CN107625968B

CN107625968B - 一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107625968B
Application number: CN201710853408.7A
Authority: CN
Inventors: 徐翔晖; 顾忠伟; 张晓�; 李亚超; 胡成; 吴花雨
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN107625968A

Abstract

本发明公开了一种肿瘤特异性组织‑细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用，结构单元通过超分子组装形成；结构单元包括以氨基酸为重复单元构成的肽类树状大分子；肽类树状大分子外围的氨基酸支化单元连接端基功能化基团；端基功能化基团通过动态化学键连接在肿瘤微环境可激活的掩蔽层；肽类树状大分子的核心分子通过动态化学键连接疏水化疗药物；本发明利用肽类树状大分子超支化结构和放大效应，通过分子设计和超分子组装，构建的纳米粒可解决药物难以进入肿瘤深处及难以跨越细胞屏障的问题。

Description

一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药剂学领域，具体涉及一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用。

背景技术

化疗已经成为恶性肿瘤的主要治疗方式之一；然而，许多化疗药物治疗效果不佳，并容易产生耐药性；其中一方面是由于致密的肿瘤外基质及较高的间质压大大阻碍了药物进入肿瘤组织深处；研究表明，仅有约0.7％的药物能够到达肿瘤组织；另外胰腺癌、卵巢癌等肿瘤由于血管密度低、血管直径小以及内皮细胞紧密排列等因素，导致这些肿瘤更难以渗透，增加了治疗难度；针对组织难渗透的问题，科学家们采用光热、电穿孔、超声作用以及外加磁场作用促进客体分子渗透；但以上方法存在导入率低、对细胞刺激大等问题；另外科学家也通过巧妙设计，使粒子通过EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)被动靶向到肿瘤组织附近，在肿瘤微环境作用下，纳米粒子粒径变小，有助于其渗透到肿瘤组织深处；该方法使用受限，并不能应用于其他分子或载体；肿瘤渗透肽是促进客体分子渗透组织的另一种方法；肿瘤渗透肽主要为包含R/KXXR/K序列的短肽，如iRGD、LyP-1和NGR等；可通过与细胞膜表面受体结合促进药物等到达肿瘤组织内部；另一方面，当药物进入肿瘤组织后，同样需要跨过细胞屏障才能进入细胞内部发挥药效；针对细胞难渗透的问题，科学研究表明，TAT、多聚精氨酸、Pep-1、transportan等穿膜肽可成功将蛋白、多肽、疏水药物、核酸等生物活性分子运输到细胞中；然而，现有的细胞穿膜肽多为线型结构、与细胞膜作用力较弱，并不具有肿瘤渗透功能；目前还没有一种能够同时实现肿瘤组织渗透和细胞渗透的分子。

发明内容

本发明公开了一种可携带药物跨越细胞屏障进入肿瘤深处的一种肿瘤特异性-细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用。

本发明采用的技术方案是：一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒，结构单元通过超分子组装形成；结构单元包括以氨基酸为重复单元构成的肽类树状大分子；肽类树状大分子外围的氨基酸支化单元连接端基功能化基团；端基功能化基团通过动态化学键连接在肿瘤微环境可激活的掩蔽层；肽类树状大分子的核心分子通过动态化学键连接疏水化疗药物。

进一步的，所述肽类树状大分子为扇形，为一代、二代或三代肽类树状大分子。

进一步的，所述端基功能化基团为端基功能化的氨基酸。

进一步的，所述结构单元其结构式如下：

式中：Rm为扇形分子的核心分子，m为核心分子的官能度，m取1或2；K为氨基酸支化单元，G1.0和G2.0分别代表一代和二代肽类树状大分子；R为端基功能化基团；D为疏水化疗药物；N为掩蔽层。

进一步的，所述的端基功能化的氨基酸为精氨酸。

进一步的，所述掩蔽层为：

中的一种。

进一步的，所述疏水化疗药物为阿霉素、顺铂、紫杉醇、喜树碱、吉西他滨中的一种。

进一步的，所述动态化学键为：

中的一种。

一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：合成外围端基功能化基团修饰的肽类树状大分子；

步骤2：通过化学键修饰将疏水化疗药物修饰到肽类树状大分子上；

步骤3：在肽类树状大分子外围修饰肿瘤微环境可激活的掩蔽层；

步骤4：通过超分子自组装形成肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒。

一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在制备化疗药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境及生理环境中具有稳定的纳米结构。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境中可破坏细胞膜。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒具有肿瘤区域选择性。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境中具有细胞渗透作用，可从内皮细胞渗透到肿瘤细胞，也可在肿瘤细胞间渗透；可从内皮细胞渗透到肿瘤细胞，也可在肿瘤细胞间渗透。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境中具有肿瘤组织渗透作用，可进入肿瘤细胞球深处。

进一步的，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒可使其携带的疏水化疗药物在肿瘤组织附近富集。

本发明的有益效果是：

(1)本发明利用肽类树状大分子超支化结构和放大效应，通过分子设计和超分子组装，构建的纳米粒可解决药物难以进入肿瘤深处及难以跨越细胞屏障的问题；

(3)本发明在肽类树状大分子外围修饰肿瘤微环境可激活的掩蔽层，在生理条件下阻止纳米粒与细胞膜作用，减少对正常组织的毒副作用，增强对肿瘤区域的选择性；

(3)本发明制备方法简单，实用性强。

附图说明

图1为本发明中制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒的工作原理示意图。

图2为本发明中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒的合成路线图。

图3为本发明实施例1中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒的圆二色谱图。

图4为本发明实施例2中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒的透射电镜图。

图5为本发明实施例3中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒的粒径电位变化示意图。

图6为本发明实施例4中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒的两相荧光变化示意图。

图7为本发明实施例5中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒与红细胞作用后的扫描电镜图。

图8为本发明实施例6中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒与细胞作用后的扫描电镜图。

图9为本发明实施例7中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒细胞摄取量示意图。

图10为本发明实施例8中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒活细胞工作站所拍照片。

图11为本发明实施例9中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒通过transwell小室后的激光共聚焦图。

图12为本发明实施例10中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒对3D肿瘤细胞球的激光共聚焦图。

图13为本发明实施例11中肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒作用于肿瘤组织后冰冻切片的激光共聚焦图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒，结构单元通过超分子组装形成；结构单元包括以氨基酸为重复单元构成的肽类树状大分子；肽类树状大分子外围的氨基酸支化单元连接端基功能化基团；端基功能化基团通过动态化学键连接在肿瘤微环境可激活的掩蔽层；肽类树状大分子的核心分子通过动态化学键连接疏水化疗药物；通过树状大分子超支化结构、多重氢键放大氨基酸生物学活性，进一步通过亲疏水作用驱动超分子自组装形成纳米粒进一步放大氨基酸功能，实现特异性组织-细胞双渗透。

进一步的，所述端基功能化基团为端基功能化的氨基酸；最优的端基功能化的氨基酸为精氨酸；通过树状大分子的放大效应，精氨酸与细胞表面磷酸、羧酸、硫酸根基团形成多重氢键，引起细胞膜破裂。

进一步的，所述结构单元其结构式如下：

进一步的，所述掩蔽层为：

中的一种。

进一步的，所述动态化学键为：

中的一种

如图1所示，该纳米粒可在肿瘤部位弱酸性环境中被激活，脱除屏蔽层，暴露出功能化氨基酸精氨酸，通过与细胞膜表面磷酸根、硫酸根、羧酸根形成多重氢键，使细胞膜破裂，实现细胞穿透；另外，纳米粒子可穿过内皮细胞进入肿瘤细胞，穿过一个肿瘤细胞到达另一个肿瘤细胞，进入肿瘤内部深处，实现肿瘤组织渗透。

按照下述方法制备肿瘤特异性组织-细胞渗透纳米粒：

步骤1：制备肽类树状大分子；肽类树状大分子的制备通过发散法进行，并使用Boc(叔丁氧羰基)、Pbf对氨基酸氨基进行保护；使用甲酯保护氨基酸的羧基部分；肽类树状大分子合成反应使用DMF(二甲基甲酰胺)为溶剂，EDC.HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)、HOBT(1-羟基苯并三唑)和HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)为缩合剂，DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)为有机碱，进行缩合反应；柱层析纯化后，TFA/DCM 脱除Boc、Pbf保护基团；重复上述步骤合成外围精氨酸修饰的肽类树状大分子；

第二代肽类树状大分子(Dend-MeO)的合成：称取1.5g H-Lys-OMe.2HCl、5.6gBoc-Lys(Boc)-OH、4.9g EDC.HCl和1.7g HOBT加入到100mL支管瓶中，抽真空，充氮气；用注射器加入约40mL重蒸过的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入3mL的DIPEA，继续搅拌半小时后撤去冰浴，改为室温下反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和 NaHCO3、NaHSO4、NaCl洗涤；用无水MgSO4干燥后，旋除溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/ 甲醇(MeOH)＝10:1)分离得到白色粉P-Dend-MeO。

脱保护：将1.0g的P-Dend-MeO白色粉末，加入3mL DCM(二氯甲烷)，然后加入3.5mL的三氟乙酸(TFA)，室温反应6h；减压旋去TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物Dend-MeO；产物无需提纯，直接用于下步反应。

精氨酸端基功能化肽类树状大分子(R-Dend-MeO)的合成

称取1.5g Dend-MeO、11.4g Boc-Arg(Pbf)-Boc、8.2g HBTU和2.9g HOBT加入到100mL 支管瓶中，抽真空，充氮气；用注射器加入约40mL重蒸过的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入11.9mL的DIPEA，继续搅拌半小时后撤去冰浴，改为室温下反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和NaHCO₃、NaHSO₄、NaCl洗涤；用无水MgSO₄干燥后，旋除溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/甲醇(MeOH)＝10:1)分离得到白色粉P-R-Dend-MeO。

脱甲酯与纯化：称取1.5g P-R-Dend-MeO于单口瓶中，加入0.5mol/L NaOH/MeOH溶液，室温搅拌反应过夜，减压旋除甲醇，用油泵抽干，加入氯仿溶解，HCl(1mol/L)调pH 为5-6，分离有机相，用无水MgSO₄干燥后，旋除溶剂，得到白色粉末P-R-Dend。

步骤2：通过化学键修饰将疏水化疗药物修饰到肽类树状大分子上；肽类树状大分子内核通过NaOH脱除甲酯保护基团，修饰水合肼，在甲醇为溶剂的条件下疏水药物，如阿霉素可通过动态化学键修饰到树状分子上，透析出去未反应的疏水药物；

称取1.5g P-R-Dend、0.3g Boc-NHNH₂、0.4g HBTU和0.2g HOBT加入到100mL支管瓶中，抽真空，充氮气；用注射器加入约40mL重蒸过的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入1.01 mL的DIPEA，继续搅拌半小时后撤去冰浴，改为室温下反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和NaHCO₃、NaHSO₄、NaCl洗涤；用无水MgSO₄干燥后，旋除溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/甲醇(MeOH)＝10:1)分离得到白色粉P-R-Dend-Hyd。

脱保护与纯化

将1.0g的P-R-Dend-Hyd白色粉末，加入3mLDCM，然后加入3.5mL的三氟乙酸(TFA)，室温反应6h；减压旋去TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物NH₂NH-Lys(G2)-Arg-NH₂；产物无需提纯，直接用于下步反应。

称取0.3g R-Dend-Hyd，0.3g DOX.HCl于50mL支管瓶中，抽真空，充氮气；用注射器加入10mL甲醇溶液，室温反应48h,减压旋去甲醇，透析除去未反应的DOX.HCl，冷冻干燥备用。

步骤4：在肽类树状大分子外围修饰肿瘤微环境可激活的掩蔽层；

步骤5：通过超分子自组装形成肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒；将步骤4中合成的最终产物溶于良性溶剂DMSO(二甲基亚砜)中，制备出10mg/mL的母液，随后在超声条件下，取10μL母液滴加到不良溶剂水溶液中；亲疏水驱动自组装，形成纳米粒子，最后透析除去DMSO，冻干备用。

实施例1

将上述制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒(步骤1-4如上述所示，步骤5中不良溶剂水的pH分别为7.4、6.5、5.0自组装形成)；三种纳米粒的浓度为100μg/mL，分布孵育 2h后，通过圆二色谱观察纳米粒在不同pH条件下的二级结构变化；结果如图3所示；该纳米粒在生理环境(pH 7.4)，肿瘤微环境(pH 6.5)中具有稳定的二级结构；而在溶酶体酸性环境中(pH 5.0)，由于药物从中断裂释放，纳米颗粒解组装，二级结构消失；纳米粒的肿瘤微环境并未使其二级结构发生明显变化，同时在腙键断裂的情况下，纳米组装结构彻底消失，说明纳米粒组装基元的成功合成。

实施例2

将上述制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒(步骤1-4如上述所示，步骤5中不良溶剂水的pH分别为7.4、6.5、5.0自组装形成)；三种纳米粒的浓度为100μg/mL，分布孵育 2h后，通过透射电子显微镜观察纳米粒的三维结构，结果如图4所示；通过磷钨酸负染，纳米粒在生理环境(pH7.4)，具有球形纳米结构；肿瘤微环境(pH6.5)中具有同样的纳米结构，而在溶酶体酸性环境中(pH5.0)，腙键断裂，疏水性化疗药物释放，纳米结构消失；该实验结果进一步表明纳米粒组装基元的成功合成及pH相应行为。

实施例3

将上述制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒(步骤1-4如上述所示，步骤5中不良溶剂水的pH分别为7.4、6.5、5.0自组装形成)；三种纳米粒的浓度为100μg/mL，分布孵育 2h后，通过马尔文动态光散射粒度仪观察纳米粒径电位变化，结果如图5所示；纳米粒在生理环境(pH7.4)，粒径约130nm；肿瘤微环境(pH6.5)中具有同样纳米结构及尺度，由于掩蔽层脱除，正负电荷聚集，粒径变大至165nm；在溶酶体酸性环境中(pH6.0)，腙键断裂，疏水性化疗药物释放，纳米结构消失；该实验结果进一步表明纳米粒可识别肿瘤微环境，暴露出功能化氨基酸精氨酸。

实施例4

用两相分区实验观察精氨酸胍基与月桂酸、胆固醇硫酸酯和磷酸酯的多重氢键作用；将上述制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒(步骤1-4如上述所示，步骤5中分别在7.4、 6.5的PBS自组装形成)；两种纳米粒的浓度为100μg/mL，体积为1mL，分布孵育2h；制备分别含有1％月桂酸、胆固醇硫酸酯和磷酸酯的氯仿有机相；将PBS水相和氯仿有机相进行混合，摇晃30s后，2000r离心1min，相机拍照，结果如图6所示；当纳米粒在pH6.5条件下，外围掩蔽层成功脱出，暴露出的胍基可与月桂酸、胆固醇硫酸酯和POPG(1-棕榈酰-2 油酰磷脂酰甘油)形成多重氢键，使肽类树状大分子渗透肽从水相快速渗透到有机相；而在生理条件(pH7.4)下，屏蔽层的存在阻止纳米粒与细胞膜作用，可减少对正常组织的毒副作用，增强对肿瘤区域的选择性；该实验结果表明，纳米粒可在生理条件下减少与细胞膜表面作用，而在肿瘤微环境被激活，暴露出精氨酸，精氨酸胍基与月桂酸、胆固醇硫酸酯和磷酸酯形成多重氢键。

实施例5

通过红细胞试验进一步观察纳米粒与红细胞膜的相互作用，将上述制备的肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒(步骤1-4如上述所示，步骤5中分别在7.4、6.5的PBS自组装形成)；两种纳米粒的浓度为100μg/mL，体积为1mL，体积为800μL；所用红细胞来自于BALB/C小鼠，通过眼球取血，离心所得；将200μL红细胞与800μL组装体混合，37℃孵育2h后， 2.5％戊二醛固定，梯度脱水后，通过二氧化碳临界干燥，扫描电镜观察红细胞形态变化；SEM 图如图7所示；当红细胞与纳米粒10μg/mL在pH7.4条件下孵育2h，红细胞呈双凹圆盘形，而在pH6.5条件下，胍基暴露，红细胞膜被破坏；实验结果表明，纳米粒在pH7.4条件下未被激活，并没有对红细胞膜形态破坏，而在pH6.5条件下被激活，脱除掩蔽层，暴露出精氨酸，与红细胞膜相互作用，使其破坏。

实施例6

为进一步观察纳米粒与细胞膜的相互作用，将肿瘤细胞，培养基稀释，按每孔固定个数的密度接种于24孔板中；待细胞壁生长24h后，以浓度为10μg/mL纳米粒与肿瘤细胞在pH7.4 和6.5条件下孵育2h后，去除含纳米粒的培养基，PBS洗3次，2.5％戊二醛固定，梯度脱水后，通过二氧化碳临界干燥，扫描电镜观察肿瘤细胞形态变化；通过肿瘤细胞SEM图如图8 所示；可以看出纳米粒子在pH6.5条件下可与肿瘤细胞膜相互作用，并使其破坏，出现较多孔洞；而在pH7.4条件下，细胞膜表面密实，与空白未做任何处理的细胞膜表面结构一致；实验结果表明，纳米粒在生理条件pH7.4条件下未被激活，并没有对细胞膜破坏，而在肿瘤微环境pH6.5条件下被激活，脱除掩蔽层，暴露出精氨酸，与肿瘤细胞膜相互作用，使其破坏。

实施例7

进行体外细胞摄取实验，取肿瘤细胞，培养基稀释，按每孔固定个数的密度接种于六孔板中，待细胞壁生长24h后，六个孔中第一个作为空白对照组，第二个孔中加入疏水性化疗药物阿霉素(DOX)浓度为2μg/mL的纳米粒，第三个孔中加入浓度为2μg/mLDOX，第四个孔中加入浓度为2μg/mL的DOX.HCl(盐酸阿霉素)，第五个孔中加入疏水性化疗药物阿霉素(DOX)浓度为2μg/mL并在pH为7.4条件下，第六个孔中加入疏水性化疗药物阿霉素 (DOX)浓度为2μg/mL并在pH为6.5条件下，细胞培养2h后，用PBS洗3边后，胰酶消化并收集细胞，通过流式细胞仪检测DOX的细胞摄取量；其结果如图9所示，在pH6.5条件下，精氨酸暴露出来，细胞摄取阳性细胞数为100％，平均荧光强度为10⁵，而盐酸阿霉素阳性细胞数仅仅为37％，平均荧光强度为10³；实验结果表明，被激活的纳米粒可大大提高药物的细胞摄取量。

实施例8

活细胞工作站实验，取肿瘤细胞，培养基稀释，按每孔固定个数的密度接种于玻底24 孔板中，待细胞贴壁生长24h后；将上述孔板分为两组，均加入DOX浓度为2μg/mL的纳米粒；将上述培养的肿瘤细胞一组在pH7.4，另一组置于6.5条件下实时观察细胞对DOX的摄取情况，实验结果如图10所示；纳米粒可在肿瘤微环境(pH6.5)条件下被激活，快速进入细胞，随着时间延长，红色荧光逐渐增强，细胞形貌发生变化；而在生理条件下，纳米粒由于表面屏蔽层的保护，未见明显的红色荧光，不能穿过肿瘤细胞。

实施例9

Transwell小室研究组织渗透，取两个培养基，首先将上室分别培养HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞和SKOV3/R(卵巢上皮性癌)耐药肿瘤细胞，下室均培养SKOV3 R肿瘤细胞；待细胞贴壁后，将上室在无血清条件下孵育纳米粒(DOX 20μg/mL)，2h后换新鲜培养基，并同下室一起继续培养24h；随后通过Hoechst 33342进行细胞核染色，并通过激光共聚焦观察；激光共聚焦实验结果如图11所示，通过上层为HUVEC内皮细胞、下层为肿瘤细胞模拟纳米粒通过内皮细胞进入肿瘤细胞的过程；在肿瘤微环境pH6.5条件下，纳米粒精氨酸暴露出来，可快速从内皮细胞渗透到肿瘤细胞，同样可可快速在肿瘤细胞间渗透；通过上层为肿瘤细胞、下层为肿瘤细胞模拟纳米粒通过一个肿瘤细胞进入另一个肿瘤细胞的过程；在肿瘤微环境pH6.5条件下，纳米粒精氨酸暴露出来，可快速从上层肿瘤细胞渗透到下层肿瘤细胞；实验结果表明，被激活的纳米粒可时间血管溢出和肿瘤见渗透。

实施例10

3D肿瘤多细胞球渗透实验，取肿瘤细胞，培养基稀释，按每孔固定个数的密度接种于表面包被1.5％琼脂糖凝胶的6孔板中，培养7天，长成直径为100μm左右的肿瘤细胞球备用；随后均加入纳米粒(DOX 2μg/mL)，将上述培养基分为两组，第一组在pH为7.4条件下孵育 4h，第二组在pH6.5条件下孵育4h；通过激光共聚焦观察其组织渗透效果，如图12所示，在肿瘤微环境条件下，纳米粒可快速携带DOX进入肿瘤细胞球深处，在生理条件下无明显渗透能力；该实验结果进一步表明，纳米粒在可肿瘤微环境识别，实现肿瘤渗透。

实施例11

活体成像实验，选择2只4-6周龄BALB/c裸鼠(约20-25g)，腋下建立SKOV3/R肿瘤模型；待肿瘤长至100cm³时，按纳米粒和DOX.HCl(其中DOX均为10mg/kg)，分别对老鼠进行尾静脉注射；每只100μL，不同时间观察其在体内的分布情况；小动物活体成像验结果如图13所示，纳米粒可在就富集到肿瘤部位，并随着时间的延长，纳米粒富集到肿瘤部位的量越来越多，而DOX.HCl被快速清除，12h后体外剖离肿瘤组织，通过小动物活体成像同样可以观察到纳米粒大量富集在肿瘤组织，说明纳米粒可识别肿瘤部位并实现肿瘤组织渗透。

天然病毒可有效进入宿主细胞并从一个细胞穿过另一个细胞实现浸染过程；修饰TAT的纳米粒子通过超分子作用已成功实现血脑屏障的穿透；基于肽类树状大分子的结构精确、易于修饰、放大效应等特点；本发明通过分子设计与超分子组装实现肿瘤特异性组织-细胞双渗透，开发一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒有益于丰富渗透肽种类和完善肽类树状大分子的功能；本发明在肿瘤微环境及肿瘤细胞内具有稳定的纳米结构；利用肽类树状大分子超支化结构和放大效应，通过分子设计和超分子组装，构建的纳米粒可解决药物难以进入肿瘤深处及难以跨越细胞屏障的问题；在肽类树状大分子外围修饰肿瘤微环境可激活的掩蔽层，在生理条件下阻止纳米粒与细胞膜作用，减少对正常组织的毒副作用，增强对肿瘤区域的选择性。

Claims

1.一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒，其特征在于，结构单元通过超分子组装形成；结构单元包括以氨基酸为重复单元构成的肽类树状大分子；肽类树状大分子外围的氨基酸支化单元连接端基功能化基团；端基功能化基团通过动态化学键连接在肿瘤微环境可激活的掩蔽层；肽类树状大分子的核心分子通过动态化学键连接疏水化疗药物；端基功能化基团为精氨酸；

结构单元结构式如下：

。

2.一种如权利要求1所述的一种肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在制备化疗药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境中可破坏细胞膜。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒在肿瘤微环境中具有细胞渗透作用和肿瘤组织渗透作用；可从内皮细胞渗透到肿瘤细胞，也可在肿瘤细胞间渗透。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤特异性组织-细胞双渗透纳米粒可使其携带的疏水化疗药物在肿瘤组织附近富集。