KR19990063672A

KR19990063672A - 표적배향된 미립자물 유전 면역화에 의한 세포-매개 면역응답의 자극.

Info

Publication number: KR19990063672A
Application number: KR1019980702134A
Authority: KR
Inventors: 루이스 디. 주니어. 팔로; 케네스 엘. 로크
Original assignee: 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 코몬웰츠 시스템 오브 하이어 에듀케이션; 브랜드 더블유. 제니시키; 다나-파버 캔서 인스티튜트
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1999-07-26
Also published as: CA2233278A1; BG102355A; TR199800573T2; CZ92998A3; SK40198A3; HUP9802651A2; PL325953A1; WO1997011605A1; CN1201369A; AU7251596A; HUP9802651A3; EP0863704A1; JPH11512724A; AU716497B2; NO981386D0; NO981386L; EP0863704A4; NZ319891A

Abstract

본 발명은 항원-특이 면역성을 인간숙주를 포함한 포유동물 숙주에게 제공하기 위한 여러 유전면역의 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 항원 단백질 또는 단백질 부분을 발현하는 미립자물 폴리누클레오티드를 항원을 표현하는 세포와 같은 숙주 표적세포의 세포질에 배향시키는 능력에 기초를 두고 있다. 그런 미립자물 폴리누클레오티드를 항원을 표현하는 세포의 세포질에 배향적으로 공급하면 항원-특정 CTL을 자극할 수 있게 되고 그리하여 신생세포 및 비루스 감염 세포와 같은 감염된 세포의 파괴를 촉진시킬 수 있다.

Description

표적배향된 미립자물 유전 면역화에 의한 세포-매개 면역응답의 자극.

세포독 T-임파구는 종양 또는 바이러스 감염에 대한 효과적인 인간 면역응답의 긴요성분이다. 세포독 T-임파구는 영향받은 표적세포의 표면상에 있는 MHC Ⅰ급 분자에 의해 제공되는 항원 펩티드를 인식함으로써 신생세포 또는 바이러스 감염 세포를 파괴한다. 이들 항원 펩티드는 영향받은 세포의 시토졸 내에 존재하는 타단백질의 변성생성물인데, 이것은 처리되어 내인 MHC Ⅰ급 처리 통로를 통하여 CTL에 제공된다.

MHC Ⅰ급 분자의 맥락 속에 타단백질을 인식하는 것이 CTL에 의한 영향받은 표적세포의 인식과 파괴를 위해 충분하겠지만, T-임파구 전구체로부터 항원-특이 CTL을 유도하는데는 추가의 신호가 필요하다. 전문화 항원제공 세포(APC)는 항원-MHC Ⅰ급 리간드 및 CTL-매개 면역성의 유도상에 요구되는 부속 신호를 제공할 수 있다. APC의 일반적 성질은 MHC Ⅰ급 및 Ⅱ급 발현, APC-임파구 상호작용에 중요한 여러 부착분자의 발현 및 CD80 및 CD86과 같은 공자극제 분자의 발현을 포함한다. APC의 예는 (표피 랑거한스 세포, 피부 수지상 세포, 및 임파 절결 및 비장에 존재하는 수지상세포를 포함하여) 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다.

죽은 종양세포, 죽은 바이러스-감염 세포, 또는 성분 단백질을 사용하여 면역법에 의해 생체 내에서 항원-특이 CTL응답을 유도하려는 시도는 대체로 실패했는데, 아마 세포외부 체액에 있는 단백질이 시토졸에 들어가서 MHC Ⅰ급 제공통로에 접근할수 없는 때문인 것 같다.

유전 면역법은 몇 가지 매력적인 특징을 갖는다. 몇 가지 생체 내 유전자 전이방법으로, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 매개 유전자 전이 및 나 DNA의 직접주입을 포함하는 유전자경유 발현법이 생겼다(참고를 위해서는, Krishnaw 등, 1995,Nature Med. 1: 521-522 및 Pardoll 등, 1995,Immunity3:165-169를 보라.)

Williams 등(1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 2726-2730)은 개똥벌레 루시페라제 유전자를 바이오리스트(바이오발리스트)로 공급하여 무자 표피세포 중에서 단백질 루시페라제를 발현하는 방법을 제시했다. CTL응답은 이 연구에서는 언급되지 않았고 세포-매개 면역응답을 발생하기 위해 표적화된 특정 숙주 세포에 대해서도 언급되지 않았다.

Tang등(1992,Nature356: 152-154)은 타단백질에 체액응답을 일으키기 위해 바이오리스트(바이오발리스트) 장치를 이용했다. 유전자-코드화하는 hGH를 CMV 촉진제 또는 β-광선 촉진제를 제어한 가운데 생쥐의 표피조직에 공급했다. 이 면역화 과정에 응답하여 생쥐 내에는 항-hGH 항체가 검출되었다. Tang등은 세포-매개 면역통로에 표적이동하는 유전면역화를 기재하고있지는 않다. 유전면역화를 위한 APC세포의 직접표적화는 Tang 등에 의해 기재 또는 시사되고있지 않다.

Fynan등(1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11478-11482)은 인플루엔저 바이러스 혈구응집소 당단백질을 코드화하는 플라스미드 DNA 구조물을 사용함으로써 Tang 등의 발견을 확인했다. Fynan등은 DNA 피복된 금 구슬을 표피에 유전자 총 공급하여 발생된 체액응답을 다른 기전과 비교하여, 바이오리스트(바이오발리스트) 장치의 사용이, 1) 치명적 인플루엔저 공격에 대한 95%보호를 달성했고, 2) DNA 면역화에 이르는 가장 효과적인 경로이어서 점막, 근육 내 또는 정맥 내 투여보다 훨씬 효과적임이 증명되었고, 3) 식염수 접종법보다 250 내지 2500배 적은 DNA를 필요로 한다는 것을 발견했다. 유전면역화를 위한 APC세포의 직접표적화는 Fynan 등에 의해 기재 또는 시사되고있지 않다. CTL 매개 면역성도 언급되지 않았다.

Liu 및 동료들(Montgomery등, 1993, DNA Cell Biol, 12:777-783; Ulmer등,1993, Science, 259:1745-1749; Donneliy등,Nature Medicine 1:583-587)은 나 DNA의 비표적화 비특이적 근육내 주사가 바이러스 단백질에 대해 항원-특이 CTL응답 및 바이러스 공격에 대한 보호면역성을 유발하는 것을 실증했다. 이 연구는 유전자 면역을 위해 유전자물질을 APC에 표적공급하는 것을 기재하고 있지는 않다.

Sun등(1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 2889-2893)은 생쥐내 항종양 응답을 야기하기 위해 바이오리스트(바이오발리스트)장치를 사용했다. 이들은 IL-6을 발현하는 플라스미드 구성물을 생쥐의 종양부위에 직접 공급했다. IL-6의 발현은 종양에 비특이적으로 배향되는 일종의 시토킨 유전요법을 제공했다. 종양에 대한 항원특이 면역성은 주장되지 않았다. 유전자 면역을 위해 유전자물질을 APC 세포에 직접 표적공급하는 것은 Sun 등에 의해 기재, 시사되고 있지 않다.

Kundig등(1995,Science,268:1343-1346)은 임파성 기관에 단백질 항원을 한정 위치시키는 것이 생체 내에서 항원특이 CTL응답을 유도하는데 긴요하다는 것을 증명하고 있다. 유전면역은 언급되고있지 않다.

Kovacsovics-Bankovski 및 Rock(1955,Science 267:243-246)은 단백질 항원을 위한 파고솜-시토졸 통로가 정상적으로는 MHC Ⅰ급 내인 통로를 통해 제공되지 않는 것을 보여주고 있다. 저자들은 파고솜 내에 내재된 입자형의 단백질이 사실 MHC Ⅰ급 제공을 위해 시토졸 통로에 들어갈 수 있다고 추측하고 있다. 기능적으로 무자인 유전물질이 파고솜-시토졸 통로를 통해 시토졸에 들어갈 수 있는 능력에 대해서는 언급이 없다.

Falo등(1995,Nature Med.1:649-653)은 미립자물 단백질 항원을 동물 내에 직접 공급함으로써 생쥐 내 항원특이 CTL매개 종양 면역이 야기된다는 것을 보여줌으로써 파고솔-시토졸 통로에 대한 생체 내 뒷받침을 제공하고 있다. 그들은 동물 내에 직접 주사된 단백질은 미립자물로 투여되면 APC의 파고솜-시토졸 통로에 특이적으로 들어갈 수 있다는 것을 실증했다. 유전면역절차에 관해서는 상세한 내용이 발표되지 않았다. 생체 내 투여된 유전자물질이 그 통로를 통해 손상되지 않고 APC 또는 기타 세포종의 시토졸에 들어갈 수 있는 능력은 기술되어있지 않다.

Padoll 및 Beckerleg(1995,Immunity 3:165-169)는 최근 나 DNA 왁찐의 면역학을 재검토했다. 그들은 현재 미지인 DNA 면역의 기전을 정의 할 수 있기 위해서는 추가연구가 중요함을 강조하고 있다. 특히, 그들은 "그것(나 DNA)이 면역응답을 활성화시키는 기전을 세분하는 것이 중요할 것이다. 오직 이 연구에 의해서만 지혜로운 변형을 도입하여 그것의 궁극적 효능을 정성 및 정량적으로 극대화시킬 수 있다."고 결론짓고 있다.

상기 문헌에 기록되어있는 연구노력에도 불구하고, 숙주내의 세포종을 특정적으로 표적공격하여 항원특정 CTL매개 면역성을 자극하고 다시 숙주내의 특정 신생물 또는 바이러스 감염된 세포의 직접 파괴를 촉진하는 유전면역 규약을 개발할 필요는 상존하고 있다. 본 발명은 이 요구를 다루고있고 그 요구를 충족시킨다.

유전면역 또는 인간숙주를 포함하는 포유동물 숙주에 있어 항원-특이 면역성을 자극시킨다는 목적이 본 발명의 핵심이다. 본 명세서는 미립자물 폴리누클레오티드를 항원을 표시하는 세포와 같은 숙주 표적 세포의 세포질에 공급하는 것을 개시한다. 이들 미립자물 폴리누클레오티드는 표적세포의 세포질에 접근하는 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 코드화 한다. 항원 유전자의 발현은 그것에 한정되는 것은 아니나 항원-특이 세포독성 T-임파구(CTL)의 유도를 포함하는 항원-특이 면역응답을 일으킨다. 항원의 시토졸 접근으로 항원 펩티드는 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통한 막제공(세포막에 도달하는 것)이 가능하다. 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통한 막제공으로 항원-특이 CTL의 유도가 자극된다. 그러면 유도된 항원-특이 CTL은 신생세포 또는 비루스 감염 세포와 같은 항원을 발현하는 영향받은 숙주세포를 목표공격하여 그것을 파괴한다.

도 1은 형질감염된 종양세포라인 MO4 및 EG7에 의한 오발부민의 기능적 제공(노정)을 보여준다.

문헌(Rock등, 1990,J.Immunol.45: 804-811)에 기재되어있는바 대로 첨가된 외인 OVA펩티드 SIINFECL(10ng/mg)의 존재하에(개방된 기호) 또는 부존재하에(폐쇄된 기호) 세포 하이브리도마 RF33.70(항OVA+K^b) 및 표시된 개수의 형질감염된(정방형) 또는 비 형질감염된(원) 종양세포로 미소배양주를 조제했다. 18시간 배양후, 상징액을 회수하여 지시 세포 라인 HT2(Rock등, 1990,J.Immunol.145: 804-811)를 사용하여 IL-2에 관해 분석했다. (A) B16 및 OVA형질감염된 서브클론MO4. (B) EL4 및 OVA형질감염된 EL4 서브클론EG7. OVA형질감염된 종양에 의한OVA제공은 분석 배양물중의 외인SIINFECL의 존재에 의해 그다지 향상되지 못했다.

도 2는 B16 유도된 멜라노마 MO4에 의한 OVA발현이 생체내 종양성장 또는 종양공격후 숙주 생존에 별로 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다.

생쥐를 MO4(원) 또는 B16(정방형)에 의해 공격되게 했다(5×104/생쥐, 즉 양측, 중간 옆구리). 종양크기(도 2A)를 3×/주로 평가하고 각군에서 첫째 사망이 일어날 때까지 평균 종양 면적을 밀리미터로 보고했다. 생존(도 2B)을 생존 동물 퍼센트로 기록했다. 모든 실험은 5생쥐/군을 사용했고 적어도 3회 반복했다. 치사가 확실한 생쥐는 희생시켰다.

도 3은 OVA를 코드화하는 DNA의 피부공급에 의한 면역화가 OVA를 발현하는 멜라노마 MO4에 의한 치사적 공격으로부터 OVA-특이 CTL 및 항원특이, CTL매개 보호를 유발하는 것을 보여준다.

OVA-면역된(실시예2에 기재된 것처럼 유전적으로 면역된) 생쥐로부터의 생체 내에서 재 자극된 비장세포를, OVA-형질감염된 임파종 EG7(폐쇄 정방형) 또는 비 형질감염된 양친 EL4(개방 정방형)에 대한 세포용해기능에 관해 분석했다(A). 효험 집단을 보체 단독으로(개방 정방형), 또는 CD4⁺(폐쇄 삼각형), CD8⁺(개방 원), Thy1.2⁺(폐쇄 원) 임파구에 대한 mAb 및 보체로 배양하고 그런 뒤 EG7표적에 대한 세포용해 활성에 대해 분석했다(B). C-F에서는, 생쥐를 OVA(폐쇄 정방형) 또는lacZ(개방 정방형)로 유전적으로 면역되게 하고 7일 후 증강시켰다. 면역된 생쥐군을 최종 면역화(0일) 후 7일째에 B16 멜라노마(D), 또는 OVA-발현 서브클론 MO4(C)로 공격되게 했다. 다른 방법으로는, 면역된 생쥐를 2군으로 분할하고, 그 중의 일군은 최종 면역 후 7 및 9일째에 항-CD8 mAb의 i.p 주사에 의해 CD8⁺임파구가 결핍되게 했다. 그런 뒤 무자(흠없는)(E) 및 CD8⁺결핍된(F) 생쥐를 최종 면역화(0일) 후 10일째에 MO4로 공격받게 했다. 생존율은 생존한 동물의 퍼센트로 보고했다(C-F). 제 60일에 생존한 동물은 종양성장의 징후가 없었다. 모든 실험은 군 당 5생쥐를 포함했고 적어도 3회 반복되었다. 죽어가는 생쥐는 동물 관리 지침에 따라 희생시켰다.

도 4는 항원 제공 세포가 미립자물 폴리누클레오티드를 내화 및 발현하고 MHC Ⅰ급 한정된 처리 통로를 통해 발현된 항원을 처리, 제공하는 것을 보여준다.

임파구에서 골수세포를 결핍되게 하고 10⁶세포/웰로 24개의 웰판 내에서 10%FCS, L-글루타민, 항균제 및 2-ME로 보충된 RPMI 1640에서 1야 배양하여 수지상 세포를 제조했다. 제 1일에, 2.5×10⁵세포/웰에서, 세포를 GM-CSF(10³U/ml, Sigma, St.Louis, MO) 및 쥐의 rlL-4(10³U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)로 보충했다. 유동 혈구계측 분석을 해본바, 이들 수지상 세포는 CD45, CD44, CD11b(Mac-1), CD18, CD80, CD86 및 Ⅰ급 및Ⅱ급 MHC항원을 발현했다. 수지상 세포를, 저 혈청 매체(Optimen, Gibco, Grand Iland, NY)중에서 OVA펩티드(20ng/ml)+β2-미크로글로빈(β2-M, 10μl/ml, 인간, Sigma)과 함께 또는 그것 없이 37℃에서 2시간 펄스 시켰다. 그런 뒤 세포를 철저히 세척하고 PBS중에 재현탁시키고 조사(2000rad)한 뒤 무결 생쥐 내에 주사했다. 표시된 수의 골수 유도 수지상 APC를, 미립자물 기질로서 Fe비드(폐쇄 정방형) 또는 금 비드(폐쇄 원)를 사용하거나 또는 가용성 OVA단백질(2mg/ml)(개방 원)을 사용하여 실시예 2(50μl/ml/10⁶개 세포 7mg/ml 미립자물)에 기재한 것과 같이하여 제조된 OVA-코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드와 24시간동안 공배양하고, 세척하고, 그런 뒤 표시된 개수의 APC를 T세포 하이브리도마 RF33.70(항-OVA+K^b)과 함께 미소배양물 내에서 공배양시켰다. 18시간 배양후, 상징액을 수확하고 지시 세포라인 HT2(Rock등, 1990,J.Immunol. 145: 804-811)를 사용하여 IL-2에 대해 분석했다.

도 5는 바이오리스트(바이오발리스트)주입 또는 피부주사에 의해 투여된 미립자물 폴리누클레오티드 면역법의 비교를 보여준다.

C57B1/6 생쥐 5마리의 군을 면역시키고 제 7일에 증강시키고 그런 다음 증강 후 7일에 각 옆구리에 5×10⁵MO5 종양세포의 피부내 주사에 의해 공격받게 했다. 면역화는: (A) 실시예 2에 기재된 것과 같이, 바이오리스트(생 투창식)(바이오발리스트)(생 탄도식)투여에 의해 제조, 공급된 β-Gal(갈락토시타제)코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드; (B) 실시예 2에 기재된 것과 같이, 바이오리스트(바이오발리스트)투여에 의해 제조, 공급된 OVA 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드; (C) 피하주사에 의해 공급된 과잉량의 OVA 코드화하는 무입자 폴리누클레오티드; 또는 (D) 실시예 2에 기재된 것과 같이 제조되었으나 피하주사에 의해 투여된 당량의 OVA 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드로 구성되었다. 데이터는, 종양공격 후 50일에 각 군에 있어 종양이 없는 동물의 %로 주어져있다.

도 6은 OVA를 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드와 함께 배양된 APC로 면역화 하면 동물이 OVA발현 멜라노마 MO5에 의한 도전으로부터 보호될 수 있다는 것을 보여준다.

한 경우에는 C57B1/6생쥐 5마리의 군을 도 5에 표시된 것처럼 피하적으로 면역시키고 그런 후 면역화 후 10일에 각 옆구리에 1×10⁵MOS 종양세포의 피내주사에 의해 도전받게 했다. 면역화는: (개방 정방형) 무관한 항원 β-갈락토시다제를 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드(양쪽으로 뒷다리 당 7mg/ml 입자용액(입자 중량/PBS 용적) 100μl); (개방 원) 적절한 pAc-neo-OVA(대략 당량의 DNA/동물을 함유하는 뒷다리 당 100μl); 또는 (폐쇄 정방형) 5×10⁴골수 유도 수지상 세포/100μl 뒷다리들, 이하로 구성되었다(실시예 2의 기재와 같이 제조됨). 생존율은 생존동물의 퍼센트로 표시했다. 모든 실험은 군당 5마리 생쥐를 포함했다. 동물관리지침에 따라 죽는 동물은 희생시켰다.

본 발명은, 항원단백질을 코드화하는 DNA 부분을 포유동물 숙주내의 표적세포에 공급하는 것, 숙주 세포 내에서 재조합 DNA 부분이 발현하는 것, 및 후속하여 숙주세포에 의해 항원펩티드 또는 펩티드들이 제공되어 세포매개 면역성, 체액 면역성 또는 그 두 가지를 자극하는 것으로 되어있는, 포유동물 숙주의 치료적 또는 예방적 유전 면역법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항원 단백질 또는 그의 생물학적 활성부분을 코드화하는 DNA 서열을 포유동물 숙주내 특정 표적세포에 공급하는 것으로 되어있는, 포유동물 숙주의 치료적 또는 예방적 유전 면역법에 관한 것이다. DNA 부분으로부터 발현된 항원펩티드는 영향받은 세포에 특이적이고 이어서 항원특이 CTL생산을 자극하고 그에 의해 신생세포 및 바이러스 감염된 세포와 같은 영향받은 세포의 파괴를 촉진한다.

본 발명은 또한 미립자물 폴리누클레오티드에 의한 유전면역과 포유동물 숙주의 접종 및 이들 입자에 기초한 유전자경유 폴리누클레오티드의 표적세포의 시토졸에의 후속공급에 관한 것이다. 일단 표적세포의 유폐부내에 있게되면, 미립자물 폴리누클레오티드는 단백질 또는 그의 생물학적 활성부분을 발현하고 그래서 적당한 항원 펩티드 부분이 생성되어 내인 MHC Ⅰ급 통로를 거쳐 표적세포막에 제공된다. MHC Ⅰ급 통로를 통해 관심하의 항원 펩티드(들)가 적당히 제공됨에 의해 CTL 생산이 자극되고 그리하여 신생세포 및 바이러스 감염된 세포와 같은 세포의 파괴가 촉진된다.

따라서 본 발명은, 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 코드화하는 DNA 부분을 발생하고, 미립자물 폴리누클레오티드가 얻어지도록 DNA 부분을 입자표면상에 분포시키고, 상기 미립자물 폴리누클레오티드로 포유동물숙주를 접종하고, 미립자물 폴리누클레오티드를 포유동물 숙주의 표적세포의 세포질에 공급하여 발현된 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분이 MHC Ⅰ급 통로를 통해 상기 표적세포의 막표면에 제공되게 하는 것으로 되어있는 포유동물 숙주의 치료적 또는 예방적 유전면역의 생체 내 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 포유동물 숙주가 인간인 것이 바람직하다.

또한 본 명세서 중에 기재된 여러 구체예에서 대상의 DNA 부분은 1)종양거부 항원이나 항원 단백질 부분 또는 2) 바이러스 항원이나 항원 단백질 부분을 발현하는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용될 수 있는 인간 TRA의 예는 거기에 한정되는 것은 아니나 MAGE-1, MAGE-3, Melan-A, gp100, p53, CEA 및 HER2/neu를 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 바이러스 항체의 예는 거기에 한정되는 것은 아니나 HIV gp120, HIV gp160, 인플루엔저 바이러스 핵단백질 및 B형 간염 표면 항원을 포함한다.

본 발명에 있어 바람직한 표적세포는 APC인 한편 APC의 바람직한 지역 또는 이동장소는 인간숙주의 임파성 조직이다.

본 발명의 한 구체예에서는 포유동물 숙주는 미소발사 포격장치를 이용함에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역화된다. 상세하게는, 포유동물 숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 적어도 적당한 수의 숙주세포의 세포질에 들어가도록, 바이오리스트(바이오발리스트)과정에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 접종하여 면역화된다. 유전자이동 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 내인 MHC Ⅰ급 통로에 제공되어 숙주세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 도입된 항원이 내인 숙주세포 막에 제공되면 항원특이 CTL의 유도가 촉진되고 이것은 이제 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 특정 구체예에 있어서는, 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간이, 미립자물 폴리누클레오티드가 APC를 포함하는 적어도 적당한 수의 숙주세포의 세포질에 들어가도록 미소발사 포격접종함으로써 비특이 발사포격의 직접적 결과로 미립자물 폴리누클레오티드에 의해 면역화된다. 피부가 포격될 때 포격될 수 있는 피부의 APC는 표피 랑거한스 세포, 각소세포, 또는 피부 수지세포를 포함하나 이것들에 한정되는 것은 아니다. 임파성 조직이 포격될 때 포격될 수 있는 임파성조직의 APC는 잔류성 수지세포, 대식세포, 기질세포, T 임파구 또는 β임파구를 포함하지만 거기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서는 포유동물 숙주가, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는(거기에 한정되지 않음) 직접주사에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역화된다. 미립자물 폴리누클레오티드는 숙주세포에 침투하여 항원펩티드 부분이 내인 MHC Ⅰ급 통로에 제공되어 숙주세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 내인 표적세포 막에 제공되면 항원특이 CTL의 유도가 촉진되고 이것은 이제 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

특히 바람직한 구체예에서는 미립자물 폴리누클레오티드가 피하주사에 의해 인간 숙주에 공급되고 파고솜-시토졸 통로를 통하여 APC에 표적배향되고 APC에 의해 생물학적 유효수준에서 발현된다. 본 발명은 미립자물 폴리누클레오티드 착체를 피하접종경로를 통해 직접 주사하여 APC에 표적적으로 공급되게 하고 임파조직내에서 항원발현이 되게 하는 것을 개시한다.

본 발명의 다른 특별한 구체예에서는 APC에 직접 표적화를 위해 피하주사하는 방법은 종양거부항원(TRA) 또는 그의 생물학적 활성부분을 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드를 공급하는 것을 포함한다. 이런 방식으로 TRA 미립자물 폴리누클레오티드를 일정방향으로 공급하면 종양특이 항원 펩티드를 Ⅰ급통로 내에 최대로 유입시킬 수 있고 동시에 비 APC세포 내에서 입자 전위를 현저히 회피할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 특별한 구체예에서는 APC에 직접 표적화를 위해 피하주사하는 방법은 바이러스 항원 또는 그의 생물학적 활성부분을 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드를 공급하는 것을 포함한다. 이런 방식으로 바이러스 항원을 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드를 일정방향으로 공급하면 바이러스특이 항원 펩티드를 Ⅰ급통로 내에 최대로 유입시킬 수 있고 동시에 비 APC세포 내에서 입자 전위를 현저히 회피할 수 있을 것이다.

전문가는, 또한, 금, 철 및 합성수지를 포함하는(그러나 여기에 한정되지는 않음) 다양한 물질로 구성된 미립자물은 본 발명에서 APC를 표적화하는데 사용되는 파고솜-시토졸 통로에 접근할 수 있다는 것을 또한 알 것이다.

본 발명의 다른 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드와 공배양시킴으로써 시험관내에서 항원 충진된 선천성 APC로, 면역화된다. 미립자물 폴리누클레오티드은, 예컨대, 미소발사대 포격에 의해 또는 파고솜-시토졸 통로에 의해 시험관 내에서 APC에 침입할 수 있을 것이다. 상세하게는, 포유동물 숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 시험관내에서 특이적으로 유입하여 APC가 숙주 내에 주입되게 하는 방식에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드 형질감염된 APC로 면역화 된다. APC에 의한 흡수에 이어, 유전자경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 임파조직 내에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드로 시험관내에서 형질감염된 선천성 APC로, 면역화된다. 상세하게는 포유동물숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 시험관내에서 본 발명의 다른 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드와 공배양시킴으로써 시험관내에서 항원 충진된 선천성 APC로, 면역화된다. 미립자물 폴리누클레오티드는, 예컨대, 미소발사대 포격에 의해 또는 파고솜-시토졸 통로에 의해 시험관 내에서 APC에 침입할 수 있을 것이다. 상세하게는, 포유동물 숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 시험관내에서 APC에 유입하고 그런 후 APC는 숙주 내에 주입되는 방식으로 미립자물 폴리누클레오티드 형질감염 APC로 면역화 된다. APC는 항원을 코드화하는 폴리누클레오티드 및/또는 APC의 항원제공기능의 효율을 증진시키는 분자(들)를 코드화하는 폴리누클레오티드로 시험관내 형질감염된다. 그런 분자는 시토킨 및 공자극제 분자를 포함하고 그러나 거기에 한정되지 않는다. 시토킨의 예는 IL-12, IL-2 및 IL-4를 포함하나 그것에 한정되지는 않는다. 공자극제 분자의 예는 CD80 및 CD86를 포함하나 그것에 한정되지 않는다. 세포경유 항원을 코드화 하는 폴리누클레오티드는, APC에 유입된 후, 항원펩티드부분이 처리되고, 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되고, APC의 막표면에 표시되게 할, 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원이 내인 APC세포막에 제공되어, 주사부위 또는 임파조직에서 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다. APC에 유입한 뒤, 세포경유 시토킨 및/또는 공자극제-코드화하는 폴리누클레오티드는, APC의 항원제공기능에 의해 주입지점 또는 임파조직에서 항원 특이 면역응답이 유도되도록, 생물학적으로 유효한 수준에서 발현된다.

전문가에게는 폴리누클레오티드가, 금, 철 및 합성 수지를 포함하고 그러나 거기에 한정되지는 않는 다양한 재료로 구성된 미립자물 위에 침전될 수 있다는 것도 알려져 있을 것이다.

전문가에게는 미립자형으로 이용될 수 있는 세포경유 서열을 발생시키기 위해 여러 재조합벡터가 사용될수 있다는 것도 알려져 있을 것이다. 주로 취급용이성으로 인해 바람직한 벡터는 DNA 플라스미드 벡터이다.

전문가에게는 APC가 골수 및 말초혈액을 포함하는 그러나 그것에 한정되지 않는 다양한 숙주 조직으로부터 얻어질 수 있다는 것 및 상기 APC는 시험관에서 조작되고 그런 뒤 상기 숙주 내에 재도입될 수 있다는 것이 아려져있을 것이다.

신생물 세포에 대한 치료적 또는 예방적 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

바이러스 감염에 대한 치료적 또는 예방적 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.

종양거부항원유전자를 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드를 CTL응답을 발생시키는데 관여하는 면역세포에 표적배향시킴으로써 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간의 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

종양거부항원유전자를 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드를 CTL응답을 발생시키기 위해 숙주 임파조직내에 국한된 또는 그 조직에 이동할 수 있는 숙주항원 제공 세포에 표적배향시킴으로써 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간의 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

바이러스 유전자를 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드를 특정 바이러스 감염에 대해 CTL응답을 발생시키는데 관여하는 숙주 면역세포에 표적배향시킴으로써 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간의 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

바이러스 유전자를 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드를 CTL응답을 발생시키기 위해 숙주 임파조직 내에 국한된 숙주항원 제공 세포에 표적배향시킴으로써 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간의 유전면역법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 명세서에서 용어 "포유동물 숙주"는 인간을 포함하나 그것에 한정되지는 않는 동물왕국의 멤버들을 포함한다.

여기서 사용된 용어 "DNA 부분"은, 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통한 세포막 제공을 위해 항원 단백질 또는 항원 단백질부분의 표적세포 발현을 야기시킬 적절한 코딩 영역 및 조절서열을 포함하고있는, DNA이거나 또는 RNA인, 임의의 핵산염을 포함할 수 있다.

여기에서 사용된 용어 "미립자물 폴리누클레오티드"는 금, 철 및 합성수지를 포함하나 그것에 한정되지는 않는 재료들로부터 제조된 미립자물을 가리킬 수 있는데, 여기서 입자는 앞절에서 정의된 DNA부분들의 집단을 포함한다.

본 발명은, DNA부분을 포유동물 숙주 내의 표적세포에 공급하고, 표적세포 내에서 DNA부분을 발현하고, 이어서 표적세포 내에서 재조합 항원 펩티드를 제공하여 세포-매개 면역성, 인간 면역성, 또는 그 두 가지를 자극하는, 포유동물 숙주의 치료적 또는 예방적 유전 면역법에 관한 것이다.

본 발명은 다시 단백질 또는 그의 생물학적 활성부분을 코드화 하는 DNA부분을 포유동물 숙주 내 특정 표적세포에 공급하는 것으로 되어있는, 포유동물 숙주의 치료적 또는 예방적 유전 면역법에 관한 것이다. DNA서열로부터 발현된 항원 펩티드는 신생세포나 바이러스 감염된 세포와 같은 영향받은 세포에 특이적이다. 항원특이 CTL생산이 자극되어 신생세포나 바이러스 감염된 세포와 같은 표적세포의 파괴를 촉진시킨다.

본 발명은 종양 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 유전면역 방법을 개시한다. 세포독 T세포는 종양 및 바이러스 감염에 대한 면역반응을 위한 중요한 성분이다. 세포독 T세포는 종양표적의 표면에 있는 MHC Ⅰ급 분자에 의해 제공되는 항원 펩티드를 인식함으로써 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 죽인다. 이들 펩티드는 영향받은 세포에 의해 합성되고 시토졸 내에서 변성되는 종양 항원으로부터 유도된다. 죽은 종양세포 또는 성분단백질로 면역화함에 의해 생체 내에 있어 종양-특이 CTL응답을 유도하려는 시도는, 아마 세포 밖의 체액에 있는 단백질이 시토졸에 들어가 MHC Ⅰ급 제공 통로에 접근할 수 없는 이유 때문에, 성공적이지 못했다.

본 발명의 특정구체예는 관심대상의 단백질을 발현하는 DNA부분을 포함하는 입자에 의한 유전 면역법에 관한 것이다. DNA부분을 함유하는 그런 입자는 이 명세서 전체를 통하여 '미립자물 폴리누클레오티드'로 지칭된다. 생체 내 세포공급은, 피복된 비드 또는 금 입자와 같은 특정 형태의 관심대상이 되는 DNA부분 또는 단백질을 투여함으로써 가장 잘 성취될 수 있다. 단백질 또는 생물학적 활성부분은 표적세포 내 시토졸공급에 이어 발현된다. 영향받은 세포에 특이적인 발현된 단백질 또는 단백질부분은 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통해 T임파구에 제공되도록 항원 펩티드를 생성할 기질을 제공한다. MHC Ⅰ급 통로를 통해 관심의 항원 펩티드(들)를 적당히 공급하면 CTL생성이 촉진되고 그것에 따라 영향받은 세포의 파괴가 촉진된다.

본 발명은, 종양거부항원(TRA) 또는 바이러스항원 또는 그 활성부분을 코드화 하는 DNA부분은 특정 세포에 표적배향되어 단계적 사건을 촉진하여 결국 CTL-매개 보호종양 면역성을 일으킨다는데 에 기초를 두고 있다. 이 목적을 위해, 본 발명은 항원단백질을 코드화하는 특정 형태의 DNA로 표적숙주세포를 형질감염함으로써 CTL-매개 면역성을 유도하는 것을 개시하고 있다. 면역화 단백질은 세포내적으로 형성되고 따라서 MHC Ⅰ급 한정된 제공통로에 접근되고 있다. 당연한 결과로 처리된 에피토프가 생성되고 형질감염된 세포는 수일 동안 면역화 단백질을 생성하여 잠재적으로 보다 강력한 세포유전적 자극을 용이화 시킨다.

본 발명의 특정 구체예에서는, 포유동물 숙주가, 특정 폴리누클레오티드가 비특이 발사 포격의 직접적 결과로서, 탄도에 있는, 바람직하게는 APC를 포함하는 (그러나 꼭 거기에 한정되지는 않는) 적어도 적당한 수의 숙주세포의 세포질에 들어가게 하는, 미소발사대 포격장치에 의해, 특정 폴리누클레오티드로 면역된다. 피부가 포격될 때 포격될 수 있는 피부의 APC는 표피 랑거한스 세포, 각질 세포 또는 피부 수지상 세포를 포함하나 거기에 한정되지는 않는다. 임파성 조직이 포격될때 포격될 수 있는 임파성조직의 APC는 잔류성 수지세포, 대식세포, 기질세포, T 임파구 또는 β임파구를 포함하지만 거기에 한정되는 것은 아니다. 세포경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 포격세포가 임파조직에 이동 후 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

포유동물 숙주세포는 특정 폴리누클레오티드가 파고솜-시토졸 통로를 통해 APC를 포함하는 숙주세포에 특이적으로 들어가도록 바이오리스트(바이오발리스트) 공급과정에 의해 특정 폴리누클레오티드로 면역된다. 특정 폴리누클레오티드는 포격지점(피부 또는 임파조직)에서 또는 이동 후에는 임파조직에서 파고솜-시토졸 통로를 통해 숙주세포에 침투한다. 그래서 미립자물 폴리누클레오티드은, 미립자물이 임파조직에 직접 이동한 뒤 임파조직내의 세포에 의해 흡수됨으로써 또는 미립자물 폴리누클레오티드를 흡수한 숙주 세포가 임파조직에 이동함으로써 임파조직에 침투한다. 숙주세포에 의해 흡수된 뒤, 세포경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 임파조직에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 구체예에 있어, 포유동물 숙주는 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 그러나 거기에 한정되지 않는 직접주사에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된다. 미립자물 폴리누클레오티드는 숙주세포에 침투하고 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 내인 표적세포막 제공으로 항원특이 CTL의 유도가 촉진되고, 이것은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

포유동물 숙주는 미립자물 폴리누클레오티드가 파고솜-시토졸 통로를 통해 APC를 포함하는 숙주세포에 특이적으로 들어가도록 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된다. 미립자물 폴리누클레오티드는 주입지점에서 또는 임파조직에 이동한 후 파고솜-시토졸 통로를 통해 숙주세포에 침투한다. 그래서 미립자물 폴리누클레오티드는, 미립자물이 임파조직에 직접이동하고 이어서 임파조직의 세포에 의해 흡수됨으로써 또는 미립자물 폴리누클레오티드를 흡수한 숙주세포가 임파조직에 이동함으로써 임파조직에 들어갈 수 있다. 숙주세포에 의한 흡수 후, 세포경유 폴리누클레오티드는, 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점 또는 임파조직에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 구체예에 있어, 포유동물 숙주는 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 그러나 거기에 한정되지 않는 직접주사에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된다. 미립자물 폴리누클레오티드의 조성은, APC식세포 통로(만노스-수용체 매개 통로, 또는 Fc-수용체 매개 통로를 포함하나 그것에 한정되지 않음)를 우선적으로 표적공격하고 또는 미립자물(바이러스 HA단백질, 또는 리스테롤리신 단백질과 같은 적혈구내질막 융합단백질을 포함하나 그것에 한정되지 않음)의 시스톨 접근을 용이하게 하는 특정분자를 포함하도록 설계된다. 미립자물 폴리누클레오티드는 주입지점에서 또는 임파조직에 이동한 후 파고솜-시토졸 통로를 통해 숙주세포에 침투한다. 그래서 미립자물 폴리누클레오티드는, 미립자물이 임파조직에 직접이동하고 이어서 임파조직의 세포에 의해 흡수됨으로써 또는 미립자물 폴리누클레오티드를 흡수한 숙주세포가 임파조직에 이동함으로써 임파조직에 들어갈 수 있다. 숙주세포에 의한 흡수 후, 세포경유 폴리누클레오티드는, 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점 또는 임파조직에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명은 실시예 1에 상세히 기재된 쥐의 멜라노마 모델을 사용하여 몇 가지 첨단 문제점에 관해 예시되어있다. 요약하면 쥐모델에 있어 항원특이 종양 면역성을 연구하는데 있어서의 한계점은 MHC Ⅰ급 제한 CTL에 의해 인식될 수 있는 정의된 종양항원의 부족이다. TRA는, 이것에는 숙주가 용납되지 않는다는 것을 제외하고는, 본질적으로 세포에 의해 합성된 어떤 다른 단백질과도 다르지 않기 때문에, 종양에 의해 만들어진 타 단백질이 종양항원으로 작용 할 수밖에 없다. 본 발명의 종양면역법은, 오발부민(OVA)유전자를 C57B1/6유도된 멜라노마 B16 내에 형질감염함에 의해 정의된, 내인 합성 TRA를 사용하여 쥐의 종양모델로 예시되어있다. 이 시스템은 여러 이유로 이점이 있다: (1)B16멜라노마는 충분히 연구된 쥐 종양이다, (2) 이 종양라인의 생체내 성장특성 및 전이는 잘 특성표시되어있다, (3)오발부민은 잘 정의된 구조를 갖고있는 점이 그것이다. C57BI/6쥐에 있어 OVA의 세포내 처리 및 제공은 알려져있다. 특히 MHC Ⅰ급 K^b와 함께 제시된, 처리된 펩티드의 구조는 알려져있다. T-T 하이브리도마 33.70.Al 항-OVA-K^b을 사용하여 H2-K^b와 더불어 오발부민 펩티드[SIINFEKL]를 기능발현하는 것에 대한 시험분석도 또한 알려져있다(Kovacovics-Bankovski등, 1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 4942-4946). 이 시스템에서 OVA특이 CTL의 생체내 유도를 평가하는 기법도 또한 기재되어있다(Moore등, 1988,Cell54: 777-785).

본 발명의 한 구체예는 바이오리스트(바이오발리스트)장치를 사용하여 관심대상의 미립자물 폴리누클레오티드로 면역하는 것이다. 특히, 포유동물 숙주가, 미립자물 폴리누클레오티드공급이 치명적인 종양공격에 대해 보호적 면역성을 유발하게 형질감염된 세포내에서 일련의 셍물학적 사건을 촉진하도록 바이오리스트(바이오발리스트)과정에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된다. 본 발명은 바이오리스트(바이오발리스트)장치를 사용하여 피부 항원공급에 의해 여러 번 예시되고 있다. 첫째, 타 단백질 β-Gal을 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드의 도입은 표피 및 배액 임파 결절에 있어 β-Gal의 발현을 야기한다. 둘째, OVA 면역화는 OVA-특이 CTL의 유발을 일으킨다. 셋째, OVA-B16모델을 사용하면, OVA-면역된 동물은 OVA 발현 종양에 의한 종양공격으로부터 보호되며 이 보호는 항원특이적이고 CTL에 의존적임이 밝혀진다. 그 위에 이 보호기전은 바이오리스트(바이오발리스트)장치를 통한 미립자물 폴리누클레오티드의 일반적 피부공급과는 다르다. 그 대신에 식세포 APC를 특정 표적화하는 것 및/또는 임파조직내에서 항원을 발현하는 것이 전구체로부터 항원-특이 CTL을 유발하는데 중요하다. 따라서 본 발명의 바람직한 구체예에서는 표적세포는 식세포 APC, 특히 임파조직 내에 국한된 또는 그 조직에 갈 수 있는 APC인 것이다.

본 발명의 다른 구체예에서는 포유동물 숙주가, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는(거기에 한정되지 않음) 직접주사에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역화 된다. 유전자경유 폴리누클레오티드는, 항원펩티드 부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로에 제공되어 표적세포의 막표면상에 표시될 정도로 생물학적 유효수준으로 발현된다. 내인 APC 세포막에 제공되면 항원특이 CTL의 유도가 촉진되고 이것은 이제 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 직접주사에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된 포유동물 숙주의 표적세포는 식세포 APC이다. 유전자경유 폴리누클레오티드는, 항원펩티드 부분이 내인 MHC Ⅰ급 통로에 제공되어 APC세포의 막표면상에 표시될 정도로 생물학적 유효수준으로 발현된다. APC세포막에 제공되면 항원특이 CTL의 유도가 촉진되고 이것은 이제 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

바람직한 구체예에서는 미립자물 폴리누클레오티드는 피하주사에 의해 인간 숙주에 전해진다. 본 발명은, 미립자물 폴리누클레오티드 착체의 직접주사로 식세포 APC에의 표적공급이 행해지고 및/또는 순수한 전구체로부터 항원-특이 CTL의 우수한 유도를 일으키는 피하투여를 통해 임파조직내에서 유전자 발현이 야기되는 것을 기술하고 있다.

따라서 본 발명에서는, 진입하여 APC에 의해 발현되는, 단백질 또는 생물학적 활성부분을 코드화하는 DNA부분이 중요하다. 관심대상의 항원은 APC 세포질 내에서 발현되고 MHC Ⅰ급 통로에 진입하여 APC로 하여금 항원-특이 CTL의 유발을 촉진하게 한다. 이 명세서에 제공된 데이터는 항원-특이 CTL을 유도하는 가장 효과적인 방법은 임파조직 내의 APC 또는 임파조직에 이행할 수 있는 APC에 유전물질을 직접 전달하는 것이라는 새로운 가정을 뒷받침한다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드로 시험관내에서 항원충진된 선천성 APC로, 면역화 된다. 상세하게는, 포유동물 숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 시험관내에서 유입하여 APC가 숙주 내에 주입되게 하는 방식에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드 감염된 APC로 면역화 된다. APC 내 진입에 이어, 유전자경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 처리되고 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되어 APC의 막표면 상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 임파조직 내에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 특정 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드와 공배양시킴으로써 시험관내에서 항원 충진된 선천성 APC로, 면역화 된다. 특히, 선천성 APC는, 미립자물 폴리누클레오티드가 파고솜-시토졸 통로를 통해 APC에 진입하도록, 시험관내 공배양에 의해 미립자물 폴리누클레오티드로 형질감염된다. 포유동물 숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 파고솜-시토졸 통로를 통해 특이적으로 APC에 진입한 후 APC가 숙주 내에 주입되게 하는 방식에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드 감염된 APC로 면역화 된다. APC에 의한 흡수에 이어, 유전자경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 처리, 제공되어 APC의 막표면 상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 임파조직 내에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드와 공배양시킴으로써 시험관내에서 항원 충진된 선천성 APC로, 면역화 된다. 상세하게는 선천성 APC는 미립자물 폴리누클레오티드로, APC의 미소발사대 포격에 의해 시험관 내에서 형질감염된다. APC내로 발사 포격된 후, 유전자경유 폴리누클레오티드는 항원 펩티드부분이 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 처리, 제공되어 APC의 막표면 상에 표시될 정도의 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원의 내인 APC 세포막 제공으로 주사지점에 있어 또는 임파조직 내에 있어 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다.

본 발명의 다른 구체예에서는, 포유동물 숙주는, 피하주사, 표피주사, 피부주사, 임파주사 및 정맥내 주사를 포함하는 (그러나 그것에 한정되지는 않음) 주사에 의해, 미립자물 폴리누클레오티드로 시험관내에서 형질감염된 선천성 APC로, 면역화 된다. 상세하게는 포유동물숙주는, 미립자물 폴리누클레오티드가 시험관내에서 APC에 진입하고 APC가 숙주 내에 주입되게 하는 방식으로, 미립자물 폴리누클레오티드 형질감염된 APC로, 면역화 된다. 미립자물 폴리누클레오티드는, 미소발사대 포격에 의해 또는 파고솜-시토졸 통로에 의해 시험관 내에서 APC에 침입한다. APC는 항원을 코드화하는 폴리누클레오티드 및/또는 APC의 항원제공기능의 효율을 증진시키는 분자(들)를 코드화하는 폴리누클레오티드로 시험관내 형질감염된다. 그런 분자는 IL-12, IL-2 및/또는 IL-4와 같은 시토킨 분자 및/또는 CD80 및/또는 CD86와 같은 공자극체 분자를 포함하나 그것에 한정되지 않는다. 세포경유 항원을 코드화 하는 폴리누클레오티드는, APC에 유입된 후, 항원펩티드부분이 처리되고, 내인 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 제공되고, APC의 막표면에 표시되게 할, 생물학적 유효수준으로 발현된다. 그런 APC의 주사 후, 항원이 내인 APC세포막에 제공되어, 주사부위 또는 임파조직에서 항원특이 CTL의 유도가 촉진된다. 유도된 항원특이 CTL은 다시 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주의 몸 전체를 통해 순환되어 신생세포 또는 바이러스 감염된 세포를 파괴한다. APC에 유입한 뒤, 세포경유 시토킨 및/또는 공자극제 코드화 폴리누클레오티드는, APC의 항원제공기능에 의해 주입지점 또는 임파조직에서 항원 특이 면역응답이 유도되도록, 생물학적으로 유효한 수준에서 발현된다.

TRA 또는 소망하는 바이러스 항원을 본 명세서에 기재되어있는 시스템 내에 통합시키는 것은 이 분야의 통상의 지식인에게는 공지일 것이다. 현재 이용가능한 TRA의 예는, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, 티로시나제, Melan-A(MART-1), gp100(pmell17), gp75(TRP1), CEA(암 배자 항원) 및 (HPV, HBV 및 EBV로부터의 바이러스 유도 종양 항원), 및 P53, P16, RAS, HER2/neu, C-ABL, 및 다형 내피 점소 항원과 같은, 종양관련의 종양형성/종양억제 유전자 돌연변이 코드화 항원을 포함하나 그것에 한정되지는 않는다(Maeurer등, 1996, Clinical Immunology Principles and Practice 중의Cancer Vaccines,R.Rich 편집, Mosby Publishing, 123장 및 Van den Eynde등, 1995, J.Exp.Med. 182:689-698에서 검토되어있음). 바이러스 항원의 예는 인플루엔저 핵단백질(Donnelly등, 1995, Nature Med. 1:583-587), HIV gp 120, HIV gp 160, 및 B형 간염 표면항원(Pardoll Beckerleg, Immunity, 1995,3:165-169에 검토되어있음)을 포함하나 그것에 한정되지는 않는다.

유전자경유 DNA서열의 발현을 조절향상시키는 것으로 알려진 성숙핵촉진제 및/또는 증진제 서열이, 재조합 벡터를 구성하고 소망입자와 결합시켜 본 발명의 미립자물 폴리누클레오티드를 발생시키는데 이용될 수 있다는 것은 통상의 지식인에게 알려져있다. 그런 촉진제 부분은 세포거대바이러스(CMV) 촉진제, 라우스 사르코마 바이러스(RSV) 촉진제, 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 촉진제, β선 촉진제, 및 표적 세포에 활성인 것으로 알려져있는 임의의 세포-특이 촉진제 또는 증진제 서열을 포함하지만 그것에 한정되지는 않는다.

이 목적을 위해, 본 발명의 바람직한 구체형은, 종양 또는 바이러스 항원을 코드화 하는 DNA를 특정적으로 임파조직 내의 APC 또는 임파조직에 이동될 수 있는 APC에 운반하여 항원의 MHC Ⅰ급 접근을 촉진하고 그리하여 APC가 항원-특이 CTL의 유도를 자극하게 하는데 입자형 DNA를 이용하는 것이다. 그러면 이들 CTL은 숙주를 통하여 순환하고 신생세포 또는 바이러스 감염 세포를 파괴한다.

임파결절 APC 내에 있어 특정응답을 촉진하기 위해 피하주사를 이용하는 바람직한 방법에 기초를 두고있는 종양면역성에 관한 내용이 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에 예시되어있다.

다음 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것으로 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1: OVA/B16 유전적 쥐 종양 모델

본 발명의 청구범위를 예시하는 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에 기재된 데이터를 얻기 위해 OVA/B16 쥐 모델을 사용했다. 이 OVA/B 쥐 시스템은 여러 이유로 매력이 있다: (1)B16멜라노마는 충분히 연구된 쥐 종양이다, (2) 이 종양라인의 생체내 성장특성 및 전이는 잘 특성표시되어있다, (3)오발부민은 잘 정의된 구조를 갖고있는 점이 그것이다. C57BI/6쥐에 있어 OVA의 세포내 처리 및 제공은 알려져 있다. 특히 MHC Ⅰ급 K^b와 함께 제시된, 처리된 펩티드의 구조는 알려져 있다. T-T 하이브리도마 33.70.Al 항-OVA-K^b을 사용하여 H2-K^b와 더불어 오발부민 펩티드[SIINFEKL]를 기능발현하는 것에 대한 시험분석도 또한 알려져 있다(Kovacovics-Bankovski등, 1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 4942-4946). 이 시스템에서 OVA특이 CTL의 생체 내 유도를 평가하는 기법도 또한 기재되어있다(Moore등, 1988,Cell54: 777-785).

생쥐 및 세포라인.암 C57BL/6생쥐, 나이 5-8주를 Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME에서 구입했다. EL4는 C57BL/6 T 임파종이고, EG7은 달걀 오발부민 (OVA)-형질감염된 EL-14(Moore등, 1988,Cell54: 777-785)의 서브클론이다. C57BL/6 유도 쥐 멜라노마 B16(Fidler등, 1976,Cancer Res. 36: 3160-3165)은 미국식 균배양 수집(ATCC)으로부터 구했다. MO4를, 문헌에 기재되어있는 바와 같이(Falo등,1995,Nature Med.1:649-653, Moore등,1988, Cell 54:777-785) pAc-Nco-OVA플라스미드로 B16의 형질감염에 의해 구성했다. 모노클론 항체는, 하이브리도마GK1.5(항-CD4,ATCC TIB207), 2.43(항-CD8 항체는 GKf1.5 세포(3×10⁶) 및 IFA(0.5ml/생쥐)의 i.p주사에 의해 Balb/c nu/nu생쥐 내에서 성장시켰다)로부터 제조했다.

B16멜라노마의 OVA형질감염, 선별, 형질감염된 B16멜라노마 서브클론 후, MO4를 분리했다. 양친 멜라노마 B16 및 OVA 형질감염제는 OVA펩티드(SINFECL)가 RF33.70에 제공되는 것에 의해 측정된 바에 따르면 세포표면에 비슷한 수준의 기능성 K^b를 발현한다(도 1). 거기에 반해 B16은 아니고 MO4/5는 외인적으로 첨가된 펩티드 없이 하이브리도마 자극을 할 수 있다(도 1). 이것은 형질감염된 항원이 내인적으로 생산, 처리 및 제공되는 것을 실증한다. 중요한 것으로는, MO4에 의한 OVA의 내인 발현이 종양의 생체내 면역원성을 그다지 변화시키지 않았다는 것이다(도 2A). B16 및 MO4의 종양 성장(도 2A)은 순수 생쥐에서는 비슷하고 숙주 생존도 그랬다(도 2B).

실시예 2. 바이오리스트(바이오발리스트)투여를 통한 유전 면역

타 단백질 발현의 국한- 조직시편(피부 및 배액 임파결절)을 면역화 24 또는 48시간 되어 수확하고 PBS중에서 세척하고 PBS중 2% 포름알데히드-0.2% 글루타르알데히드내에서 4℃에서 30분간 고정했다. 고정된 시편을 PBS로 철저히 세척하고 그런 뒤 37℃에서 18시간동안 X-gal염색용액(PBS중 1mg/ml X-gal, 5mM 페리시안화 칼륨, 5mM 페리시안염, 2mM MgCl₂)중에서 배양했다. 염색된 조직을 파라핀 섹숀(박편화)하고 0.1% 뉴클리어 파스트 레드로 반대염색했다.

유전 면역- 50mg의 0.95μm 금 비드와 100μl의 0.1M 스페르미딘을 조합하고 5초 동안 초음파처리하여 DNA피복된 금 입자를 제조했다. 132μg의 플라스미드 DNA와 200μl의 CaCL₂를 와류형성시키면서 순차로 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 5-10분간 방치 침전시켰다. 그런 뒤 비드 조제물을 원심분리하고(30초간 10,000rpm) 냉 에탄올 중에서 3회 세척한 후 7 ml의 에탄올 중에 재현탁시켜 최종농도 7mg금/ml를 얻었다. 그런 뒤 용액을 Tefzel^ⓡ튜브(Agracetus)내에 충진하고 5분간 방치시켰다. 에탄올을 제거하고 20rpm으로 30초간 회전시켜 비드를 튜브의 측면에 부착되게 하고 N₂건조시켰다. 그런 뒤 비드가 부착된 건조 튜브를 0.5인치 부분씩 절단하고 파라핀 밀봉된 바이알내에 건조제와 함께 사용을 위해 저장했다. Accell Gene 공급장치를 사용하여 방출압력 300 psi에서 2발(각 발은 0.5mg 금 비드 = 0.5인치 튜브로 구성됨)을 면도된 복강부위에 발사하여 동물을 왁찐접종했다. CMV 촉진제를 조절하면서 pAc-Neo-OVA 플라스미드(Moore등, 1988,Cell54:777-785) 또는 lacZ유전자를 함유하는 pIEglacZ플라스미드(Nadia Jouroud제품)로 면역시켰다. 미립자물 폴리누클레오티드의 피하주사와 관련된 실험에 대해서는(도 5), DNA 피복된 비드를 상기와 같이 제조하고 해당량의 DNA를 주사했다. 일부 동물의 경우(도 5), 과잉량의 유리 플라스미드 DNA를 피하주사했다. 피하주사는 100㎕용량의 PBS로 옆구리 중앙 양쪽에 투여했다. APC의 시험관 형질감염의 경우(도 4), 해당중량의 Biomag 산화철 비드 또는 금 비드를 미립자물 기질로 사용하여 DNA비드를 동일하게 제조했다.

미립자물 폴리누클레오티드의 피하주사와 관련된 실험에 대해서는(도 5 및 도 6), DNA 피복된 비드를 상기와 같이 제조하고 해당량의 DNA 또는 도면 설명에 규정되어있는 양을 주사했다. 일부 동물의 경우(도 5 및 도 6), 과잉량의 유리 플라스미드 DNA를 피하주사했다. 피하주사는 100㎕용량의 PBS로 뒷다리 양쪽에 투여했다.

APC의 시험관 형질감염의 경우(도 4 및 도 6), 해당중량의 Biomag 산화철 비드(Fe 비드) 또는 금 비드를 미립자물 기질로 사용하여 DNA비드를 동일하게 제조했다. IL-4를 조직배지로 사용하지 않은 것을 제외하고는 도면의 간단한 설명에서와 같이 골수로부터 37℃에서 18시간동안 25㎕의 7mg/㎖ 미립자물 폴리누클레오티드용액(미립자물 중량/ 용적 PBS)으로 수지상 APC를 제조했다. 항원-펄스량 적용된 수지상 세포를 제조하고 도면의 간단한 설명에 기재된 것처럼 주사했다. 간단히 설명하면 임파구에서 골수세포를 결핍시키고 10⁶세포/웰의 율로 24개의 웰판에서 10% FCS, L-글루타민, 항생제 및 2-ME로 보충된 RPMI 1640중에서 1야 배양함으로써 수지상 세포를 제조했다. 제 1일 2.5×10⁵세포/웰에서 GM-CSF(10³U/㎖, Sigma,St.Louis,MO) 및 쥐 rIL-4(103U/㎖, Genzyme,Cambridge, MA)로 세포에 보충하고, 느슨하게 부착된 세포를 제 8일에 수확했다. 유동 세포측정 분석에 의해, 상기 수지 세포들이 CD45, CD44, CD11b(Mac-1), CD18, CD80, cD86 및 Ⅰ급 및 Ⅱ급 MHC항원을 발현하는 것을 알았다. 수지상 세포에 37℃에서 2시간 동안, 감소된 혈청 매질(Optimen, Gibco, Grand Island,NY)중에서 OVA펩티드(20ng/㎖) + β2-미크로글로빈(β2-M,10㎕/㎖,인간,Sigma)으로 펄스량 적용하거나 또는 적용하지 않았다. 그런 뒤 세포를 충분히 세척하고 PBS중에 재현탁하고 순수 쥐에 주사하기 전 조사(2000 rad)했다.

세포독성 분석-상기한 규약을 약간 변형하여 면역된 동물로부터의 비장세포를 재자극했다. (Falo등, 1995,Nature Med.1: 649-653). 요약하면, 면역화 1주일 후 조사된(20,000 rad) EG 세포(10×10⁶)로 배양함으로써 비장세포(30×10⁶)를 재자극했다. 주효체 세포를 5일 후 수확하고 표시된 주효체 목표세포비에서 환저 마이크로웰(200㎕)내에서 2×10⁴ ⁵¹Cr표지된 표적으로 배양했다. 몇 가지 경우에서는 문헌 기재와 같이 분석 전 mAB 더하기 보체를 사용하여 주효체 세포에서 T세포 부분집합을 고갈시켰다. (Rock등, 1993,J. Immunol. 150: 1244-1251). 37℃에서 4시간 유지한 후, 3벌로 된 미소배양물들로부터의 상징액 100㎕를 수집하고 계수하여 문헌기재(Falo등,1995,Nature Med.1: 649-653)와 같이 특정방출의 퍼센트를 계산했다. 결과는 3벌 배양의 평균치로 보고했다. 3벌 배양물의 SEM은 항상 평균의 15% 미만이었다.

단백질 분석-C57BL/6 생쥐를 상기와 같이 표시한 항원 유전자 구성물로 면역시켰다. 동물을 종양으로 공격받게 하고 상기와 같이 종양에 대해 평가했다. 요약하면, 최종면역(제 0일) 7일 후, OVA-면역된 또는 lacZ-면역된 동물로 하여금 그 양쪽 옆구리 중앙에, 피시험 동물의 50% 치사량(LD50)의 2배 또는 도면의 간단한 설명에서 표시한 종양세포의 2배의 멜라노마 세포(2×104)로, 피내주사에 의해 공격받게 했다. 생존율은 생존동물의 퍼센트로 기록했다. 주사를 위한 멜라노마 세포는 PBS중에서 3회 세척했다. 주사된 세포들은 트리판 블루 배제 시 95% 이상이 생존가능했다. 모든 실험은 군당 생쥐 5마리를 포함했고 적어도 3회 반복되었다. 치사확실한 생쥐는 피츠버그 의과대학 의료원의 동물관리지침에 따라 희생시켰다. 몇 가지 실험에서는 동물에서 CD8⁺세포를 고갈시켰다. 이것은 문헌기재와 같이 면역후 7 및 9일에 CD8 mAb(2.43)의 i.p.주사에 의해 행했고, 이어서 제 10일에 종양공격을 받게 했다(Falo등, 1995,Nature Med.1: 649-645).

항원특이 CTL을 유도할 바이오리스트(바이오발라스트)의 능력을 평가했다. 2회 중복하여 펄스식 적용으로 총합 적어도 2.64㎍의 OVA 코드화하는 DNA를 복강에 공급하여 순수 C57B1/6 생쥐를 면역시키고 7일 후 동일하게 증강 투여했다. 이들 생쥐로부터의 시험관내 재자극된 비장세포는 선천성 OVA-발현 쥐 흉선종 EG7을 용해했으나 비 형질감염된 양친 종양 EL4는 용해하지 못했다(도 3). 그래서 표적세포용해는, 종양표적에 의한 OVA의 발현에 따라 항원특이적인 것이었다. mAB을 사용하여 주효집단으로부터 T세포 부분집합을 삭제해본 결과, 용해도는 MHC Ⅰ급-한정된 CTL 주효세포가 특징적인 Thy⁺, CD8⁺부분집합에 의존하는 것이 증명되었다(도 3B).

상기와 같이 면역되고 증강된 생쥐군을, 보호 종양 면역성을 유발할 바이오리스트(바이오발리스트) 면역 능력을 결정하기 위해, 7일 후 먼 지점에서 MO4의 i.d.주사에 의한 공격을 받게 했다. OVA-면역된 생쥐는 치사적 종양공격에 대항하여 보호되었으나, 대조군의 쥐(비슷하게 면역되었으나 lacZ 보고형 유전자로 면역됨)의 종양은 진행적으로 성장하여 제 40일에는 동물의 60%가 치사했다(도 3C). OVA-면역된 생쥐는 그러나 비형질감염된 양친 멜라노마 B16의 공격에는 보호되지 못했는데(도 3D), 이것은 보호면역성이 종양표적에 의한 OVA발현에 따라 항원 종류에 따라 특이적인 것임을 표시하는 것이다. 본 발명자들은, 종양공격 전에 항-CD8mAB의 반복된 i.p.주사를 통하여 면역된 또는 대조의(lacZ 면역된)동물로부터 CD8⁺주효세포를 제거함으로써 CD8⁺주효세포의 보호적 종양면역성에 대한 기여를 시험평가해보았다. (Falo등, 1995,Nature Med.1: 649-645). OVA-면역된 동물은 MO4공격으로부터 보호될 수 있었지만, 면역되었으나 CD8⁺T세포가 제거된 동물의 생존율은, T세포가 고갈된 또는 고갈되지 않은, 대조의 동물에서 관찰된 율과 유사했다(도 3E-F). 따라서 CD8⁺T세포는 이 모델에 있어 유전 면역법에 의해 유도되는 보호적 종양면역성에 긴요하다.

위에서 제의한 종양면역성의 기전을 뒷받침하는 추가의 증거에는, lacZ 구성물의 바이오리스트(바이오발리스트)공급 후 표피에 있어, 흥미롭게도 배액 임파결절 내 특정발현의 이산영역들에 있어 β-갈락토시다제 발현이 실증된 것이 포함된다. 이들 결절은 면역화 부위로부터 원격하기 때문에, 임파결절 발현이 직접적 물리포격의 결과일 것 같지는 않다. 제 48시간에 있어 DNA 공급 및 표피 각질세포 내 lacZ발현 24시간 후, 면역된 피부(비염색)의 표피 및 진피에는 금 입자가 우세했다. 또한 배액 임파결절내에는 특정염색의 이산영역들이 있었다. 무관한 DNA로 면역된 생쥐들로부터의 동일하게 처리된 시편은 lacZ발현을 보이지 않았다. 이런 관찰로 추가분석을 시도하게 되었고 그 분석은 실시예 3에 기재되어있다.

실시예 3. 피하투여에 의한 유전면역

미립자물 폴리누클레오티드의 피하투여에 의해 종양면역성을 유도하기 위한 재료 및 방법은 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 것과 같다.

이들 데이터는, 미립자물 폴리누클레오티드를 생체내 피하주사함에 의해, 임파조직내의 식세포 APC 또는 임파조직에 이동할 수 있는 APC에 특이적으로 표적진행할수 있는 것을 증명한다.

종양공격으로부터 보호되는 정도는, 피하주사이거나 또는 바이오리스트(바이오발리스트) 투여이거나, pAc-Neo-OVA로 된 미립자물 폴리누클레오티드로 면역된 경우 면역된 생쥐군들 내에 있어 같았다(도 5). 실시예 2에서의 발견에 일치하여, 무관한 항원(예컨대 pIEglacZ)을 코드화하는 미립자물 폴리누클레오티드로 면역화해서는 보호가 얻어지지 않았다(도 5). 미립자물 없는 pAc-Neo-OVA의 피하 주사로는 유관 종양 공격으로부터 보호가 얻어지지 않았다(도 5). 이들 데이터는 미립자물 폴리누클레오티드의 피하주사는 적어도 바이오리스트(바이오발리스트)만큼은 효과적임을 나타내고 있다. 또한, 피하주사로는 폴리누클레오티드 입자가 개별 숙주세포의 세포질 내에 바로 물리적 탄도포격을 하게 되는 것은 아니기 때문에, 그 발현에는 식작용/내세포분해를 행할 수 있는 숙주세포에 의해 폴리누클레오티드를 활성적으로 흡수할 필요가 있는 것 같다. 미립자물 없는 pAc-Neo-OVA의 피하 주사가 보호를 제공하지 않는다는 관찰도 또한 인공적 형질변환의 기전이 미립자물 공급/식작용임을 암시하는 것이다. 식작용에 의한 미립자물 형질전환은, 유전자경유 발현이, APC를 포함하는, 식작용 가능한 세포에 우선적으로 집중된다는 것을 암시한다.

이 제의된 기전을 뒷받침하는 또 다른 것은, 오발부민을 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드(실시예 2에서 기재한바와 같이 제조된)(pAc-Neo-OVA)와 함께 시험관 내에서 배양된 APC(골수 유도 수지상 세포)가 OVA(SIINFECL+K^b)특이 T 세포 하이브리도마 RF33.70이 IL-2를 생성하도록 자극할 수 있다는 관찰이다(도 4). 이들 데이터는 이들 APC가 기능적으로 오발부민 유전자를 발현하고 오발부민 펩티드-K^b착체를 생성한다는 것을 나타낸다. 이 자극 능력은 2mg/ml의 가용성 OVA단백질로 펄스첨가된 APC에 의한 경우에 비교될만하다. 미립자물 폴리누클레오티드는 미립자물 기질로서 금 또는 철을 사용할 때 이 분석에 있어 효과적이다. 그래서 시험관내에서 식세포 APC과 함께 미립자물 폴리누클레오티드를 배양하면 형질감염된 항원의 내인 생성, 처리 및 제공이 야기된다. 이들 관찰은, 미립자물 폴리누클레오티드가 APC에 의해 흡수, 발현되는 것과, 대응하는 단백질이 항원특이 면역 응답을 유도하도록 기능적으로 제공될 수 있다는 것을 증명하는 것이다.

그 위에, 도 6에 도시된 것처럼, 항원 제공 세포, 이 경우에는, 상기와 같이 시험관내에서 항원 OVA를 코드화 하는 미립자물 폴리누클레오티드로 배양된, 피하주사된 골수유도 수지상 세포는, 항원유전자를 발현하는 종양세포에 보호 면역성을 유발할 수 있다. 주어진 예에서는, 10⁵개의 조사된 형질감염된 수지상 세포/동물(한 뒷다리 당 5×10⁴, 양쪽)의 1회 공급으로 종양 공격에 대해 완벽한 보호가 유발되었다. 그래서 시험관 내에서 펩티드-충진될 때 항원-특이 CTL 및 보호 종양 면역성의 잠재적 자극제가 되는, 생체내 공급된 수지상 세포는, 미립자물 폴리누클레오티드와의 공배양에 의해 항원-충진될 때와, 적어도 유사할 정도로는 면역원적이다.

종합해 볼 때, 이들 결과는, 미립자물 폴리누클레오티드의 피하공급은 항원을 식세포 APC에 배향공급하고, 유전 면역성의 효율을 잠재적으로 증가시키는 이점을 갖고, 그러면서도 정상의, 비-APC 숙주 세포의 형질감염에 기인하는 공차 유도 또는 변이발생을 포함하는(그것에 한정되지는 않음) 소망스럽지 않은 유해영향을 감소시킬 수 있음을 보여준다.

Claims

(a) 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 발현하는 DNA부분을 발생시키고;

(b) 상기 DNA 부분을 입자 표면상에 분포시켜, 미립자물 폴리누클레오티드를 생성시키고;

(c) 포유동물 숙주를 상기 미립자물 폴리누클레오티드로 접종하고;

(d) 상기 발현된 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분이 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 상기 표적세포의 막표면에 제공되도록, 상기 미립자물 폴리누클레오티드를 상기 포유동물 숙주내 표적세포의 세포질에 공급하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 숙주의 생체내 치료적 또는 예방적 유전면역 방법.
제 1항에 있어서, 상기 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 DNA 부분이 종양 거부 항원, 바이러스 항원 또는 그의 항원단백질 부분을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 표적세포가 항원 제공 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 항원 제공 세포가 상기 인간 숙주의 임파조직 내에 거주하거나 또는 그 조직에 이행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 MAGE-1 와 MAGE 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 Melan-A인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 gp100인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 p53인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 CEA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 HER2/neu인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV gp120, HIV gp160인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 인플루엔저 바이러스 핵단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 B형 간염 표면 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 발현하는 DNA부분을 발생시키고;

(b) 상기 DNA 부분을 입자 표면상에 분포시켜, 미립자물 폴리누클레오티드를 생성시키고;

(c) 포유동물 숙주를 바이오리스트 장치를 사용하여 상기 미립자물 폴리누클레오티드로 접종하고;

(d) 상기 발현된 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분이 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 상기 표적세포의 막표면에 제공되도록, 상기 미립자물 폴리누클레오티드를 상기 포유동물 숙주내 표적세포의 세포질에 공급하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 숙주의 생체내 치료적 또는 예방적 유전면역 방법.
제 15항에 있어서, 상기 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 DNA 부분이 종양 거부 항원, 바이러스 항원 또는 그의 항원단백질 부분을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 표적세포가 항원 제공 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 항원 제공 세포가 상기 인간 숙주의 임파조직 내에 거주하거나 또는 그 조직에 이행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 MAGE-1 와 MAGE 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 Melan-A인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 gp100인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 p53인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 CEA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 HER2/neu인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV gp120, HIV gp160인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 인플루엔저 바이러스 핵단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 B형 간염 표면 항원인 것을 특징으로 하는 방법
(a) 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 발현하는 DNA부분을 발생시키고;

(b) 상기 DNA 부분을 입자 표면상에 분포시켜, 미립자물 폴리누클레오티드를 생성시키고;

(c) 포유동물 숙주를 직접 주사에 의해 상기 미립자물 폴리누클레오티드로 접종하고;

(d) 상기 발현된 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분이 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 상기 표적세포의 막표면에 제공되도록, 상기 미립자물 폴리누클레오티드를 상기 포유동물 숙주내 표적세포의 세포질에 공급하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 숙주의 생체내 치료적 또는 예방적 유전면역 방법.
제 29항에 있어서, 상기 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 직접주사가 피하주사에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 31항에 있어서, 상기 재조합 DNA 벡터 부분이 종양 거부 항원, 바이러스 항원 또는 그의 항원단백질 부분을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 표적세포가 항원 제공 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, 상기 항원 제공 세포가 상기 인간 숙주의 임파조직 내에 거주하거나 또는 그 조직에 이행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 MAGE-1 와 MAGE 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 Melan-A인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 gp100인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 p53인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 CEA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 HER2/neu인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV gp120, HIV gp160인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 인플루엔저 바이러스 핵단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 B형 간염 표면 항원인 것을 특징으로 하는 방법
(a) 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분을 발현하는 DNA부분을 발생시키고;

(b) 상기 DNA 부분을 입자 표면상에 분포시켜, 미립자물 폴리누클레오티드를 생성시키고;

(c) 상기 발현된 항원 단백질 또는 항원 단백질 부분이 MHC Ⅰ급 통로를 통하여 상기 표적세포의 막표면에 제공되도록, 상기 미립자물 폴리누클레오티드를 시험관중에서 상기 포유동물 숙주의 표적세포의 세포질에 공급하고;

(d) 포유동물 숙주를 직접 주사에 의해 상기 표적세포로 접종하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 숙주의 생체외 치료적 또는 예방적 유전면역 방법.
제 44항에 있어서, 상기 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어, 상기 직접주사가 피하주사에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 상기 재조합 DNA 벡터 부분이 종양 거부 항원, 바이러스 항원 또는 그의 항원단백질 부분을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 47항에 있어서, 상기 표적세포가 항원 제공 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 상기 항원 제공 세포가 상기 인간 숙주의 임파조직 내에 거주하거나 또는 그 조직에 이행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 MAGE-1 와 MAGE 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 Melan-A인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 gp100인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 p53인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 CEA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 종양 거부 항원이 HER2/neu인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV gp120, HIV gp160인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 인플루엔저 바이러스 핵단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 B형 간염 표면 항원인 것을 특징으로 하는 방법
(a) APC의 항원 제공 기능을 증진시키는 분자를 발현하는 DNA부분을 발생시키고;

(b) 상기 DNA 부분을 입자 표면상에 분포시켜, 미립자물 폴리누클레오티드를 생성시키고;

(c) 상기 발현된 항원 제공성 증진 단백질(들)이 생물학적 의미있는 형태 및 생물학적 의미있는 수준으로 발현되도록, 상기 미립자물 폴리누클레오티드를 시험관 내에서 상기 포유동물 숙주의 표적세포의 세포질에 공급하고;

(d) 포유동물 숙주를 직접주사에 의해 상기 표적세포로 접종하는 것으로 되어있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 숙주의 생체외 치료적 또는 예방적 유전면역 방법.
제 59항에 있어서, 상기 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 60항에 있어서, 직접주사가 피하주사에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 상기 표적세포가 항원 제공 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 62항에 있어서, 상기 항원 제공 세포가 상기 인간 숙주의 임파조직 내에 거주하거나 또는 그 조직에 이행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 63항에 있어서, 상기 DNA 벡터 부분이 공자극제 분자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 상기 공자극제 분자가 CD80과 D86으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 63항에 있어서, 상기 DNA 벡터 부분이 시토킨 분자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 66항에 있어서, 상기 시토킨 분자가 IL-12, IL-4 및 IL-2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.