CN102526716A - 一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗技术，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备，本发明的制备方法，包括以下步骤：步骤1，外周血采集单状核细胞；步骤2，DC和T细胞分离；步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；步骤4，CIK制备；步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备。
背景技术
肿瘤发病率逐年上升，传统的手术、放疗、化疗三大模式中，化疗是唯一的全身治疗手段，但化疗的有效率低（25-30%）、副反应大、耐药性、只对分裂期细胞有效、严重的免疫抑制、对肿瘤干细胞无效六大缺陷，严重限制了临床应用。“细胞免疫治疗”作为一种全新的全身治疗新技术应用于临床，并获得了有效率高、副反应小的良好效果，被越来越多的肿瘤病患所接受，因而成为肿瘤的第四大治疗模式。
目前国内外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技术进行肿瘤的细胞免疫治疗，临床疗效虽远高于化疗，但回输的效应细胞在体内存留时间短，有效率低仍是目前亟待解决的瓶颈问题。
基础研究证实，肿瘤一旦形成，就会形成“肿瘤微环境”，产生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-β、IL-6等，同时调节性T淋巴细胞（Treg）水平大幅升高，结果导致病人本身的免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，致使肿瘤无限制生长，我们称之为肿瘤的“免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要这些免疫抑制因素存在，体外制备的效应细胞回输体内后很快被抑制，体内的存留时间只有3-5天，严重影响了效应细胞对肿瘤的杀伤效应。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破肿瘤免疫耐受、提高免疫治疗疗效的关键。
细胞免疫治疗方法很多，上世纪初就出现了应用LAK细胞治疗肿瘤的技术，但由于有效率低，疗效不确切而被放弃。以后，人们逐一探讨了NK细胞、TIL细胞、CTL细胞、DC疫苗等临床应用的可行性，均因疗效的不确切性而未被临床认可。本世纪初，人们发现DC-CIK细胞具有强大的肿瘤杀伤功能，并能在体内产生免疫记忆，有利于持续的免疫杀伤，而且副反应小、安全性高，因而国内外临床已广泛推广应用至今。
DC-CIK技术的方法是：从肿瘤病人外周血获取单状核细胞，体外分离出DC细胞（贴壁）和T细胞（悬浮）。贴壁的DC细胞内加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集备用。悬浮的T细胞加入INF-γ冲击，然后加入CIK细胞因子，每48小时扩增一次。第5-7天，将成熟DC和CIK细胞混合培养8-10天获得DC-CIK，移至含有2.0g白蛋白的0.9%生理盐水中制备成DC-CIK效应细胞制剂，直接静脉输注治疗（参照专利200510112381）。上述方法存在的问题是：①效应细胞制剂肿瘤杀伤力强但特异性相对差；②直接回输后，在肿瘤微环境中IL-10、TGF-β及Treg的免疫抑制下，效应细胞在体内的存留时间短（3-5天），杀伤效率低；③所产生的免疫记忆也被抑制而不能发挥免疫激发功能，因而，临床疗效有限。
本发明在于提供一种在干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受基础上，DC-CIK-CTL高效特异性细胞免疫治疗的新技术，解决了现有DC-CIK技术存在的特异性差、体内存留时间短、杀伤效率低等瓶颈问题。
本发明的方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞经过INF-γ冲击后，应用CIK细胞因子扩增至第7天，半数移瓶加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数继续CIK扩增，至第10天收集CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml 0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，2次/日，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。
本发明还发现，单次应用小剂量替加氟或环磷酰胺（CTX），能够有效的降低肿瘤病人外周血调节性T淋巴细胞（Treg）的比率，同时能够降低外周血中IL-10和TGF-β的量，但并不能有效的杀伤肿瘤细胞。因而我们假设，尽管小剂量CTX的应用不能起到治疗肿瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF-β含量，恰恰能够达到消除肿瘤微环境中重要的免疫抑制因素，在此基础上实施细胞免疫治疗，可以有效的延长回输的效应细胞在体内的存留时间，强化细胞免疫对肿瘤的杀伤效应，获的更高的临床疗效。
基于以上发现，我们建立了本发明，即首先应用小剂量替加氟和CTX对肿瘤病人进行预处理，然后给予DC-CIK-CTL高效特异性杀伤细胞，进行细胞免疫治疗。经过实验室研究、动物实验研究及临床试验研究，获得大量研究数据，证实了该技术的有效性和安全性。
目前临床应用替加氟和CTX，目的是化疗，用量分别是：替加氟800-1000mg，总量20g-40g一疗程，CTX 500-1000mg/m2，每周1次，此剂量是化疗的常规剂量，具有较大的副反应，而小剂量虽可降低副反应，但达不到化疗目的。
本技术应用小剂量替加氟和CTX，目的不是化疗，而是降低外周血Treg、IL-10和TGF-β的含量，达到干扰肿瘤微环境，打破肿瘤免疫耐受的疗效，为随后进行的细胞回输治疗创造环境，因而目的和用途是不同的。
本技术应用了替加氟和CTX复合制剂，对肿瘤病人进行预处理，使外周血Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因素显著降低，在此基础上，回输的效应细胞在体内的存留时间显著延长，达到20-30天，肿瘤的杀伤效率明显提高，使临床总体疗效提高到68%。所以，本技术是国际国内最新研究成果，也是最合理的临床治疗模式。
发明内容
本发明的主要目的在于：解决目前DC-CIK方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的瓶颈问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。
为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，本发明的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，外周血采集单状核细胞；
步骤2，DC和T细胞分离；
步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；
步骤4，CIK制备；
步骤5，CTL制备；
步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清（方法：加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清），4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层（单状核细胞）。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）。
其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。
其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml（含GM-CSF 50ug/500ml，IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天。第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml（自体肿瘤相关抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量），次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗（附图1-5）。
其中，步骤4的CIK制备的方法如下：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml（含IFN-γ 50ug/500ml；庆大霉素2万单位/500ml），将悬浮的T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。次日，补充半量的CIK培养基（该培养基为：AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位）。第5天补充IL-2培养基（该培养基为：AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位）。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
其中，步骤5的CTL制备的方法如下：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL（附图6-9）。
其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，（该生理盐水中含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位），制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂（细胞数量控制在1-2×109），4℃环境输送病房备用。
通过以上方法得到的特异性DC-CIK-CTL细胞，在经过常规的制剂学处理后可以得到用于治疗的细胞制剂。
因此本发明还包括，含有本发明特异性DC-CIK-CTL细胞的细胞制剂。
本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的特异性DC-CIK-CTL细胞制剂回输到肿瘤病人体内。
本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用替加氟和CTX，注射用替加氟和CTX均为小剂量，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，两种制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用替加氟一次用量为800mg，CTX一次用量为300-400mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9%氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中给病人输注，两种制剂可单独使用，也可混合使用，必要时可制备成复方药物制剂。
本发明还包括一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂，试剂的名称如下：
DC-CIK-CTL组合试剂：
1. 单核巨噬细胞克隆刺激因子（GM-CSF）；
2. 白细胞介素4（IL-4）；
3. 庆大霉素；
4. 自体肿瘤相关全抗原；
5. IFN-γ；
6. CD3单抗；
7. 白细胞介素-2（IL-2）；
8. 0.9%氯化钠；
9. 人血白蛋白；
10. 注射用白细胞介素-2（IL-2）；
干扰肿瘤微环境组合制剂：
1. 09%氯化钠；
2. 注射用替加氟；
3. 注射用环磷酰胺；
试剂的剂量如下：
DC-CIK-CTL组合试剂的剂量和终浓度如下：
1. GM-CSF：50ug/500ml；
2. IL-4：30ug/500ml；
3. 庆大霉素：2.0万单位/500ml；
4. 自体肿瘤相关全抗原：50ug/ml；
5. IFN-γ：50ug/500ml；
6. CD3单抗：25ug/500ml；
7. IL-2：15ug/500ml；
8. 0.9%氯化钠：200ml；
9. 人血白蛋白：2.0g；
10. 注射用白细胞介素-2（IL-2）：20万U；
干扰肿瘤微环境组合制剂的剂量如下：
1. 0.9%氯化钠：500ml；
2. 注射用替加氟：800mg；
3. 注射用环磷酰胺：300-400mg/m2；
本发明还包括一种组合包装，其特征在于，将权利要求6中的注射用替加氟和注射用CTX分别装入到各自的容器中，再一同装入同一包装盒中形成组合包装。
本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下：
细胞培养的第9天，开始应用干扰微环境制剂对病人进行前处理，方法为：替加氟1000mg加入5%的葡萄糖或0.9%的生理盐水500ml静脉输注，环磷酰胺（CTX）400-600mg加入0.9%的生理盐水20ml静脉推注或入壶，1次/日，连续2天。细胞培养第11天，细胞回输治疗，方法为：采用带滤器输血袋，生理盐水100ml静脉点滴（冲袋），换细胞制剂200ml静脉输注，速度40-60滴/分，期间每5-10分钟轻柔摇晃输液瓶（袋），保持细胞混悬状态。细胞输注完成后，换生理盐水100ml静脉点滴（冲洗输液器）。细胞回输治疗每日2次，上下午分开，共6次3天完成。细胞回输当日行DC疫苗局部淋巴结注射接种，以后每周接种一次共三次。细胞回输当日起IL-2 100万U肌肉注射，2次/日，连续5天。干扰微环境制剂处理前1天和处理后4天分别采取外周血（抗凝），流式细胞学（FCM）检测Treg（CD4+CD25+）水平，ELISA法检测IL-10和TGF-β水平（附图10-12）。
本发明的优点在于，通过干扰肿瘤微环境能够有效降低肿瘤病人外周血中IL-10、TGF-β等免疫抑制因子及调节性T淋巴细胞（Treg）水平，打破肿瘤免疫耐受，在此基础上回输体外制备的高强度、特异性肿瘤杀伤细胞（DC-CIK-CTL）进行细胞免疫治疗，可以有效延长效应细胞在体内的存留时间；同时，在打破肿瘤免疫耐受基础上实施DC疫苗接种，能够有效激发体内特异性肿瘤免疫，从而实现体内、体外双途径肿瘤杀伤效应，提高细胞免疫治疗的临床疗效（附图13-15）。
本技术的意义在于，提出了一种全新的细胞免疫治疗理念，即“打破肿瘤免疫耐受基础上的细胞免疫治疗”；提出了一种高效特异性肿瘤杀伤细胞（DC-CIK-CTL）的制备方法；提出了一种在打破肿瘤“免疫耐受”基础上实施高效特异性肿瘤杀伤的新技术、新方法。本技术解决了目前肿瘤免疫治疗中效应细胞在体内存留时间短，肿瘤杀伤效率低，临床疗效低的瓶颈问题，大幅提高了细胞免疫治疗的临床疗效。
现有技术的主要缺陷是：①、所制备的细胞制剂虽然杀伤力较强，但特异性较差；②、虽然DC-CIK具有产生免疫记忆，诱导持续的肿瘤杀伤的优点，但由于体内的免疫抑制因素未被清除，抵消了持续肿瘤杀伤的功能；③、由于没有打破肿瘤免疫耐受，回输的DC-CIK细胞，只能在体内存留3-5天，因而对肿瘤的杀伤效率低；④、临床疗效主要是改善患者生存质量，延长生存期，但肿瘤的客观缓解率（肿瘤缩小或消失）不明显。
本技术的主要内容是：实验室制备高效率DC-CIK-CTL细胞制剂，回输治疗前，首先干扰肿瘤微环境，降低外周血Treg、L-10及TGF-β水平，并使其低水平状态保持4-10天，从而打破肿瘤免疫耐受，解除免疫抑制因素（Treg、L-10及TGF-β）对回输效应细胞的免疫抑制，然后进行细胞回输治疗。优势在于：①、效应细胞DC-CIK-CTL，具备强大的杀伤功能，同时具备较高的特异性，对肿瘤的杀伤效率明显增高，较DC-CIK有显著的优势；②、同样产生免疫记忆，并能诱导持续的肿瘤杀伤，而且由于打破了肿瘤的免疫耐受，消除了免疫抑制因素，免疫记忆功能不被抵消；③、由于打破了肿瘤免疫耐受，回输的DC-CIK-CTL效应细胞在体内的存留时间显著延长，能持续存在30天以上，因而对肿瘤的杀伤效率高；④、临床疗效显著提高，特别是对肿瘤的客观有效率显著提高。
附图说明：
附图1. DC疫苗制备流程示意图
附图2. DC细胞不同培养时期的镜下形态。培养的1-5天，属于未成熟DC，形态特点是类圆形，细胞表面无树突样结构平滑，缺少树突样结构。随培养时间延长，细胞表面逐渐出现树突样结构。加入抗原后培养2天，DC成熟，细胞表面呈典型的树突样突起，如电镜图所示。
附图3. DC疫苗制备成功后，DC细胞表面的重要细胞因子表达显著增高。CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达，在未成熟DC（im-DC）十分低下，因而不具备抗原提呈功能；而在成熟DC（m-DC）的表达显著增高，抗原提呈功能强大。
附图4. 体外制备的DC疫苗，其标志性细胞因子IL-12的分泌量显著升高。
附图5. 携带肿瘤抗原的DC疫苗，能有效的激活自体T细胞和同种异体T细胞，且在DC:T为1：20时，激活效率最高。
附图6. 携带肿瘤抗原的DC疫苗，在第一信号和第二信号的共同参与下，能够有效的激活T细胞，制备成肿瘤特异性CTL。第一信号即，DC表面的MHC分子提供抗原给T细胞表面的T细胞受体（TCR）；第二信号即，DC表面的B7分子（CD80、CD86）激活T细胞表面的CD28分子。
附图7. DC细胞激活T细胞的电镜示意图
附图8. 体外制备的CTL，其标志性细胞因子INF-γ的分泌量显著增高。
附图9. 体外制备的自体肿瘤特异性CTL，对肿瘤的特异性杀伤能力显著增强。
附图10. 应用CTX处理后，Treg的水平显著下调至正常人水平，从而消除Treg对免疫系统的免疫抑制效应。
附图11. 应用CTX处理后，IL-10水平显著下调至正常人水平。
附图12. 应用CTX处理后，TGF-β水平显著下调至低于正常人的水平。
附图13. 应用CTX处理后，荧光标记的效应细胞在肿瘤组织内存留时间长达30天以上，因而肿瘤杀伤效率明显提高。
附图14. 动物实验表明，干扰肿瘤微环境条件下，DC诱导的肿瘤特异性CTL，对肿瘤的特异性杀伤能力显著增强。
附图15. 在干扰肿瘤微环境基础上，肺癌病人应用本DC疫苗联合DC-CIK-CTL过继回输治疗，一个疗程后，肿瘤缩小50%以上。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备，包括以下步骤：
步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清（方法：加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清），4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层（单状核细胞）。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）。
步骤2的DC和T细胞分离的方法如下：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。
步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml（含GM-CSF 50ug/500ml，IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天。第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml（自体肿瘤相关全抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量），次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗（附图1-5）。
步骤4的CIK制备的方法如下：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml（含IFN-γ50ug/500ml；庆大霉素2万单位/500ml），将悬浮的T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。次日，补充半量的CIK培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位）。第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位）。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
步骤5的CTL制备的方法如下：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL（附图6-9）。
步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，控制细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，（含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位），制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂（细胞数量控制在1-2×109，4℃环境输送病房备用。
实施例2
干扰微环境制剂的制备方法和用法：
成人按照静脉注射用替加氟1000mg，CTX 300-400mg/m2,计算病人用药剂量。一般采取替加氟800mg加入0.9%的生理盐水500ml，用20ml注射器抽取CTX 400-600mg，然后抽取0.9%的生理盐水20ml稀释，制备成干扰肿瘤微环境制剂。治疗时，首先静脉输注替加氟，掌握速度为30-40滴/分，然后将CTX入壶或静脉推注。治疗前1天和治疗后4天，分别采取外周血2ml，抗凝，FCM检测Treg含量，ELISA检测IL-10和TGF-β含量。
实施例3
本发明还包括一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂，试剂的名称如下：
DC-CIK-CTL组合试剂：
11. 单核巨噬细胞克隆刺激因子（GM-CSF）；
12. 白细胞介素4（IL-4）；
13. 庆大霉素；
14. 自体肿瘤相关全抗原；
15. IFN-γ；
16. CD3单抗；
17. 白细胞介素-2（IL-2）；
18. 0.9%氯化钠；
19. 人血白蛋白；
20. 注射用白细胞介素-2（IL-2）；
试剂的剂量如下：
DC-CIK-CTL组合试剂的剂量和终浓度如下：
11. GM-CSF：50ug/500ml；
12. IL-4：30ug/500ml；
13. 庆大霉素：2.0万单位/500ml；
14. 自体肿瘤相关全抗原：50ug/ml；
15. IFN-γ：50ug/500ml；
16. CD3单抗：25ug/500ml；
17. IL-2：15ug/500ml；
18. 0.9%氯化钠：200ml；
19. 人血白蛋白：2.0g；
20. 注射用白细胞介素-2（IL-2）：20万U；
干扰肿瘤微环境组合制剂：
4. 09%氯化钠；
5. 注射用替加氟；
6. 注射用环磷酰胺；
干扰肿瘤微环境组合制剂的剂量如下：
4. 0.9%氯化钠：500ml；
5. 注射用替加氟：800mg；
6. 注射用环磷酰胺：300-400mg/m2。
Claims (10)
1.一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，外周血采集单状核细胞；
步骤2，DC和T细胞分离；
步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；
步骤4，CIK制备；
步骤5，CTL制备；
步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，循环外周血6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清，得到自体血清，4℃冷藏备用；收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数；
其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞；
其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下：
贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml，IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml的无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，其中，自体肿瘤相关全抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量；次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗；
其中，步骤4的CIK制备的方法如下：
取175cm2培养瓶若干，分别加入含IFN-γ 1000U/ml，庆大霉素2万单位/500ml的AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充半量的CIK培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位），第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位），以后根据培养液颜色，每次补充40％以上的IL-2培养基，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养；
其中，步骤5的CTL制备的方法如下：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL；
其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备方法如下：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位的生理盐水瓶，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂，4℃环境保存。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，外周血采集单状核细胞；
步骤2，DC和T细胞分离；
步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；
步骤4，CIK制备；
步骤5，CTL制备；
步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备；
其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，循环外周血6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清，得到自体血清，4℃冷藏备用；收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数；
其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞；
其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下：
贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml，IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml的无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml，其中，自体肿瘤相关抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量；次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗；
其中，步骤4的CIK制备的方法如下：
取175cm2培养瓶，分别加入含IFN-γ50ug/500ml，庆大霉素2万单位/500ml的AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的T细胞移入，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日，补充半量的CIK培养基（500ml AIM-V无血清培养基中含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位），第5天补充IL-2培养基（AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位），以后根据培养液颜色，每次补充40％以上的IL-2培养基，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养；
其中，步骤5的CTL制备的方法如下：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5：1，继续培养3天获取CTL；
其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，控制细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位的生理盐水瓶，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂，4℃环境保存。
4.含有权利要求1的方法制备的特异性DC-CIK-CTL细胞。
5.含有权利要求1的方法制备的特异性DC-CIK-CTL细胞的细胞制剂。
6.一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用替加氟和注射用CTX，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX均为小剂量，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的；制剂的剂量范围分别为一次性用于病人的剂量，注射用替加氟一次用量为800mg，注射用CTX一次用量为300-400mg/m2。
7.根据权利要求6的制剂，其特征在于，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9%氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中静脉输注。
8.根据权利要求6的制剂，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX是水针、粉针或输液剂。
9.一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂。
10.一种组合包装，其特征在于，将权利要求6中的注射用替加氟和注射用CTX分别装入到各自的容器中，再一同装入同一包装盒中形成组合包装。
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