리케이트와 접촉시키고, 이로써 적재된 YCWP는 실리케이트로 캡핑됨에 따라서 캡핑된다. 바람직한 실시양태에서, 적재된 YCWP는 약 60분, 약 45분, 약 30분, 약 15분, 약 10분, 약 5분 또는 약 2분 이내에 실리케이트로 캡핑된다. 테트라알킬오르토실리케이트의 반응성은 암모니아에 의해 매개되는 가수분해하에서 테트라알킬오르토실리케이트가 YCWP의 β-글루칸 구조의 1급 히드록실과 반응하는 정도이다. 테트라알킬오르토실리케이트는 또한 이들 세포벽 실리케이트의 단부와 자가 반응하여 브릿지, 예컨대, -O-Si(OH)2-O-, 또는 3차원으로, 예컨대, -O-Si(-O-Si-O-)(OH)-O- 또는 -Si(-O-Si-O-)2-O-를 형성한다. 상기 브릿지는 YCWP 안의 적재된 약물 또는 생물학적 물질의 체류를 증가시키도록 그 사이의 공극 간에 존재할 수 있다. 캡핑된 YCWP의 구조는 도 7e에 도시되어 있다. 상기 캡핑된, 적재된 YCWP를 동결건조시킬 수 있다.
본 출원의 발명자는, 실리케이트로 캡핑된, 적재된 YCWP가 효과적인 백신 전달 시스템이라는 예상 밖의 발견을 하게 되었다. 더욱 구체적으로, 캡핑된 YCWP는 캡핑되지 않은 YCWP보다 더 많은 적재된 물질을 보유한다. 더욱더 놀랍게도, 실험 실시예에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 캡핑된 YCWP는 캡핑되지 않은 YCWP와 비교하여 유의적으로 더 많은 방출된 생물학적 물질을 포식성 세포의 세포질 내로 전달할 뿐만 아니라, 유의적으로 더 많은 적재된 입자를 포식성 세포 내로 전달한다.
또 다른 실시양태에서, 동결건조시킨 후, 적재된 입자를 희석제 또는 용액 중에 재현탁시킨다. 구체적인 실시양태에서, 희석제 또는 용액은 물이다. 구체적인 실시양태에서, 적재된 입자를 재현탁시키고/거나, 추가의 생물학적 물질, 예를 들어, 백신과 인큐베이션시켜 입자를 침투시킨 후, 조합물을 다시 동결건조시킨다. 다른 실시양태에서, 조합물을 다회에 걸쳐 동결건조시키고, 재현탁시킨다. 다른 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자를 동결건조 이후, 및 사용 이전에 에탄올 중에서 멸균시킨다. 생물학적 물질로는 예를 들어, 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, (a) 생물학적 물질 및 입자의 현탁액을 인큐베이션시켜 생물학적 입자가 입자 내부 중공 내로 침투할 수 있도록 하고, 적재된 입자의 현탁액을 동결건조시키고, (b) 임의적으로, 입자를 재현탁시키고, 재현탁된 입자를 인큐베이션시키고, 재현탁된 입자, 및 입자 중에 이미 존재하고 있는 것인 아닌 임의의 백신을 동결건조시킴으로써 생물학적 물질을 입자 내로 적재한다.
YCWP를 사용하는 구체적인 실시양태에서, YCWP의 개수는 약 1x109개이고, 생물학적 물질의 부피는 약 50 ㎕이다. 구체적인 실시양태에서, YCWP의 개수는 1x109개이고, 생물학적 물질의 부피는 50 ㎕이다. 구체적인 실시양태에서, 단계 (a)에서 인큐베이션은 약 4℃에서 1시간 미만 동안 이루어진다. 구체적인 실시양태에서, 단계 (a)에서 인큐베이션은 4℃에서 약 1시간 동안 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 상기 현탁액을 2시간 미만인 기간에 걸쳐 또는 약 2시간 동안에 걸쳐 동결건조시킨다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 YCWP를 약 50 ㎕의 물 또는 50 ㎕의 물을 비롯한, 물 중에 재현탁시킨다. 일부 실시양태에서, 재현탁된 YCWP를 단계 (b)에서 약 4℃에서 1시간 미만 또는 약 1시간 동안, 또는 4℃에서 2시간 미만 또는 약 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 생물학적 물질은 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다.
투여 이전에, 캡핑된, 적재된 효모 세포벽 입자는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, PBS 또는 염수 용액 중에 재현탁된다.
수지상 세포
본원에 기술된 바와 같이, "수지상 세포"는 말초 혈액 단핵 세포 ("PBMC")로부터 생성되는 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, 수지상 세포는 (a) 혈액을 수집하고, (b) 혈액을 희석시키고, (c) PBMC의 밀도 구배 분리를 수행하고, (d) 적혈구를 용해시키고, PBMC를 세척하고, (e) PBMC를 인큐베이션시키고, (f) 비부착성 세포를 제거하고, (g) 배지 중에서 부착성 세포를 배양함으로써 제조된다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포는 5일 이하 동안 배양된 미성숙 수지상 세포이다. 다른 실시양태에서, 수지상 세포는 6-8일 동안 배양된 것이다.
구체적인 실시양태에서, 혈액은 헤파린 처리된다. 구체적인 실시양태에서, 단계 (c)에서 밀도 구배 분리되는 림프구 분리 배지(Lymphocyte Separation Medium)에 혈액을 놓은 후, 혈액을 원심분리하는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 원심분리는 약 20분 동안 약 1,000x중력으로, 또는 20분 동안 1,000x중력으로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 2차 원심분리는 단계 (d) 이전에 수행되고, 약 5분 동안 약 500 g로 수행되거나, 또는 5분 동안 500 g로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 3차 원심분리는 단계 (d) 이전에 수행되고, 약 10분 동안 약 500 g로 수행되거나, 또는 10분 동안 500 g로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 원심분리는 약 10분 동안 약 1,200x중력으로, 또는 약 15분 동안 1,200x중력으로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 2차 원심분리는 단계 (d) 이전에 수행되고, 약 5분 동안 약 500 g로 수행되거나, 또는 5분 동안 500 g로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 용해는 ACK 용해액을 사용하여 수행되고, 이어서, 바람직하게는 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션이 수행된 후, 후속 원심분리가 수행된다. 구체적인 실시양태에서, PBMC는 RPMI 배지 중에서 세척된다. 구체적인 실시양태에서, 단계 (e)에서 PBMC를 플라스크 중에서 약 37℃에서 약 1-2시간 동안, 또는 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션시킨다. 구체적인 실시양태에서, 무혈청 DC 배지를 플라스크에 첨가한다.
일부 실시양태에서, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (예컨대, 800 유니트/ml) 및 IL-4 (예컨대, 500 유니트/ml)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 시토카인이 배양 배지 중에 존재한다.
백신 조성물
일부 실시양태에서, 적재된 입자가 진피 수지상 세포에 의해 포식되도록 생물학적 물질이 적재된 입자는 대상체의 진피 내로 직접 주사된다. 일부 실시양태에서, 임의적으로, 생물학적 물질이 적재된 입자는 시험관내에서 단핵구, 바람직하게, 수지상 세포 내에서 포식된다. 일부 실시양태에서, 입자가 진피 수지상 세포에 의해 포식되도록 생물학적 물질이 적재되고, 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자는 대상체의 진피 내로 직접 주사된다. 한 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자는 수지상 세포와 함께 인큐베이션됨에 따라 상기 세포는 생물학적 물질이 적재된 입자를 포식하게 된다. 생물학적 물질은 예를 들어, 특이적인 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 종양 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 캡핑된, 적재된 입자는 시험관내에서 단핵구에 의해 포식되고, 여기서, 단핵구는 바람직하게는 수지상 세포이다.
구체적인 실시양태에서, 입자는 임의적으로는 인간에게로의 투여 이전에 수지상 세포와 함께 약 1:1 내지 약 100:1의 비로 인큐베이션된다. 인큐베이션은 약 1시간, 1시간 또는 바람직하게는 1시간 미만인 기간 동안 수행될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 캡핑된, 적재된 입자를 함유하는 수지상 세포를 수집하고, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4회 이상 세척한다. 다른 실시양태에서, 세척 후, 수지상 세포를 인큐베이션시키고, 냉동 배지 중에 재현탁시키고, 사용 전 보관을 위해 동결시킨다. 구체적인 실시양태에서, 재현탁시킴으로써 약 10x106개의 세포/ml 또는 10x106개의 세포/ml인 농도를 얻는다. 구체적인 실시양태에서, 재현탁액을 사용 전 보관을 위해 동결시킨다.
제제화
본 발명의 조성물을 점막 투여용 (예컨대, 비내 및 흡입 투여용) 또는 경피 투여용으로 제제화시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 비경구 투여용으로 (예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사용) 제제화될 수 있고, 환자 내로 직접 주사되고, 단핵구성 기원의 세포, 예컨대, 대식세포 및 수지상 세포를 표적화할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 수지상 세포와 함께 사전 인큐베이션이 이루어지지 않은, 캡핑된, 생물학적 물질이 적재된 입자는 대상체의 진피 내로 직접 주사된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 종래 백신과 같이 투여될 수 있다. 이는 또한 더 낮은 수준의 기술이 요구되는 바, 이에 실질적으로는 비용이 절감된다. 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여하기 이전에, 캡핑된, 적재된 입자를 먼저 단핵구성 기원의 세포, 예컨대, 수지상 세포와 함께 인큐베이션시킨다.
주사용 제제는 단위 투여 형태로, 예컨대, 앰플로 또는 다회 투약 용기에, 임의적으로는 첨가된 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 제약상 허용되는 부형제를 사용하여 제제화될 수 있다. 상기 부형제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있지만, 전형적으로는 생리학상 허용되는 수용액일 것이다. 생리학상 허용되는 수용액은 본질적으로 비독성인 것이다. 바람직한 부형제는 불활성 또는 증진성이겠지만, 억제성 화합물 또한 면역관용(tolerogenic) 반응을 달성하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 어떤 다른 면역억제성 처치, 예컨대, 스테로이드제 또는 화학요법과 함께 투여되지 않는다.
치료 방법
본 발명의 조성물은 포식성 세포, 예컨대, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 미성숙 수지상 세포를 비롯한, 단핵 포식세포계의 세포를 유인하는 바, 따라서, 이는 백신으로서 사용될 수 있다. 백신접종 분야에서, 단핵 포식세포계의 세포는 "전문" 항원 제시 세포로 간주되며, 따라서, 백신 전달을 위해 이상적인 표적이다. 강력한 세포성 면역 반응을 생성하는 데 있어서 APC 내에서의 항원 제시가 임의의 다른 세포 유형 내에서 상기와 같은 항원을 발현하는 것보다 훨씬 더 효과적이라는 것은 널리 공지되어 있다. 그러므로, 클래스 I MHC 및 클래스 II MHC 분자를 통해 항원 제시 세포 상에 항원을 제시할 수 있는 본 발명의 조성물의 능력은 상기 백신의 효능을 현저히 증강시킨다.
본 발명은, 예컨대, 현재 백신 전략법으로 표적화되는 바이러스 매개성, 박테리아 매개성, 또는 기생충 질환, 또는 현 백신 기술의 한계에 기인하여 미미하게 감수성인 질환과 같은 감염성 질환, 및 암을 비롯한, 비감염성 질환에 대한, 본원에 개시된 조성물의 예방학적 및 치료학적 용도를 고려한다. 치료하고자 하는 질환은 특별히 제한되지 않지만, 입자 내로 적재되는 생물학적 물질에 의존한다. 상기 예시적인 생물학적 물질로는 종양 용해물, 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 탄수화물, 또는 그의 조합을 포함한다.
본 발명의 조성물은 생체내 또는 시험관내에서 포식성 세포와 접촉하게 된다. 그러므로, 생체내 또는 시험관내 방법, 둘 모두 고려된다. 생체내 방법의 경우, 본 발명의 조성물은 일반적으로 비경구적으로, 보통은 정맥내로, 근육내로, 피하로, 진피간, 또는 진피내로 투여된다. 이는, 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 시험관내 방법에서, 단핵구성 세포는 신체 밖에서 접촉하게 되고, 이어서, 접촉된 세포는 환자에게 비경구적으로 투여된다.
투여량
일부 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자, 또는 캡핑된, 생물학적 물질이 적재된 효모 세포벽 입자를 함유하는, 약 200 ㎕의 10x106 농도의 수지상 세포가 1회 용량분의 치료를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 용량은 대상체에게 상기 용량을 투여하기 이전에 200 ㎕ 분취량을 1 ml의 최종 부피로 희석시킴으로써 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 분취량은 5% 인간 혈청 알부민을 함유하는 멸균 염수로 희석된다. 구체적인 실시양태에서, 200 ㎕ 분취량은 희석 전에 해동되어야 할 것이다. 상기 시나리오에서, 해동과, 대상체에게로의 용량 투여 시간 사이의 기간은 2시간 이하가 될 것이다. 일부 실시양태에서, 희석된 분취량은 3 cc 시린지로 투여된다. 일부 실시양태에서, 23 게이지 이상의 시린지 니들이 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 1, 2, 3 또는 4회 용량분 이상의 본 발명의 조성물을 투여받는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 매 4주마다 1회에 걸쳐 다시 백신 접종을 받는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자를 포함하는 조성물은 먼저 수지상 세포에의 융합 없이 대상체에게 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 매 4주마다 1회에 걸쳐 조성물을 다시 투여받는다. 구체적인 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자, 또는 캡핑된, 적재된 입자를 함유하는, 약 1-2x106개의 수지상 세포는 임의적으로 매회 백신 접종시 주사에 의해 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 생물학적 물질이 적재된 입자, 또는 캡핑된, 적재된 입자는 대상체에서 (1) 감염 또는 질환 부위, 또는 (2) 림프절에 또는 그 주변에 주사된다. 생물학적 물질은 예를 들어, 단백질 또는 그의 단편, 핵산, 또는 그의 조합을 포함한다.
백신 조성물은 핵산, 예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드, 단백질 또는 펩티드 에피토프, 예컨대, 파상풍 톡소이드 MHC 클래스 II-결합 p30 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 생물학적 애주번트 또한 함유할 수 있다.
본 발명은 하기 실험 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이 실험 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 결코 아니다.
실시예
실시예 1: 수지상 세포 제조
환자의 PBMC로부터 수지상 세포를 생성하였다. 표준 작업 절차에 따라 200 ml를 채혈하여 PBMC를 환자로부터 수집하였다. 이어서, 혈액을 250 ml 원심분리 튜브로 옮겨 놓고, 1 X PBS로 1:1로 희석하였다. 이어서, 35 ml의 희석된 혈액을 50 ml 튜브 중 15 ml의 실온 림프구 분리 배지 (LSM; 메디아테크(Mediatech)) 상에 적층시키고, 실온에서 20분 동안 1,000 g로 원심분리하였다. LSM 구배로부터 피펫팅하여 PBMC 층을 제거하고, 깨끗한 50 ml 원심분리 튜브에 넣었다. 4 부피의 1 X PBS를 첨가하고, 상기 튜브를 뒤집어 내용물을 혼합하였다. 이어서, PBMC를 실온에서 5분 동안 500 g로 원심분리하였다. 10 ml의 1 X PBS를 각 튜브에 첨가하고, 세포를 재현탁시키고, 1개의 튜브로 풀링하였다. PBMC를 실온에서 10분 동안 500 g로 원심분리하고, 20 내지 40 ml의 ACK 용해액 (캠브렉스(Cambrex)) 중에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 5분 동안 1,500 rpm으로 다시 원심분리시켰다. PBMC를 30 ml RPMI-1640 배지 (메디아테크) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 2-4개의 T75 플라스크로 옮겼다. 플라스크를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 비부착성 세포는 세정하여 제거하였다. 이후, 10 ml의 1 X PBS를 각 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 와동시키고, PBS를 제거하였다. 이후, 10 ml의 완전 DC 배지 (무혈청 DC 배지 + 800 U/ml GM-CSF + 1,000 U/ml IL-4)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 플라스크를 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 인큐베이션시켰다. 3일째, 10 ml의 완전 DC 배지를 각 플라스크에 첨가하였다. 이어서, 세포를 추가로 2일 동안 인큐베이션시켰다. 6 또는 7일째, 생성된 미성숙 수지상 세포는 사용될 수 있는 준비를 갖추게 되었다.
도 1은 수지상 세포 생성에 관한 개요를 제공하는 것이다.
실시예 2: 항원 제조
합성 항원, 예컨대, 펩티드는 상업적으로 쉽게 제조될 수 있고, 냉동건조된 상태로 제공될 수 있다. 상기 펩티드는 적재를 위하여, 제조된 YCWP와 재구성되고, 공동으로 인큐베이션될 수 있다. 유사하게, 하기 논의되는 바와 같이, 재조합 단백질 및/또는 단리된 단백질은 용액 중에 현탁될 수 있고, YCWP와 공동으로 인큐베이션될 수 있다.
실시예 3: 종양 용해물 제조
종양 샘플을 환자로부터 수득하였다. 종양 조직으로부터 지방 및 괴사성 조직을 분리해 낸 후, 조직의 중량을 측정하고, 1 X PBS를 첨가하고 (조직 200 ㎍당 50 ㎕의 PBS), 종양을 1 X PBS 중에서 외과용 메스를 이용하여 완전하게 민싱하였다. 이어서, 종양 세포를 4회 사이클로 냉동 및 해동시켰다. 냉동은 20분 동안 액상 질소 중에서 수행되었고, 해동은 실온에서 수행되었다. 제조된 종양 용해물을 분광광도계를 이용하여 정량화하였다. 품질 관리 검사를 위해 분취량을 채취하였다. 나머지는 백신 제조용 제제로 ≤ -135℃에서 보관하였다. 소량의 애주번트를 냉동 해동 사이클 이후에 임의적으로 첨가할 수 있다.
도 2는 종양 세포 용해물 프로세싱에 관한 개요를 제공하는 것이다.
실시예 4: 효모 세포벽 입자 제조
플레이쉬만즈 베이커스 이스트(Fleishmans Baker's Yeast) 또는 등가물로부터 YCWP를 제조하였다. 간략하면, 10 g의 플레이쉬만즈 베이커스 이스트를 100 ml의 1 M NaOH 중에 현탁시키고, 1시간 동안 80℃로 가열하였다. 용해되지 않는 효모 세포벽은 10분 동안 2,000xg로 원심분리하여 회수하였다. 이어서, 회수된 효모 세포벽은, HCl을 이용하여 pH 4.5로 조정된 100 ml의 물에 재현탁시키고, 55℃에서 추가 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 원심분리에 의해 회수하였다. 이어서, 회수된 YCWP를 물로 1회, 이소프로판올로 4회, 및 마지막으로 아세톤으로 2회에 걸쳐 세척하였다. 일단 YCWP가 완전히 건조되고 나면, 이를 PBS 중에 재현탁시키고, 계수하고, 1 X 109개의 입자로 이루어진 군으로 분취하고, 백신 제조에 사용하기 위해 동결건조시켰다.
도 3은 효모 세포벽 입자 프로세싱에 관한 개요를 제공하는 것이다.
실시예 5: 효모 세포벽 입자 제조
30 mL의 멸균수 중에 효모를 현탁시키고, 와동시키고, 실온에서 5분 동안 800-1,000xg로 원심분리하여 3 g의 활성 건조 효모 (플레이쉬만즈 또는 등가물)를 물 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 상청액을 경사분리한 후, 효모 펠릿을 50 mL의 1 M NaOH 중에 재현탁시키고, 90℃ 수조에서 1시간 동안 가열하였다.
이어서, 효모 현탁액을 5분 동안 800-1,000xg로 원심분리하고, 펠릿을 25-30 mL의 산성 물 (HCl을 이용하여 pH 4.5로 조정된 물) 중에 재현탁시켰다. 현탁액의 pH가 < 7.0이 될 때까지 산성 물 세척 단계를 반복하였다. 이어서, 펠릿을 30 mL의 산성 물 중에 재현탁시키고, 75℃ 수조에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 5분 동안 1,000xg로 원심분리하여 효모 펠릿을 회수한 후, 10 mL의 멸균수로 3회, 10 mL의 이소프로판올로 4회, 및 마지막으로 10 mL의 아세톤으로 2회에 걸쳐 세척하였다. 조심스럽게 아세톤을 제거하고, 펠릿을 비커의 유리 표면 상에 고르게 펴고, 밤새도록 대기 건조시켰다.
건조된 YWCP를 수집하고, 4℃ 진공 자(vacuum jar)에서 보관한 후, 10-15 mL의 여과된 70% 에탄올 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. YWCP를 마지막 세척시 짧게 초음파 처리하고, 필요할 경우, 초음파 처리를 반복하여 응집물을 분산시켰다. 일단 에탄올을 제거하고 나면, YWCP를 멸균수 중에서 세척하였다. 100 ㎕의 YWCP의 분취물을 2.0 mL 둥근 바닥 스냅 탑 원심분리 튜브에 분배하고, 1시간 동안 냉동기에 놓고, 동결건조시키고, 추후 사용을 위해 4℃ 진공 자에서 보관하였다.
실시예 6: 효모 세포벽 입자 제조
1 L의 1 M NaOH 중에 사카로미세스 세레비지아에 (100 g의 플레이쉬만즈 베이커스 이스트, AB 마우리 푸드 인크.(AB Mauri Food Inc.: 미국 미주리주 체스터필드))를 현탁시키고, 1 h 동안 80℃로 가열하여 효모 세포벽 입자 (YCWP)를 제조하였다. 10 min 동안 2,000xg로 원심분리하여 효모 세포벽을 함유하는 불용성 물질을 수집하였다. 이어서, 상기 불용성 물질을 1 L의 물 중에 현탁시키고, HCl을 이용하여 pH 4-5로 만들고, 이어서 55℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 원심분리에 의해 불용성 잔류물을 다시 수집하고, 1 L의 물로 1회, 200 mL의 이소프로판올로 4회, 및 200 mL의 아세톤으로 2회에 걸쳐 세척하였다. 생성된 슬러리를 멸균 후드에서 실온에서 건조시켜 12.4 g의 약간 회백색을 띠는 미세 분말을 수득하였다. 건조 YCWP로 구성된 분말의 중량을 조심스럽게 측정하고, 10 mgs/ml 농도로 멸균 증류수 중에 현탁시키고, 1 ml 분취량을 멸균 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 놓고, -60℃에서 냉동시키고, 0.012 mBar에서 동결건조시켰다. 이소프로판올 및 아세톤의 비등점이 물의 비등점보다 상당히 낮기 때문에, 상기 용매에 의한 임의의 가능한 오염은 상기 높은 진공 조건하에서 제거될 것이다.
실시예 7: 종양 용해물 제조 및 YCWP 적재
3회에 걸친 냉동 (-60℃)/해동 사이클을 수행한 후, 21,000 g로 원심분리하여 모든 불용성 물질을 제거함으로써 종양 조직으로부터 종양 단백질 항원을 유리시킨다. 가용성 종양 항원성 물질 및 임의적으로 포함된 애주번트 물질을 중공 YCWP의 내부에 적재한 후, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 소량의 가용성 종양 용해물이 YCWP의 중공 내부로 완전히 침투되도록 한다. 사용되는 가용성 종양 용해물의 부피는, 가용성 종양 용해물 대부분이 인큐베이션 이후에 YCWP의 중공 내부 내에 존재하도록 YCWP의 내부의 부피에 매우 근접하게 면밀히 계산한다. 인큐베이션 후, 완전히 용해된 YCWP를 -60℃에서 냉동시키고, 8시간 동안 0.012 mBar 진공에서 동결건조시켜 모든 물을 제거함에 따라 무수 종양 용해물 항원성 물질은 대부분이 중공 YCWP 내부에 남게 된다. 임의의 잔류 종양 용해물 물질을 YCWP의 내부로 유도하기 위해, YCWP의 내부의 동일하게 작은 계산된 부피의 멸균수를 건조된 부분적으로 적재된 YCWP에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 다시 인큐베이션시킨 후, 다시 8시간 동안 0.012 mBar 진공에서 동결건조시킨다.
실시예 8: 생물학적 물질의 YCWP 내로의 적재
4℃에서 2시간 동안에 걸쳐 완전한 무수 YCWP (1 X 109) 현탁액을 PBS 중의 펩티드 50　㎕와 접촉하게 놓음에 따라 펩티드가 YCWP의 중공 내부로 침투할 수 있도록 함으로써 적재된 YCWP를 수득한다. 이어서, 현탁액을 2시간 동안 동결건조시킨다. 동결건조시킨 후, 50 ㎕의 물을 적재된 YCWP에 첨가하고, 4℃에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션시키고, 다시 동결건조시킴으로써 그의 중공 내부에 건조 생물학적 물질이 있는 YCWP를 수득한다. 이어서, 적재된 YCWP를 에탄올 중에서 세척함으로써 멸균시키고, 에탄올 중에서 유지시킨다.
도 4는 YCWP 적재 절차에 관한 개요를 제공하는 것이다.
실시예 9: YCWP에의 종양 용해물 적재
혼합하는 동안 기포가 형성되지 않게 하면서, 환자 종양 생검 샘플을 (종양 샘플의 양에 따라) 50-100 ㎕의 용해 완충제 (PBS)를 이용하여 조심스럽게 혼합한 후, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 혼합물을 아세톤-드라이아이스 배쓰 및 37℃ 수조에서 3회에 걸쳐 냉동-해동시키고, 4℃에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리시켰다. 10 mg의 건조된 YCWP를 함유하는 멸균 2 mL 원심분리 튜브에 50 ㎕의 제조된 종양 용해물을 첨가함에 따라 액상 종양 용해물이 YCWP를 커버하였다. 액상 종양 용해물이 YCWP 내로 스며들 때까지 2시간 동안 4℃에서 혼합물을 인큐베이션시켰다.
이어서, 펠릿을 신속하게 냉동시키기 위해 상기 튜브를 30분 동안 -85℃ 냉동기에 놓았다. 상기 튜브를 밤새도록 동결건조기에 놓았다. 50 ㎕의 멸균수를 건조된 효모 펠릿에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 액체가 펠릿 내로 스며들게 하였다.
펠릿을 신속하게 냉동시키기 위해 상기 튜브를 30분 동안 -85℃ 냉동기에 놓았다. 이어서, 상기 튜브를 밤새도록 동결건조기에 놓았다. 이어서, 건조된 입자를 1 mL의 70% 에탄올 중에 재현탁시키고, 추후 사용을 위해 4℃에서 보관하였다.
실시예 10: 적재된 YCWP의 대상체에게로의 투여
임의적으로 5% 인간 혈청 알부민을 함유하는, 주사에 적합한 용액, 예컨대, 주사용 멸균수 또는 주사용 멸균 염수 1 mL 중에 상기 실시예에 따라 제조된, 적재된 YCWP를 멸균 조건하에서 재현탁시킨다. 일단 적재된 YCWP를 조심스럽게 재현탁시키고 나면, 전체 부피를 뽑아 내고, 이를 시린지를 이용하여 환자의 진피로 주사한다.
실시예 11: 적재된 입자를 함유하는 수지상 세포 제조
70% 에탄올 현탁액 중에서 상기 실시예에 따라 제조된, 적재된 YCWP를 원심분리한다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고, 1 mL의 PBS로 대체한다. 적재된 YCWP를 초음파 처리한다. 적재된 YCWP를 멸균 1 X PBS로 세척한다. 최종 세척 후, 적재된 YCWP를 대략 1 X 108개의 입자/100 ㎕ PBS로 PBS 중에 재현탁시킨다.
적재된 YCWP를 수지상 세포 배양물에 1:100의 비로 첨가하고, 상기 배양물을 37℃ 인큐베이터로 다시 복귀시켰다. 이어서, 배양물에 하기 인자들을 첨가한다: 멸균수 중 50 ㎍/mL의 TNF-α를 배양물에 1:5,000 부피비 (배양물 10 mL당 2 ㎕)로 첨가하고; 멸균수 중 10 ㎍/mL의 IL-1β를 배양물에 1:1,000 부피비로 첨가하고; 멸균수 중 10 ㎍/mL의 IL-6을 배양물에 1:1,000 부피비로 첨가하고; 100% 에탄올 중 1 mg/mL의 PGE2를 배양물에 1:1,000 부피비로 첨가한다. 모든 인자를 배양물에 첨가하고, 혼합한 후, 배양물을 밤새도록 인큐베이션시킨다.
실시예 12: 수지상 세포 수거, 백신 조성물 제조 및 냉동 보존
실시예 11로부터 제조된 수지상 세포 배양물을 인큐베이터로부터 제거하였다. 멸균 조건하에 후드에서 하기 절차를 수행하였다. 10 mL의 배지를 배양 플라스크로부터 제거하였다. 배양 플라스크를 4.0-4.5 mL의 1 X PBS로 세정하고, 이를 또한 배지에 첨가하였다.
1.5-2.0 mL의 셀스트라이퍼(CellStripper)™를 배양 플라스크에 첨가하였다. 배양 플라스크를 10-20분 동안 37℃ 인큐베이터에 놓았다. 약 4 mL의 배양 배지를 상기 튜브로부터 다시 플라스크로 첨가하고, 세포를 세척 및 제거하였다. 플라스크를 세척하여 가능한 많은 세포를 수거하였다. 혈구계수기 또는 셀로미터(Cellometer)™에서 세포를 계수하였다. 원심분리 후 상청액을 제거하였다.
이어서, 세포를 5 X 106개의 세포/mL로 크라이오스토르(CryoStor)™ 10 중에 재현탁시키고, 환자 식별 번호, 날짜 및 세포 농도로 적절히 표지된 냉동 바이알로 바이알 1개당 (약 250 ㎕) 1.25 X 106개의 세포/mL로 분취하였다. 무균성 검사를 위해 250-500 ㎕ 분량을 냉동 바이알에서 저장하고, 남은 바이알은 스티로폼(Styrofoam) 용기에서 보관하고, -86℃하에 놓고 스텝 다운 동결시켰다.
실시예 13: 환자 투여를 위한 고체 투약용 백신 제조
환자 세포가 있는 냉동 바이알 1개를 냉동보관소로부터 꺼내고, 37℃ 수조에서 조심스럽게 해동시켰다. 멸균 조건하에서, 5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 1 mL의 주사용 멸균 염수 (또는 1 mL의 멸균 1 X PBS)를, 상기 세포를 함유하는 냉동 바이알에 서서히 첨가하였다. 세포를 조심스럽게 재현탁시킨 후, 냉동 바이알로부터 전체 부피를 뽑아 내고, 환자에게 투여하는 데 백신을 함유하는 시린지를 사용하였다.
실시예 14: 면역화 절차
대상체를 백신 접종하기 위해, 백신이 적재된 입자를 함유하는 1.25x106개의 수지상 세포 용량을 0.2 mL의 무혈청, 10% 디메틸 술폭시드 동결 배지 (크라이오스토르™ CS-10, 바이오라이프 솔루션즈, 인크.(BioLife Solutinos, Inc.)) 중에서 냉동 보존시킨다. 주사하기 전, 수지상 세포를 해동시키고, 5% 인간 혈청 알부민 (알부미나르-25(Albuminar-25), 아벤티스 베링(Aventis Behring))을 함유하는 주사용 멸균 염수를 이용하여 1 mL로 희석시켰다. 이어서, 23 게이지 이상의 니들을 사용하여 희석액을 3.0 cc 주사용 시린지로 옮기고, 이는 해동 후 2시간 이내에 투여한다. 주사는 림프절 부위 내로 피하로 투여될 수 있거나, 또는 진피내로 투여될 수 있다.
실시예 15: 셉메이트 -50( SepMate -50) 시스템을 이용한 전체 말초 혈액으로부터의 단핵 세포 단리
인서트가 있는 셉메이트-50 튜브를 통해 밀도 구배 배지 (LSM) 상에 희석된 혈액을 신속하게 적층시킬 수 있고, 층이 혼합되는 것을 막을 수 있다. 브레이크를 걸고 원심분리 후, 농축된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 새 튜브에 붓고, 추후 배양을 위해 하기 기술되는 바와 같이 프로세싱한다.
절차 1:
Figure 112016094996334-pct00001
절차 2:
Figure 112016094996334-pct00002
Figure 112016094996334-pct00003
실시예 16: 적재된 YCWP와 조합된 수지상 세포 생성
실시예 15의 절차에 따라, 하기 방법을 수행한다:
I. YCWP 첨가
Figure 112016094996334-pct00004
II. 시토카인 제조 및 첨가
Figure 112016094996334-pct00005
실시예 17: 세포 수거, 백신 조성물 제조 및 냉동 보존
하기 방법을 수행한다:
세포 수거:
Figure 112016094996334-pct00006
II. 백신 조성물 제조 및 냉동 보존:
Figure 112016094996334-pct00007
실시예 18: 마우스 모델에서의 실험
B16 뮤린 종양 용해물이 적재된 효모 세포벽 입자를 마우스용 백신으로서 사용하였다. 백신 접종을 받지 않고, 1x106개의 B16 종양 세포 IV 접종받은 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 같은 종양 부하 IV를 이용하여 종양 시험접종을 수행하기 3일 전, 마우스에 (i) 간단하게 혼합된 종양 용해물 및 효모 세포벽 입자로; 또는 (ii) 종양 용해물이 적재된 효모 세포벽 입자로 백신 접종을 하였다. 백신 접종을 받은 마우스 군, 둘 모두에 대한 종양 용해물의 총 단백질 함량 및 효모 세포벽 개수는 동일하였다. 1x106개의 B16 종양 세포 IV 접종 후 21일째, 각 군의 마우스의 폐를 검사하였다.
도 6a, 6b 및 6c는 종양 시험접종 후 21일째 각 군의 마우스의 폐의 결과를 보여주는 것이다.
실시예 19: 실리케이트로 캡핑된 효모 세포벽 입자 제조
상기 실시예에 기술된 바와 같이 효모 세포벽 입자 (YCWP)를 제조하고, 그에 펩티드를 적재하였다. 1 mg의 YCWP에 500 ㎍의 펩티드를 적재하였다. 이어서, 동결건조된, 적재된 YCWP를 1 ml의 무수 에탄올 중에 현탁시키고, 여기에 현탁액 100 ㎕의 테트라에틸오르토실리케이트 및 100 ㎕의 10% 암모니아 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 서서히 진탕시켰다. 이어서, YCWP를 무수 에탄올을 이용하여 철저히 세척하고, 사용시까지 4℃에서 에탄올 중에서 보관하였다.
실시예 20: 시험관내 누출 검정
YCWP에 형광 표지된 알부민을 적재한 후, 적재된 YCWP 중 일부를 상기 실시예에 따라 실리케이트로 캡핑하고, 나머지는 캡핑하지 않은 상태 그대로 두었다.
형광 표지된 알부민이 적재된, 캡핑되지 않은 YCWP 및 실리케이트로 캡핑된 YCWP, 둘 모두 먼저 판독기 상에서 판독하여 전체 형광 계수(count)에 대한 초기 판독치를 수득한 후, 이어서, 캡핑되지 않은 YCWP 및 실리케이트로 캡핑된 YCWP, 둘 모두를 왕성하게 진탕시켰다. 1시간째 및 2시간째에 캡핑되지 않은 YCWP 및 실리케이트로 캡핑된 YCWP, 둘 모두로부터 상청액을 채취하여 하기 상세하게 기술되는 바와 같은 형광 판독치를 수득하였다.
Figure 112016094996334-pct00008
상기 표에 제시되어 있는 바와 같이, 1시간 진탕 후, 캡핑되지 않은 YCWP는 전체 형광의 24.73%를 누출시켰고, 실리케이트로 캡핑된 YCWP는 전체 형광의 15.81%를 누출시켰다. 2시간 진탕 후, 캡핑되지 않은 YCWP는 전체 형광의 16.6%를 누출시켰고, 실리케이트로 캡핑된 YCWP는 전체 형광의 6.65%를 누출시켰다. 요약하면, 2시간 후, 캡핑되지 않은 YCWP는 형광 표지된 알부민을 41.33% 손실한 반면, 실리케이트로 캡핑된 YCWP는 적재된 알부민 중 오직 22.46%만을 손실하였다.
실시예 21: 생체내 적재 방출 검정
마우스 대식세포 원시 세포, 포식성 단핵구성 세포주를 6 웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새도록 배양하였다. 2일째 아침, 둘 모두 형광 표지된 알부민이 적재된, 캡핑되지 않은 YCWP 및 실리케이트로 캡핑된 YCWP를 세포에 첨가하였다. 밤새도록 배양한 후, 세포를 PBS로 수회에 걸쳐 세척하고, 용해시켰다. 용해물을 원심분리함으로써 상청액을 수집하여 형광 판독치를 수득하였다. 캡핑되지 않은 YCWP의 상청액 및 펠릿의 형광 계수는 각각 1,042 및 1,094인 반면; 실리케이트로 캡핑된 YCWP의 상청액 및 펠릿의 형광 계수는 각각 1,945 및 878이었다. 따라서, 실리케이트로 캡핑된 YCWP가 캡핑되지 않은 YCWP보다 86.6% 더 많이 방출된 알부민을 포식성 세포의 세포질로 전달하였다.
실시예 22: 시험관내 포식작용 검정
마우스 대식세포 원시 세포를 24 웰 플레이트에 플레이팅하고, 밤새도록 배양하였다. 2일째 아침, 둘 모두 형광 표지된 알부민이 적재된, 캡핑되지 않은 YCWP 및 실리케이트로 캡핑된 YCWP를 세포에 첨가하였다. 각각 20분, 1시간, 및 2시간째에 세포 형광 판독치를 측정하였다.
Figure 112016094996334-pct00009
상기 표에 제시되어 있는 바와 같이, 실리케이트로 캡핑된 YCWP가 캡핑되지 않은 YCWP보다 82% 더 많이 적재된 알부민을 포식성 세포로 전달하였다.
실시예 23: 마우스 생존 연구
I-IV 군의 각 군은 5마리의 마우스로 이루어지고, V 군은 10마리의 마우스로 이루어진, 5개의 마우스 군에 대하여 생존 연구를 수행하였다. 대조군 (I 군)은 IV 주사에 의해 0.5 X 106개의 B16 흑색종 종양 세포를 받았다. "일반 YCWP" 군 (II 군)은 IV 주사에 의해 0.5 X 106개의 B16 흑색종 종양 세포를 받고, 종양 세포 IV 주사 1주 전, 및 그 이후 매주 6주째까지 B16 종양 용해물이 적재된 캡핑되지 않은 YCWP를 진피간 주사에 의해 백신 접종을 받았다. "Si 캡핑된 YCWP" 군 (III 군)은 IV 주사에 의해 0.5 X 106개의 B16 흑색종 종양 세포를 받고, 종양 세포 IV 주사 1주 전, 및 그 이후 매주 6주째까지 B16 종양 용해물이 적재된 실리케이트로 캡핑된 YCWP를 진피간 주사에 의해 백신 접종을 받았다. "일반 YCWP + AD" 군 (IV 군)은 IV 주사에 의해 0.5 X 106개의 B16 흑색종 종양 세포를 받고, 종양 세포 IV 주사 1주 전, 및 그 이후 매주 6주째까지 B16 종양 용해물, 및 GpC 올리고뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 애주번트가 적재된 캡핑되지 않은 YCWP를 진피간 주사에 의해 백신 접종을 받았다. "Si 캡핑된 YCWP + AD 군" (V 군)은 IV 주사에 의해 0.5 X 106개의 B16 흑색종 종양 세포를 받고, 종양 세포 IV 주사 1주 전, 및 그 이후 매주 6주째까지 B16 종양 용해물, 및 GpC 올리고뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 애주번트가 적재된 실리케이트로 캡핑된 YCWP를 진피간 주사에 의해 백신 접종을 받았다.
도 8에 제시되어 있는 바와 같이, 대조군에 있는 마우스는 모두 약 22일 경과 후 사망하였다. 일반 YCWP 군에 있는 마우스는 모두 약 25일 경과 후 사망하였고, 실리케이트로 캡핑된 YCWP 군에 있는 마우스는 모두 약 35일 경과 후 사망하였고, 일반 YCWP 및 애주번트 군에 있는 마우스는 모두 약 45일 경과 후 사망하였다. 이에 반해, 실리케이트로 캡핑된 YCWP 및 애주번트 군에 있는 마우스 중 약 40%는 100일 경과 후에도 생존해 있었다.

Claims (44)

  1. (i) 효모 세포벽 입자, (ii) 실리케이트 및 (iii) 효모 세포벽 입자 내에 적재된 외인성 생물학적 물질을 포함하는, 암을 치료하기 위한 백신을 전달하기 위한 조성물이며, 여기서 생물학적 물질은 종양 용해물을 포함하고, 효모 세포벽 입자는 실리케이트로 캡핑된 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 실리케이트가 오르토실리케이트의 4개의 산소 화합물 각각에 부착된 유기 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 실리케이트가 테트라에틸오르토실리케이트, 테트라메틸오르토실리케이트, 테트라프로필오르토실리케이트 및 테트라부틸오르토실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 적재된 입자가, 투여 이전에, 단리된 수지상 세포와 함께 추가로 인큐베이션된 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 애주번트, 부형제, 및 보존제를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 애주번트가 모노포스포릴 지질 A 또는 CpG 올리고뉴클레오티드인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 암이 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경아교종, 수모세포종, 신경모세포종, 윌름스 종양(Wilms tumor), 횡문근육종, 골육종, 간암, 췌장암, 흑색종, 전립샘암 및 안구 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 효모 세포벽 입자가 실리케이트에 의해 캡핑되도록 암모니아의 존재하에서 효모 세포벽 입자를 실리케이트와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.
  9. (i) 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자 내로 적재하여 적재된 입자를 제조하는 단계;
    (ii) 적재된 입자를 실리케이트로 캡핑하는 단계;
    (iii) 캡핑된, 적재된 입자를 동결건조시키는 단계; 및
    (iv) 캡핑된, 적재된 입자를 단핵구성 기원의 세포와 함께 인큐베이션시키는 단계로, 여기서 인큐베이션시킴으로써 단핵구성 기원의 세포는 캡핑된, 적재된 입자를 포식하게 되는 것인 단계
    를 포함하는, 제1항의 조성물을 함유하는 세포 혼합물을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (i)이
    (a) 희석제 중에 효모 세포벽 입자 및 생물학적 물질을 현탁시키고, 생물학적 물질이 효모 세포벽 입자에 의해 흡착될 수 있도록 하는 기간 동안 인큐베이션시키는 단계; 및
    (b) 현탁액을 동결건조시켜 생물학적 물질을 효모 세포벽 입자 내에 적재하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 1회 이상 반복하는 것인 방법.
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