CN114748446B - 一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域，尤其涉及一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用。所述信使RNA铝基自组装递送系统由铝离子与mRNA及共组装分子，通过配位驱动的原位自组装形成的纳米晶，作为白细胞介素21的mRNA的无载体自递送系统，可实现白细胞介素21的mRNA的高效递送，提升mRNA的稳定性及靶向递送效率。纳米颗粒在血清中稳定，毒性低，可实现黑色素瘤细胞之中mRNA高效转染，在黑色素瘤小鼠模型中，可以显着抑制肿瘤生长。是一种高效、便捷的核酸递送系统制备方法，具有极高的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域，特别涉及一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
癌症目前已成为危险人类健康的重大疾病，与传统的化疗和物理治疗相比，免疫检查点治疗显著延长了癌症患者的无进展生存期，但由于肿瘤的免疫抑制微环境，免疫治疗仅在少数患者中引发持久反应。尽管与炎性细胞因子或免疫激动剂的合理组合可以缓解一些免疫抑制，但这些蛋白质的全身给药受到严重的免疫相关不良事件的阻碍。早期1期临床试验涉及一些有希望的细胞因子，如白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素12(IL-12)，由于有限的肿瘤内的药物暴露和健康组织中淋巴细胞的过度刺激，导致抗肿瘤疗效欠佳，治疗相关的发病率甚至死亡率很高。白细胞介素21(IL-21)是主要的免疫调节剂之一，通过影响多种免疫细胞来调节各种免疫应答。IL-21能增强免疫细胞的抗原特异性反应，促进T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性，在B细胞分化和生发中心中起着关键作用，是开发肿瘤免疫疗法的潜在靶点。然而，IL-21的过表达可引起致病性自身抗体的产生，导致自身免疫性疾病的发生。IL-21的临床肿瘤治疗由于严重的肝脏或胃肠道毒性问题以及缺乏一致的临床活性最终应用受限。开发将细胞因子高效递送到肿瘤部位的策略极为重要。基于递送的IL-21的基因治疗可在不诱导血管渗漏综合征的情况下，实现抗肿瘤反应。
通过质粒DNA转染IL-21实现抗肿瘤的功能已经得到证实(Cancer Res.2003,63,9016.)，然而，质粒DNA的递送受到体内递送不稳定的限制，以及依赖细胞核定位及基因整合风险的阻碍。mRNA也能提供快速的蛋白质表达，且不依赖于核定位，无基因整合风险，是IL-21肿瘤内递送的更优选择。然而，mRNA的递送也有几个潜在的挑战，包括大尺寸、高负电荷、对降解的敏感性，如果它没有被有效地修饰和传递到细胞中，将导致目标蛋白质翻译能力欠佳。因此，在保持完整性和功能活性的同时，安全有效地在体内将mRNA递送至肿瘤细胞仍然具有挑战。
发明内容
本发明提供了一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用。所述mRNA铝基自组装递送系统由铝离子与细胞因子如白细胞介素21的mRNA及共组装分子，通过配位驱动的原位自组装形成的纳米晶，作为白细胞介素21的mRNA的无载体自递送系统，可实现白细胞介素21的mRNA的高效递送，提升mRNA的稳定性及靶向递送效率。纳米颗粒在血清中稳定，毒性低，可实现黑色素瘤细胞之中mRNA高效转染，在黑色素瘤小鼠模型中局部给药时，可以显着抑制肿瘤生长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述递送系统由铝离子、mRNA和共组装分子通过配位相互作用自组装而成。
优选地，所述mRNA为携带细胞因子遗传信息的单链核糖核苷酸，进一步优选为白细胞介素21的mRNA。
优选地，所述共组装分子为多羟基药物小分子，所述多羟基药物小分子选自白藜芦醇、大黄酸、单宁酸、没食子酸、茶多酚、多巴胺中的至少一种；进一步优选为白藜芦醇。
第二方面，本发明提供了第一方面所述铝基自组装递送系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将mRNA和共组装分子加入溶剂中，搅拌反应，得到混合液1；
(2)将铝盐溶液和所述混合液1混合均匀，得到混合溶液2；
(3)在所述混合溶液2中加入碱溶液调节pH，并恒温度反应，冷却后产物离心洗涤，得到所述mRNA铝基自组装递送系统。
所述步骤(1)中搅拌反应的温度为4-25℃，所述搅拌反应的时间为1-20min，所述搅拌反应的搅拌速率为100～600rpm；
所述步骤(2)中的混合方式为搅拌或涡旋；
所述步骤(3)中恒温反应的时间为0.5～24h。优选地，所述离心洗涤的转速为6000～18407g/min，所述离心的时间为1～15min/次，所述离心的次数为1～5次。
优选地，所述铝盐溶液中铝离子的浓度为1～100mM。
优选地，所述混合液1中mRNA的浓度为0.005～1.0mM。
优选地，所述共组装分子的浓度为1～100mM。
优选地，所述混合液2中，所述铝盐与所述共组装分子的摩尔比为100:1～1:100。
优选地，所述混合液2中铝离子与mRNA的摩尔比为(1～500):1。
优选地，所述碱溶液为NaOH溶液、KOH溶液、磷酸钠溶液、焦磷酸钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液和氨水中的一种以上；所述碱溶液的浓度为5～1000mM。
所述搅拌的速度为0～1400rpm，
所述搅拌的时间为5～300min。
所述pH为6.0～10.0；所述反应的温度为25～90℃。
第三方面，本发明提供了所述mRNA的铝基自组装递送系统在制备药物递送系统中的应用。
优选地，所述药物为抗肿瘤、抗病毒药物。
优选的，所述应用包括瘤内注射使用、肌肉注射使用、皮下注射使用、皮内注射使用、静脉注射使用、施用于粘膜使用中任意一种使用或任意组合的使用。
本发明具有的技术效果为：
本发明所提供的铝基自组装能够有效结合mRNA，并能有效提升mRNA的入胞水平，提升mRNA的血清稳定性，降低全身毒性，制备方法科学高效，对技术人员的水平要求较低，应用前景广泛。
相较于现有mRNA递送技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的共组装分子(抗肿瘤、抗病毒药物)、信使RNA和铝离子组装在同一个纳米颗粒内部，可以同时递送进入细胞，具有协同治疗的效果；
(2)共组装颗粒含有金属离子稳定核酸结构，提升颗粒在血清的稳定性，降低血管渗漏引起的毒性风险。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒的TEM图像；
图2为本发明实施例6中获得铝基自组装颗粒的TEM图像；
图3为本发明实施例9中获得铝基自组装颗粒的TEM图像；
图4为本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001的细胞毒性结果；
图5为本发明实施例6获得的铝基自组装颗粒mRRAl-006的胞内mRNA递送结果；
图6为本发明实施例13中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗肿瘤模型小鼠后，小鼠体重；
图7为本发明实施例13中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗肿瘤模型小鼠后，肿瘤体积；
图8为本发明实施例13中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗肿瘤模型小鼠后，存活率情况；
图9为本发明实施例14中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗组、free mRNA治疗组以及空白对照组治疗肿瘤模型小鼠后，瘤内关键因子IL12+细胞检测结果；
图10为本发明实施例14中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗组、free mRNA治疗组以及空白对照组治疗肿瘤模型小鼠后，瘤内关键因子干扰素IFN-γ表达阳性细胞检测结果；
图11为本发明实施例14中，本发明实施例1中获得铝基自组装颗粒mRRAl-001治疗组、free mRNA治疗组以及空白对照组治疗肿瘤模型小鼠后，瘤内关键因子CD8+T细胞百分比检测结果；
图12为本发明铝基自组装递送系统的制备方法示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种mRNA的铝基自组装递送系统及其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的白细胞介素21信使RNA(mRNA)的铝基自组装递送系统制备方法，以及在抗肿瘤的应用中所用原料或试剂均可由市场购得。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
主要原料：
白藜芦醇购自麦克林，CAS:501-36-0；
IL-21的mRNA
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
将含有5nmol mRNA的360μL水溶液中与20μL白藜芦醇(20mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将20μL AlCl3·6H2O(20mM)水溶液添加到溶液1中，然后涡旋10秒。然后，用100mM的NaOH调节pH至7左右，将混合物在95度金属浴中加热反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-001)。
实施例2
将含有5nmol mRNA的360μL水溶液中与20μL白藜芦醇(20mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将20μL Al(NO3)3·6H2O(20mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的磷酸钠调节pH至7左右，将混合物在50度下100rpm搅拌反应1小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-002)。
实施例3
将含有5nmol mRNA的320μL水溶液中与40μL白藜芦醇(20mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将40μL AlCl3·6H2O(20mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的KOH调节pH至6.5左右，将混合物在75度下100rpm搅拌反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-003)。
实施例4
将含有5nmol mRNA的320μL水溶液中与40μL白藜芦醇(20mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将40μL Al2(SO4)3·6H2O(20mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的焦磷酸钠调节pH至6.5左右，将混合物在50度下100rpm搅拌反应6小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-004)。
实施例5
将含有5nmol mRNA的320μL水溶液中与40μL白藜芦醇(80mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将40μL Al(NO3)3·6H2O(40mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的碳酸钠调节pH至7.5左右，将混合物在30度下100rpm搅拌反应6小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-005)。
实施例6
将含有5nmol mRNA-Cy5的320μL水溶液中与40μL白藜芦醇(40mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将40μL AlAc3·6H2O(80mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的NaOH调节pH至8.0左右，将混合物在60度下100rpm搅拌反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-006)。
实施例7
将含有5nmol mRNA的360μL水溶液中与20μL单宁酸(40mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将20μL AlAc3·6H2O(100mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的KOH调节pH至9.5左右，将混合物在25度下100rpm搅拌反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-白藜芦醇-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-007)。
实施例8
将含有5nmol mRNA的360μL水溶液中与20μL没食子酸(60mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将20μL AlCl3·6H2O(100mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的氨水调节pH至7.5左右，将混合物在50度下100rpm搅拌反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-没食子酸-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-008)。
实施例9
将含有5nmol mRNA的360μL水溶液中与20μL多巴胺(100mM)在室温下涡旋1分钟混合得到溶液1，随后将20μL AlCl3·6H2O(100mM)水溶液添加到溶液1中，然后100rpm搅拌2分钟。然后，用100mM的NaOH调节pH至6.5左右，将混合物在50度下100rpm搅拌反应3小时，产物在13000g/min速度离心洗涤3次，得到mRNA-多巴胺-铝自组装纳米颗粒(mRRAl-008)。
实施例10
(1)铝基自组装递送系统的形貌表征
25℃条件下，用超纯水将铝基自组装的浓度稀释至10μg/ml，滴在普通碳支持膜上，待其自然干燥后在电镜下观察铝基自组装的结构，透射电镜(FEI公司，型号Tecnai G220S-TWIN)下显示为颗粒状。结果如图1～3所示，其中图1为实施例1产物电镜图像，图2为实施例9产物电镜图像，图3为实施例6产物电镜图像。图1～3表明基于多种不同比例和浓度的反应条件，金属-多酚配合物的自组装均能够得到尺寸均一的自组装颗粒。
(2)对所述铝基自组装进行水合粒径表征
25℃条件下，将铝基自组装颗粒的浓度稀释至10μg/ml，用纳米粒度仪测试铝基自组装的粒径(购自Malvern公司，Zetasizer Nano ZS型号)，结果如表1所示。
实施例1～9制备的铝基自组装颗粒的理化性质如表1所示。
表1
| 样品 | 水合粒径 | 样品 | 水合粒径 |
| 实施例1 | 130nm | 实施例6 | 135nm |
| 实施例2 | 140nm | 实施例7 | 1.92μm |
| 实施例3 | 340nm | 实施例8 | 2.89μm |
| 实施例4 | 670nm | 实施例9 | 3.50μm |
| 实施例5 | 2.27μm |
表1可知，本发明所有实施例均得到纳米尺寸的铝基自组装纳米颗粒，其中实施例1得到的铝基自组装尺寸分布更加均一，且尺寸处于纳米级，更适合胞内递送mRNA所以选择实施例1得到的铝基自组装纳米颗粒进行后继实验。
实施例11
本实施例主要是为了评估实施例1制备的mRRAl-001自组装纳米颗粒的体外细胞毒性，将细胞以合适数目接种在96孔板上，并使其附着和生长直至约80％密度。用不同mRNA浓度(0.062、0.125、0.250和0.500μg ml-1)的mRRAl-001转染细胞)16小时，吸去培养上清，PBS洗一遍后，加入10％的CCK-8工作液，继续孵育2h后，将检测液移至新的96孔细胞培养板中，对比检测450nm和600nm处的吸光度。结果如图4所示，由图4可知在0.5μg ml-1的最高IL-21mRNA浓度下，近80％的B16F10细胞仍然存活，表明本发明实施例1所构建的mRRAl-001自组装纳米颗粒具有非常低的细胞毒性。
实施例12
本实施例评估了本发明实施例6制备的自组装颗粒mRRAl在细胞内递送白细胞介素21-mRNA的能力。本实施例用Cy5标记IL-21mRNA基于实施例6同样制备条件制备了自组装纳米颗粒mRRAl-006。B16F10细胞接种到玻璃底小皿中，用mRRAl-006处理2h，8h后，将其固定，用Hoechst33342对细胞核进行染色，并在激光共聚焦显微镜下观察。结果如图5所示，由图5的激光共聚焦图像说明细胞核(用Hoechst33342标记)和mRRAl-006(用Cy5标记)的荧光，胞内mRRAl-006的量随着孵育时间延长逐渐增加(图5)，这可归因于mRRAl-006在细胞中的时间依赖性内化增加。
实施例13
BALB/c裸鼠(6-7周)在右腿后部接种了B16F10黑色素瘤，当肿瘤体积达到～100mm3时，小鼠按体重随机分为3组，分别为：空白对照组(Ctrl)，free mRNA(1nmol)对照组，mRRAl-001(含mRNA1nmol)组。瘤内注射材料药物，并记为第0天，分别于第1天，第4天，第7天对各组小鼠进行相应的治疗。每两天记录一次各组小鼠的肿瘤体积。每只小鼠肿瘤体积(V，mm3)通过以下等式计算：体积V＝长×宽2/2；结果如图4～8所示，其中图6为各组别小鼠体重变化情况，图7为各组别小鼠肿瘤体积变化情况，图8为各组别小鼠存活率情况。
由图6可知，各组别小鼠体重变化并不大；由图7可知，20天时，对照组小鼠肿瘤平均大小为1746mm3；free mRNA组能一定程度上抑制肿瘤的生长，肿瘤平均大小为1028mm3，而使用本申请的mRRAl-001能够有效抑制肿瘤的生长，小鼠肿瘤平均大小为201.7mm3；由图8可知，对照小鼠存活时间最长为26天，free mRNA小鼠的存活时间最长为43天，而mRRAl-001组小鼠在70天时仍有部分存活，组内其余小鼠存活时间也有显著延长。结果表明，使用mRRAl-001能显著抑制肿瘤生长并提高小鼠存活率以及延长存活时间，mRRAl-001可作为肿瘤免疫增效剂增强机体的抗原位瘤效果。
实施例14
将实施例13所研究的小鼠安乐死后，将其肿瘤解剖并用胶原酶IV和DNase在37℃下消化，然后过滤以制备其单细胞悬液。每个样品在4℃下用荧光偶联IL-21，INF-γ及CD8+T细胞特异性抗体染色，然后固定在4％PFA中并进行流式细胞术分析。用FlowJoV10软件分析数据。实验结果如图9～11所示。
由图9～11可知，经过不同的药物治疗后，mRRAl-001处理的肿瘤组织中具有36.8％IL12+细胞，约为free mRNA治疗组的肿瘤的4倍(图9，验证了mRRAl-001在肿瘤中的有效转染效率。mRRAl-001处理的肿瘤具有26.45％干扰素IFN-γ表达阳性细胞，是freemRNA治疗组的3倍(图10)，而CD8+T细胞百分比为17.2％是free组的3.7倍(图11)。图9～11的结果充分证明了mRRAl-001是非常有效的白细胞介素21的mRNA递送系统。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (16)
1.一种mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述递送系统由铝离子、mRNA和共组装分子通过配位相互作用自组装而成；
所述共组装分子为多羟基药物小分子；
所述多羟基药物小分子为白藜芦醇；
所述的mRNA的铝基自组装递送系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将mRNA和共组装分子加入溶剂中，搅拌反应，得到混合液1；
(2)将铝盐溶液和所述混合液1搅拌或涡旋方式混合均匀，得到混合溶液2；
(3)在所述混合溶液2中加入碱溶液调节pH，并恒温反应，冷却后产物离心洗涤，得到所述mRNA铝基自组装递送系统，所述pH为6.5～8.0；所述反应的温度为50～90℃。
2.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，
所述mRNA为携带细胞因子遗传信息的单链核糖核苷酸。
3.根据权利要求2所述mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述mRNA为细胞因子mRNA。
4.根据权利要求3所述mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述mRNA为白细胞介素21的mRNA。
5.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌反应的温度为4～25℃，所述搅拌反应的时间为1～20min，所述搅拌反应的搅拌速率为100～600rpm。
6.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述步骤(3)中恒温反应的时间为0.5～24h，所述离心洗涤的转速为6000～18407g/min，所述离心的时间为1～15min/次，所述离心的次数为1～5次。
7.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述铝盐溶液中铝离子的浓度为1～100mM。
8.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述混合液1中mRNA的浓度为0.005～1.0mM。
9.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述共组装分子的浓度为1～100mM。
10.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述混合液2中，所述铝盐与所述共组装分子的摩尔比为100:1～1:100。
11.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述混合液2中铝离子与mRNA的摩尔比为(1～500):1。
12.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述碱溶液为NaOH溶液、KOH溶液、磷酸钠溶液、焦磷酸钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液和氨水中的一种以上；所述碱溶液的浓度为5～1000mM。
13.根据权利要求1所述的mRNA的铝基自组装递送系统，其特征在于，所述步骤(1)中，所述搅拌的速度为0～1400rpm，所述搅拌的时间为5～300min。
14.权利要求1-13任一项所述的mRNA的铝基自组装递送系统在制备药物递送系统中的应用。
15.权利要求1-13任一项所述的mRNA的铝基自组装递送系统在制备抗肿瘤或抗病毒药物递送系统中的应用。
16.权利要求14-15任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括瘤内注射使用、肌肉注射使用、皮下注射使用、皮内注射使用、静脉注射使用、施用于粘膜使用中任意一种使用或任意组合的使用。
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