CN109010821B - 以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制备方法 - Google Patents

以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制备方法，利用细菌纳米磁小为载体建立一种复合肿瘤抗体疫苗，建立一种新型简便高效的抗体治疗方式，为生物治疗提供一种新的免疫方法。

Description

以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制
备方法。
背景技术
细胞受体4-1BB(CD137)作为T细胞激活和功能维持的重要调节元件，可以直接激活细胞毒性CD8+T细胞。研究表明，在小鼠模型中，单独使用抗-4-1BB抗体或者与其他抗体联用可以消除初期肿瘤。但是使用抗体进行治疗时，常采用腹腔注射的方式，由于靶向性较差，因此抗体用量较大，治疗效果有限。因此建立一种安全简便高效的抗体治疗方式极为重要。细菌纳米磁小体(BMP)是新型生物学纳米材料，主要成分是Fe3O4，直径在25nm～45nm之间，外面被脂膜包被，膜上有大量的生物活性基团，可以与抗体，基因等进行共价连接，而且连接抗体后可以通过外加磁场而易于分离纯化。由于其具有趋磁性，当利用其进行体内抗体治疗时，可以用外加磁场使其具有磁靶向性。国内外虽然有研究报道其可以连接膜抗体，但是仅用该膜抗体对相应的细菌进行检测。目前还未有报道用细菌磁小体连接抗体后，应用该复合抗体疫苗对肿瘤进行治疗，提高抗体治疗的靶向性和精准性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗及制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗，是由细菌纳米磁小体和抗4-1BB单克隆抗体连接复合而成，两者的质量比为0.3：1。
优选的，所述疫苗还包含连接试剂，细菌纳米磁小体、抗4-1BB单克隆抗体和连接试剂的质量比为0.3：1：1。
进一步优选的，所述连接试剂为二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)。
上述疫苗的制备方法，利用连接试剂将细菌纳米磁小体与抗4-1BB单克隆抗体连接制成复合物。
优选的，利用连接试剂BS3将细菌纳米磁小体与抗4-1BB单克隆抗体连接制成BS3-BMP-抗4-1BB复合物。
进一步优选的，具体步骤如下：
(1)将细菌纳米磁小体与连接试剂BS3混合后，超声波浴分散，旋转振动器孵育，得BS3-BMP复合物；
(2)利用磁体收集BS3-BMP复合物，PBS洗涤，然后在抗4-1BB单克隆抗体溶液中重悬，得到BS3-BMP-抗4-1BB复合物；
(3)封闭存储。
更进一步优选的，细菌纳米磁小体、连接试剂BS3、PBS、抗4-1BB单克隆抗体溶液的质量体积比为1mg：1mL：1mL：500μL，其中，连接试剂BS3的浓度为1mmol/L，PBS的浓度为10mmol/L，pH为7～8，抗4-1BB单克隆抗体溶液的浓度为1mg/mL。pH更进一步优选为7.4。
更进一步优选的，步骤(1)中，细菌纳米磁小体在使用前进行灭菌处理，具体是采用γ射线照射，照射剂量为15kGy。
更进一步优选的，步骤(1)中，超声波浴分散条件为：功率50W，时间2分钟。
更进一步优选的，步骤(1)中，旋转振动器的旋转转速为150rpm。
更进一步优选的，步骤(1)中，孵育时间为30分钟。
更进一步优选的，步骤(2)中所述磁体为NdFeB磁体。
更进一步优选的，步骤(2)中，PBS洗涤三次。
更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：重复分散、孵育、收集和洗涤步骤，然后利用无菌的体积分数0.5％的BSA(牛血清白蛋白)溶液在4℃条件下对所述复合物进行封闭和存储。
本发明的有益效果在于：
本发明利用细菌纳米磁小为载体建立一种复合肿瘤抗体疫苗，建立一种新型简便高效的抗体治疗方式，为生物治疗提供一种新的免疫方法。
本发明以细菌纳米磁小体连接基因疫苗对肿瘤模型治疗时，确定了治疗剂量范围和免疫途径，展示其较强的抗肿瘤效果。
本发明将细菌磁小体用于连接抗体，实验发现可在体内靶向杀伤小鼠的肿瘤，与单纯的抗体相比，可以明显抑制肿瘤的生长，延长小鼠的生存期。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为细菌纳米磁小体和抗体连接的示意图；
图2为电镜图，其中，a为细菌纳米磁小体的电镜图；b为细菌纳米磁小体连接抗-4-1-BB后的复合物的电镜图；
图3为复合肿瘤抗体疫苗的刺激作用，其中，A为不同剂量下的复合肿瘤抗体疫苗对T细胞的刺激作用；B为100μg的复合肿瘤抗体疫苗刺激机体产生IFN-γ；C为100μg的复合肿瘤抗体疫苗刺激机体产生TNF-α；
图4为复合肿瘤抗体疫苗的治疗作用，其中，A为复合肿瘤抗体疫苗对小鼠肿瘤的治疗作用，小鼠的肿瘤生长曲线；B为复合肿瘤抗体疫苗对小鼠肿瘤的治疗作用，小鼠的生存期；
图5为复合肿瘤抗体疫苗治疗小鼠后，小鼠肿瘤中的肿瘤浸润性T淋巴细胞；其中，左图是PBS组；右图是BMs-Ab治疗组；
图6为复合肿瘤抗体疫苗治疗小鼠后，复合肿瘤抗体疫苗产生的细胞毒作用。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
复合肿瘤抗体疫苗(BMP-抗4-1BB)的制备：
(1)对纯净的细菌纳米磁小体(制备方法：Sun JB,Zhao F，Tang T,Jiang W,TianJS,Li Y Li JL.High-yield growth and magnetosome formation by Magnetospirillumgryphiswaldense MSR-1in an oxygen-controlled fermentor supplied solely withair.2008；79(3):389-397)进行灭菌处理是采用γ射线照射进行，照射剂量为15kGy；依照Nakamura,N.等人的方法测定细菌纳米磁小体在660nm的吸光值(Nakamura,N.,Mutsunaga,T.Highly sensitive detection of allergen using bacterial magnetic particles:Biosensors.Anal Chem Acta,1993,281,585-589)并根据1OD660＝172μg细菌纳米磁小体对其进行定量。
(2)抗4-1BB单克隆抗体依照Zhou H等人的制备方法(Zhou H,Zhang GB,Dong QM,Yu GH,Xu Y,Zhang XG.Preparation of anti-human 4-1BB monoclonal antibody andcharacterization of its biological activities，Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue ZaZhi.2011；27(9):993-6.)，抗4-1BB单克隆抗体进行紫外分光光度法A280测定定量。
(3)1mg的BMP和1mL的1mM连接试剂BS3混合后，放入超声波浴(50W)2分钟，在旋转振动器(150g)孵育30分钟。NdFeB磁体将BS3-BMP复合物从溶液中分离，用1mLof 10mM PBS(pH 7.4)洗三遍，在500μl的1mg/mL抗体溶液中重悬。重复上述的分散，孵育，收集和洗涤的步骤三遍后，制成BS3-BMP-抗4-1BB复合物。该复合物就是本发明的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗。图1是细菌磁小体和抗体连接的示意图。图2中a是细菌磁小体的电镜图，b是细菌磁小体连接抗体后的复合肿瘤抗体疫苗的电镜图，两图比较表明，复合肿瘤抗体疫苗的大小和分散度均较细菌磁小体无改变。
实施例2
复合肿瘤抗体疫苗刺激T细胞的最佳剂量的选取
(1)复合肿瘤抗体疫苗的制备：(具体操作方法参见实施例1的相应部分)
(2)小鼠的新鲜脾细胞取自C57BL/6小鼠。用Tris溶液(北京中杉金桥生物公司)去除红细胞后，脾细胞溶液通过尼龙筛网，制成单个脾细胞溶液。分别将25μg，50μg，100μg和200μg的复合肿瘤抗体疫苗作为刺激物，而将浓度为2×105/ml的脾细胞作为反应性T细胞。将反应性T细胞和刺激物加入96孔的孵育板的每一孔后，再用600mT磁铁放在每一孔下作用10分钟。然后将加入混合物的96孔板放置在含有5％CO2的37℃孵箱。72小时后用CCK8试剂进行检测，酶标仪读取每孔492nm的OD值，计算出T细胞的增长率。图3中A表明100μg的复合肿瘤抗体疫苗刺激T细胞的效果最佳，因此后续实验均采用100μg复合肿瘤抗体疫苗进行实验。
实施例3
复合肿瘤抗体疫苗刺激CD8+T细胞的作用
(1)分离纯化小鼠的CD8+T细胞
采用CD8+T细胞MACS分离纯化试剂盒(Miltenyi,Biotec)从C57BL/6小鼠的脾脏分离CD8+T细胞。将生物素标记的单克隆抗体混合物结合非CD8+T细胞，再用间接标记磁珠法去除非CD8+T细胞，剩余的CD8+T细胞的纯度用CD8-PE抗体在流式细胞仪检测。
(2)细胞因子的检测
将上述步骤分离出的CD8+T细胞加入96孔板中，每孔加入1×105CD8+T细胞，之后加入100μg的复合肿瘤抗体疫苗，再用600mT磁铁在每孔下作用10分钟，在二氧化碳孵箱里共培养48小时后，收集上清液，用ELISA试剂盒(欣博盛公司，深圳)测定IFN-γ和TNF-α的浓度。图3中B表明100μg的磁小体-抗体能有效刺激CD8+T产生IFN-γ。图3中C表明100μg的磁小体-抗体能有效刺激CD8+T产生TNF-α。
实施例4
复合肿瘤抗体疫苗在体内免疫的治疗效果
(1)复合肿瘤抗体疫苗的制备：(具体操作方法参见实施例1的相应部分)
(2)复合肿瘤抗体疫苗治疗小鼠皮下肿瘤模型的最佳剂量选取：领取40只6周大小的C57雌性小鼠(购自购自中国医学科学院实验动物研究所。饲养于本所动物室)，第0天皮下注射TC-1 5×104，待肿瘤生长至5×5mm，随机分为4组，每组10只。给小鼠进行注射之前，复合肿瘤抗体疫苗需要用超声波轻微击打(所用超声波功率是45W)使该复合物更好的分散。第4天，第8天，第12天皮下注射不同剂量100μg的复合肿瘤抗体疫苗，100μg BMP，0.1mL磷酸盐缓冲体系(PBS，配方组成：1000ml蒸馏水，NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.87g，KH2PO4 0.2g)，100μg抗4-1BB抗体。并在注射部位固定磁场(磁场强度600mT)作用10min,观察小鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤的大小，记录小鼠的生存期。图4显示复合肿瘤抗体疫苗治疗组相比其他对照组，肿瘤生长明显减慢，生存期明显延长。
实施例5
复合肿瘤抗体疫苗的制备以及诱发的机体免疫效应
(1)复合肿瘤抗体疫苗的制备：(具体操作方法参见实施例1的相应部分)
(2)建立小鼠皮下肿瘤的治疗模型(具体操作方法参见实施例4的相应部分)
(3)在第三次免疫后的第三天，切除肿瘤。将PBS组和复合肿瘤抗体疫苗治疗组的肿瘤进行HE染色，图5显示，复合肿瘤抗体疫苗治疗组与PBS组比较，小鼠肿瘤组织中有大量的肿瘤浸润性T细胞产生。而肿瘤浸润性淋巴细胞的多少与预后成正相关。
(4)乳酸脱氢酶法(LDH法)测小鼠脾细胞中细胞毒性淋巴细胞(CTL)活性：处死PBS组和复合肿瘤抗体疫苗治疗组小鼠，无菌条件下打开腹腔，取出脾，将脾浸入生理盐水，在80目钢网上轻轻研磨，收集脾细胞。1500r/min离心4～5min，弃上清。加入红细胞裂解液(Tris-NH4Cl，0.16M的NH4Cl和0.17M的Tris放入1000ml去离子水中混合，pH 7.2)，作用1～2min，迅速加入生理盐水，洗两遍。台盼蓝计数，用含5％胎牛血清的1640培养基稀释作为效应细胞，待用。采用CytoTox
Figure BDA0001772583200000051
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promage USA)试剂盒，以TC-1细胞为靶细胞，将TC-1细胞以每孔1万个的浓度加入96孔板中，待细胞贴壁后，将脾细胞按15:1,30:1,60:1的比例加入到上述96孔板中。酶标仪测490nm处的吸光值，计算杀伤率。图6显示当效靶比为15:1,30:1,60:1时，复合肿瘤抗体疫苗治疗组的脾细胞对TC-1细胞的杀伤率分别是(27.36±4.61)％，(57.21±4.16)％，(72.83±7.94)％，说明治疗组中产生了特异性杀伤的细胞毒性淋巴细胞。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗，其特征在于，是由细菌纳米磁小体、抗4-1BB单克隆抗体和连接试剂BS3复合而成；所述肿瘤抗体疫苗中细菌纳米磁小体、抗4-1BB单克隆抗体和连接试剂BS3的质量比为0.3:1:1。
2.权利要求1所述的以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤抗体疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将细菌纳米磁小体与连接试剂BS3混合后，超声波浴分散，旋转振动器孵育，得BS3-BMP复合物；
(2)利用磁体收集BS3-BMP复合物，PBS洗涤，然后在抗4-1BB单克隆抗体溶液中重悬，得到BS3-BMP-抗4-1BB复合物；
(3)封闭存储。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，细菌纳米磁小体、连接试剂BS3、PBS、抗4-1BB单克隆抗体溶液的质量体积比为1mg:1mL:1mL:500μL，其中，连接试剂BS3的浓度为1mmol/L，PBS的浓度为10mmol/L，pH为7～8，抗4-1BB单克隆抗体溶液的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，细菌纳米磁小体在使用前进行灭菌处理，具体是采用γ射线照射，照射剂量为15kGy。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，超声波浴分散条件为：功率50W，时间2分钟。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，孵育时间为30分钟。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：重复分散、孵育、收集和洗涤步骤，然后利用无菌的体积分数0.5％的BSA溶液在4℃条件下对所述复合物进行封闭和存储。
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