CN101077418A - 一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体，它由同型双功能试剂、带伯胺基药物和细菌纳米磁小体三个结构单元组成。本发明还提供了这种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体的制备方法。本发明所述的载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体，载药量高，不易聚集，易于分离纯化，且具有与纯的带伯胺基药物相似的抗癌、抗肿瘤效果，而其毒性要远低于纯的带伯胺基药物。

Description

一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体及其制备方法

技术领域

本发明涉及细菌纳米磁小体领域，具体地涉及一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体及其制备方法。

背景技术

纳米药物载体是指用于装载(吸附、连接或包埋)药物的纳米颗粒，其直径一般小于100nm。纳米药物载体的粒径小，能增加药物对生物膜的透过性，有利于药物透皮吸收和在细胞内发挥药效。纳米药物载体比表面积大，能增大药物与机体的接触面积，提高药物的利用度。

磁性纳米药物载体能在外加磁场的作用下，引导至靶位点，实现靶向给药。靶向给药可极大的简化给药方式和途径，减少药物在到达靶部位之前与生物体的接触，并减少药物对正常组织的毒副作用，提高靶区的药物浓度，进而减低用药量。此外，纳米药物载体因构建材料种类和配比不同而具有不同的缓释性，可使药物在特定时间内、在特定位点自动按某一速度从药剂中释放出来发挥作用，使得药物浓度能够较长时间的维持在有效浓度水平。

纳米药物载体虽然具有很好的应用前景，并已经成为医药领域研究的热点，但至今仍然存在很多问题有待解决。用普通的制备技术获得的纳米材料中，纳米尺寸的部分所占比例小，颗粒粒度分布范围宽，既影响药物装载量，又难于控制材料的降解速率。无机非金属纳米颗粒表面电荷密度偏低，用其作为药物载体材料难以获得满意的药物装载量，而且在制备时普遍存在团聚现象，导致其比表面减少，使得药物装载量不高。靶向物质与纳米载体结合时存在结合率低、毒性高等问题。纳米载体及其偶联的药物还普遍存在着被网状内皮系统非选择性清除的问题。由于多数药物为疏水性，它们与纳米颗粒载体偶联时可能会产生沉淀。此外，多数载药纳米颗粒的稳定性不好，尤其是在体内，很容易受到各种环境因素如水、pH、温度、离子强度和各种生物分子的影响而发生降解，使药物与载体分离，失去了原有的可控缓释性和靶向作用。

细菌磁小体是趋磁细菌细胞内合成的天然纳米磁性颗粒，具有晶形稳定、颗粒均匀的特点，每个磁颗粒都有脂膜包被，不易聚集。目前对磁小体膜的组分分析证明，磁小体膜的主要成分是磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，因而带有大量裸露的伯胺基，膜上游离的伯基团可以直接用于连接抗体或药物。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体，本发明的另一目的是提供这种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体的制备方法。

(二)技术方案

在本发明的意义上，下述术语的定义为：

1、带伯胺基药物是指带有伯胺基基团，且伯胺基不是其发挥药效的活性位点的药物；

2、同型双功能试剂是指两端都能与伯胺基发生反应的试剂；

3、吸附磁小体是指用磁铁将磁小体吸附于容器(如锥形瓶、试管)的底部或侧壁的操作；

4、载带伯胺基药物的磁小体是指磁小体膜上已偶联带伯胺基药物的磁小体。

在本发明中，所述的载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体是由同型双功能试剂、带伯胺基药物和细菌纳米磁小体三个结构单元组成，其中同型双功能试剂的一端与带伯胺基药物的伯胺基连接，另一端与细菌纳米磁小体外膜上的伯胺基连接，所述的带伯胺基药物选自阿霉素、道诺霉素、表柔比星、柔红霉素、依达比星或吡柔比星，同型双功能试剂选自戊二醛、丁二醛、N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、3，3′-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯或二甲基己二酰亚胺。

优选地，带伯胺基药物为阿霉素，同型双功能试剂为戊二醛。

本发明所述的载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体的制备方法，它包括如下步骤：

(1)将细菌纳米磁小体悬浮于蒸馏水中，用⁶⁰Co照射灭菌，然后用磁铁吸附磁小体，用无菌PBS溶液反复洗涤所吸附的磁小体，再用无菌PBS溶液悬浮磁小体；

(2)向步骤(1)所得磁小体悬液中加入经过滤除菌的带伯胺基药物，进行超声波处理，然后加入同型双功能试剂，混匀，并对混合溶液进行超声波处理，静置、分层后吸附载药磁小体，除去上清液，用无菌PBS溶液重新悬浮所得沉淀，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；然后用无菌PBS溶液重新悬浮沉淀，并向所得悬浮液中第二次加入带伯胺基药物，然后对得到的混合溶液进行超声波处理，静置、分层、吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；

(3)用无菌PBS溶液重新悬浮步骤(2)所得的载药磁小体，置于4℃保存或经冷冻干燥后置于-70℃保存。

本发明所述的载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体的制备方法，在步骤(1)和步骤(3)不变的前提下，步骤(2)可采用如下操作：向步骤(1)所得磁小体悬液中加入经过滤除菌的同型双功能试剂，进行超声波处理，静置、分层后吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；然后用无菌PBS溶液重新悬浮沉淀，向所得悬液中加入经过滤除菌的带伯胺基药物，然后对所述混合溶液进行超声波处理，静置、分层、吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色。

在本发明所述的制备方法中，步骤(3)在重新悬浮所得载药磁小体前，可对载药磁小体用⁶⁰Co照射灭菌，然后再行保藏。

在本发明所述的制备方法中，所有涉及⁶⁰Co照射灭菌的操作，其照射剂量均为1-15kGy。

在本发明所述的制备方法中，所述的细菌纳米磁小体、带伯胺基药物、同型双功能试剂反应体系中三者之间的比例按重量份计为：细菌纳米磁小体∶带伯胺基药物∶同型双功能试剂＝1-100∶1-100∶1-200。

在本发明所述的制备方法中，当步骤(2)采取分两次加入带伯胺基药物的操作时，同型双功能试剂与第二次加入的带伯胺基药物的比例按重量份计为：同型双功能试剂∶带伯氨基药物＝1-10∶1-10。根据同型双功能试剂与第二次加入的带伯胺基药物之间的比例，以及同型双功能试剂与加入的带伯胺基药物的总量之间的比例，可以计算出第一次加入的带伯胺基药物的量。

在本发明所述的制备方法中，所述的超声波处理的具体操作为：超声1-100次，每次超声1-20分钟，每两次超声之间间歇1-60分钟。本发明所述的超声波处理均采用超声波清洗仪(型号为SB-3200D，生产厂家为宁波新芝生物科技股份有限公司)完成，超声波处理的目的是为了促进磁小体/药物的分散，加快反应速度。

下面以带伯胺基药物选用阿霉素为例，阐述采用本发明所述载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体的检测方法：

方法一：配制系列浓度的盐酸阿霉素水溶液(y，μg/ml)[配制方法为：称取9mg盐酸阿霉素于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，以之为母液用蒸馏水稀释成系列阿霉素浓度，例如3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml、15μg/ml、18μg/ml、24μg/ml、30μg/ml、42μg/ml]，置于479nm(所用仪器为紫外-可见-近红外光谱仪，型号为UV-3100，厂家为SHIMADZU)测定各自的吸光值(x)，以吸光值为横坐标，阿霉素浓度为纵坐标绘制曲线，得出阿霉素标准曲线方程为y＝42.1x。再将制备的载阿霉素磁小体用20ml PBS溶液重新悬浮后，取0.2ml加入到3.5ml 50％乙醇中，补加浓盐酸(36-38％)至5ml，振荡混匀后超声分散5分钟，静置1小时后用磁铁吸附磁小体，取上清稀释3倍，同样置于479nm测定吸光值。根据阿霉素标准曲线方程和测得的上清液吸光值，计算出1mg磁小体载阿霉素的量。

方法二：利用纯阿霉素不溶于氯仿的原理，将制备的载阿霉素磁小体用PBS溶液重新悬浮，取上清液，加入氯仿，振荡混匀后静置、分层，如果上清无色、下层呈阿霉素颜色，则可判断阿霉素已与磁小体膜偶联。

(三)有益效果

本发明所述的载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体，载药量高，不易聚集，易于分离纯化，且具有与纯的带伯胺基药物相似的抗癌、抗肿瘤效果，而其毒性要远低于纯的带伯胺基药物。

附图说明

图1是阿霉素标准曲线图；

图2是EMT-6细胞吸收利用阿霉素的荧光显微观察结果图，其中，A、B、C分别为EMT-6细胞在盐酸阿霉素处理30min、60min和120min后的荧光显微照片，D、E、F分别为EMT-6细胞在载阿霉素磁小体处理30min、60min和120min后的荧光显微照片；

图3是实施例13中三种癌细胞给药处理后的增殖曲线，其中，(△)表示对照组，(▲)表示阿霉素组，(■)表示纯磁小体组，(□)表示载阿霉素磁小体组；

图4是实施例14中各处理组动物肿瘤重量示意图；

图5是实施例14中大体标本检查结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  载阿霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将1mg纯净的细菌纳米磁小体悬浮于10ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为1-3kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，除去上清液；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用1ml无菌PBS溶液悬浮，加入100ml经过滤除菌的1mg/ml阿霉素(购自深圳市君宁科技有限公司)溶液，超声分散1分钟，再加入0.2μl 50％戊二醛(购自Sigma公司)溶液，混匀，对混合溶液超声2次(每次超声20分钟，中间间歇1分钟，本实施例中的超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入0.2μl0.5mg/ml的阿霉素水溶液，超声处理，静置，分层，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至所得上清液无色；

(3)用无菌PBS重新悬浮得到的载阿霉素磁小体，置于4℃保存。

实施例2  载阿霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将100mg纯净的细菌磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤5次，然后用100ml无菌PBS溶液悬浮，加入1ml经过滤除菌的1mg/ml阿霉素溶液，超声分散20分钟，再加入80μl 50％戊二醛溶液，混匀，对混合溶液超声100次(每次超声1分钟，每两次之间间歇60分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入500ml 0.5mg/ml的阿霉素溶液，超声处理，静置，分层，然后吸附磁小体，所得沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清无色；

(3)对沉淀采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，再用无菌PBS重新悬浮得到的载阿霉素磁小体，真空干燥，冷冻(采用液氮处理)，置于-70℃保存。

实施例3  载阿霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml阿霉素溶液，超声分散5分钟，再加入1ml 50％戊二醛溶液，混匀，对混合溶液超声14次(每次超声1分钟，每两次之间间歇4分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的阿霉素溶液，超声14次，静置，分层，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清无色；

(3)再用无菌PBS重新悬浮得到的载阿霉素磁小体，置于4℃保存。

实施例4  载阿霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入1ml 50％戊二醛溶液，混匀，对混合溶液超声50次(每次超声10分钟，每两次之间间歇30分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml阿霉素溶液，超声处理，静置，分层，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清无色；

(3)再用无菌PBS重新悬浮得到的载阿霉素磁小体，真空干燥，冷冻(采用液氮处理)，置于-70℃保存。

实施例5  载阿霉素磁小体的检测

配制系列浓度(3μg/ml，6μg/ml，9μg/ml，12μg/ml，15μg/ml，18μg/ml，24μg/ml，30μg/ml，42μg/ml)的盐酸阿霉素溶液(y，μg/ml)(配制方法为：称取9mg盐酸阿霉素于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，以之为母液用稀释成上述系列阿霉素浓度)，于479nm(所用仪器为紫外-可见-近红外光谱仪，型号为UV-3100，厂家为SHIMADZU)测定各自的吸光值(x)(对应的分别为0.0694，0.1295，0.2248，0.2953，0.3529，0.4225，0.5602，0.7115，1.0019)，以吸光值为横坐标，阿霉素浓度为纵坐标绘制曲线(见附图1)，得出阿霉素标准曲线方程为y＝42.1x。

将实施例3制备的载阿霉素磁小体用20ml PBS溶液重新悬浮后，取0.2ml加入到3.5ml 50％乙醇中，补加浓盐酸(36-38％)至5ml，振荡混匀后超声分散5分钟，静置1小时后用磁铁吸附磁小体，取上清稀释3倍，置于479nm测定吸光值为0.2757。根据阿霉素标准曲线方程和测得的上清液吸光值，计算出1mg磁小体载阿霉素的量为0.87mg。

实施例6  载道诺霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的细菌纳米磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为15-20kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml道诺霉素溶液，超声分散10分钟，再加入1ml 50％丁二醛溶液，混匀，对混合溶液超声10次(每次超声3分钟，每两次之间间歇10分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的道诺霉素溶液，超声处理，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清液无色；

(3)对沉淀采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，最后用无菌PBS重新悬浮得到的载道诺霉素磁小体，置于4℃保存。

实施例7  载表柔比星的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为15-20kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤4次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml表柔吡星溶液，超声分散18分钟，再加入5ml 10％N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶液，混匀，对混合溶液超声90次(每次超声6分钟，每两次之间间歇50分钟，本实施例中处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的表柔吡星溶液，超声处理，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清无色；

(3)再用无菌PBS重新悬浮得到的载表柔比星磁小体，真空干燥，冷冻(采用液氮处理)，置于-70℃保存。

实施例8  载柔红霉素的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的细菌纳米磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清液；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤9次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml柔红霉素溶液，超声分散3分钟，再加入5ml 10％3，3′-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯溶液，混匀，对混合溶液超声60次(每次超声16分钟，每两次之间间歇30分钟，以下超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的柔红霉素溶液，超声处理，静置，分层，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清液无色；

(3)再用无菌PBS重新悬浮得到的载柔红霉素磁小体，置于4℃保存。

实施例9  载吡柔比星的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的细菌纳米磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，去上清；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml吡柔比星溶液，超声分散5分钟，再加入5ml 10％二甲基己二酰亚胺溶液，混匀，对混合溶液超声15次(每次超声1分钟，每两次之间间歇4分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的吡柔比星溶液，超声处理，静置，分层，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清液无色；

(3)最后用无菌PBS重新悬浮得到的载吡柔比星磁小体，置于4℃保存。

实施例10  载依达比星的细菌纳米磁小体的制备

(1)将20mg纯净的细菌磁小体悬浮于100ml蒸馏水中，采用⁶⁰Co照射灭菌(照射剂量为10-15kGy)，然后用磁铁吸附磁小体，除去上清液；

(2)将吸附的磁小体用无菌PBS溶液洗涤3次，然后用70ml无菌PBS溶液悬浮，加入30ml经过滤除菌的1mg/ml依达比星溶液，超声分散6分钟，再加入5ml 10％丁二醛溶液，混匀，对混合溶液超声20次(每次超声3分钟，每两次之间间歇15分钟，本实施例中超声处理参数均相同)后静置，待悬液分层后吸附磁小体，除去上清液，沉淀用无菌PBS溶液重新悬浮，超声打散后吸附磁小体，除去上清液；重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；将所得沉淀用30ml无菌PBS溶液悬浮，加入10ml 0.5mg/ml的依达比星溶液，超声处理，然后吸附磁小体，沉淀用PBS溶液反复洗涤直至上清液无色；

(3)最后用无菌PBS重新悬浮得到的载依达比星磁小体，置于4℃保存。

实施例11  细胞吸收载阿霉素磁小体的实验

小鼠乳腺癌细胞EMT-6(购自中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室)加入待测试物[分对照、纯磁小体、阿霉素、载阿霉素磁小体四组，其中载阿霉素磁小体组(BGA)所含阿霉素的量与纯阿霉素组(ADM)的相同，纯磁小体组(BMP)磁小体的量与载阿霉素磁小体组所含磁小体的量相同，两者浓度都以阿霉素的浓度表示，均为4μg/ml]30min、60min、120min后，用D-Hank’s液洗涤(D-Hank’s的成分为：KH₂PO₄ 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO₃0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na₂HPO₄·H₂O 0.06g，加H₂O至1000ml)3遍后，置于荧光显微镜(Nikon ECLIPSE TE2000-U)下观察。

观察结果(见附图2)表明：细胞能迅速吸收利用阿霉素，在给药30min(附图2A)、60min(附图2B)和120min(附图2C)的三组细胞内阿霉素的量几乎没有差别。同时，细胞对载阿霉素磁小体的吸收利用需要一定的时间，随着给药时间的延长，其细胞内吸收的载阿霉素磁小体的量就越多，见附图2D(给药30min)、附图2E(给药60min)、附图2F(给药120min)。

实施例12  载阿霉素磁小体对癌细胞抑制效果实验

采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法测定载阿霉素磁小体对小鼠肝癌细胞H22、人急性白血病细胞HL60和小鼠乳腺癌细胞EMT-6(三种细胞均购自中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室)的抑制活性，具体操作如下：

取对数生长期的上述三种癌细胞接种于96孔板中(每孔1*10⁴细胞，96孔板购自Corning Incorporated公司)，培养24h后加入待测试物，分对照、纯磁小体、阿霉素、载阿霉素磁小体四组，其中载阿霉素磁小体组(BGA)所含阿霉素的量与纯阿霉素组(ADM)的相同，纯磁小体组(BMP)磁小体的量与载阿霉素磁小体组所含磁小体的量相同，两者浓度都以阿霉素的浓度表示，所有实验与此相同。孵育24小时后加入MTT溶液(MTT购自Sigma，用PBS配制)，避光孵育4小时后离心(4000rpm，8min，ROTANTA 460台式离心机)，吸去上清，加入150μl DMSO(二甲基亚砜，购自北京化学试剂有限公司)，振荡5分钟(Vortex-Genie振荡器)，用酶标仪(Bio-Rad AutomatedEIA Analyzer，型号REIA 0000)于570nm测定吸光值。根据下述公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％)＝(对照的吸光值-处理的吸光值)/对照的吸光值×100％。

对三种不同癌细胞的MTT细胞毒性实验结果表明：对H22细胞和EMT-6细胞而言，载阿霉素磁小体(BGA)具有与纯阿霉素(ADM)相似的抗癌活性(两者之间差异不显著)，对HL60细胞则纯阿霉素具有更大的毒性；纯磁小体(BMP)对EMT-6细胞没有毒性，对HL60细胞和H22细胞都有一定的毒性，但都远低于阿霉素和载阿霉素磁小体。从所测的阿霉素的IC₅₀(IC₅₀表示细胞抑制率为50％时的药物浓度)，阿霉素对急性白血病的效果最佳，这是与已知的阿霉素抗癌活性一致的。

               表1.受试物对癌细胞的半数抑制浓度

药物	IC50(μg/ml)
				H22	HL60	EMT-6
	ADMBMPBGA	5.87±2.11a23.74±11.18b5.47±1.32	0.36±0.11ac4.90±1.82b0.05±0.01				4.04±3.35anullb2.45±0.83

注：表1中a表示ADM与BGA之间无显著差异(α＝0.05)；b表示BMP与ADM之间，以及BMP与BGA之间存在显著差异；c表示ADM与BGA之间存在显著差异。

实施例13  载阿霉素磁小体对癌细胞增殖的抑制实验

接种小鼠肝癌细胞H22、人急性白血病细胞HL60(均购自中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室)于24孔板中(购自Corning Incorporated公司，接种量为2×10⁵cells/ml，1ml/well)，每孔给药8μg[分对照、纯磁小体、阿霉素、载阿霉素磁小体四组，其中载阿霉素磁小体组(BGA)所含阿霉素的量与纯阿霉素组(ADM)的相同，纯磁小体组(BMP)磁小体的量与载阿霉素磁小体组所含磁小体的量相同，两者浓度都以阿霉素的浓度表示]，每个处理设4个重复，给药前进行细胞计数，给药后每隔24h计数一次。

接种EMT-6细胞(购自中国医学科学院肿瘤医院中心实验室，接种量1×10⁴cells/ml)于24孔板中(1ml/well)，接种12小时后给药，每孔给药8μg(分对照、纯磁小体、阿霉素、载阿霉素磁小体四组，其中载阿霉素磁小体组(BGA)所含阿霉素的量与纯阿霉素组(ADM)的相同，纯磁小体组(BMP)磁小体的量与载阿霉素磁小体组所含磁小体的量相同，两者浓度都以阿霉素的浓度表示)，每个处理设20个重复孔，给药前取4孔采用MTT试验方法(同实施例12)测定细胞生长情况，给药后每隔24h测定一次，每次测定4个重复孔。

实验结果显示上述三种癌细胞给药处理后，其细胞增长情况都相似：BMP处理组与对照组相似，细胞增长迅速；BGA处理组与ADM组相似，细胞数在给药后24小时内略有增加，随后迅速下降直至几乎全部死亡(见附图3)。这表明载阿霉素磁小体具有和纯阿霉素相似的抗癌效果。

实施例14  载阿霉素磁小体的体内实验

本实验中用到的清洁级BABL/C小鼠(许可证编号“scxk京2004 0001”)购于中国医学科学院实验动物研究所繁育场。

取0.5ml 1*10⁶ H22肝癌细胞(同实施例12)，接种于BABL/C小鼠腹腔，一周后抽取小鼠腹水，离心洗涤收集到H22细胞，接种0.1ml(1*10⁷个/ml)H22细胞于BABL/C小鼠背部皮下，共接种54只。接种10日后，从中挑选出40只，均匀分布至4组，在肿瘤附近皮下注射给药[分对照、纯磁小体、阿霉素、载阿霉素磁小体四组，其中载阿霉素磁小体组(BGA)所含阿霉素的量与纯阿霉素组(ADM)的相同，纯磁小体组(BMP)磁小体的量与载阿霉素磁小体组所含磁小体的量相同，两者浓度都以阿霉素的浓度表示]，给药量为10mg/kg。接种第14天和第18天再分别给药一次，34天后处死所有动物，剥离肿瘤并称重。

实验结果：

1.阿霉素组动物在给药后体重急剧下降并陆续死去，最终只有2只存活，这是阿霉素毒性太大所致，载阿霉素磁小体组动物体重略有下降，存活8只，这表明载阿霉素细菌纳米磁小体毒性要远低于阿霉素；

2.对照组(注射PBS缓冲液)和BMP组动物均无死亡，其体重均稳定增长，最终处死时各组动物的肿瘤平均重量见附图4，结果表明载阿霉素细菌纳米磁小体具有和阿霉素相似的抗肿瘤效果，纯磁小体则与对照组相似，无抗肿瘤作用。

3.大体标本检查结果(见附图5)也表明BMP组与对照组肿瘤生长良好，血管丰富，而ADM组和BGA组的肿瘤明显萎缩，未见丰富血管。

Claims (8)

1、一种载带伯胺基药物的细菌纳米磁小体，其特征在于它由同型双功能试剂、带伯胺基药物和细菌纳米磁小体三个结构单元组成，其中同型双功能试剂的一端与带伯胺基药物的伯胺基连接，另一端与细菌纳米磁小体外膜上的伯胺基连接，所述的带伯胺基药物选自阿霉素、道诺霉素、表柔比星、柔红霉素、依达比星或吡柔比星，同型双功能试剂选自戊二醛、丁二醛、N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、3，3′-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯或二甲基己二酰亚胺。

2、根据权利要求1所述的载伯胺基药物的细菌纳米磁小体的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)将细菌纳米磁小体悬浮于蒸馏水中，用⁶⁰Co照射灭菌，然后用磁铁吸附磁小体，用无菌PBS溶液反复洗涤所吸附的磁小体，再用无菌PBS溶液悬浮磁小体；

(2)向步骤(1)所得磁小体悬液中加入经过滤除菌的带伯胺基药物，进行超声波处理，然后加入同型双功能试剂，混匀，并对混合溶液进行超声波处理，静置、分层后吸附载药磁小体，除去上清液，用无菌PBS溶液重新悬浮所得沉淀，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；然后用无菌PBS溶液重新悬浮沉淀，并向所得悬浮液中第二次加入带伯胺基药物，然后对得到的混合溶液进行超声波处理，静置、分层、吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；

(3)用无菌PBS溶液重新悬浮步骤(2)所得的载药磁小体，置于4℃保存或经冷冻干燥后置于-70℃保存。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)的操作是：向步骤(1)所得磁小体悬液中加入经过滤除菌的同型双功能试剂，进行超声波处理，静置、分层后吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色；然后用无菌PBS溶液重新悬浮沉淀，向所得悬液中加入经过滤除菌的带伯胺基药物，然后对所述混合溶液进行超声波处理，静置、分层、吸附磁小体，除去上清液，重复上述超声分散、静置、分层、吸附、除去上清液和悬浮操作多次，直至所得上清液无色。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤(3)中在重新悬浮所得载药磁小体前，对载药磁小体用⁶⁰Co照射灭菌。

5、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于用⁶⁰Co照射灭菌的照射剂量为1-15kGy。

6、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的细菌纳米磁小体、带伯胺基药物、同型双功能试剂反应体系中三者之间的比例按重量份计为：细菌纳米磁小体∶带伯胺基药物∶同型双功能试剂＝1-100∶1-100∶1-200。

7、根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述同型双功能试剂与第二次加入的带伯胺基药物的比例按重量份计为：同型双功能试剂∶带伯氨基药物＝1-10∶1-10。

8、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的超声波处理操作是：超声1-100次，每次超声1-20分钟，每两次超声之间间歇1-60分钟。

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