CN115919880A - 中药成分组合物及其制剂在协同pd-1抑制剂抗肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药成分组合物及其制剂在协同PD‑1抑制剂抗肿瘤中的应用。所述中药活性成分组合物为氧化苦参碱、黄芪甲苷配伍的组合物，二者配伍可提高PD‑1抑制剂的抗肿瘤疗效。此外还可协同其药学上可接受的载体以制剂的形式实现体内药物递送，载体可选用铁基MOF、脂质体等，实现极性不同的氧化苦参碱与黄芪甲苷的共载及药物高效递送。铁基MOF载体具有载药量高，Fe离子可协同黄芪甲苷改善肿瘤浸润性T细胞活性的优势，铁磁性和血小板膜修饰还可精准靶向肿瘤组织；脂质体制备工艺成熟，有利于工业化生产，临床转化前景广阔，二者分别与PD‑1抑制剂联用可以显著提高PD‑1抑制剂的抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及中药活性成分组合物及其制剂在协同PD-1抑制剂抗肿瘤增效中的应用。
背景技术
肝癌和乳腺癌均为常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、易复发的特点。临床上对恶性肿瘤的治疗手段中，化疗和放疗等往往伴随着强烈的副作用，而手术切除则存在着较高的复发率，均难以取得理想的治疗效果。近年来，以PD-1抑制剂为代表的免疫检查点阻断疗法，被认为是治疗恶性肿瘤最有希望的方法之一。然而，对于某些实体瘤，如肝癌和乳腺癌等，由肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)和肿瘤浸润性T淋巴细胞(TILs)线粒体异常等肿瘤微环境因素引起的TILs数量和活性的不足，导致PD-1抑制剂在临床上存在客观响应率低等问题，严重限制了其抗肿瘤疗效的发挥和进一步应用。
氧化苦参碱(Oxymatrine)和黄芪甲苷(Astragaloside IV)是苦参和黄芪中的主要有效成分，文献和我们前期研究表明，二者均具有良好的抗肿瘤和免疫调节作用。其中，氧化苦参碱能够有效地抑制小鼠肝纤维化，降低CAFs活化标志物α-SMA的表达，具有抑制CAFs活化的功效；黄芪甲苷能够通过上调PGC-1α的表达，促进线粒体的生物发生和氧化磷酸化过程，可用于促进TILs线粒体正常化。
经检索，现有技术已有对氧化苦参碱或黄芪甲苷抗肿瘤或辅助抗肿瘤的相关报道。
有关氧化苦参碱的中国专利申请有：中药单体氧化苦参碱在制备治疗或预防非小细胞肺癌药物上的应用(CN201911068153.9)，治疗肝炎、肝纤维化及肝癌的药物组合(CN201610255001.X)，一种治疗结直肠癌的药物组合物(CN201210155469.3)，氧化苦参碱在制备抗肿瘤药物中的应用(CN201110379693.6)，一种体内缓慢释放的抗癌药物组合物(CN200410075842.X)，一种抗肿瘤组合物及其制备方法和用途(CN200110030181.5)，氧化苦参碱在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用(CN201610000529.2)，一种抗肿瘤药物组合物及其制备方法(CN201510367188.8)，一种治疗结直肠癌的药物组合物(CN201210155469.3)，含氧化苦参碱的药物(CN200810132186.0)等。
有关黄芪甲苷的中国专利申请有：一种用于癌症防治的人体免疫力增强剂及其制备方法(CN201911095186.2)，一种CAR-T细胞的复苏方法(CN202011058265.9)，黄芪甲苷与奥沙利铂的组合在制备抗肿瘤药物中的用途(CN201910632861.4)，一种具有光热治疗及创面修复功能的控释水凝胶的制备方法(CN201910618151.6)，一种天然产物组合及其医药用途(CN201810076809.0)，一种抗肿瘤注射制剂的检测方法(CN201711436366.3)，治疗因癌症放化疗所致白细胞减少中药新药及制备方法(CN201210023511.6)，用于肝癌的新复方辅助治疗药物(CN201410434469.6)，一种治疗癌症的药物组合物及制备方法和用途(CN201310698698.4)等。
现有文献也有分别对氧化苦参碱与黄芪甲苷抗肝癌或辅助抗肝癌作用的报道。但不管是现有专利和还是现有文献，现有技术尚无将氧化苦参碱与黄芪甲苷两者按照特定的比例配伍并用于提升PD-1抑制剂抗肿瘤，特别是肝癌或乳腺癌效果的报道，且目前尚无将二者共载于同一纳米制剂的报道，也无使用金属有机骨架(MOF)和脂质体载药系统共递送二者至肿瘤组织的报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种中药活性成分组合物在协同PD-1抑制剂抗肿瘤增效中的应用。
所述中药活性成分组合物为氧化苦参碱、黄芪甲苷配伍的组合物。
作为一种优选的实施方式，所述氧化苦参碱与黄芪甲苷的质量比为1～8:1，优选1～2:1。
作为一种优选的实施方式，所述肿瘤为肝癌或乳腺癌。
作为一种优选的实施方式，所述组合物还包括氧化苦参碱、黄芪甲苷配伍组合物药学上可接受的载体。即可将所述组合物制成制剂后递送药物。
作为一种优选的实施方式，所述载体为铁基MOF(Fe·MOF)或脂质体。
作为一种优选的实施方式，所述的肿瘤为肝癌，使用铁基MOF作为组合物载体。
作为一种优选的实施方式，所述的肿瘤为乳腺癌，使用脂质体作为组合物载体。
本发明将水溶性药物氧化苦参碱和脂溶性药物黄芪甲苷二者以特定比例配伍并制备成纳米制剂，可以将不同极性的两种药物共同递送至肿瘤组织中，能够显著改善PD-1抑制剂的抗肿瘤疗效。
本发明的另一目的在于提供一种协同PD-1抑制剂抗肿瘤增效的纳米制剂，其包括上述中药活性成分组合物及其药学上可接受的载体。
作为一种优选的实施方式，所述载体为铁基MOF。共载水溶性药物氧化苦参碱和脂溶性药物黄芪甲苷的纳米制剂，由氧化苦参碱和黄芪甲苷作为原料药，以金属铁和有机配体构建的MOF系统作为药物载体，并使用表面修饰改善靶向肝癌组织能力。
所述纳米制剂的制备方式包括：由金属节点经有机配体连接构成铁基MOF，将铁基MOF活化后置于以中药活性成分组合物为溶质的溶液中进行载药，获取载药纳米制剂，对载药纳米制剂利用表面修饰材料修饰，获得成品纳米制剂；
其中，上述制备方式的原料包括如下质量份的组分：
中药活性成分组合物198-792份，金属节点4-101份，有机配体32-64份，表面修饰材料10-160份；所述以中药活性成分组合物为溶质的溶液中，溶质和溶剂的质量比浓度为0.15～2.4％(w/w)。
作为一种优选的实施方式，所述金属节点采用Fe3O4纳米粒、FeCl3·H2O、Fe(NO3)3·9H2O中的一种或两种；优选Fe3O4纳米粒。
所述有机配体采用均苯三甲酸、对苯二甲酸和2-氨基对苯二甲酸中的一种，优选均苯三甲酸。
所述表面修饰材料采用血小板膜、红细胞膜、肝癌细胞膜、透明质酸中的一种，优选血小板膜。
作为一种优选的实施方案，铁基MOF通过水热合成法制备。
作为一种优选的实施方式，所述载体为脂质体。以脂质体的磷脂双分子层荷载脂性药物黄芪甲苷，亲水性内腔包封水溶性药物氧化苦参碱，通过PEG化实现体内长循环，并通过EPR效应被动靶向乳腺癌组织。
所述纳米制剂包括如下质量份的组分：
中药活性成分组合物15-120份，天然磷脂100-500份，合成磷脂60-200份，胆固醇30-75份，DSPE-PEG200014-20份。
作为一种优选的实施方式，脂质体制备方法采用薄膜分散法-pH梯度法、乙醇注入法-pH梯度法，优选乙醇注入法-pH梯度法。
所述天然磷脂优选大豆卵磷脂；所述合成磷脂优选氢化大豆卵磷脂。所述大豆卵磷脂：氢化大豆卵磷脂混合比例为0.5～5:1，优选4:1。
本课题组经过长期大量的实验研究发现，将氧化苦参碱和黄芪甲苷组合使用，可通过抑制CAFs活化并促进TILs线粒体正常化来同时提升TILs的数量和抗肿瘤活性，联合PD-1抑制剂使用后，抗肿瘤疗效的改善显著优于单一药物，显示出极强的协同抗肿瘤作用。经处方优选过的氧化苦参碱和黄芪甲苷通过特定的比例配伍具有开发成提高PD-1抑制剂抗肿瘤疗效药物的应用前景。
但由于氧化苦参碱和黄芪甲苷存在代谢速度快、生物利用度低及体内组织分布靶向性差的问题，且氧化苦参碱具有较好的水溶性，而黄芪甲苷则水溶性差，因此如何将极性跨度较大的氧化苦参碱、黄芪甲苷高效共递送至肿瘤组织内极具挑战。
铁基MOF是一种由Fe离子或Fe团簇与有机配体通过配位键自组装形成的新型晶体多孔材料，具有荷载药物极性跨度大、载药量高等特点，可用于共递送氧化苦参碱和黄芪甲苷，且其中自带Fe元素，可用于协同黄芪甲苷提升TILs活性。同时，MOF系统通过配位键连接金属节点和有机配体，能够在肿瘤酸性和还原性的微环境下通过配位键的断裂实现药物的释放。以磁性Fe3O4纳米粒为核心的磁性铁基MOF可以在外磁场的作用下靶向肝癌组织，同时在其表面修饰主动靶向配体可以实现双重靶向的同时避免免疫系统对制剂的清除，将氧化苦参碱和黄芪甲苷高效、精准共递送至肝癌组织中。
脂质体是由磷脂和胆固醇构成、具有类脂质双分子层结构的微型封闭囊泡。相较于传统的给药系统，脂质体具有独特的载药优势，其内水相可包载水溶性药物，脂质双分子层可包载脂溶性药物，因此脂质体可同时包载水溶性氧化苦参和脂溶性的黄芪甲苷，是实现二者瘤内共递送的理想载体。由于肿瘤组织的EPR效应和脂质体的类细胞膜结构，使得粒径小于200nm的脂质体易于在肿瘤部位蓄积，并通过与细胞膜融合，渗透进入细胞，从而促进所包封药物的胞内递送。脂质体对药物的肿瘤靶向递送也降低了药物在体循环中的代谢及排泄，从而增强药物的抗肿瘤药效。同时，脂质体作为药物载体具有良好的生物相容性，其制备工艺成熟，临床转化程度高。
因此，本发明采用铁基MOF或脂质体共载并递送氧化苦参碱及黄芪甲苷至肿瘤组织中，以协同PD-1抑制剂提高其抗肿瘤作用。
本发明所述中药活性成分配伍组合物、制剂及应用的有益效果表现在如下几方面：
1、本发明在中医药理论的指导下，充分应用了中医药配伍理论，将中药苦参中的氧化苦参碱和黄芪中的黄芪甲苷以特定的比例配伍，氧化苦参碱发挥抑制肿瘤相关成纤维细胞活化提升肿瘤浸润性T淋巴细胞数量的作用，黄芪甲苷发挥调控肿瘤浸润性T淋巴细胞线粒体正常化提升其抗肿瘤活性的作用，并与PD-1抑制剂联用，发挥协同的抗肿瘤药效。
2、本发明使用金属节点和有机配体构建的铁基MOF纳米给药系统，实现了化学结构、分子量和溶解性差异大的氧化苦参碱和黄芪甲苷的共载，同时还能够提高药物的载药量，载药量达30～40wt％。此外，本发明所选用的金属节点为Fe元素，能够协同黄芪甲苷改善肝癌免疫微环境，起到了药辅合一的功效。
3、本发明采用磁性铁基MOF作为药物载体，并在其表面修饰以血小板膜等表面修饰物，在获得双重主动靶向的同时，还能够规避体内免疫系统对制剂的清除，实现长循环效果，能够实现对肿瘤的精准且高效靶向，克服了氧化苦参碱和黄芪甲苷的生物利用度低及体内组织分布靶向性差的问题缺陷。
4、本发明采用MOF系统作为药物载体，能够避免药物在正常组织和体液中被代谢破坏的同时，藉由MOF配位键对酸性和还原性肿瘤微环境的不稳定性，在肿瘤组织中释放药物，从而在保护药物稳定的同时确保其能够在肿瘤中得到有效的释放，以发挥药效。
5、本发明使用脂质体纳米给药系统，其内水相和脂质外层可分别包载水溶性药物氧化苦参碱和脂溶性药物黄芪甲苷，并在表面使用PEG修饰，实现体内长循环效果，提高药物瘤内蓄积。
6、本发明采用生物相容性良好的磷脂、胆固醇作为药物载体，将天然磷脂与合成磷脂混合使用，成功共载溶解性差异大的氧化苦参碱与黄芪甲苷，且相比于单一磷脂而言，提高了两药的载药量。脂质体具有类细胞膜结构，表面使用PEG修饰，借助EPR效应到达瘤组织后，与目标细胞进行膜融合，促进药物胞内递送。
7、本发明采用乙醇注入法联合pH梯度法构建脂质体纳米给药系统，采用主动载药技术如pH梯度法包载水溶性药物氧化苦参碱，乙醇注入法包载脂溶性药物黄芪甲苷。这种脂质体制备技术工艺成熟，有利于工业化生产，临床转化前景广阔。
附图说明
图1为氧化苦参碱和黄芪甲苷的化学结构式。
图2为实施例1中不同配伍比例和浓度的氧化苦参碱与黄芪甲苷对CTLL-2小鼠T细胞活性的影响(n＝6，X±SD)。
图3为实施例2中不同配伍比例和浓度的氧化苦参碱与黄芪甲苷对CAFs细胞活性的影响(n＝6，X±SD)。
图4为CTLL-2细胞在氧化苦参碱:黄芪甲苷＝2:1条件下4T1细胞和CTLL-2细胞共培养24h后CTLL-2细胞相对细胞活性(*P<0.05，**P<0.01)。
图5为实施例4中得到的铁基MOF的粒径分布与zeta电位图。
图6为实施例4中得到的铁基MOF的SEM图。
图7为实施例5中使用本发明组合物纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗H22原位肝癌C57BL/6小鼠后各组小鼠瘤重、瘤体积和肿瘤指数对比(n＝3，X±SD)；注：与模型组比较***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；
图8为实施例5中使用本发明组合物纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗H22原位肝癌C57BL/6小鼠后各组小鼠肿瘤组织CD4+T细胞免疫荧光染色结果。
图9为实施例5中使用本发明组合物纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗H22原位肝癌C57BL/6小鼠后各组小鼠肿瘤组织CD8+T细胞免疫荧光染色结果。
图10为实施例6中使用本发明组合物及纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗4T1原位乳腺癌BALB/c小鼠后各组小鼠瘤重和瘤体积对比(n＝6，X±SD)；注：与模型组比较***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与PD-1组比较▲▲▲P<0.001，▲▲P<0.01，▲P<0.05。
图11为实施例6中使用本发明组合物及纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗4T1原位乳腺癌BALB/c小鼠肿瘤组织HE、Ki 67染色结果(图中标尺为200μm)。
图12为实施例6中使用本发明组合物及纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗4T1原位乳腺癌BALB/c小鼠肿瘤组织TUNEL染色结果(图中标尺为40μm)。
图13为实施例6中使用本发明组合物及纳米制剂与PD-1抑制剂联合治疗4T1原位乳腺癌BALB/c小鼠肿瘤组织α-SMA染色结果(图中标尺为40μm)。
图14为实施例8中得到的共载氧化苦参碱与黄芪甲苷脂质体的粒径分布与zeta电位图。
图15为实施例10中不同浓度的共载氧化苦参碱与黄芪甲苷脂质体对CTLL-2小鼠T细胞活性的影响(n＝6，X±SD)。
图16为实施例10中不同浓度的共载氧化苦参碱与黄芪甲苷脂质体对小鼠CAFs细胞活性的影响(n＝6，X±SD)。
具体实施方式
实施例涉及细胞、动物、药品、试剂、仪器来源如下：
实验细胞：CTLL-2小鼠T细胞、NIH3T3小鼠胚胎纤维细胞、H22-Luc小鼠肝癌细胞、4T1-Luc小鼠乳腺癌细胞，均购自中科院上海细胞库。
实验动物：SPF级C57BL/6雄性小鼠、SPF级BALB/c雌性小鼠，均购自江苏集萃药康生物技术股份有限公司，实验动物许可证号(SCXK(苏)2018-0008)，光照/黑暗(12h/12h)、温度(23±3)℃饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，自由饮食及饮水，实验动物使用许可证(SYXK(苏)2016-0018)。
药品与试剂：氧化苦参碱(HPLC≥98％，春秋生物)；黄芪甲苷(HPLC≥98％，源叶生物)；吐温80(Biofroxx)；注射用鼠源PD-1抗体(Bioxcell)；FeCl3·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O(阿拉丁试剂)；无水乙酸钠、硝酸、氢氟酸(南京化学试剂)；二乙二醇(Sigma)；丙烯酸钠、均苯三甲酸、对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸、荧光素钾盐、胆固醇(罗恩试剂)；甲醇、乙醇(西陇科学)；蛋白酶抑制剂(CSNpharma)；RPMI1640培养基(BasalMedia)；DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(Deary Tech)；CCK8(同仁化工)；重组小鼠TGF-β1蛋白(Novoprotein)；基质胶、24孔0.4μm Transwell小室(Corning)，大豆卵磷脂(Lipoid)，氢化大豆卵磷脂(艾伟特A.V.T)。
仪器：Mutiskan Go型酶标仪、ST16R型离心机、311型CO2培养箱(ThermoFisher)；超净工作台(苏安泰空气技术有限公司)；细胞计数仪(IC1000型，Countstar)；TriStar II3020型比表面积与孔隙度分析仪(Micromeritics)；MS205DU型十万分之一电子天平(，Mettler Toledo)；XMTD-8222型高温烘箱(精宏仪器)；OS20-Pro型机械搅拌器(SCILogex)；ABM型小动物气体吸入式麻醉机(玉研仪器)；ChemStudio PLUS型小动物活体成像仪(Analytik JenaAG)。
其他如无特殊说明，均为商业来源。
实施例1：不同配伍比例和浓度的氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物对小鼠T细胞活性的影响
取对数生长期的CTLL-2细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，每组设6个平行孔，细胞于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，5％CO2、37℃培养箱内培养24h后，分别添加不同浓度的氧化苦参碱(0.5、1、2、4、8μg/mL)、黄芪甲苷(0.5、1、2、4、8μg/mL)以及氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物(质量比为1:1、2:1、4:1和8:1，以黄芪甲苷计浓度为0.5、1、2、4、8μg/mL)，37℃、5％CO2条件下孵育24h。
孵育结束后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育1.5h后，酶标仪测定450nm处吸光度。并计算相对细胞活性(相对细胞活性＝(给药孔吸光度-培养基吸光度)/(空白组吸光度-培养基吸光度))。
结果：氧化苦参碱与黄芪甲苷的组合物在比例为1:1～8:1的范围内均能提高小鼠T细胞的活性，且当二者比例在1:1、2:1及8:1时能够显著提升小鼠T细胞的活性(P＜0.05)。而单独使用氧化苦参碱或黄芪甲苷未表现出显著提高小鼠T细胞活性的作用(如图2)。
结果表明氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物对于T细胞的活性具有协同促进作用。
实施例2：不同配伍比例和浓度的氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物对小鼠CAFs细胞活性的影响
取对数生长期的NIH3T3细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，并加入5ng/mL的重组小鼠TGF-β1蛋白，诱导其活化为CAFs，每组设6个平行孔，细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，5％CO2、37℃培养箱内培养24h后，分别添加不同浓度的氧化苦参碱(0.5、1、2、4、8μg/mL)、黄芪甲苷(0.5、1、2、4、8μg/mL)以及氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物(质量比为1:1、1:2、4:1和8:1，以黄芪甲苷计浓度为0.5、1、2、4、8μg/mL)，37℃、5％CO2条件下孵育24h。
孵育结束后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育1.5h后，酶标仪测定450nm处吸光度。并计算相对细胞活性(相对细胞活性＝(给药孔吸光度-培养基吸光度)/(空白组吸光度-培养基吸光度))。
结果：氧化苦参碱与黄芪甲苷的组合物在比例为1:1～8:1的范围内均能抑制小鼠CAFs细胞的活性，且当二者比例在1:1、2:1及8:1时能够显著抑制小鼠CAFs细胞的活性(P＜0.05)。而单独使用氧化苦参碱或黄芪甲苷未表现出抑制小鼠CAFs细胞活性的作用(如图3)。
结果表明氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物对于CAFs细胞的活性具有协同抑制作用。
结合实施例1结果可知，氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物能够在提升T细胞活性的同时抑制CAFs细胞活性，且以二者比例为2:1时效果最佳，可用于协同PD-1抑制剂提升抗肿瘤效果。
实施例3：不同浓度比例的氧化苦参碱-黄芪甲苷组合物在4T1细胞和CTLL-2细胞共培养模型中对T淋巴细胞活性的影响
取对数生长期的4T1细胞，以5×104个/孔接种于Transwell上室；取对数生长期的CTLL-2细胞，以1×105个/孔接种于Transwell下室，5％CO2、37℃培养箱内培养24h后，分别添加不同浓度的质量比为2:1的氧化苦参碱-黄芪甲苷组合物(以黄芪甲苷计浓度为0.25、0.5、1、2、4μg/mL)。5％CO2、37℃培养箱内培养24h后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育1.5h后，酶标仪测定450nm处吸光度。并计算相对细胞活性(相对细胞活性＝(给药孔吸光度-培养基吸光度)/(空白组吸光度-培养基吸光度))。
结果：质量比为2:1的氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物能够改善与4T1肿瘤细胞共培养状态下T细胞的活性，尤其在浓度为0.25-4μg/mL的范围内(以黄芪甲苷计)时，可显著提高与4T1肿瘤细胞共培养状态下T细胞的活性(如图4)。
结果说明氧化苦参碱与黄芪甲苷组合物能够改善肿瘤浸润性T淋巴细胞的活性，可用于协同PD-1抑制剂提升抗肿瘤效果。
实施例4氧化苦参碱-黄芪甲苷铁基MOF系统制备及理化性质测定
取FeCl3·6H2O 1份，无水乙酸钠2份，丙烯酸钠2份，二乙二醇66份。将FeCl3·6H2O、无水乙酸钠和丙烯酸钠溶于二乙二醇，于反应釜中190℃反应10小时，反应物于5500rpm离心1h，乙醇清洗2遍，5500rpm离心1h，收集沉淀，40℃真空干燥12h，得到Fe3O4纳米粒。
取氧化苦参碱264份，黄芪甲苷132份，Fe3O4纳米粒8份，均苯三甲酸32份，血小板膜20份，0.1mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸水溶液20000份，甲醇86000份。将氧化苦参碱和黄芪甲苷溶于66000份甲醇中，备用；取血小板膜分散于10000份甲醇中，200w超声10min，备用；取Fe3O4纳米粒和均苯三甲酸，分散于0.1mmol/L硝酸和0.003mmol/L氢氟酸水溶液中，置于聚四氟乙烯内衬的反应釜中，150℃反应4小时后，反应物于5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到铁基MOF空白载体(Fe·MOF)，Fe·MOF于150℃活化8h，置于氧化苦参碱-黄芪甲苷甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，分散于10000份甲醇中，在超声状态下逐滴加入血小板膜甲醇分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并于5500rpm离心1h，收集沉淀，即为血小板膜修饰的氧化苦参碱-黄芪甲苷Fe·MOF纳米制剂，即Pm-Om-As-Fe·MOF，HPLC测定其荷载氧化苦参碱载药量为21.83wt％，荷载黄芪甲苷载药量为10.97wt％，总载药量达32.80wt％。
Fe·MOF纳米制剂的粒径分布与zeta电位图及SEM图分别见图5、6。
实施例5血小板膜修饰的氧化苦参碱-黄芪甲苷铁基MOF联合PD-1抑制剂抗原位肝癌增效药效学实验
取处于对数生长期的H22-Luc细胞，1500rpm离心4min，沉淀使用基质胶重悬为1×108个/mL的细胞悬液，保存于碎冰中，备用。
小鼠预先使用脱毛膏将以胸凸为中心长3cm，宽2cm的椭圆形区域脱毛后，使用棉球蘸取清水去除残留脱毛膏，并对小鼠禁食不禁水12h。
小鼠采用异氟烷麻醉后，仰卧于操作台上。使用75％乙醇对小鼠腹部区域进行消毒。沿胸凸以下的腹白线切开1cm长的开口以暴露出腹腔，使用沾有生理盐水的棉签轻轻挤压胸腔两侧，使肝脏从切口处挤出。对肝大叶进行翻转，暴露出内侧，使用微量注射器向肝包膜下注入10μL的H22-Luc细胞悬液，棉签压迫止血30s。
使用镊子轻提切口两侧皮肤，将肝脏放回腹腔，并对伤口进行缝合，并使用碘伏消毒，肌内注射庆大霉素注射液0.02mL。术后10天通过小动物活体成像剔除造模不成功者，其余小鼠随机分为模型对照组、Om-As组、Pm-Om-As-Fe·MOF组(此处使用实施例4的Pm-Om-As-Fe·MOF纳米制剂)、Pm-Om-As-Fe·MOF联合PD-1组以及PD-1单药组。
Pm-Om-As-Fe·MOF使用PBS分散至3mg/mL，Om-As使用1％吐温80配制成含氧化苦参碱0.96mg/mL和黄芪甲苷0.48mg/mL的溶液(质量比为2:1)，PD-1抗体使用备用PBS配制成0.5mg/mL的溶液，备用。
对小鼠按分组尾静脉给药，每只给药0.1mL，每日给药1次，在第3天和第7天时，腹腔给药PD-1抑制剂0.2mL。给药后，Pm-Om-As-Fe·MOF组与Pm-Om-As-Fe·MOF联合PD-1组将磁铁绑缚于肝脏部位，磁靶向2h。
给药10天后，脱颈椎处死小鼠，解剖其原位肝癌，并对其瘤重、瘤体积和肿瘤指数进行测量和分析，肿瘤组织进行免疫荧光切片，观察其组织中CD4+、CD8+T细胞数量和分布。
各组小鼠的瘤重、瘤体积和肿瘤指数统计结果如图7所示，结果表明，Pm-Om-As-Fe·MOF与PD-1抑制剂联用后能够显著降低原位肝癌的瘤重、瘤体积和肿瘤指数。各组小鼠肿瘤组织免疫荧光切片如图8、9所示，结果表明Pm-Om-As-Fe·MOF与PD-1抑制剂联用可以有效提高肿瘤组织内CD4+、CD8+T细胞的水平。表明Pm-Om-As-Fe·MOF能够协同提高PD-1抑制剂的抗肝癌效果。
实施例6：氧化苦参碱-黄芪甲苷组合物及脂质体制剂联合PD-1抑制剂抗原位乳腺癌增效药效学实验
取处于对数生长期的4T1-Luc细胞，1500rpm离心4min，沉淀使用1640完全培养基重悬为1×107个/mL的细胞悬液，保存于碎冰中，备用。
小鼠预先使用脱毛膏将以左下侧乳腺部位为中心长3cm，宽2cm的椭圆形区域脱毛后，使用棉球蘸取清水去除残留脱毛膏，并对小鼠禁食不禁水12h。
小鼠采用异氟烷麻醉后，仰卧于操作台上。使用75％乙醇对小鼠腹部区域进行消毒在第四乳头和中线之间做一个小切口，找到脂肪垫，用镊子从底部挤压脂肪垫使其完全暴露。使用注射器向脂肪垫将100μL的4T1-Luc细胞悬液注入脂肪垫中，检查是否漏液。缝合伤口，并使用碘伏消毒，肌内注射庆大霉素注射液0.02mL。术后2天通过观察乳腺部分是否鼓起剔除造模不成功者，其余小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、Om-As低剂量组、Om-As高剂量组、PD-1单药组、Om-As低剂量联合PD-1组以及Om-As-Lip联合PD-1组。
Om-As低剂量组使用1％吐温80配制成含氧化苦参碱0.250mg/mL和黄芪甲苷0.125mg/mL的溶液(质量比为2:1)；Om-As高剂量组使用1％吐温80配制成含氧化苦参碱0.320mg/mL和黄芪甲苷0.160mg/mL的溶液(质量比为2:1)；PD-1抗体使用备用PBS配制成0.5mg/mL的溶液，备用；Om-As-Lip使用实施例8的Om-As-Lip纳米给药系统。
对小鼠按分组尾静脉给药，每只给药0.1mL，每日给药1次，在第3天和第7天时，腹腔给药PD-1抑制剂0.2mL。
给药9天后，脱颈椎处死小鼠，解剖其原位乳腺癌，并对其瘤重、瘤体积和肿瘤指数进行测量和分析，肿瘤组织进行HE、Ki 67、TUNEL、α-SMA染色，观察其抗肿瘤作用。
各组小鼠的瘤重、瘤体积和肿瘤指数如图10所示，结果表明，Om-As-Lip与PD-1联用后能够显著降低原位乳腺癌的瘤重、瘤体积和肿瘤指数，且低剂量裸药联合PD-1效果优于单用低剂量裸药或PD-1。H&E、Ki67染色如图11所示，Om-As低剂量联合PD-1组的肿瘤细胞核区域面积明显减少，且可见较大面积的组织坏死区域。同时，Om-As低剂量联合PD-1组的Ki67阳性细胞区域面积明显减少，癌细胞增殖能力较弱。TUNEL染色结果如图12所示，标记肿瘤组织中凋亡细胞，Om-As低剂量联合PD-1组中细胞凋亡水平明显升高，表明联合用药后癌细胞出现明显的凋亡。α-SMA染色结果如图13所示，各组均能降低α-SMA蛋白表达，其中以联用组降低最为显著，α-SMA是CAFs活化特征蛋白，表明氧化苦参碱-黄芪甲苷组合物与PD-1联用能有效抑制CAFs活化。
实施例7：共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF的制备
本实施例实验了不同处方对Fe·MOF纳米制剂的影响
处方1：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方2：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取528份氧化苦参碱和264份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方3：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取396份氧化苦参碱和198份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方4：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取132份氧化苦参碱和66份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方5：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份肝癌细胞膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入肝癌细胞膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方6：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份红细胞膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入红细胞膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方7：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取10份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方8：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取90份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方9：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取160份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方10：8份Fe3O4纳米粒与64份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方11：4份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方12：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和264份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方13：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取528份氧化苦参碱和66份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方14：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。将40份透明质酸溶于10000份水中，加入载药纳米制剂，300rpm避光机械搅拌1h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方15：将4份Fe3O4纳米粒分散于20000份水中，加入65份FeCl3·6H2O和55份均苯三甲酸，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方16：将4份Fe3O4纳米粒分散于20000份水中，加入97份Fe(NO3)3·9H2O和55份均苯三甲酸，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方17：16份Fe3O4纳米粒与46份对苯二甲酸分散于20000份水中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取31份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方18：8份Fe3O4纳米粒与46份2-氨基对苯二甲酸分散于20000份水中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取264份氧化苦参碱和132份黄芪甲苷，溶于66000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取31份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方19：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取528份氧化苦参碱和264份黄芪甲苷，溶于33000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
处方20：8份Fe3O4纳米粒与32份均苯三甲酸分散于20000份含0.01mmol/mL硝酸和0.003mmol/mL氢氟酸的水溶液中，于反应釜中，150℃反应4h，5500rpm离心10min，60℃热水和乙醇各清洗2遍，5500rpm离心10min，收集沉淀，得到Fe·MOF。取132份氧化苦参碱和66份黄芪甲苷，溶于132000份甲醇中，备用；Fe·MOF在150℃活化8h，置于氧化苦参碱和黄芪甲苷的甲醇溶液中，300rpm避光机械搅拌24h，5500rpm离心1h，收集沉淀部分，为载药纳米制剂。取20份血小板膜，分散于10000份甲醇中，备用；将载药纳米制剂分散于10000份甲醇中，200w超声状态下逐滴加入血小板膜分散液中，超声10min，12000rpm离心1h，沉淀部分使用PBS清洗2次并5500rpm离心1h，收集沉淀，即为共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米制剂。
结果显示，在中药活性成分组合物198-792份，金属节点4-101份，有机配体32-64份，表面修饰材料10-160份；所述以中药活性成分组合物为溶质的溶液中，溶质和溶剂的质量比浓度为0.15～2.4％(w/w)的条件下，均可制得共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的Fe·MOF纳米系统。
实施例8：共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体纳米制剂制备及理化性质测定
取大豆卵磷脂120份，氢化大豆卵磷脂180份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/LHEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体，DLS测定粒径和电位。HPLC测定其氧化苦参碱包封率为60.34，载药量为1.96％，黄芪甲苷包封率为95.60％，载药量为5.38％，总载药量达7.34％。
结果：氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体粒径分布与电位结果如图14所示。
实施例9：共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体(Om-As-Lip)的制备
本实施例实验了不同处方对脂质体纳米制剂的影响制备方法：
处方1(薄膜分散法-pH梯度法)：取蛋黄卵磷脂300份，胆固醇75份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷10份置于100mL茄形瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，50℃，60rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，形成均匀脂质薄膜层。加入150mmol/L柠檬酸溶液50份，50℃，100rpm下机械搅拌，水合1h，冰浴探头超声10min，形成黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/LHEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有10份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方2(乙醇注入法-pH梯度法)：取蛋黄卵磷脂300份，胆固醇75份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有10份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方3：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷50份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有50份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方4：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷10份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取150mmol/L柠檬酸溶液50份置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有10份氧化苦参碱)40份50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方5：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷30份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取150mmol/L柠檬酸溶液50份置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有30份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方6：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷40份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取150mmol/L柠檬酸溶液50份置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有40份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方7：大豆卵磷脂100份，氢化大豆卵磷脂200份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取150mmol/L柠檬酸溶液50份置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方8：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方9：大豆卵磷脂180份，氢化大豆卵磷脂120份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方10：大豆卵磷脂200份，氢化大豆卵磷脂100份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有40份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方11：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷5份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有10份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方12：大豆卵磷脂150份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷10份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有10份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方13：大豆卵磷脂500份，氢化大豆卵磷脂100份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方14：大豆卵磷脂450份，氢化大豆卵磷脂150份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方15：大豆卵磷脂400份，氢化大豆卵磷脂200份，胆固醇50份，DSPE-PEG200014份，黄芪甲苷20份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份150mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/L HEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有20份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
处方16：大豆卵磷脂300份，胆固醇30份，DSPE-PEG200020份，黄芪甲苷60份置于5mL西林瓶中，加入无水乙醇20份溶解至澄清透明，作为油相备用。取50份50mmol/L柠檬酸溶液置于20mL西林瓶中，作为水相备用。在50℃，800rpm磁力搅拌下，使用1mL注射器将油相匀速缓慢注入水相中，搅拌30min。50℃，30rpm下真空旋转蒸发除去无水乙醇，探头冰浴超声10min，即为黄芪甲苷脂质体。加入50mmol/LHEPES缓冲溶液10份，300mmol/LNa2CO3溶液(预溶有60份氧化苦参碱)40份，50℃水浴加热孵育30min，即为氧化苦参碱与黄芪甲苷共载脂质体。
结果显示：薄膜分散法-pH梯度法，乙醇注入法-pH梯度法，中药活性成分组合物15-120份，天然磷脂100-500份，合成磷脂100-240份，胆固醇(膜流动性调节剂)30-75份，DSPE-PEG2000(表面修饰剂)14-20份范围内，均可制得氧化苦参碱-黄芪甲苷共载脂质体给药系统。
实施例10共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体纳米制剂对CTLL-2小鼠T细胞活性的影响
取生长状态良好的CTLL-2细胞接种于96孔板(1×104个/孔)，37℃、5％CO2条件下孵育24h。Om-As-Lip(此处使用实施例8的Om-As-Lip)过0.22μm滤膜，吸弃板中上清，倍比稀释加入药液，平行复5孔并预留空白孔、对照孔，37℃、5％CO2条件下孵育24h。
孵育结束后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育2.5h后，酶标仪测定450nm处吸光度。并计算相对细胞活性。
[相对细胞活性＝(给药孔吸光度-培养基吸光度)/(空白组吸光度-培养基吸光度)]
结果：共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体在0.25～7.5μg/mL的浓度范围(以黄芪甲苷浓度计)内，能够明显提高CTLL-2小鼠T细胞活性(图15)。
实施例11共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体纳米制剂对CAFs活化抑制作用考察
取生长状态良好的NIH3T3细胞接种于96孔板(2.5×103个/孔)，37℃、5％CO2条件下孵育24h。As-Om-Lip(此处使用实施例9-处方9的As-Om-Lip)过0.22μm滤膜，吸弃板中上清，倍比稀释加入药液，平行复5孔并预留空白孔、对照孔，混匀后孵育1h，加入TGF-β1(终浓度为5ng/mL)37℃、5％CO2条件下孵育24h。
孵育结束后，每孔加入10μL CCK8试剂，继续孵育1.5h后，酶标仪测定450nm处吸光度。并计算相对细胞活性。[相对细胞活性＝(给药孔吸光度-培养基吸光度)/(空白组吸光度-培养基吸光度)]
结果：共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体在0.07～34.4μg/mL浓度范围(以黄芪甲苷浓度计)内，能够显著抑制CAFs活性(图16)。结合实施例10结果可知，共载氧化苦参碱与黄芪甲苷的脂质体可有效提高PD-1抑制剂的抗肿瘤能力。
Claims (10)
1.中药活性成分组合物在协同PD-1抑制剂抗肿瘤增效中的应用，所述中药活性成分组合物为氧化苦参碱、黄芪甲苷配伍的组合物。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氧化苦参碱与黄芪甲苷的质量比为1~ 8:1，优选1~2:1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌或乳腺癌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括氧化苦参碱、黄芪甲苷配伍组合物药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体为铁基MOF或脂质体。
6.一种协同PD-1抑制剂抗肿瘤增效的纳米制剂，其特征在于，包括权利要求1~2任一项所述中药活性成分组合物及其药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的纳米制剂，其特征在于，所述载体选用铁基MOF，所述纳米制剂的制备方式包括：由金属节点经有机配体连接构成铁基MOF，将铁基MOF活化后置于以中药活性成分组合物为溶质的溶液中进行载药，获取载药纳米制剂，对载药纳米制剂利用表面修饰材料修饰，获得成品纳米制剂；
其中，上述制备方式的原料包括如下质量份的组分：
中药活性成分组合物198-792份，金属节点4-101份，有机配体32-64份，表面修饰材料10-160份；所述以中药活性成分组合物为溶质的溶液中，溶质和溶剂的质量比浓度为0.15~2.4%（w/w）。
8.根据权利要求7所述的纳米制剂，其特征在于，所述金属节点选用Fe3O4纳米粒、FeCl3·H2O、Fe(NO3)3·9H2O中的一种或两种；
有机配体选用均苯三甲酸、对苯二甲酸和2-氨基对苯二甲酸中任意一种；
所述表面修饰材料选用血小板膜、红细胞膜、肿瘤细胞膜、透明质酸中任意一种，优选血小板膜。
9.根据权利要求6所述的纳米制剂，其特征在于，所述载体选用脂质体，所述纳米制剂包括如下质量份的组分：
中药活性成分组合物15-120份，天然磷脂100-500份，合成磷脂60-200份，胆固醇30-75份，DSPE-PEG2000 14-20份。
10.根据权利要求9所述的纳米制剂，其特征在于，所述天然磷脂选用大豆卵磷脂；所述合成磷脂选用氢化大豆卵磷脂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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