CN1850032A - 一种两性霉素b纳米制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，是抗真菌药两性霉素B(AmB)的一种纳米制剂。本发明以聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)为AmB的载体材料制备而成，经动物实验证实，能够透过血脑屏障，测得脑组织内药物浓度高于临床应用的AmB脂质体制剂。疗效学实验结果显示，本发明的纳米制剂能够显著延长隐球菌性脑膜炎小鼠的生存期，使脑组织内感染菌量降低，疗效优于AmB脂质体制剂。

Description

一种两性霉素B纳米制剂
                                技术领域
本发明涉及医药技术领域，是抗真菌药两性霉素B的一种纳米制剂。
                                背景技术
两性霉素B(AmB)属大环多烯类抗生素，是用于治疗深部真菌感染的首选药物。隐球菌性脑膜炎是一种常见的深部真菌感染性疾病，用AmB治疗的最大问题是由于其不易透过血脑屏障，鞘内直接注射给药不仅操作不便，而且由于危险性高，合并症较多，患者难以接受。临床应用的脂质体制剂虽经证明能够穿越血脑屏障，但因价格昂贵、实际疗效并不确切而限制了广泛使用。
                                发明内容
本发明以聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)为AmB载体材料，提供一种能通过血脑屏障的AmB纳米制剂。制备方法如下：
一、试剂：
1、两性霉素B(25mg/支、上海新先锋药业)；
2、α-氰基丙烯酸正丁酯(北京瞬康医用胶有限公司)；
3、右旋糖苷Dextran T-70(Pharmacia公司)；
4、Polxamer 188(北京世纪华林生物科技有限公司)；
5、聚山梨酯-80(Tween-80)(上海化学试剂公司)；
二、具体制备方法：
将稳定剂Dextran-70和/或Poloxamer188各按6mg/ml的浓度溶于蒸馏水，同时加或不加助溶剂脱氧胆酸钠，浓度为0.4mg/ml，在pH值约为3的条件下边搅拌边缓缓加入α-氰基丙烯酸正丁酯，至终浓度为1％，搅拌约4小时后，调pH值至7.5-8.5，得空白α-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，然后以空白纳米粒胶体溶液10ml:20mg两性霉素B粉剂的比例加入两性霉素B粉剂，在pH值约为7的中性条件下继续搅拌约4小时，得两性霉素B-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(AmB-PBCA-NP)胶体溶液，最后用1％的聚山梨酯-80于37℃恒温箱中孵化，即成两性霉素B纳米制剂。
激光粒度分析仪测定粒径大小及分布
取上述两性霉素B纳米制剂适量，加注射用水使分散，置Nano-S粒径测定仪中测定粒径，平均粒径为74.38nm。
透射电镜下观察纳米粒形态
本发明两性霉素B纳米制剂外观呈淡黄色不透明乳状液体，取1-2滴溶液置于铜网上，2％磷钨酸溶液负染色，室温晾干，透射电镜下观察其形态，纳米粒呈圆或类圆形，大小较为均匀，无明显聚集。
紫外法测定包封率和载药量
取两性霉素B纳米制剂适量，于4℃、35000r/min离心，取上清液测定紫外吸收度，所得浓度计为Cb(mg/ml)，按投药量计算AmB的初始浓度，计为C(mg/ml)，PBCA-NP空白纳米粒的初始浓度计为M(mg/ml)，按以下公式计算包封率及载药量。
包封率计算公式： E = C - C b C × 100 %
载药量计算公式为： Y ( mg / mg ) = C - C b M × 100 %
得包封率范围在23.10％-56.10％，载药量为25％-92％。
两性霉素B纳米制剂的体外释放试验
选择聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的水溶液为保护胶体，配制较高浓度的PVP水溶液，加入适量置AmB-PBCA-NP液中，制成含PVP为2％的AmB-PBCA-NP液，超声振荡5分钟，室温振摇12小时。取1ml置于已处理好的透析袋中，进行体外释放实验，结果表明，本发明制剂呈时间依赖性释放，5小时释放40.9％，10小时释放47.45％，24小时释放93.28％，具有一定缓释性。
                              具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细描述：
实施例1：
称取300mg Dextran-70，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.5，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本发明纳米制剂。经检测，包封率56.10％，载药量82％，平均粒径为79.9nm。
实施例2：
称取300mg Dextran-70，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.5，再加入助溶剂脱氧胆酸钠20mg，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本发明纳米制剂。经检测，包封率23.1％，载药量25％，平均粒径为90.7nm。
实施例3：
称取300mg Dextran-70和300mgPoloxamer 188，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素粉针剂，测定pH值约为7.0，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本发明纳米制剂。经检测，包封率38.4％，载药量92％，平均粒径为83.4nm。
实施例4：
称取300mg Dextran-70和300mgPoloxamer 188，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.0，再加入助溶剂脱氧胆酸钠10mg，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本发明纳米制剂。经检测，包封率34.8％，载药量45％，平均粒径为88.6nm。
实施例1中的稳定剂采用Dextran T-70，且不加助溶剂脱氧胆酸钠，结果显示粒径较小，载药量及包封率均较高。
动物实验研究
为了进一步验证纳米制剂的脑靶向作用，我们进行了动物实验，采用高效液相色谱分析法(HPLC)测定小鼠脑内药物浓度。动物为6-8周龄健康昆明小鼠，雌雄各半，体重25±5g(购于第二军医大学实验动物中心)。
动物分成4组，每组21只：
1、AmB粉针剂组：尾静脉注射两性霉素B粉针剂(1mg/kg)
2、本发明AmB纳米制剂组：尾静脉注射AmB-PBCA-NP(3mg/kg)
3、AmB脂质体组：尾静脉注射AmB-L(10mg/kg)
4、空白对照组：尾静脉注射生理盐水(注射容积0.1ml)
各组小鼠分别于给药后0.5h，1h，3h，6h，12h，24h及48h摘除眼球取血，即刻断髓处死后取脑组织留用。血液置于滴有肝素钠的抗凝管中，轻轻震荡摇匀，防止凝固，离心取上清液100μl备用；脑组织生理盐水作匀浆处理，离心后取上清液100μl，加入含内标的乙腈100μl，涡旋、离心，取上清液100μl，再离心后取上清液，待测。
色谱分析采用Dikma-C18色谱柱(规格200×4.6mm)，预柱采用Dikma EasyGuard通用HPLC保护柱(柱芯尺寸8×4mm)(DIKMA公司)，流动相组成为乙腈、水(40∶60)及4％的乙酸，流速为0.9ml/min；紫外线检测波长405nm，柱温37℃，进样量20μl。
AmB粉针剂组小鼠脑组织中未能测出药物，这与文献报道及临床观察结果相一致；而本发明AmB纳米制剂在脑组织中显示出较高的药物浓度，30分钟平均浓度为61.4930ng/g，3小时达到132.5203ng/g，48小时后浓度仍为66.1001ng/g，而脂质体制剂在6小时后才能测出药物，12小时浓度最高仅为66.1400ng/g，之后浓度缓慢下降。结果表明PBCA能够携载AmB到达脑部，且本发明AmB纳米制剂的脑靶向性明显优于脂质体。
动物疗效学实验
选取ATCC30629B型新生隐球菌菌株(长征医院皮肤科真菌保存室提供)及BALB/c雌性小鼠(20±5g，6-8周龄，购于中国科学院上海实验动物中心)，通过脑室内注射建立隐球菌性脑膜炎的小鼠动物模型，模型小鼠分成4组，每组10只。
一、动物分组及处理：
1、AmB粉针剂治疗组：尾静脉注射两性霉素B粉针剂(1mg/kg)
2、AmB-PBCA-NP治疗组：尾静脉注射AmB-PBCA-NP(3mg/kg)
3、AmB脂质体治疗组：尾静脉注射AmB-L(10mg/kg)
4、空白对照组：尾静脉注射生理盐水(注射容积0.1ml)
二、生存期观察
观察各组小鼠的生存率发现，AmB粉针剂组小鼠与生理盐水对照组生存期无明显差别，20天内全部死亡；AmB-PBCA-NP治疗组小鼠10天生存率为100％，20天生存率为80％，而AmB脂质体治疗组小鼠10天和20天生存率均为80％，说明纳米制剂短期疗效明显好于脂质体制剂。
三、菌落计数对比研究
取各组小鼠治疗前后脑组织，匀浆，37℃条件下沙氏培养基培养，观察菌落生长情况。结果显示，经AmB粉针剂治疗一天的小鼠脑组织菌落计数为308000cfu/g，一周后上升到549000cfu/g，说明粉针剂静脉给药对隐球菌性脑膜炎无治疗作用。而本发明纳米制剂治疗一周后小鼠的脑组织匀浆菌落计数仅为9800cfu/g，同等条件下的脂质体制剂治疗小鼠的菌落计数为53400cfu/g，统计学差异显著，间接证明了本发明的AmB纳米制剂具有脑靶向作用，对隐球菌性脑膜炎有明显有效的治疗作用。

Claims (2)

1、一种两性霉素B纳米制剂，制备方法如下：
将稳定剂Dextran-70和/或Poloxamer188各按6mg/ml的浓度溶于蒸馏水，同时加或不加助溶剂脱氧胆酸钠，浓度为0-0.4mg/ml，在pH值约为3的条件下边搅拌边缓缓加入α-氰基丙烯酸正丁酯，至浓度为1％，搅拌约4小时后，调pH值至7.5-8.5，得空白α-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，然后以空白纳米粒胶体溶液10ml∶20mg两性霉素B粉剂的比例加入两性霉素B粉剂，在pH值约为7的中性条件下继续搅拌约4小时，得两性霉素B-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，最后用1％的聚山梨酯-80于37℃恒温箱中孵化，即成两性霉素B纳米制剂。
2、按权利要求1所述的两性霉素B纳米制剂，其特征在于制备方法中所说的稳定剂为Dextran-70，配成6mg/ml的水溶液，再加入α-氰基丙烯酸正丁酯，搅拌4小时后，调pH值至8.5。
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