CN114522226B

CN114522226B - 一种手性肿瘤纳米疫苗及其应用

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Publication number: CN114522226B
Application number: CN202210134628.5A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 王伟炜; 匡华; 徐丽广; 孙茂忠; 吴晓玲; 刘丽强; 马伟; 朱建平; 郝昌龙; 宋珊珊; 胡拥明; 吴爱红; 郭玲玲; 胥欣欣
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-02-14
Also published as: CN114522226A

Abstract

本发明涉及一种手性肿瘤纳米疫苗及其应用，涉及手性纳米肿瘤佐剂技术领域。本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗，包括手性金纳米粒子、免疫刺激剂、油剂和抗原。本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗能激活树突细胞，促进抗原提呈，进而活化CD8⁺T淋巴细胞以及自然杀伤细胞，并增强自然杀伤细胞以及CD8⁺T淋巴细胞的杀伤能力，以达到预防和治疗肿瘤的目的。本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗具有优异的免疫激活效果以及抗原特异性抗肿瘤的治疗和预防效果，能增强免疫动物针对肿瘤抗原的细胞免疫应答，其制备过程简易，效果良好。

Description

一种手性肿瘤纳米疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及手性纳米肿瘤佐剂技术领域，尤其涉及一种手性肿瘤纳米疫苗及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是全球疾病和死亡发生的重要原因之一，传统的治疗方式主要有化疗、放疗以及手术治疗，但是都使患者伴随着一定程度的痛苦，并且存在不确定性。随着生物医疗技术的发展，基于免疫的癌症治疗方法获得了广泛的关注，通过激活机体的免疫功能以达到对抗肿瘤的目的。相对传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗不仅能够直接杀伤肿瘤，还能很好的对抗肿瘤转移，基于免疫的癌症疗法给人类抗癌带来巨大的希望。如何更好的激活抗原提呈细胞，递送抗原，促进抗原提呈细胞对抗原的提呈，激活更强的细胞免疫成为了肿瘤免疫治疗的重点研究内容。

纳米材料由于其优越的物理化学特性，良好的生物相容性，广泛应用于生物学领域。作为佐剂，纳米材料易于修饰的表面特性使其可与多种免疫刺激剂或者疫苗结合，发挥更好的免疫效应。但是对纳米材料的修饰改性等过程往往步骤繁琐，效率不高，因此需要开发简单易操作的纳米疫苗合成方法。此外，大多数佐剂并没有区分其手性特性，为了更好的适应机体，引起机体免疫反应，区分材料的手性特性是很有必要的。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中操作繁琐，对肿瘤抑制以及预防程度有限的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种手性肿瘤纳米疫苗及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种手性肿瘤纳米疫苗，包括手性金纳米粒子、免疫刺激剂、油剂和抗原。

在本发明的一个实施例中，所述手性金纳米粒子粒径为50-500nm。

在本发明的一个实施例中，所述手性金纳米粒子粒径为120nm。

在本发明的一个实施例中，所述免疫刺激剂为单磷酰脂质A、脂多糖、CpG寡核苷酸、R848和聚肌胞苷酸中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述油剂为植物油、石蜡油和矿物油中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述植物油为花生油。

在本发明的一个实施例中，所述免疫刺激剂为单磷酰脂质A。

在本发明的一个实施例中，所述抗原为肿瘤细胞碎片、肿瘤组织碎片、卵清蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA、血蓝蛋白KLH和人血清蛋白HAS中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述抗原为卵清蛋白OVA。

在本发明的一个实施例中，所述手性金纳米粒子的浓度为5-50mg/mL；免疫刺激剂的浓度为1-500μg/mL；抗原的浓度为1-500μg/mL；油剂的体积与其他组分的体积比为0.1-1：1。

在本发明的一个实施例中，所述油剂的添加体积与其他组分的体积比为0.2：1。

本发明的第二个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的手性肿瘤纳米疫苗。

本发明的第三个目的是提供一种所述的手性肿瘤纳米疫苗或所述的试剂盒在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗能够刺激免疫动物免疫系统并产生良好的抗原特异性抗肿瘤抑制以及预防效果。

在本发明的一个实施例中，所述手性肿瘤纳米疫苗的给药剂量为2-12mL/kg。

在本发明的一个实施例中，所述手性肿瘤纳米疫苗通过皮下、皮内、腹腔、鼻腔或者尾静脉进行免疫。

在本发明的一个实施例中，所述应用中至少进行2次免疫，免疫的间隔为1-3周。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗能激活树突细胞，进而活化CD8⁺T淋巴细胞以及自然杀伤细胞，并增强自然杀伤细胞以及CD8⁺T淋巴细胞的杀伤能力，以达到预防和治疗肿瘤的目的。

(2)本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗具有优异的免疫激活效果以及抗原特异性抗肿瘤的治疗和预防效果，能更好的促进抗原提呈细胞提呈抗原。

(3)本发明所述的手性肿瘤纳米疫苗能增强免疫动物针对肿瘤抗原的细胞免疫应答，其制备过程简易，效果良好。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为本发明实施例1中手性金纳米粒子的手性信号以及扫描电镜图；其中，a为L型金纳米粒子的手性信号图谱，b为D型金纳米粒子的手性信号图谱，c为L型金纳米粒子的扫描电镜图，d为D型金纳米粒子的扫描电镜图。

图2为本发明测试例1中小鼠皮下免疫实施例1中的手性肿瘤纳米疫苗后36h，小鼠淋巴结中树突细胞的活化程度；其中，a，b，c分别为小鼠淋巴结中表达CD40，CD80，CD86的树突细胞的比例分析图，图d为小鼠淋巴结中表达SIINFEKL-MHC I的树突细胞的比例分析图。

图3为本发明测试例2中小鼠皮下免疫实施例1中的手性肿瘤纳米疫苗后，小鼠体内T细胞激活情况；其中，a为小鼠脾脏CD8⁺IFN-γ⁺的比例分析，b为小鼠脾脏CD4⁺IFN-γ⁺的比例分析，c为小鼠脾脏CD8⁺TNF-α⁺的比例分析，d为小鼠脾脏CD4⁺TNF-α⁺的比例分析。

图4为本发明测试例3中荷EG7.OVA小鼠T淋巴瘤细胞模型小鼠接种本发明实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗后，小鼠肿瘤体积的变化曲线，小鼠自接种肿瘤后的存活情况以及接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计情况；其中，a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，c为小鼠接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计图。

图5为本发明测试例4中手性肿瘤纳米疫苗预防小鼠肿瘤生长情况，小鼠接种EG7.OVA小鼠T淋巴瘤细胞后，皮下免疫实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗，小鼠肿瘤体积大小变化，小鼠存活曲线图以及接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计情况；其中，a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，c为小鼠接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计图。

图6为本发明测试例5中荷EG7.OVA小鼠T淋巴瘤细胞模型小鼠接种本发明对比例1制备的非手性肿瘤纳米疫苗后，小鼠肿瘤体积的变化曲线，小鼠自接种肿瘤后的存活情况以及接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计情况；其中，a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，c为小鼠接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计图。

图7为本发明测试例6中非手性肿瘤纳米疫苗预防小鼠肿瘤生长情况，小鼠接种EG7.OVA小鼠T淋巴瘤细胞后，皮下免疫对比例1制备的非手性肿瘤纳米疫苗，小鼠肿瘤体积大小变化，小鼠存活曲线图以及接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计情况；其中，a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，c为小鼠接种肿瘤第18天小鼠肿瘤组织中CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的活化程度以及杀伤活性统计图。

图8为本发明测试例7中小鼠皮下免疫对比例2中的无油剂手性肿瘤纳米疫苗后36h，小鼠淋巴结中树突细胞的活化程度；其中，a，b，c分别为小鼠淋巴结中表达CD40，CD80，CD86的树突细胞的比例分析图，图d为小鼠淋巴结中表达SIINFEKL-MHC I的树突细胞的比例分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明涉及的检测方法如下：

(1)小鼠淋巴结中树突细胞活化程度的检测：将小鼠拖颈处死，取小鼠腹股沟淋巴结，将其研磨为单细胞，PBS洗涤3遍后收集，加入CD11c-FITC，CD40-PerCP Cy5.5，CD80-PE，CD86-APC，SIINFEKL-MHC I-PE荧光抗体，室温避光孵育30min，离心收集细胞重悬于磷酸盐缓冲溶液中，通过流式细胞仪检测相关标志物的表达量。

(2)脾脏中CD4⁺T及CD8⁺T细胞表达TNF-α及IFN-γ的检测：将小鼠拖颈处死，取小鼠脾脏，将其研磨为单细胞，加入1mL红细胞裂解液，5min后1200rpm离心3min，去上清，收集细胞，洗涤后加入CD3-FITC，CD8-APC荧光抗体，室温避光孵育30min，离心收集细胞重悬于2％多聚甲醛中，室温固定15min，1200rpm离心3min，去上清，收集细胞，重悬于含有TNF-α-PE-Cy7，IFN-γ-PerCP-Cy5.5抗体的1％Triton，室温避光孵育30min，1200rpm离心3min，重悬于磷酸盐缓冲溶液中，通过流式细胞仪检测相关标志物的表达量。

(3)肿瘤组织中自然杀伤细胞及CD8⁺T细胞活化及杀伤能力检测：将小鼠拖颈处死，取小鼠肿瘤组织，将其剪为小块，用磷酸盐缓冲液洗涤三次后，向组织碎片中加入5-6倍0.25％胰酶，37℃消化30min，期间每5min用抢吹打一次，促使细胞分离。然后加入5mL含血清的培养基终止胰酶消化，静置2min，取上清，用200目尼龙网过滤，所得溶液1200rpm离心3min，即可得到肿瘤细胞，对细胞进行计数，调整浓度为每100μL磷酸盐缓冲液中10⁶个细胞，加入流式抗体，室温避光孵育30min，离心收集细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，通过流式细胞仪检测相关标志物的表达量。

实施例1

一种手性肿瘤纳米疫苗及其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)手性金纳米粒子的制备：先将反应瓶用王水浸泡24h，洗净，晾干。向9.6mL，16.7mM的十六烷基三甲基氯化铵水溶液中加入75μL，10mM的碘化钾溶液，100.4μL氯金酸钠，80μL，64mM抗坏血酸，混合后加入10μL，0.1M氢氧化钠，快速搅拌20s，静置10min后生成种子，将种子溶液离心(8000rpm，5min)，浓缩20倍于1mM十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，用于下一步生长。

向4.75mL，1.7mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入0.2mL，10mM的氯金酸，静置10min后，加入0.475mL，40mM抗坏血酸，混合后加入5μL，4mM的L型或者D型半胱氨酸-苯丙氨酸二肽，以及50μL浓缩后的种子溶液，快速搅拌均匀，将溶液放于光密度为84mW/cm²，波长为594nm的左圆(L型)或者右圆(D型)偏振光下照射30min，将照射后溶液离心浓缩(4200rpm，3min)40倍，加入巯基聚乙二醇，至其终浓度为0.2nM，4h后即可得到(L型或D型)手性金纳米粒子，对其进行手性信号以及形貌的表征。

手性信号具体如图1所示。其中，图1-a为L型金纳米粒子的信号，1-b为D型金纳米粒子的信号，图1-c为L型金纳米粒子的扫描电镜图，图1-b为D型金纳米粒子的扫描电镜图。

(2)手性肿瘤纳米疫苗的制备：将合成的手性金纳米粒子在-30℃，8Pa条件下冷冻干燥9h，得到具有佐剂潜力的手性纳米材料，使用时称取2mg材料，10μg单磷酰脂质A，50μg模型抗原卵清蛋白溶解于100μL生理盐水中，加入20μL花生油，剧烈搅拌30min，即得到手性肿瘤纳米疫苗。

实施例2

一种手性肿瘤纳米疫苗及其制备方法，具体包括以下步骤：

向4.75mL，1.7mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入0.2mL，10mM的氯金酸，静置10min后，加入0.475mL，40mM抗坏血酸，混合后加入5μL，4mM的L型或者D型半胱氨酸-苯丙氨酸二肽，以及50μL浓缩后的种子溶液，快速搅拌均匀，将溶液放于光密度为84mW/cm²，波长为594nm的左圆(L型)或者右圆(D型)偏振光下照射30min，将照射后溶液离心浓缩(4200rpm，3min)40倍，加入巯基聚乙二醇，至其终浓度为0.2nM，4h后即可得到(L型或D型)手性金纳米粒子。

(2)手性肿瘤纳米疫苗的制备：将合成的手性金纳米粒子在-30℃，8Pa条件下冷冻干燥9h，得到具有佐剂潜力的手性纳米材料，使用时称取2mg材料，10μg单磷酰脂质A，50μg牛血清白蛋白溶解于100μL生理盐水中，加入20μL花生油，剧烈搅拌30min，即得到手性肿瘤纳米疫苗。

实施例3

一种手性肿瘤纳米疫苗及其制备方法，具体包括以下步骤：

(2)手性肿瘤纳米疫苗的制备：将合成的手性金纳米粒子在-30℃，8Pa条件下冷冻干燥9h，得到具有佐剂潜力的手性纳米材料，使用时称取2mg材料，15μg CpG寡核苷酸，50μg模型抗原卵清蛋白溶解于100μL生理盐水中，加入20μL花生油，剧烈搅拌30min，即得到手性肿瘤纳米疫苗。

对比例1

通过在合成纳米材料的过程中不加手性分子合成了非手性金纳米材料(A-NP)，冷冻干燥后称取2mg材料，10μg单磷酰脂质A，50μg模型抗原卵清蛋白溶解于100μL生理盐水中，加入20μL花生油，剧烈搅拌30min，即得到非手性纳米疫苗。

对比例2

实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗在制备过程中不添加花生油，获得的疫苗作为对比，研究了其在小鼠体内刺激树突细胞活化及抗原提呈的效果。

测试例1

实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗的活体促进抗原提呈能力的评价，具体步骤如下：

将C57BL/6小鼠随机分为三组，每组5只，分别皮下免疫抗原与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合物，实施例1制备的L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)和D型手性肿瘤纳米疫苗(D-P^-NP)，36h后检测小鼠淋巴结中树突细胞活化程度以及抗原提呈能力，具体结果如图2所示。

图2-a为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD40⁺的比例分析，图2-b为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD80⁺的比例分析，图2-c为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD86⁺的比例分析，图2-d为小鼠淋巴结中CD11c⁺SIINFEKL-MHC I⁺的比例分析。由图2可知，L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)能够促进小鼠淋巴结中树突细胞的活化，促进树突细胞的抗原提呈。

测试例2

实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗的活体免疫性能评价，具体步骤如下：

C57BL/6小鼠随机分为三组，每组5只，分别皮下免疫抗原与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合物，实施例1制备的L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)和D型手性肿瘤纳米疫苗(D-P^-NP)，7天后检测小鼠脾脏以及血清中相关免疫指标，具体结果如图3所示。

图3-a为小鼠脾脏CD8⁺IFN-γ⁺的比例分析，图3-b为小鼠脾脏CD4⁺IFN-γ⁺的比例分析，图3-c为小鼠脾脏CD8⁺TNF-α⁺的比例分析，图3-d为小鼠脾脏CD4⁺TNF-α⁺的比例分析。由图3可知，L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)能够诱导机体产生更强的免疫应答。小鼠皮下免疫L型手性肿瘤纳米疫苗后，刺激脾脏产生更多的IFN-γ⁺TNF-α⁺CD8⁺T细胞，有利于细胞免疫应答，更好的发挥抗肿瘤作用。

测试例3

实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗实验，具体步骤如下：

C57BL/6小鼠皮下接种EG7.OVA肿瘤细胞(1×10⁶/只)构建皮下肿瘤模型，将小鼠随机分为三组，每组5只，分别在接种肿瘤后第3、10和17天皮下免疫抗原与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合物，实施例1制备的L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)和D型手性肿瘤纳米疫苗(D-P^-NP)。接种肿瘤后每3天记录一次小鼠肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况至50天。在接种肿瘤的第18天，取小鼠肿瘤组织，通过流式细胞仪检测肿瘤组织中NK细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力，具体结果如图4所示。

图4-a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，图4-b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，图4-c为小鼠肿瘤组织中自然杀伤细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力情况统计图。由图4可知，L型纳米疫苗(L-P⁺NP)很好的抑制了肿瘤的生长。L型纳米疫苗(L-P⁺NP)组的小鼠肿瘤在28天已完全抑制，而PBS组的小鼠肿瘤体积超过1200mm³。PBS组的小鼠在接种肿瘤后的35天内全部死亡，D型纳米疫苗组(D-P^-NP)的小鼠50天的存活率为20％，而L型纳米疫苗(L-P⁺NP)组50天小鼠存活率为100％。此外，通过流式细胞技术我们检测了肿瘤组织中的自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性，结果表明，皮下免疫L型纳米疫苗(L-P⁺NP)能显著提升肿瘤组织中的自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性。

测试例4

实施例1制备的手性肿瘤纳米疫苗预防肿瘤生长实验，具体步骤如下：

C57BL/6小鼠随机分为三组，每组5只，分别皮下免疫抗原与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合物，实施例1制备的L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)和D型手性肿瘤纳米疫苗(D-P^-NP)，免疫三次每次间隔7天，于最后一次免疫后第7天皮下接种EG7.OVA肿瘤细胞(1×10⁶/只)，接种肿瘤后每3天记录一次小鼠肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况至50天。在接种肿瘤的第18天，取小鼠肿瘤组织，通过流式细胞仪检测肿瘤组织中NK细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力，具体结果如图5所示。

图5-a为小鼠接种肿瘤后肿瘤体积的变化曲线，图5-b为小鼠接种肿瘤后小鼠存活情况统计，图5-c为小鼠肿瘤组织中自然杀伤细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力情况统计图。由实验结果可知，L型纳米疫苗(L-P⁺NP)具有很好的预防肿瘤生长的功能。L型纳米疫苗(L-P⁺NP)组的小鼠肿瘤能在28天完全抑制，而PBS组的小鼠肿瘤体积超过1200mm³。PBS组的小鼠在接种肿瘤后30天内全部死亡，D型纳米疫苗组(D-P^-NP)的小鼠50天的存活率为20％，而L型纳米疫苗(L-P⁺NP)组50天小鼠存活率为100％。此外，通过流式细胞技术我们检测了肿瘤组织中的自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性，结果表明，皮下免疫L型纳米疫苗(L-P⁺NP)能显著提升肿瘤组织中的自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性。

测试例5

对比例1制备的非手性肿瘤纳米疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗实验，具体步骤如下：

小鼠皮下接种EG7.OVA肿瘤细胞后(1×10⁶/只)，分别在接种肿瘤后第3、10和17天皮下免疫非手性纳米疫苗，接种肿瘤后每3天记录一次小鼠肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况至50天。在接种肿瘤的第18天，取小鼠肿瘤组织，通过流式细胞仪检测肿瘤组织中NK细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力，具体结果如图6所示。由图6可知，非手性纳米疫苗并没有抑制肿瘤生长的功能，在接种肿瘤细胞后肿瘤仍然生长，在接种肿瘤细胞后的第28天肿瘤体积达到了1200mm³，并且小鼠在接种肿瘤后的35天内全部死亡，通过对肿瘤组织中的自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性分析，皮下免疫非手性纳米疫苗并没有显著提高自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性。

测试例6

对比例1制备的非手性肿瘤纳米疫苗预防肿瘤生长实验，具体步骤如下：

C57BL/6小鼠皮下免疫非手性纳米疫苗三次每次间隔7天，于最后一次免疫后第7天皮下接种EG7.OVA肿瘤细胞(1×10⁶/只)，接种肿瘤后每3天记录一次小鼠肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况至50天。在接种肿瘤的第18天，取小鼠肿瘤组织，通过流式细胞仪检测肿瘤组织中NK细胞及CD8⁺T细胞活化程度及杀伤能力，具体结果如图7所示。由图7可知，非手性纳米疫苗不具有预防肿瘤生长的功能，肿瘤持续生长，并且小鼠在接种肿瘤后的35天内全部死亡，通过对肿瘤组织中自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性分析可知，非手性纳米疫苗没有显著提升自然杀伤细胞和CD8⁺T细胞的杀伤活性。

测试例7

对比例2制备的无油剂手性肿瘤纳米疫苗活体激活树突细胞促进其抗原提呈能力的评价，具体步骤如下：

将C57BL/6小鼠随机分为三组，每组5只，分别皮下免疫对比例2制备的无油剂L型手性肿瘤纳米疫苗(L-P⁺NP)和无油剂D型手性肿瘤纳米疫苗(D-P^-NP)，36h后检测小鼠淋巴结中树突细胞活化程度以及抗原提呈能力，具体结果如图8所示。

图8-a为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD40⁺的比例分析，图8-b为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD80⁺的比例分析，图8-c为小鼠淋巴结中CD11c⁺CD86⁺的比例分析，图8-d为小鼠淋巴结中CD11c⁺SIINFEKL-MHC I⁺的比例分析。有实验结果可知，对比例2制备的无油剂的手性肿瘤纳米疫苗能够激活机体树突细胞，也能促进树突细胞的抗原提呈能力，但是对比实施例1制备的添加油剂的手性肿瘤纳米疫苗，其作用效果明显较差。

由此可见，手性构型是纳米疫苗发挥免疫调节的重要特性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种手性肿瘤纳米疫苗，其特征在于，所述手性肿瘤纳米疫苗的制备包括以下步骤：

(1)手性金纳米粒子的制备：先将反应瓶用王水浸泡24h，洗净，晾干；向9.6mL，16.7mM的十六烷基三甲基氯化铵水溶液中加入75μL，10mM的碘化钾溶液，100.4μL氯金酸钠，80μL，64mM抗坏血酸，混合后加入10μL，0.1M氢氧化钠，快速搅拌20s，静置10min后生成种子，将种子溶液离心，浓缩20倍于1mM十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，用于下一步生长；所述离心为8000rpm，离心5min；

向4.75mL，1.7mM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入0.2mL，10mM的氯金酸，静置10min后，加入0.475mL，40mM抗坏血酸，混合后加入5μL，4mM的L型或者D型半胱氨酸-苯丙氨酸二肽，以及50μL浓缩后的种子溶液，快速搅拌均匀，将溶液放于光密度为84mW/cm²，波长为594nm的左圆L型或者右圆D型偏振光下照射30min，将照射后溶液离心浓缩40倍，加入巯基聚乙二醇，至其终浓度为0.2nM，4h后即可得到手性金纳米粒子；所述离心浓缩为4200rpm，离心浓缩3min；

2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的手性肿瘤纳米疫苗。

3.权利要求1所述的手性肿瘤纳米疫苗在制备淋巴肿瘤治疗药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述手性肿瘤纳米疫苗的给药剂量为2-12mL/kg。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述手性肿瘤纳米疫苗通过皮下、皮内、腹腔、鼻腔或者尾静脉进行免疫。