CN103007294A

CN103007294A - 一种多价免疫刺激纳米制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103007294A
Application number: CN2012105869599A
Authority: CN
Inventors: 黄庆; 陈楠; 魏敏; 裴洁; 李凡; 孙艳红; 李晓明; 樊春海
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提供一种多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，包括：（1）提供纳米金水溶液；（2）利用多聚腺苷酸修饰CpG ODN的3’端得到CpGODN-polyA；以及（3）将所述CpG ODN-polyA组装到所述纳米金上形成所述多价免疫刺激纳米制剂。本发明还提供一种通过该制备方法得到的多价免疫刺激纳米制剂及其用途。该多价免疫刺激纳米制剂与传统的CpG ODN相比，具有很高的稳定性，对细胞活力没有影响，细胞摄取率高，给药剂量低，免疫刺激活性好，在低剂量时效果尤为突出。

Description

一种多价免疫刺激纳米制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种多价免疫刺激纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术

CpG DNA是一类具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotides，此时简称为CpG ODN）和自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA。其中，CpG基序（CpG motifs）是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸。

CpG DNA是首先在卡介苗（BCG）提取液中发现的，它可以刺激多种免疫细胞的活化或增殖，产生多种细胞因子，具有强烈的免疫激活功能。CpGDNA在细菌、病毒基因组中的出现频率远高于在脊椎动物中的出现频率，相应地，脊椎动物的80％胞嘧啶的第五位碳原子是甲基化的。这种显著的差异使脊椎动物可以识别入侵的细菌及病毒，CpG基序成为人等哺乳动物免疫刺激信号的基础。

人工合成的含有CpG基序的DNA序列（CpG ODN）可以完全模仿细菌DNA的刺激性作用，具有激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子的作用，尤其可用于调节例如免疫应答向Th1型转换等免疫学效应。另外，CpG ODN可作为具有治疗性作用的DNA，在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病以及免疫佐剂等领域具有巨大的潜在应用前景。

但是，未经过修饰的CpG ODN易降解、摄取率低、需要高剂量重复给药，极大地限制了它在医学领域的应用。

现有的应用于临床实验的CpG ODN主要是DNA骨架经过硫代修饰的硫代磷酸酯骨架，简称为S-CpG ODN。研究表明，通过硫代方法修饰的CpG ODN药物存在明显的毒副作用，重复注射高剂量硫代CpG ODN会引发机体急性毒性，引起剂量依赖性脾肿大、导致肾损伤并造成其它与过度激活免疫相关的毒性表现甚至死亡。

在此基础上，申请人利用巯基修饰CpG ODN，从而将CpG ODN偶联到纳米金粒子表面，稳定地形成自组装纳米结构载体，此时，该自组装结构又被称为CpG ODN-SH-纳米金复合物。该CpG ODN-SH-纳米金复合物具有很低的细胞毒性并在细胞内具有很好的稳定性，另外，该CpG ODN-SH-纳米金复合物还具有良好的生物相容性和高效载运特性。该工作已发表在著名期刊Angew.Chem.Int.Ed.上（Polyvalent Immunostimulatory Nanoagents withSelf-Assembled CpG Oligonucleotide-Conjugated Gold Nanoparticles.Min Wei,Nan Chen,Jiang Li,Min Yin,Le Liang,Yao He,Haiyun Song,Chunhai Fan,andQing Huang,Angew.Chem.Int.Ed2012，51，5：1202-1206）。但是，申请人发现，对CpG ODN进行巯基修饰需要耗费大量的成本，而且，所形成的CpGODN-SH-纳米金复合物在低剂量下的免疫刺激效果非常有限。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的未经修饰的CpG ODN易降解、摄取率低和需要高剂量重复给药，而修饰的CpG ODN具有各种副作用以及低剂量下免疫刺激效果低等问题。

本发明提供一种多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，包括：（1）提供纳米金水溶液；（2）利用多聚腺苷酸修饰CpG ODN的3’端得到CpGODN-polyA；以及（3）将所述CpG ODN-polyA组装到所述纳米金上形成所述多价免疫刺激纳米制剂。该制备方法简便快速、原料易得、成本较低且可重复性高。

在所述步骤（1）中，通过柠檬酸三钠水溶液还原氯金酸得到所述纳米金水溶液。该还原方法操作简便，工艺成熟。虽然在实施例中仅给出了15nm的纳米金水溶液的制备步骤，但是通过调节反应的条件，本领域的技术人员可以根据实际得到各种粒径的纳米金。

所述步骤（3）进一步包括：（3.1）将所述纳米金水溶液和所述CpGODN-polyA混合均匀并震荡反应；（3.2）分批加入磷酸盐缓冲液，分离得到所述多价免疫刺激纳米制剂。磷酸盐缓冲液采用分批加入的原因是可以防止由于盐浓度的骤然增高而导致的纳米金的聚集，从而使得CpG ODN-polyA更为有效地结合到纳米金表面。

在所述步骤（3.1）之前，步骤（3）进一步包括浓缩所述纳米金水溶液。实验证明，高浓度的纳米金水溶液更有利于组装到所述CpG ODN-polyA表面。通过上述浓缩步骤，所述纳米金与所述CpG ODN-polyA的终浓度优选比值为10nM：3μM。应该理解，虽然实施例中仅给出了该具体的比例值，但是，其他终浓度比例的纳米金和CpG ODN-polyA同样能够发生结合，只要CpG ODN序列上存在多聚腺苷酸polyA即可。

在所述步骤（3.2）中，所述分离操作包括利用磷酸盐缓冲液进行洗涤和重悬。该具体的分离操作主要用于洗涤除去没有组装到纳米金表面的CpGODN-polyA，消除其它干扰因素。

所述CpG ODN-polyA的序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3。

所述CpG ODN-polyA在其5’端进行FAM标记或Cy5标记。

本发明提供一种上述制备方法所获得的多价免疫刺激纳米制剂，所述多价免疫刺激纳米制剂为polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物。该polyA tailedCpG ODN-纳米金复合物的免疫刺激活性及材料稳定性与传统的巯基修饰的CpG-纳米金复合物相当，但价格更为低廉。

本发明还提供一种上述多价免疫刺激纳米制剂在免疫刺激上的应用。

所述polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物的浓度为5-25nM。

通过透射电子显微镜TEM观察polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物进入细胞后在细胞内的位置，以及通过氯喹抑制其受体TLR-9确定复合物的细胞通路。结果表明，本发明的多价免疫刺激纳米制剂进入细胞后主要位于内吞小体内，且该多价免疫刺激纳米制剂与传统CpG DNA细胞通路一致，均是通过其受体TLR-9起作用的。本发明提供的polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物分别刺激RAW264.7细胞8h、24h，取细胞培养上清进行细胞因子TNF-a（8h）、IL-6/IL-12（24h）的ELISA检测。结果表明，本发明的多价免疫刺激纳米制剂可以显著提高细胞水平的免疫刺激活性，活性的提高在低浓度时尤为明显。通过将本发明提供的polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物通过尾静脉注射到小鼠体内，3h后取血清进行ELISA检测。结果表明，与传统未经修饰的CpG DNA相比，本发明的多价免疫刺激纳米制剂可以提高CpG的体内免疫刺激活性。

总之，本发明提供的多价免疫刺激纳米制剂与传统的CpG ODN相比，具有很高的稳定性，对细胞活力没有影响，细胞摄取率高，给药剂量低，免疫刺激活性好，在低剂量时效果尤为突出。

附图说明

图1A是通过透射电子显微镜TEM表征所获得的纳米金的照片；

图1B是通过透射电子显微镜TEM表征所获得的根据本发明的纳米金复合物的照片；

图2是通过荧光分光光度计所获得的CpG ODN浓度的数据分析图，其中，横坐标CpG-SH表示CpG ODN-SH；CpG-A5表示CpG ODN-polyA5；CpG-A10表示CpG ODN-polyA10；CpG-A15表示CpG ODN-polyA15；纵坐标表示每个纳米金粒子表面的CpG ODN的条数；

图3A是通过动态光散射粒子分析仪所获得的CpG ODN-SH与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；

图3B是通过动态光散射粒子分析仪所获得的CpG ODN-polyA5与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；

图3C是通过动态光散射粒子分析仪所获得的CpG ODN-polyA10与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；

图3D是通过动态光散射粒子分析仪所获得的CpG ODN-polyA15与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；

图4是通过噻唑蓝（MTT）细胞活力检测方法所获得的polyA tailed CpGODN-纳米金复合物细胞活力的数据分析图，其中，CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailedCpG ODN-纳米金复合物；横坐标表示复合物的浓度；纵坐标表示细胞活力；

图5是通过流式细胞仪检测所获得的纳米金复合物的细胞摄取图，其中，空白对照组表示的是序列为Cy5-CpG-poly A5，其序列为SEQ ID NO.9：Cy5-TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA；Cy5-CpG-A5-AuNPs表示Cy5修饰的polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物；

图6A是细胞摄取Cy5-ssCpG ODN的细胞亮场视野图；

图6B是细胞摄取Cy5-CpG-A5-AuNPs的细胞亮场视野图；

图6C是细胞摄取Cy5-ssCpG ODN的细胞荧光图片，单链ODN由于难以进入细胞，所以没有观察到荧光；

图6D是细胞摄取Cy5-CpG-A5-AuNPs的细胞的荧光图片，可见Cy5-CpG-A5-AuNPs大量摄取；

图7A表示polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物与硫代CpG在不同溶度下的TNF-a细胞因子分泌水平对比，其中，S-CpG表示硫代CpG ODN，其指的是CpG ODN1826对应的硫代磷酸酯骨架；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物；

图7B表示polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物、CpG ODN-SH-纳米金复合物、硫代CpG在不同溶度下的TNF-a细胞因子分泌水平对比，其中，S-CpG ODN表示CpG ODN1826对应的硫代磷酸酯骨架；CpG-SH-AuNPs表示CpG ODN-SH-纳米金复合物；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpGODN-纳米金复合物；

图7C表示polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、polyA10tailed CpGODN-纳米金复合物、polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物在不同溶度下的IL-6细胞因子分泌水平对比，其中，CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpGODN-纳米金复合物；CpG-A10-AuNPs表示polyA10tailed CpG ODN-纳米金复合物；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物；

图7D表示polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、polyA10tailed CpGODN-纳米金复合物、polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物在不同溶度下的IL-12细胞因子分泌水平对比，其中，CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpGODN-纳米金复合物；CpG-A10-AuNPs表示polyA10tailed CpG ODN-纳米金复合物；CpG-A15-AuNPs表示polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物；

图8A表示磷酸缓冲液、纳米金、指3’端修饰有5个腺苷酸的非CpG ODN、单链CpG ODN、polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、CpG ODN-SH-纳米金复合物、硫代CpG ODN的IL-12细胞因子分泌水平对比，其中，PBS表示磷酸缓冲液；AuNPs表示纳米金；Non-CpG-A5-Au表示3’端修饰有5个腺苷酸的非CpG ODN；ssCpG ODN表示单链CpG ODN；CpG-A5-Au表示polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物；CpG-SH-Au表示CpG ODN-SH-纳米金复合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN；

图8B表示磷酸缓冲液、纳米金、指3’端修饰有5个腺苷酸的非CpG ODN、单链CpG ODN、polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、CpG ODN-SH-纳米金复合物、硫代CpG ODN的MCP-1细胞因子分泌水平对比，其中，PBS表示磷酸缓冲液；AuNPs表示纳米金；Non-CpG-A5-AuNPs表示3’端修饰有5个腺苷酸的非CpG ODN；ssCpG ODN表示单链CpG ODN；CpG-A5-AuNPs表示polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物；CpG-(SH)-AuNPs表示CpGODN-SH-纳米金复合物；S-CpG ODN表示硫代CpG ODN。

具体实施方式

下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。

在本文中，CpG DNA是指一类具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列。

CpG ODN是指一类含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸。

CpG ODN-SH是指3’端修饰有巯基的CpG ODN。

CpG ODN-SH-纳米金复合物是指CpG ODN-SH与纳米金组装形成的复合物。

CpG ODN-polyA是指一类3’端修饰有多聚腺苷酸的CpG ODN。其中，CpG ODN-polyA5是指3’端修饰有5个腺苷酸的CpG ODN。CpGODN-polyA10是指3’端修饰有10个腺苷酸的CpG ODN。CpG ODN-polyA15是指3’端修饰有15个腺苷酸的CpG ODN。

CpG ODN-polyA-纳米金复合物是指CpG ODN-polyA与纳米金组装形成的复合物，同时也被称为polyAtailed CpG ODN-纳米金复合物。其中，polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物是指CpG ODN-polyA5与纳米金组装形成的复合物。polyA10tailed CpG ODN-纳米金复合物是指CpG ODN-polyA10与纳米金组装形成的复合物。polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物是指CpGODN-polyA15与纳米金组装形成的复合物。

FAM-CpG ODN是指一类5’端修饰有荧光基团FAM的CpG ODN。

FAM-CpG ODN-polyA是指一类5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有多聚腺苷酸的CpG ODN。其中，FAM-CpG ODN-polyA5是指5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有5个腺苷酸的CpG ODN。FAM-CpGODN-polyA10是指5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有10个腺苷酸的CpG ODN。FAM-CpG ODN-polyA15是指5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有15个腺苷酸的CpG ODN。

Cy5-CpG ODN-polyA是指一类5’端修饰有荧光基团Cy5，3’端修饰有多聚腺苷酸的CpG ODN。其中，Cy5-CpG ODN-polyA5是指5’端修饰有荧光基团Cy5，3’端修饰有5个腺苷酸的CpG ODN。Cy5-CpG ODN-polyA10是指5’端修饰有荧光基团Cy5，3’端修饰有10个腺苷酸的CpG ODN。Cy5-CpG ODN-polyA15是指5’端修饰有荧光基团Cy5，3’端修饰有15个腺苷酸的CpG ODN。

实施例1纳米金的制备

试剂包括：

氯金酸购自阿拉丁公司，分析纯的柠檬酸三钠购自国药化学试剂有限公司。

制备过程包括以下几个步骤：

（1）取1%氯金酸HAuCl₄溶液1ml和99ml的Milli-Q水倒入干净的蒸馏瓶内，制成0.01%HAuCl₄工作溶液，加入搅拌子，置于磁力搅拌加热器上加热并搅拌；

（2）待溶液完全沸腾后，将转速调至30，并一次性快速加入3.5ml新鲜配制的10mg/ml柠檬酸三钠水溶液；

（3）保持溶液沸腾且快速搅拌20min，停止加热，继续搅拌，冷却；

（4）老化过夜，用0.22μm滤膜过滤，得到粒径基本均一的15nm的纳米金水溶液，4℃保存。

应该理解，上述提供的纳米金的制备方法是已知的，通过调节反应的条件，本领域的技术人员可以根据实际需要调节最终的所获得的纳米金的粒径。同样，除了上述通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法来获得纳米金之外，其他任何合适的能够得到纳米金的方法均在本发明的保护范围之内。

实施例2纳米金复合物的制备及表征

试剂包括：

HPLC纯化的CpG ODN合成自Invitrogen公司，分析纯的氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自国药化学试剂有限公司。

制备过程包括以下几个步骤：

（1）取1ml纳米金12000rpm4℃离心20min，弃去800μl上清，沉淀重悬即得浓缩5倍的纳米金溶液。

（2）取1ml浓缩5倍的纳米金于1.5mL离心管中至终浓度10nM，加入100μM CpG ODN至终浓度3μM，轻轻吹打混合均匀，25℃400rpm震荡过夜。

其中，该CpG ODN是CpG ODN-polyA5（其序列为SEQ ID NO.1：TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAA）、CpG ODN-polyA10（其序列为SEQ ID NO.2：TCCATGACGTTCCTGACGTTTTTTTAAAAAAAAAA）或CpG ODN-polyA15（其序列为SEQ ID NO.3：TCCATGACGTTCCTGACGTTTTT TTAAAAAAAAAAAAAAA）。不难看出，本实施例所利用的CpG ODN的DNA序列仅是简单地在CpG ODN1826序列的3’端加上一段不同长度的多聚腺苷酸polyA序列。为了便于后续的表征，该CpG ODN可以首先进行荧光基团FAM在其5’端进行标记，此时对应的CpG ODN为FAM-CpG ODN-polyA5、FAM-CpG ODN-polyA10、FAM-CpGODN-polyA15。

（3）缓慢加入1M磷酸盐缓冲液PBS（1M NaCl/0.1M PB，pH7.4）使其终浓度为0.1M，PBS（分5～6次加入，大于30min/次间隔），25℃400rpm震荡24h。

（4）13000rpm，4℃，20min离心，弃上清，加入500μl的0.1M PBS，如此反复洗3次，加入适量0.1M PBS重悬，4℃保存待用。

通过透射电子显微镜TEM表征所获得的纳米金复合物可知，上述方法成功地将CpG ODN偶联到纳米金粒子表面从而形成纳米金复合物，该纳米金复合物又被称为polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物。具体的表征步骤包括：将纳米金和所形成的纳米金复合物用1%磷钨酸水溶液（pH7.0）染色，滴于铜网上烘干，然后利用TEM观察（Jeol,JEM2010,200KV）。结果如图1所示，由于纳米金本身是不会被染色的，裸露的纳米金呈现出图1A所示的视野；相反，由于纳米金复合物表面包裹有DNA（CpG ODN），即CpG ODN偶联到纳米金粒子表面，则纳米金复合物呈现出图1B所示的染色后的界面。

通过荧光分光光度计可以对上述获得的polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物进行进一步表征。具体表征步骤包括：将巯基乙醇加入FAM荧光标记的CpG-纳米金溶液中至终浓度20mM，震荡孵育过夜，离心取上清后，用荧光分光光度计测定荧光强度，换算得到DNA的摩尔浓度。结果如图2所示，不同polyA长度的CpG序列（FAM-CpG ODN-polyA5、FAM-CpG ODN-polyA10、FAM-CpG ODN-polyA15）及巯基修饰的CpG序列（CpG ODN-SH）组装到纳米金的数量，随着polyA长度的增加，每个纳米金粒子上组装的CpG序列条数减少。

另外，通过动态光散射粒子分析仪（BECKMAN COULTER,America）可以测定上述获得的polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物的水合半径及分散度，结果如图3A-图3D所示，其中，图3A表示的是CpG ODN-SH与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；图3B表示的是CpG ODN-polyA5与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；图3C表示的是CpG ODN-polyA10与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；图3D表示的是CpG ODN-polyA15与纳米金组装形成的复合物对应的谱图；相关的数据归纳为下表1：

表1

	平均粒径大小（nm）	分散系数
			CpG ODN-SH-纳米金复合物	30.0	0.175
polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物	35.3	0.304
			polyA10tailed CpG ODN-纳米金复合物	35.9	0.292
polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物	37.6	0.282

由此可知，随着polyA长度增加，CpG ODN-纳米金复合物的粒径逐渐增大。而且，所形成的各组复合物的分散良好，呈单一分布峰。

实施例3细胞活力及摄取率检测

试剂包括：

Raw264.7细胞购自中科院上海细胞库，噻唑蓝（MTT），十二烷基磺酸钠（SDS）,Hoechst33258购自Sigma-Aldrich公司，Cy5标记的荧光修饰CpGODN购自Invitrogen公司

MTT细胞活力检测方法：

（1）前一日铺板，24孔板每孔铺2×105个细胞，37℃5%CO2培养过夜。

（2）500μl PBS洗一次，将新鲜的含有5-25nM的CpG ODN-polyA-纳米金的培养基加入各孔，继续培养24小时

（3）每孔加入50μl5mg/ml的MTT，37度孵育4小时后，会有蓝紫色不溶甲瓚生成，此时每孔加入10%SDS（pH2-3）1ml溶解甲瓚，37度孵育过夜

（4）12000rpm，20min离心，取200μl上清至96孔板中，OD570nm处测吸光值（参考波长633nm）

（5）细胞存活率计算公式：生存率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%

细胞摄取率检测：

（1）Cy5荧光标记的CpG ODN-polyA5、CpG ODN-polyA15与纳米金组装，组装方法与实施例2相同，形成polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物。

（2）不同浓度polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物、polyA15tailedCpG ODN-纳米金复合物（5nM、10nM、25nM）分别加入预先铺好的细胞中，37℃孵育4小时，分别进行流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测。

结果如图4所示，纵坐标表示MTT检测polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物细胞活力，由此可以看出所测浓度（5-25nM）范围内，纳米金复合物对细胞活力没有影响，表现出良好的生物相容性。

通过流式细胞仪检测可以得到纳米金复合物的细胞摄取图，结果如图5所示，由于单链CpG序列（CpG1826，其序列为SEQ ID NO.4:TCCATGACGTTCCTGACGTT）很难进入细胞，所以几乎没有检测到荧光；而polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物可以进入细胞，且检测到的荧光呈现浓度依赖性变化，即随着纳米金复合物浓度的增大，荧光强度逐渐增加。

另外，通过激光共聚焦显微镜可以检测细胞对polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物的摄取，结果如图6A-图6D所示，可以直观从其看到细胞对polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物的摄取；相对应的，单链Cy5-CpG DNA很难进入细胞，细胞内没有荧光。

实施例4细胞水平免疫刺激检测

试剂包括：

Raw264.7细胞购自中科院上海细胞库，ELISA抗体及标准品购自eBioscience公司。

实验方法如下：

（1）铺24孔板，每孔2×105个Raw264.7细胞，37℃过夜

（2）新鲜培养基含有不同浓度的polyA-tailed CpG-纳米金复合物加入各孔，37度孵育8h（TNF-α）or24h（IL-6,IL-12）

（3）8h、24h取细胞培养上清，进行ELISA检测。

结果如7A-图7D所示，图7A为polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物与硫代CpG在不同溶度下的TNF-a分泌水平比较，可以看出，在5nM-25nM范围内，polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物分泌TNF-a多于硫代CpG，且浓度越低，差异越明显，说明CpG ODN-polyA-纳米金具有低剂量高免疫刺激活性的特点。图7B-图7D分别检测了不同polyA长度的纳米金复合物的TNF-a、IL-6、IL-12细胞因子的分泌，说明polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物具有明显的免疫刺激活性，并且在CpG浓度相同的情况下，细胞因子的分泌量polyA15tailed CpG ODN-纳米金复合物>polyA10tailed CpG ODN-纳米金复合物>polyA5tailed CpG ODN-纳米金复合物。

实施例5动物体内免疫刺激测试

试剂包括：

ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物公司；IL-12细胞因子由上海森雄生物科技实业有限公司提供检测；CBA试剂盒购自BD公司

实验方法如下：

（1）4-6周大的ICR小鼠饲养在无菌、恒温的动物房内，称取体重大约20-25g时用于实验。

（2）将小鼠随机分为7组，每组7只。

（2）单链CpG DNA或不同修饰/组装的CpG DNA均溶于PBS中，以PBS作为对照，通过尾静脉注射注入小鼠体内，注射剂量为60μg/kg(0.1ml/10g体重).

（3）注射3小时后，将小鼠通过摘眼球放血的方法，取小鼠全血37℃静置半小时，3000rpm离心15分钟后取血清-80度待测

（4）血清IL-12及MCP-1含量通过ELISA/CBA试剂盒按照说明书进行检测。

结果如图8A和图8B所示，通过实验动物体内实验，取血清测得IL-12、MCP-1细胞因子的含量，说明polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物在体内也具有一定的免疫刺激活性。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）提供纳米金水溶液；

（2）利用多聚腺苷酸修饰CpG ODN的3’端得到CpG ODN-polyA；以及

（3）将所述CpG ODN-polyA组装到所述纳米金上形成所述多价免疫刺激纳米制剂。

2.如权利要求1所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，通过柠檬酸三钠水溶液还原氯金酸得到所述纳米金水溶液。

3.如权利要求1所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）进一步包括：

（3.1）将所述纳米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均匀并震荡反应；

（3.2）分批加入磷酸盐缓冲液，分离得到所述多价免疫刺激纳米制剂。

4.如权利要求3所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3.1）之前，步骤（3）进一步包括浓缩所述纳米金水溶液。

5.如权利要求3所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3.2）中，所述分离操作包括利用磷酸盐缓冲液进行洗涤和重悬。

6.如权利要求1所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述CpG ODN-polyA的序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3。

7.如权利要求1所述的多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述CpG ODN-polyA在其5’端进行FAM标记或Cy5标记。

8.一种如权利要求1-7中任一项所述的制备方法所获得的多价免疫刺激纳米制剂，其特征在于，所述多价免疫刺激纳米制剂为polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物。

9.一种如权利要求8所述的多价免疫刺激纳米制剂在免疫刺激上的应用。

10.如权利要求9所述的多价免疫刺激纳米制剂在免疫刺激上的应用，其特征在于，所述polyA tailed CpG ODN-纳米金复合物的浓度为5-25nM。