JPH11512724A

JPH11512724A - 標的性の粒子性遺伝子を用いた免疫処置による細胞治療の免疫反応の促進

Info

Publication number: JPH11512724A
Application number: JP9513762A
Authority: JP
Inventors: ディ．ジュニアファロ，ルイス; エル．ロック，ケネス
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; University of Pittsburgh
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; University of Pittsburgh
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 1999-11-02
Also published as: SK40198A3; AU7251596A; EP0863704A4; TR199800573T2; NO981386L; PL325953A1; KR19990063672A; NZ319891A; AU716497B2; WO1997011605A1; HUP9802651A2; NO981386D0; BG102355A; CA2233278A1; CN1201369A; CZ92998A3; EP0863704A1; HUP9802651A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトを含む哺乳類宿主体内に抗原特異的な免疫性を供与する目的の、遺伝子的な免疫処置の様々な方法に関している。本発明は、抗原呈示性細胞など宿主の標的細胞の細胞質に、抗原性蛋白や抗原性蛋白のフラグメントを発現する粒子性ポリヌクレオチドを、調整する能力に基づくものである。抗原呈示性細胞の細胞質に、そのような粒子性ポリヌクレオチドを調整的に導出することは、抗原呈示性CTLsの生成を促し、すなわち、新生物細胞やウイルス感染細胞などの病原細胞の破壊を促進するのである。

Description

【発明の詳細な説明】標的性の粒子性遺伝子を用いた免疫処置による細胞治療の免疫反応の促進１．序ヒト宿主を含めた哺乳類宿主内における、抗原特異性の免疫を刺激することを目的とする遺伝子的免疫処置が、本開示の核心である。この明細書は、抗原呈示細胞など、宿主の標的細胞の細胞質への粒子性ポリヌクレオチドの配置(deliver y)を開示するものである。これらの粒子性ポリヌクレオチドは、標的細胞に接近して(access)抗原性タンパクあるいはそのフラグメントにコードを付すものである。抗原の遺伝子の発現は、抗原特異性の免疫反応を生じ、また、この反応として、細胞特異性の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTLs)の誘導が含まれるが、これに限定されるものではない。抗原の細胞質基質の接近によって、抗原ペプチドの細胞膜での呈示が、内因性のMHCクラスＩ経路でおこる。内因性のMHCクラスＩ経路での膜上呈示は抗原特異性CTLsの誘導を引きおこす。そして、誘導されたCTLsが、新生物細胞やウイルスに感染した細胞のような、抗原性を示す病原宿主細胞をターゲッティングして破壊するのである。２．発明の背景細胞傷害性Ｔリンパ球(CTLs)は、腫瘍やウイルス感染に対して有効なヒト免疫反応に於いては重大な要素である。細胞傷害性Ｔリンパ球は、標的の病原細胞の表面上にMHCクラスＩの分子によって呈示される抗原ペプチドを認識することで、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊する。これらの抗原ペプチドは、病原細胞の細胞質基質の中の異物蛋白の分解生成物であり、それらは、内因性のMHCクラスＩ経路を経て処理され、CTLsに呈示されるのである。 CTLsによる病原細胞の認識と破壊には、MHCクラスＩ分子の菌子体中の異物蛋白を認識することで十分であろうが、Ｔリンパ球前駆物質から抗原特異性のCTL を誘導するには、さらに別の信号を必要とする。特別化した抗原呈示細胞（APCs ）は、抗原-MHCクラスＩリガンドも、CTL性の免疫の誘導の際に必要となる補助信号も、出すことができる。APCsの一般特性には、MHCクラスＩとクラスIIの発現、APCリンパ球の相互作用にとって重要な様々な接着分子の発現、およびＣＤ8 0とＣＤ86のような補刺激分子の発現が含まれる。APCsの例には、マクロファージと樹枝状細胞（皮膚表面のランゲルハウス細胞と真皮の樹枝状細胞と、リンパ節と脾臓の中の樹枝状細胞を含む）が含まれる。破壊された腫瘍細胞、破壊されたウイルス感染細胞、または成分蛋白を用いた免疫処置によって、生体内条件で抗原特異性CTL反応を誘導する試みは、概してこれまでは成功しなかったが、それはおそらく、細胞外液中の蛋白には細胞質基質の中に入ってMHCクラスＩ呈示経路に接近することができないためである。遺伝子的な免疫処置には、いくつかの魅力ある特徴がある。レトロウイルスやアデノウイルスによる遺伝子移送や、裸のDNAの直接注入を含め、生体内条件で遺伝子を移送する方法のいくつかは、転移遺伝子(transgene)の発現を生む（参照：Krishnawほか著,1995, Nature Med. 1: 521-522、Pardollほか著、1995, Immuity 3：165-169）。 Wiiliams らは、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子のバイオリスティック（バイオバリスティック）（biolistic(biobalistic)）な導出に続いて、無傷の表皮細胞中に蛋白ルシフェラーゼの発現を示した(1991，Proc．Natl. Acad．Sci．USA 88: 2726-2730)。CTL反応はこれらの研究では扱われていないし、また、細胞性免疫反応を生じさせるのにターゲッティングされる特異性のある宿主細胞についても同様である。 Tang らは、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobal istic))な装置を使って、異物蛋白に対する体液性の反応をおこした(1992, Nat ure 356: 152-154)。hGHのコードをつくる遺伝子が、CMVプロモーターかβ-アクチンプロモーターのいずれかの調整下で、ネズミの表皮組織に対して配置された。この免疫処置過程に対応して、ネズミの体内に、抗ｈＧＨの抗体が検出された。Tang らは、細胞性免疫経路をターゲッティングする遺伝子的な免疫処置を開示していない。また、遺伝子的な免疫処置のためのAPC細胞の直接的なターゲッティングは、Tang らによって開示もしくは提案されていない。 Fynanらは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素の糖蛋白のコードをつくるプラスミドDNA構造物質を用いて、Tangらの調査結果を確認した(1993，Proc． Natl．Acad. Sci．USA 90: 11478-11482)。Fynanらは、表皮に対しての、DNAにコートされた金のビードの遺伝子放射（genegun delivery of DNA coated gold beads to the epidermis）によって生じる体液性の反応と他の機構を比較して、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な装置の使用は、1）致死レベルのインフルエンザの攻撃に対して95％の防御率を得られること、2）粘膜や筋肉内や静脈内への糖より実質的に有効であることがわかり、DNA免疫処置にとっても有効な方法であること、3）食塩の接種より、210〜2 500倍もDNAが少なくてすむことを発見した。遺伝子的な免疫処置のためのAPC細胞の直接的なターゲッティングは、Fynanらによって、開示あるいは提案されていない。また、CTL性免疫は扱われていない。 Liu および同僚は、筋肉内への無標的で非特異的な裸のDNA注入は、ウイルス性蛋白に対する抗原特異性CTL反応と、ウイルスの攻撃に対する防御的な免疫を誘導すると、主張してきた(Montgomery ほか著、1993，DN A Cell Biol．12: 777-783; Ulmer ほか著、1993，Science．259：1745-1749)。この研究は、遺伝子的な免疫処置のためのAPCsに対する遺伝部質のターゲッティングのことを開示していない。 Sun らはバイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalist ic))な装置を使って、抗腫瘍反応をネズミにおこした(1995，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 92: 2889-2893)。この著者らは、ネズミの腫瘍部位に直接IL-6を発現するプラスミド構造物質を導出した。IL-6の発現は、非特異的に腫瘍に向けられる、一種のサイトカイン遺伝子療法にもできる。腫瘍に対する抗原特異性免疫は要求されなかった。また、遺伝子的な免疫処置のためのAPC細胞の直接的なターゲッティングは、Sunらによって、開示あるいは提案されていない。 Kundig らは、生体内条件でリンパ器官への蛋白抗原の定位が、抗原特異性CTL sの誘導にとって重大だと主張している(1995，Science．268: 1343-1346)。遺伝子的な免疫療法は扱われていない。 Kovacsovics-Bankowski とRockは、食胞-細胞質基質の経路は、蛋白抗原に対して、通常はMＨＣクラスＩ内因性経路を経て呈示されないと主張している(1995 ，Scienc e．267: 243-246)。この著者らは、食胞内部に取り込まれた粒子状の蛋白は、実際には、MHCクラスＩの呈示のための細胞質基質経路の中に入ることができると推測している。機能的に無傷の遺伝子物質が食胞-細胞質基質の経路を経て、細胞質基質の中に入る可能性については扱われていない。 Faloらは、動物体内に直接入ったt蛋白抗原の導出が、抗原特異性CTLsによる腫瘍免疫を生むことを、ネズミで示すことによって、食胞-細胞質基質経路の確かさを示している(1995，Nature Med．1: 649-653)。生体内条件では、動物体内に直接注入された蛋白は、粒子状で投与された場合、特異的にAPCsの食胞-細胞質基質経路の中に入ることができると、彼らは主張している。遺伝子的な免疫処置過程に関しては、詳細には進んでいない。生体内条件において投与された遺伝子物質が、この経路でAPCsあるいは他の細胞タイプに機能的に無傷で入る可能性は、扱われていない。 Pardoll とBeckerleg が最近、裸のDNAワクチンの免疫学について再考している(1995，Immuity 3: 165-169)。彼らは、現在は知られていないDNA免疫処置の機構を決定するための、さらなる研究の重要性を強調している。とりわけ、彼らは、「それ（裸のDNA）が免疫反応を促進する際の機構を分析することが重要になるだろう。こうした研究によらなければ、これの最大の効能を質的にも量的にも極限まで引き出すことはできないのだ。」と結んでいる。前出の物質における記述の努力にもかかわらず、抗原特異性CTLsによる免疫をおこし、次に宿主内の特定の新生物やウイルス感染細胞の直接的な破壊を促進するために、宿主内の細胞のタイプを特異的にターゲッティングするような遺伝子の免疫処置のプロトコルを発展させる必要性がまだ残されているのである。本発明は、この必要性を扱い、かつこれに応えるものである。３．発明の概要本発明は、哺乳類宿主についての治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置に関するものであり、その中味は、哺乳類宿主体内の標的細胞に対する抗原蛋白のコードをつくるDNAのフラグメントの導出、宿主細胞内の組み換えDNAのフラグメントの発現、そしてこれにひき続き、細胞性免疫か体液性免疫のいずれか、もしくは療法をひきおこすための宿主細胞による抗原ペプチドの呈示である。本発明はさらに、哺乳類宿主内の特定の標的細胞に対して、抗原性蛋白もしくは生物学的に活性なフラグメントのコードをつくるDNA列の導出による、哺乳類宿主についての、治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置に関している。そのDNAのフラグメントから発現する抗原性蛋白は病原細胞にとって特異性を持つ結果、抗原特異性 CTLsの生成をひきおこし、それによって新生物細胞やウイルス感染細胞のような病原細胞の破壊を促進するのである。本発明はまた、粒子のポリヌクレオチドと哺乳類宿主の接種による遺伝子的な免疫処置と、それに引き続き、粒子をベースにするトランスジェニック（transg enic）なポリヌクレオチドを標的細胞の細胞質基質へ導出することにも関している。ひとたび標的細胞の内部に入ると、粒子性ポリヌクレオチドは蛋白もしくは生物学的に活性なフラグメントを発現することから、それによって、内因性のMH CクラスＩ経路を経て標的細胞の膜に適当な抗原性ペプチドフラグメントが生じて呈示される。MHCクラスＩ経路を通じて得られる抗原性ペプチドによる固有の呈示が、CTLsの生成をひきおこし、次に新生物細胞やウイルス感染細胞のような細胞の破壊を促進するのである。したがって、本発明は、抗原性蛋白あるいは抗原性蛋白フラグメントを発現するDNAフラグメントを生じさせること、そのDNAフラグメントを粒子状ポリヌクレオチドになる粒子表面に配置すること、哺乳類宿主に当該粒子性ポリヌクレオチドを接種すること、および、発現した抗原性蛋白あるいは抗原性蛋白フラグメントがMHCクラスＩ経路を経て当該標的細胞の膜表面に呈示されるよう、その哺乳類宿主の標的細胞の細胞質に対して粒子性ポリヌクレオチドを導出することから成る、哺乳類宿主についての治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置の方法にも関しているのである。本発明において、哺乳類宿主はヒトであることが望ましい。また、この明細書に開示される様々な実施例においては、その得られるDNAフラグメントは、1）腫瘍拒絶性蛋白のフラグメントおよび2）ウイルス性抗原もしくは抗原性蛋白のフラグメントを発現することが望ましい。本発明に使われうるヒトTRAsの例には、MAGE-1.，MAGE-3，Melan-A ,gp100，p53，CEA，HER2/neuが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明で使われうるウイルス性抗原の例には、HIV gp120、HIV gp160、インフルエンザウイルスの核蛋白、Ｂ型肝炎の表面抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。望ましい定位または移動のAPC標的細胞はヒト宿主のリンパ組織であるが、本発明において望ましい標的細胞はAPCである。本発明の実施例のひとつでは、哺乳類宿主はマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（microprojectile bombardment）の装置を使って、粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置される。特に、粒子性ポリヌクレオチドが、適正数以上の宿主細胞の細胞質に入ることができるようなバイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な過程で、哺乳類宿主は粒子性ポリヌクレオチドを接種される。抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路に対して呈示され、宿主細胞の膜表面に現れるよう、生物学的に有効なレベルにおいて、そのトランスジェニック（transgenic）なポリヌクレオチドは発現する。内因性の宿主細胞膜へひき出された抗原の呈示が、抗原特異生CTLs の誘導を促し、それがその哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内をめぐって、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の独特の実施例のひとつでは、哺乳例宿主（望ましくはヒト）は、非特異的な衝撃放射の直接的な結果としてのその放射経路で、粒子性ポリヌクレオチドがAPCsを含めて適正数以上の宿主細胞の細胞質の中に入るような、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（microprojectile bombardment）によって、粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置がなされる。皮膚に衝撃が与えられた場合、衝撃を与えられうる皮膚のAPCsとしては、表皮のランゲルハンス細胞やケラチン生成細胞や真皮の樹枝状細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。リンパ組織に衝撃が与えられた場合、衝撃を与えられうるリンパ組織のAPCsとしては、内在の樹枝状細胞やマクロファージや基質細胞やＴリンパ球やβリンパ球が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の別の実施例では、哺乳類宿主は、直接注入によって粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置され、この直接注入には皮下注入や表皮注入や真皮注入やリンパ注入や静脈内注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。粒子性ポリヌクレオチドは、宿主細胞に入り、内因性のMHCクラスＩ経路に対して抗原性ペプチドのフラグメントが呈示されて宿主細胞の膜表面に現われるのに生物学的に有効なレベルにおいて、発現される。内因性の標的細胞膜の表示が、抗原特異性CTLsの誘導を促進し、その次に哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内をめぐって、真生物細胞やウイルス感染細胞を破壊する。特に望ましい実施例の一つでは、粒子性のポリヌクレオチドが、皮下注入によってヒト宿主に導出され、食胞-細胞質基質経路でAPCsをターゲッティングし、また、APCsによって生物学的に有効なレベルで発現する。本発明は、皮下接種胞での粒子性ポリヌクレオチド複合物の直接注入によって、APCsに対する標的の定まった導出と抗原のリンパ組織内での発現を得ることを開示するものである。本発明の別の特に望ましい実施例では、APCへの直接的なターゲッティングのための皮下注入は、腫瘍拒絶性の抗原(TRA)や生物学的に活性なフラグメントのコードをなす粒子性ポリヌクレオチドの導出を伴う。非APC細胞内での実質的な粒子の転座(translocation)を防ぐとともに、この方法におけるTRAの粒子性ポリヌクレオチドを正確に導出すれば、クラスＩ経路に入る腫瘍特異性の抗原性ペプチドの量は最大になるであろう。この発明のさらに別の特に望ましい実施例では、APCの直接的なターゲッティングのための皮下注入は、ウイルス性抗原あるいは生物学的に活性なフラグメントのコードをそこからつくる。非APC細胞内での実質的な粒子の転座を防ぐとともに、この方法における抗ウイルス性の粒子性ポリヌクレオチドを正確に導出すれば、クラスＩ経路に入るウイルス特異性の抗原性ペプチドの量は最大になるであろう。この発明では、次の様々な物質を構成子にもつ粒子は、APCsにターゲッティングするのに使われる食砲-細胞質基質経路に接近することができ、その物質としては、金や鉄や合成樹脂が含まれるが、これらに限定されるものではないことは、当技術者には知り得ることであろう。本発明の別の実施例では、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドとの共培養によって抗原を与えられてきた同系のAPCsを用いて、哺乳類宿主は注入によって免疫処置される。ただし、その注入には、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、粒子性ポリヌクレオチドは生体内条件で、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（microprojectile bombardment）あるいは、食砲-細胞質基質経路によって、APCの中に入る。特に、その粒子性ポリヌクレオチドが生体内条件で特異的にAPCsの中に入って、そのAPCsが宿主に注入されるように、哺乳類宿主は粒子性ポリヌクレオチドをトランスフェクトしたAPCsで免疫処置される。APCsによる取り込みの結果、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路を経て送られて呈示され、 APCsの膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて、トランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは発現される。このようなAPCsの注入後、内因性のAPC細胞膜の抗原の呈示によって、注入の部位またはリンパ組織の中のいずれかにおいて、抗原特異性CTLsの誘導は促進される。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、その哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の実施例において、哺乳類宿主は粒子性ポリヌクレオチドで生体内条件でトランスファクトされた同系のAPCsを用い、注入によって免疫処置される。また、その注入には、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。APCs内への進入の結果、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路を経て送られて呈示され、APCsの膜表面に現れるよう、生物学的に有効なレベルにおいて、トランスジェニック(transgenic)な抗原のコードをつくるポリヌクレオチドは発現される。そのようなAPCsの注入後、内因性のAPC細胞の膜の抗原呈示によって、注入部位かリンパ組織の中のいずれかにおいて、抗原特異性CTLsの誘導は促進される。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。APCs内への進入の結果、注入部位かリンパ組織の中のいずれかにおいて、APCsの抗原呈示機能が抗原特異性の免疫反応を誘導するよう、生物学的に有効なレベルにおいて、トランスジェニック(transgenic)なサイトカインまたは（および）補刺激分子のコードをつくるポリヌクレオチドが発現される。ポリヌクレオチドは次の様々な物質から成る粒子上に沈降でき、また、その様々な物質には、金、鉄、合成樹脂が含まれるが、これらに限定されるものではないことも、当技術者には知られるであろう。粒子状で適用される転移遺伝子(transgene)列を生むために、様々な組み換えベクターが使われうる。最も扱いやすく、望ましいベクターはDNAプラスミドベクターであることも、当技術者には知られるであろう。 APCsは様々な宿主細胞から得られ、この様々な宿主細胞には骨髄や抹消血液が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、APCsは、生体内条件での操作によって当該宿主体内に再入できることも、当技術者には知られるであろう。本発明の目的は、新生物細胞に対する、治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置を提供することである。本発明の別の目的は、ウイルス感染に対する、治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置を提供することである。本発明の目的は、CTL反応の生成中に宿主細胞に対して腫瘍拒絶性の抗原遺伝子のコードをつくる粒子性のポリヌクレオチドをターゲッティングすることで、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の遺伝子的な免疫処置に供与することである。本発明の目的は、宿主のリンパ組織の内部または出入可能な配置の宿主抗原呈示細胞に対して、腫瘍拒絶性の抗原のコードをつくる粒子性ポリヌクレオチドをターゲッティングしてCTL反応を生じさせることで、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の遺伝子的な免疫処置に供与することである。本発明の目的は、CTL反応の生成中に宿主細胞に対してウイルス性の遺伝子のコードをつくる粒子性のポリヌクレオチドをターゲッティングすることで、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の遺伝子的な免疫処置に供与することである。本発明の目的は、宿主のリンパ組織の内部または出入可能な配置の宿主抗原呈示細胞に対して、ウイルス性の遺伝子のコードをつくる粒子性ポリヌクレオチドをターゲッティングしてCTL反応を生じさせることで、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の遺伝子的な免疫処置に供与することである。４．図の簡単な説明図１は、トランスフェクトした腫瘍細胞株MO4とEG7による、卵白アルブミンの機能的な呈示を示している。Ｔ細胞ハイブリドーマRF33.70(抗OVA+K^b)を、記載されているように、一定数のトランスフェクトした腫瘍細胞(正方形の印)、トランスフェクトしていない腫瘍細胞（円形の印）と、外因性OVAペプチドSINFEKL（ 10ng/ml）の添加の存在条件下（白ぬきの印）と非存在条件下（黒ぬりの印）とで、ミクロ培養した(Rockほか著、1990，J．Immunol．145: 804-811)。18時間培養した後、上層部を回収し、指示細胞株HT2を用いてIL-2があるか分析を行った( Rockほか著、1990，J．Immunol．145: 804-811)。(A)は、B16と、OVAトランスフェクトしたサブクローンMO4である。(B)は、EL4と、OVAトランスフェクトしたEL 4サブクローンEG7である。この分析培養では、OVAトランスフェクトをした腫瘍によるOVAの呈示は、外因性SINFEKLの存在下では有意な上昇がなかった。図２はB16由来のメラノーマMO4によるOVA発現は、生体内条件で、腫瘍を投与された後の腫瘍の成長や宿主の生存に、有意に影響しないことを示したものである。ネズミにMO4（円）かB16（正方形）を投与した（5×10⁴ /マウス、i.d.、両側腹部中央部)。腫瘍面積（図2A）は、3×／週と査定され、これは各被験群で最初の死亡がおこるまでの平均の腫瘍面積平方ミリメートルであるとして報告されている。生存（図2B）は、生存している個体の百分率で記録されている。全ての実験は、1群に５匹ずつのネズミで、最低３回以上繰り返して行われた。瀕死状態になったネズミは殺処分した。図３は、OVAのコードをなすDNAを皮膚に対して導出することによって免疫処置を施すと、OVA特異性のCTLsと、OVA発現のメラノーマMO4の致死レベルの投与に対しての抗原特異性CTLsの防御効果が導かれることを示している。生体内条件では、OVA免疫処置（７．実例の第7節に述べる遺伝子的な免疫処置）を施したネズミの脾細胞を再刺激すると、OVAトランスフェクトをしたリンパ腫EG7（黒正方形）やトランスフェクトしていない親細胞EL4（白三角形）に対して、細胞傷害機能があることが分析された(A)。作用因子の個体群は、補体のみと培養したもの（白正方形）、CD4+リンパ球に対するmAbと補体とで培養したもの(黒三角形)、C D8+リンパ球に対するmAbと補体とで培養したもの(白円形)、Thy1.2+リンパ球に対するmAbと補体とで培養したもの（黒円形）であり、EG7標的に対して細胞傷害活性があるかを分析した(B)。C-Fでは、ネズミにOVA（黒正方形）かlacZで遺伝子的な免疫処置を施し、7日後に追加免疫を施した。免疫処置を行ったネズミ群に、最後の免疫処置（第0日）から7日後にB16メラノーマ(D)、OVA発現のサブクローンMO4（C）を投与した。他方で、免疫処置を施したネズミを2群に分け、そのうち一方は、最後の免疫処置の日から7日後と9日後にCD8+リンパ球をi.p. 抗CD8+のmAbで奪去した。無傷のネズミ群(E)とCD8+ 奪去のネズミ群（F）に、最後の免疫処置から10日後にMO4を投与した。生存は、生存している個体(C-F)の百分率で記録されている。60日目に生存していた個体に、腫瘍成長の兆候はなかった。全ての実験は、1群に５匹ずつのネズミで、最低３回以上繰り返して行われた。瀕死状態になったネズミは、動物保護ガイドライン(animal care guideline )に基づき、殺処分した。図４は、抗原呈示細胞がポリヌクレオチドを取り込んで発現し、MHCクラスIの制限されたプロセッシング経路で、プロセッシングして発現抗原を呈示することを示している。骨髄細胞からリンパ球を奪去して、1容器あたり10⁶細胞の24個のくぼんだ容器(well plate)で、10％のFCSとL-グルタミンと抗生物質2-MEを加えたRPMI 1640中で一晩培養させて、樹枝状細胞を得た。第1日目に、細胞は2.5×1 0⁵個／容器で、GM-CSF(10³U/ml，Sigma，St．Louis, MO)とネズミのrIL-4(10³U/ ml，Genzyme，Cambridge，MA)を十分に加え、第8日目に緩く接着した細胞を回収した。フローサイトメトリー分析によると、この樹枝状細胞はCD45、CD44、CD11 b(Mac-1)、CD18、CD80、CD86、クラスＩとクラスIIのMHC抗原を発現した。薄めた血清媒基で(Optimen，Gibco，Grand Island，NY)、37℃で2時間かけて、樹枝状細胞の一方はOVAペプチド(20ng/ml)＋ β2-マイクログロビン(β2-M, 10μl/ml，ヒト，Sigma)を適用し、他方にはそれらを適用しなかった。細胞は十分に洗浄し、未被験のネズミに注入する前にPB S中で再懸濁して照射を行った(2000 rad)。一定数の骨髄由来の樹枝状APCsを、粒子性の培養基質として鉄ビード(黒正方形)、金ビード(黒円)、または可溶OVA 蛋白（2mg/ml）（白正方形）を使って、第７節の実例のに述べる方法で得たOVA 発現の粒子性ポリヌクレオチド（粒子7mg/mlで50μl/ml/10⁶細胞個）と共培養し、24時間経過後に洗浄し、一定数のAPCsをミクロ培養でＴ細胞ハイブリドーマRF 33.70(抗OVA+K^b)と共培養した。18時間培養した後、上層部を回収し、指示細胞株HT2を用いてIL-2があるかの分析を行った(Rockほか著、1990，J．Immunol．14 5: 804-811)。図５は、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalist ic))な注入か、皮下注入によって施した、粒子性ポリヌクレオチドの免疫処置の比較を示したものである。5群、C57B1/6のネズミに免疫処置をし、第７日目に追加免疫を行って、さらに追加免疫から7日後に、5×10⁵個のMO5腫瘍細胞をそれぞれの側腹部に皮膚内注入した。免疫処置の内訳は、(A)第７節の実例に述べるようなバイオリスティック（バイオバリスティック） (biolistic(biobalistic))な方法によって得られ導出されたβ-Galのコードをつくる粒子性ポリヌクレオチド、(B)第７節の実例に述べるようなバイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な方法によって得られ導出されたOVAのコードをつくる粒子性ポリヌクレオチド、(C)皮下注入によって導出される粒子なしの、過剰のOVAのコードをつくるポリヌクレオチド、(D)第７節の実例に述べるように皮下注入によって導出した等量のOVAのコードをつくる粒子性ポリヌクレオチドである。データは、腫瘍投与後50日後に各群の腫瘍に冒されなかった個体数の百分率（％）で表わしている。図６は、OVAのコードをつくる粒子性ポリヌクレオチドと共培養したAPCsによる免疫処置が、OVA発現性メラノーマMO5を投与した個体に防御効果があることを示したものである。5群、C57B1/6のネズミに、図5のときに述べたのと同様に皮下注入で免疫処置を1回だけ施し、免疫処置から10日後に1×10⁵個MO5の腫瘍細胞をそれぞれの側腹部に皮膚内注入した。免疫処置は、（白正方形）左右の後ろ足 1本ずつに、無関係な抗体β-ガラクトシダーゼのコードをつくる粒子性ポリヌクレオチド(7mg/mlで100μl、粒子溶液(粒子質量/体積 PBS))、または、(白円)販売可能なpAc-neo-OVA(後ろ足1本につき100μ、これはl1個体あたりのDNAとほぼ等量)、または、(黒正方形)5×10⁴個の骨髄由来の樹枝状細胞／100μlを後ろ足、s.q．（例7 に述べる方法で得たもの）である。生存は、生存していた個体の百分率で報告された。全ての実験は1群あたり5匹のネズミを用いた。瀕死状態になったネズミは動物保護ガイドライン(animal care guidelines)に基づき、殺処分にした。５．発明の詳しい説明本文において、「哺乳類宿主」という語は、ヒトを含むがヒトのみに限らない動物界の構成員も含む。本文において、「DNAフラグメント」という語は、いかなるヌクレオチド列も含むことができ、すなわち、MHCクラスＩ経路での細胞膜表面での呈示のために抗原性蛋白や抗原性蛋白のフラグメントが標的細胞で発現するような適当なコード領域と決まった配列を有するものである、DNAもしくはRNAを含むことができる。本文において、「粒子性ポリヌクレオチド」という語が言及できる粒子がつくられる物質には、前段落で定義したDNAフラグメント群でなる粒子を持つ、金、鉄、合成樹脂が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は哺乳類宿主についての治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置に関するものであり、それは、哺乳類宿主体内の標的細胞に対するDNAフラグメントの導出、宿主細胞内のDNAフラグメントの発現、そしてこれにひき続き、細胞性免疫か体液性免疫のいずれか、もしくは療法をひきおこすための宿主細胞による組み換え抗原ペプチドの呈示である。本発明はさらに、哺乳類宿主体内の特定の標的細胞に対する蛋白か生物学的に活性なフラグメントをコード化するDNAフラグメントの導出で成る、哺乳類宿主についての治療学的または予防学的な遺伝子的免疫処置にも関している。そのDN A列から発現する抗原性ペプチドは、新生物細胞やウイルス感染細胞などの病原細胞に対して、特異性を持つ。抗原特異性CTLsが刺激を受け、それによって新生物細胞やウイルス感染細胞などの標的細胞の破壊を促進するのである。本発明は、腫瘍やウイルス感染の治療や予防のための遺伝子的な免疫処置方法を開示するものである。細胞傷害性Ｔ細胞は、新生物細胞やウイルス感染細胞を、標的腫瘍細胞の表面上にMHCクラスＩ分子によって呈示される抗原性ペプチドを認識することによって、破壊する。このペプチドは、病原細胞によって合成され、その細胞質基質の中で分解した腫瘍抗原から生じる。破壊された腫瘍細胞や成分蛋白を用いた免疫処置で、生体内条件で腫瘍特異性CTL反応を誘導する試みは、これまで概して成功しなかったが、それはおそらく、細胞外液中の蛋白は細胞質基質の中に入ってMHCクラスＩ呈示経路に接近することができないためである。本発明の特異な実施例のひとつは、その得るべき蛋白を発現するDNAフラグメントを有する粒子を用いた、遺伝子的な免疫処置に関している。そのようなDNAフラグメントを有する粒子を、この明細書中では、「粒子性ポリヌクレオチド」として言及している。生体内条件では、細胞の導出は、コーティングされたビードや金の粒子(coated beads or g old particles)など、DNAフラグメントや粒子状での得るべき蛋白を投与することによって、なされるのが最もよい。そのような蛋白や生物学的に活性なフラグメントは、標的細胞の中の細胞質基質での導出の結果、発現する。そうして発現した蛋白や蛋白フラグメントは、病原細胞に対する特異性があり、内因性のMHC クラスＩ経路を経たＴリンパ球への呈示のための抗原性ペプチドを生じる基質となる。生じた抗原性ペプチドがMHCクラスＩ経路を経て適当な呈示をなすことで、CTLsの生成がおこり、次に、病原細胞の破壊が促されるのである。本発明は、腫瘍拒絶性抗原(TRA)やウイルス性抗原を発現するDNAフラグメントを特定の細胞にターゲッティングすることで、CTL性の抗腫瘍免疫を完結しうるという既述文書を基にしている。この目的のために、本発明は、抗原性蛋白のコードをつくる粒子状のDNA構造物資を用いて宿主の標的細胞をトランスフェクトすることによってなされる、CTL性免疫の誘導を開示する。この免疫性蛋白は細胞内で生成するので、制限されたMHCクラスＩ経路に接近する。自然に抗原決定基ができる結果、トランスフェクトした細胞は免疫性蛋白を数日の間生じるであろうし、より活発な免疫原性の刺激が助長される可能性もある。本発明の特異的な実施例のひとつでは、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント(microprojectile bombardment)装置によって、粒子性ポリヌクレオチドが、非特異的なマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント(microprojecti le bombardment)の直接的な結果としてその投射の経路で、適正数以上の宿主細胞の中に入るよう、哺乳類宿主を粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施す。また、その宿主細胞は、望ましくはAPCsであるが、必ずしもそれに限ることはない。皮膚に衝撃が与えられた場合、衝撃を与えられうる皮膚のAPCsとしては、表皮のランゲルハンス細胞やケラチン生成細胞や真皮の樹枝状細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。リンパ組織に衝撃が与えられた場合、衝撃を与えられうるリンパ組織のAPCsとしては、内在の樹枝状細胞やマクロファージや基質細胞やＴリンパ球やβリンパ球が含まれるが、これらに限定されるものではない。トランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APC細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、衝撃を受けた細胞のリンパ組織へのトラフィッキング後において、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促す。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。粒子性ポリヌクレオチドが食胞-細胞質基質経路を経て、APCsを含む宿主細胞に特異的に入るよう、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic (biobalistic))な導出過程で、哺乳類宿主を粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置することができる。衝撃が与えられた部位（皮膚やリンパ組織）、あるいは、衝撃を受けた細胞のリンパ組織へのトラフィッキング後において、粒子性ポリヌクレオチドは宿主細胞に入る。すなわち、粒子性ポリヌクレオチドがリンパ組織に入るのは、その粒子がリンパ組織の細胞に取り込まれるという、リンパ組織への直接的経路によるか、もしくは、宿主細胞が粒子性ポリヌクレオチドを取り込んでリンパ組織に送る経路によるかである。宿主細胞に取り込まれる結果、トランスジェニック(transugenic)なポリヌクkレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、宿主のAPC細胞の膜の表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPCsの細胞膜の抗体呈示は、衝撃を受けた部位またはリンパ組織中において、抗原特異性 CTLsの誘導を促進する。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の実施例において、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。その粒子性ポリヌクレオチドは宿主細胞に入り、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、宿主のAPC細胞の膜の表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPCsの細胞膜の抗体呈示は、衝撃を受けた部位またはリンパ組織中において、抗原特異性CTLs の誘導を促進する。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。粒子性ポリヌクレオチドが食胞-細胞質基質経路を経て、APCsを含む宿主細胞に特異的に入るよう、哺乳類宿主を粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置することができる。注入が行われた部位、あるいは、衝撃を受けた細胞のリンパ組織へのトラフィッキング後において、粒子性ポリヌクレオチドは食胞-細胞質基質経路を経て、宿主細胞に入る。すなわち、粒子性ポリヌクレオチドがリンパ組織に入るのは、その粒子がリンパ組織の細胞が取り込まれるという、リンパ組織への直接的経路によるか、または、宿主細胞が粒子性ポリヌクレオチドを取り込んでリンパ組織に送る経路によるか、いずれかである。宿主細胞に取り込まれる結果、トランスジェニック（transu genic）なポリヌクkレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHC クラスＩ経路で送られて呈示され、宿主のAPC細胞の膜の表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPCsの細胞膜の抗体呈示は、衝撃を受けた部位またはリンパ組織中において、抗原特異性CTLsの誘導を促進する。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の特異な実施例においても、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。その粒子性ポリヌクレオチドの構成は、選択的にAPCsの食細胞経路をターゲッティングする特異性分子を含んだり(この食細胞経路には、マンノース・レセプターによる経路やFcレセプターによる経路が含まれるが、これらに限定されない)、あるいは、その粒子性物（ウイルス性HAやリステロリシン蛋白などエンドソーム性の膜融合性蛋白が含まれるが、これらに限定されない）が細胞質基質によって接近するのを助長したりするように、造られる。粒子性ポリヌクレオチドは、注入を行った部位、または、リンパ組織へのトラフィッキング後において、食胞 -細胞質基質経路によって宿主細胞に入る。すなわち、粒子性ポリヌクレオチドがリンパ組織に入るのは、その粒子がリンパ組織の細胞に取り込まれるという、リンパ組織への直接的経路によるか、もしくは、宿主細胞が粒子性ポリヌクレオチドを取り込んでリンパ組織に送る経路によるかである。宿主細胞に取り込まれる結果、トランスジェニック(transugenic)なポリヌクkレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、宿主のAPC 細胞の膜の表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPCsの細胞膜の抗体呈示は、衝撃を受けた部位またはリンパ組織中において、抗原特異性CTLsの誘導を促進する。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明は、第６節の実例に述べるネズミのメラノーマをモデルとしたいくつかのフロン(fronts)のもとに例証される。簡単に述べると、ネズミをモデルとする抗原特異性腫瘍免疫の研究における第一の限界は、MHCクラスＩに限定されるCTL sとして認められる明確な腫瘍抗原が不足していることである。TRAは、その細胞から合成される他のどの蛋白とも基本的に異なっているので、宿主がそれらに対する耐毒性を持たない場合を除けば、腫瘍から合成される異物蛋白は腫瘍抗原として機能するであろう。本発明による腫瘍免疫処置の方法は、メラノーマB16由来のC57B1/6に入る卵白アルブミン(OVA)の遺伝子をトランスフェクトすることによって内因性的に合成される明確なTRAを用いて、ネズミの腫瘍をモデルに例証される。このシステムは以下の理由により優れている。(1)B16メラノーマは、よく研究が進んでいるネズミの腫瘍であること。 (2)生体内条件では、この腫瘍株の増殖性格と転移は、際立った特徴を持っていること。(3)卵白アルブミンは、はっきりと決まった構造を持っていること。C57 B1/6のネズミの体内において、OVAの細胞内のプロセッシングと呈示は、知られている。特に、プロセッシングされてMHCクラスＩＫ^bに関連して表示されるペプチドの構造が知られている。T-Tハイブリドーマ33.70.Al 抗OVA-Ｋ^bを用いて、H 2-Ｋ^bと関連する卵白アルブミンペプチド[SINFEKL}の機能的な発現を分析することも、知られている(Kovacovics-Bankowskiほか著、1993、Proc．Natl．Acad．S ci．USA．90: 4942-4946)。このシステムで、生体条件内でOVA特異生CTLsの誘導を評価する技術も、詳細に既述がなされている(Mooreほか著、1988, Cell 54: 777-785)。本発明の実施例のひとつは、バイオリスティック（バイオバリスティック）(b iolistic(biobalisic))な装置を用いて、粒子性ポリヌクレオチドを得て行う免疫処置である。特に、粒子性のポリヌクレオチドの導出が、トランスフェクトした細胞内での一連の生物学的な反応を刺激して致命的な腫瘍の投与に対する免疫防御効果を引き出すよう、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalisic))な過程によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すものである。本発明は、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalisic))な装置を用いた皮膚の抗原の導出によって、幾重にも例証される。第一に、そのような異物蛋白β-Galのコードをなす粒子性ポリヌクレオチドの導出は、表皮、流出リンパ節のいずれにおいても、β-Gal蛋白の発現を得る。第二に、OVA免疫処置は、OVA特異性CTLsの誘導を得る。第三に、OVA-B16のモデルの使用によって、OVA免疫処置を施した個体は、OV A発現の腫瘍による腫瘍投与に対して抵抗力を持ち、また、その防御効果は抗原特異的で、しかもCTLsによるものであることが示されている。さらに、この防御効果の機構は、一般化されているバイオリスティック（バイオバリスティック） (biolistic(biobalisic))な装置による皮膚での粒子性ポリヌクレオチの導出を凌ぐものである。それよりも、食細胞性APCsへの特異的なターゲッティング、および(または)、リンパ組織内での抗原発現性が、前駆物質からの抗原特異性CTLs 導出にとって主要事項である。したがって、標的細胞が食細胞性APCs、それも特に、リンパ組織の中に定位しているか、リンパ組織にトラフィックすることができるようなAPCsとするのが、本発明の望ましい実施例である。本発明の別の実施例において、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。そのトランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APC細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、衝撃を受けた細胞のリンパ組織へのトラフィッキング後において、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促し、それが、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の望ましい実施例において、直接注入によって粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施した哺乳類宿主の標的細胞は、食細胞性APCsである。トランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APC細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。APC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、衝撃を受けた細胞のリンパ組織へのトラフィッキング後において、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促し、それが次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の望ましい実施例において、その粒子性ポリヌクレオチドは皮下注入によってヒト宿主に導出される。本発明は、粒子性ポリヌクレオチドの複合物の直接注入を行うと、食細胞性のAPCsにターゲッティングの定まった導出がなされ、リンパ組織での遺伝子の発現が得られることを、開示するものである。投与を受けていない前駆物質から抗原特異性CTLsをよりよく誘導する効果を生むのは、皮下投与による、この食細胞性のAPCsにターゲッティングの定まった導出、および (もしくは)、リンパ組織での遺伝子の発現である。したがって、APCsに入ってそれによって発現するような、蛋白あるいは生物学的に活性なフラグメントをコード化するDNAフラグメントが、本発明の主要事項である。そこで得る抗原は、APCsに抗原特異性CTLsの誘導を促進すべく、APCsの細胞質の中で発現されてMHCクラスＩ経路に入る。この本開示中に示すデータは、そのような抗原特異性CTLsを誘導するのに最も効果的な仕方が、リンパ組織の APCsまで遺伝子物質の直接的な移送、あるいは、リンパ組織までトラフィックすることのできるAPCsによるものである、新しい前駆物質を支持するものである。本発明の別の実施例において、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドにより抗原を与えられた同系のAPCsを用いて、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。特に、その粒子性ポリヌクレオチドが生体内でAPCsに入り、そのAPCsが宿主体内に注入されるように、粒子性ポリヌクレオチドでトランスフェクトしたAPCs で宿主を免疫処置する。APCs内への進入の結果、トランスジェニック(transgeni c)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APC細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。そのようなAPCsの注入後、内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、そのリンパ組織で、衝撃抗原特異性CT Lsの誘導を促す。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の特異的な実施例において、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドと共培養して抗原を与えた同系のAPCsを用いて、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。特に、その粒子性ポリヌクレオチドが食胞-細胞質基質経路を経てAPCsに入るよう、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドとの共培養によってAPCsをトランスフェクトする。その粒子性ポリヌクレオチドが食胞-細胞質基質経路を経て生体内でAPCsに入り、そのAPC sが宿主体内に注入されるように、粒子性ポリヌクレオチドでトランスフェクトしたAPCsで宿主を免疫処置する。APCsに取り込まれる結果、トランスジェニック (transgenic)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性の MHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APC細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。そのようなAPCsの注入後、内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、そのリンパ組織で、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促す。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の特異的な実施例において、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドで抗原を与えられた同系のAPCsを用いて、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。特に、生体内条件でAPCsのマイクロプジェクタイル・ボンバードメント(microprojecti le bombardment)で、同系APCsをトランスフェクトする。APCsへの衝撃投射の結果、トランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APCs細胞の膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。そのようなAPCs の注入後、内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、そのリンパ組織で、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促す。誘導された抗原特異性CTLs は、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。本発明の別の特異的な実施例において、生体内条件で粒子性ポリヌクレオチドで抗原を与えた同系のAPCsを用いて、直接注入によって、哺乳類宿主に粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施すことができ、その注入としては、皮下注入、表皮注入、真皮注入、リンパ注入、静脈内注入が含まれるが、これらに限定されない。特に、その粒子性ポリヌクレオチドが生体内でAPCsに入り、そのAPCsが宿主体内に注入されるように、粒子性ポリヌクレオチドでトランスフェクトしたAPCs で宿主を免疫処置する。粒子性ポリヌクレオチドは、マイクロプジェクタイル・ボンバードメン(microprojectile bombardment)もしくは食胞-細胞質基質経路によって、生体でAPCsの中に入る。抗原のコードをなすポリヌクレオチドおよび(または)、APCの抗原呈示機能を増すような分子をコード化したポリヌクレオチドで、APCsをトランスフェクトする。また、そのような分子は、IL-12、IL-2、IL-4などのサイトカイン分子や、CD80、CD86などの補刺激分子であるが、これらに限定されるものではない。トランスジェニック(transgenic)な抗原発現性ポリヌクレオチドは、APCs内への進入の結果、抗原性ペプチドのフラグメントが内因性のMHCクラスＩ経路で送られて呈示され、APCsの膜表面に表われるよう、生物学的に有効なレベルにおいて発現する。そのようなAPCsの注入後、内因性のAPC細胞膜の抗原呈示は、衝撃を受けた部位、あるいは、そのリンパ組織で、衝撃抗原特異性CTLsの誘導を促す。誘導された抗原特異性CTLsは、次に、哺乳類宿主（望ましくはヒト）の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。サイトカインや補刺激分子のコードをなす、トランスジェニック(transgenic)なポリヌクレオチドは、AP Cs内への進入の結果、注入の部位もしくはリンパ組織でAPCの抗原呈示機能が抗原特異性免疫反応を促すよう、生物学的に有効なレベルにおいて、発現する。本明細書に開示するシステムに、厳選したTRAやウイルス性抗原を組み込むことが、一般技術者の視野に入るようになるであろう。現在利用可能なTRAの例としては、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、 Tyrosinase、 Melan-A(MART-1)、gp100(pme117)、gp75(TRP1)、CEA(癌胎児性抗原)、ならびに、HPV、HBV，EBVから生じるウイルス由来の腫瘍抗原、ならびに、腫瘍結合性のオンコーゲン／腫瘍抑制遺伝子の突然変異による、P53、P16、RAS、HER²/neu、C -ABL、多形性内皮ムチンなどの抗原が含まれるが、決してこれらのみに限定されるものではない(参照：Maeurerほか著、1996,「Cancer Vaccines」Clinical Imm unology Princiiples and Practice, R．Rich編, Mosby Publishing．第123章 : 1904-1918 ／ Van den Eynde ほか著、1995, J．Exp．Med．182: 689-698) 。ウイルス性抗原の例としては、インフルエンザの核蛋白(Donnellyほか著、199 5,「Nature Med.」1: 583-587.)、HIV gp 120、HIV gp 160、B型肝炎の表面抗原 (参照：Pardoll、Beckerleg共著、「Immunity」1995，3: 165-169)。トランスジェニック(transgenic)なDNA列の発現の調整を促進したり増幅したりするのに使えることが知られている任意の真核性のプロモータ及び／又は利用可能なエンサー列を、本発明の粒子性ポリヌクレオチドを生じさせるために厳選した粒子によって、組み換えベクターを構成するのに使うことができることは、一般技術者には知られていることである。そのような促進剤フラグメントとしては、標的細胞中で活性であることが知られている細胞特異性の促進剤列や増幅剤列だけでなく、サイトメガロウイルス(CMV)促進剤、ラウスサクロマウイルス(RSV)促進剤、ネズミ白血病ウイルス(MLV)促進剤、βアクチン促進剤が含まれるが、決してこれらのみ限定されるものではない。この目的のために、本発明の望ましい実施例は、抗原のMHCクラスＩ性の接近を促進し、そして、APCsに抗原特異性CTLsの誘導を刺激させるために、リンパ組織の中のAPCsか、リンパ組織までトラフィッキング可能なAPCsに、特異的に腫瘍やウイルス性抗原のコードをつくるDNAを導出するための粒子結合性DNAを使用するものである。すると、これらのCTLsは宿主の体内を巡り、新生物細胞やウイルス感染細胞を破壊するのである。皮下注入を使ってリンパ節APCsでの特異的な反応を進めるという、望ましい方法に基づく腫瘍免疫は、第6節、第7節、第8節の実例で例証する。後述の例は、制限の意味ではなく本発明の実例という意味で、提供するものである。６．実例：OVA/B16 遺伝子によるネズミの腫瘍のモデル特許請求の範囲に記載の発明を例証する実例の第7節と第8節で開示されるデータを生むために、OVA/B16のネズミを使ったモデルを使用した。OVA/B16のネズミを使うシステムは、次のいくつかの理由によって優れたものである。 (1)B16メラノーマは、よく研究が進んでいるネズミの腫瘍であること。(2)生体内条件では、この腫瘍株の増殖性格と転移は、際立った特徴を持っていること。(3)卵白アルブミンは、はっきりと決まった構造を持っていること。C57B1/6のネズミの体内において、OVAの細胞内のプロセッシングと呈示は、知られている。特に、プロセッシングされてMHCクラスＩＫ^bに結びついて表示されるペプチドの構造が知られている。T-Tハイブリドーマ33.70.Al抗OVA -Ｋ^bを用いて、H2-Ｋ^bと関連する卵白アルブミンペプチド[SINFEKL]の機能的な発現を分析することも、知られている(Kovacovics-Bankowskiほか著、1993、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA．90: 4942-4946)。このシステムで、生体条件内でOVA 特異性CTLsの誘導を評価する技術も、詳細に既述がなされている(Mooreほか著、 1988, Cell 54: 777-785)。 --ネズミと細胞株-- 生後5週間のメスのC57BL/6のネズミをJackson Laboratoy，Bar Harbor，ME.より購入した。EL4はC57BL/6のＴ細胞腫であり、EG7はニワトリの卵の卵白アルブミン(OVA)でトランスフェクトしたEL4のサブクローンである(Mooreほか著、1988 , Cell 54: 777-785)。C57BL/6由来のネズミのメラノーマB16(Fidlerほか著、1 976，Cancer Res．36: 3160-3165)が、アメリカ細胞タイプコレクション(ATCC) から得られた。MO4は、記述のとおり、pAc-Nco-OVAプラスミドを用いて、B16のトランスフェクションで合成した(Faloほか著、1995，Nature Med．1: 649-653／Mooreほか著、1988， Cell 54: 777-785)。ハイブリドーマGK1.5(抗CD4、ATCC TIB-207)、2.43(抗CD8 抗体をBalb/c nu/nuのネズミの体内で、i.p.GKfl.5細胞(3×10⁶)とIFA（0.5ml／マウス）を注入しておこした）から、単クローン性の抗体を得た。 B16のOVAトランスフェクションと選定の後、トランスフェクトしたB16メラノーマのサブクローンMO4だけが遊離した。親細胞メラノーマB16と、OVAのトランスフェクション細胞は、OVAペプチド（SINFEKL）のRF33.70への呈示によって計測されるように、類似したレベルの機能のK^bを細胞表面に発現する(図1)。それに対して、B16ではなくMO4/5は、外因的に添加されたペプチドがなくてもハイブリドーマの刺激が可能である(図1)。このことは、トランスフェクトされた抗源の内因性的な生成、プロセッシング、および呈示を示している。重要なことに、 MO4によるOVAの内因性的な発現は、生体内条件ではその腫瘍の免疫原性を有意に変えることがなかった(図2)。B16とMO4の腫瘍の成長率は、未被験のネズミで比較することができ(図2A)、宿主の生存率についても同様である(図2B)。７．実例：バイオリスティック（バイオバリスティック）な投与による遺伝子的免疫処置 --異物蛋白発現の定位-- 組織標本（皮膚か排出リンパ節）を免疫処置を施してから24〜28時間後に回収して、PBS中で洗浄した後、温度4℃で30分間、PBS中で2％ホルムアルデヒド-0.2 ％グルタルアルデヒドの中で定着させる。定着した標本をPBSで十分に洗浄し、X -galの着色溶液（PBS中、1 mg/ml X-gal， 5mM フェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウム、2mM 塩化マグネシウム）中で37℃で18時間培養した。着色された組織はパラフィン系物質で、0.1％の核ファスト赤を用いて対比染色した。 --遺伝子的免疫処置-- 0.95μmの金のビード(beads)の50mgと0.1Mのスペルミジンの100μlを合わせたあと、5秒間音波破砕を施して、DNAでコートした金の粒子を得た。引き続き、渦を巻いている間に132μgのプラスミドDNAと200μlの塩化カルシウムを加えた。この混合物を室温で5-10分間かけて沈澱させた。このビードの標本は、遠心分離器にかけて(10,000rpm, 30秒)、低温のエタノール中で3回洗浄した後、7mlエタノールで再懸濁して、7mg 金/mlの最終的な濃縮物を得た。この溶液を、Tefzel 管（商標）(Agracetus社)に入れて、5分間着定させる。エタノールを除き、20rp mで30秒間の回転と乾燥窒素によって、ビードを管側面に付着させた。乾燥した管をビードとともに伸ばし、0.5インチずつに切って、パラフィルムで密閉したガラス瓶の中で乾燥剤を入れて保管しておく。被験動物の腹部を剃ったところに、アクセル・ジーン・デリバリー・デバイス(Accel Gene Delive ry Device)を用いて噴射圧300psiで２度の噴射を与え、ワクチン接種した(各噴射は0.5mgの金のビード＝管0.5インチ)。lacZ遺伝子を含む、pAc-Neo-OVAプラスミド(Mooreほか著、1988, Cell 54: 777-785)、もしくはpIEglacZプラスミド（ Nadia Jouroud提供）で、CMVプロモーターで調整しながら動物に免疫処置を施す。粒子性ポリヌクレオチドの皮下注入を行う実験のために(図5)、DNAでコートしたビード(DNA coated beads)を上述した方法で用意し、同量のDNAも体内に注入した。一部の個体には(図5)、過剰の遊離プラスミドDNAを皮下注入した。皮下注入は、左右の側腹部の中央部に100μlのPBSに溶かして投与を行った。生体内のA PCsのトランスフェクション（図4）のために、DNAのビード(DNA beads)は、粒子性基質として同質量のバイオマグ酸化鉄ビードまたは金のビード(Biomag iron o xide beads or gold beads)を用いて、全く同様に用意した。粒子性ポリヌクレオチドの皮下注入を行う実験のために(図5、6)、DNAでコートしたビード(DNA coated beads)を上述した方法で用意し、同量のDNAも体内に注入するか、その量を数値で明記した。一部の個体には(図5、6)、過剰の遊離プラスミドDNAを皮下注入した。皮下注入は、左右の後ろ足に100μlのPBSに溶かして投与を行った。生体内のAPCsのトランスフェクション（図4、6）のために、DNAのビード(DNA beads)は、粒子性基質として同質量のバイオマグ酸化鉄ビードまたは金のビード(Biomag iron oxide beads or gold beads)を用いて、上述と全く同様に用意した。37℃で18時間、7mg／mlの粒子性ポリヌクレオチド溶液25μl（粒子質量／体積 PBS）を用いた組織培養基で、IL-4は使用しなかったが、図の簡単な説明の中で述べたように、骨髄から樹枝状細胞APCsを得た。また、図の簡単な説明の中で述べたように、抗原を適用した樹枝状細胞を得て、体内に注入した。簡単に述べれば、骨髄細胞からリンパ球を奪去して、1容器あたり10⁶細胞の24個のくぼんだ容器(well plate)で、10％のFCSとL-グルタミンと抗生物質2-MEを加えたPRMI 1640中で一晩培養させて、樹枝状細胞を得た。第1日目に、細胞は2.5×10⁵個／容器で、GM-CSF(10³U/ml，Sigma，St．Louis，MO)とネズミのrIL-4(10³U/ml,Genzyme，Cambridge, MA)を十分に加え、第8日目に緩く接着した細胞を回収した。フローサイトメトリー分析によると、この樹枝状細胞は CD45、CD44、CD11b(Mac-1)、CD18、CD80、cD86、クラスＩとクラスIIのMHC抗原を発現した。薄めた血清媒基で(Optimen，Gibco，Grand Island，NY)、37℃で2 時間かけて、樹枝状細胞の一方はOVAペプチド(20ng/ml)＋β2-マイクログロビン（β2-M, 10μl/ml，ヒト，Sigma）を適用し、他方にはそれらを適用しなかった。細胞は十分に洗浄し、PBS中で再懸濁して照射を行ってから(200 0 rad)後、未被験のネズミに注入した。 --細胞傷害性分析-- 免疫処置を施した個体から得た脾細胞を、既に記述されているプロトコルの劣性変異体で再刺激した(Faloほか著、1995, Nature Med．1: 649-653)。簡単に述べると、処置後1週間の免疫脾細胞(30×10⁶)を、照射(20,000rad)を受けたEG7 (10×10⁶)と共培養することで、再刺激した。作用因子細胞を5日後に回収し、５１クロームで標識をつけた2×10⁴個の標的とともに、丸底マイクロウェル(200μ l)の中で、作用因子の標的細胞を一定割合にして、共培養した。既述のように分析の前にmABプラスの補体を用いると、作用因子細胞からT 細胞の亜群が奪去されるケースもあった（Rockほか著、J．Immunol．150: 1244-1251)。37℃で4時間後、3回のミクロ培養から上層部を100μlを集めて数え、既述のようにt特異性遊離の百分率を算出した(Faloほか著、1995, Nature Med．1: 649-653)。結果は、3回の培養の平均値で報告されている。3回の培養のSEMは常にその平均値の15 ％未満であった。 --防御性分析-- C57BL/6のネズミに既述のように一定構造の抗原遺伝子を用いて免疫処置を施した。既述のように、被験動物に腫瘍を投与して、腫瘍に対する生存率の評価を行った。簡単に述べると、最後の免疫処置から7日後（第0日）に、OVA免疫処置またはlacZ免疫処置を施した被験動物に対して、左右の側腹部中央部に真皮内注入で、50％の被験動物が死ぬ量(LD₅₀)のメラノーマ細胞(2×10⁴)あるいは、第4節に示した数の腫瘍細胞を２回投与した。生存は、生存していた個体の百分率で記録されている。注入するメラノーマ細胞は、PBSで3回洗浄した。注入した細胞は、トリパンブルーの排除によると、95％以上が生存可能であった。全ての実験は1群あたり5匹のネズミを用い、最低3回以上繰り返して行った。瀕死状態になったネズミは、University of Pittsburg Me dical Center の動物保護ガイドライン(animal care guidelines)に基づいて、殺処分にした。いくつかの実験では、被験動物からCD8⁺細胞を奪去した。既述されているように、CD8 mAb(2.43)のi.p.注入によって、免疫処置後7日目と9日目にこれを行った後、第10日に腫瘍の投与を行った(Faloほか著、1995, Nature Me d．1: 649-653)。バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な免疫処置が抗原特異性CTLsを誘導する可能性の評価を行った。未被験のC57B1/6のネズミに、計2.64μg以下OVAコード化したDNAを２つのオーバーラップするパルスで腹部の皮膚に導出して、免疫処置を施した。生体内で再刺激を受けたこれらのネズミの脾細胞は、同系のOVA発現性のネズミの胸腺腫EG7を溶解させたが、トランスフェクトされていない親腫瘍EL4は溶解させなかった(図3A)。すなわち、標的細胞の溶解は、標的腫瘍細胞によるOVAの発現によって決定する、抗原特異的なものであった。mABを用いて作用因子群からＴ細胞の亜群を奪去することで、溶解は、MHCクラスＩ限定のCTL 作用因子細胞に特有のThy1⁺、CD8⁺の亜群によることが示された(図3B)。防御効果のある腫瘍免疫を誘導するバイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な免疫処置の力を決定するために、上述のように免疫処置と追加免疫を施したネズミ群に、7日後に、MO4メラノーマをいくらか離れた部位にi.d.注入で投与した。OVA免疫処置を施したネズミには、致死量の腫瘍の投与に対する防御効果があったが、対比群のネズミ（同様に免疫処置したが、lacZの伝達遺伝子を用いたもの）では、腫瘍の成長が進行して、第40日目には 60％の個体が死亡していた(図3C)。OVA免疫処置を施したネズミは、トランスフェクトしていない親メラノーマB16の投与に対しては、防御効果がみられなかったが(図3D)、このことは、防御効果のある免疫性は、腫瘍標的によるOVA発現に対して抗原特異的であったことを示している。申請者は、免疫処置を行った個体群と、その対比（lacZ免疫処置を行った）群から、それぞれCD8⁺作用因子を奪去して、腫瘍投与の前に抗CD8⁺mABのi.p.注入を行うことを繰り返して、この防御効果のある腫瘍免疫に対するCD8⁺作用因子細胞の寄与の評価を行った（Faloほか著、1995, Nature Me d．1: 649-653)。OVA免疫処置を施した個体にはMO4の投与に対して防御効果があり、CD8+Ｔ細胞を奪去した個体に免疫処置をした生存率は、Ｔ細胞の奪去をしたものでもしていないものでも対比群に見られた生存率に類似していた(図3E-F)。したがって、CD8+Ｔ細胞が、このモデルにおける遺伝子的免疫処置によって導かれる防御性の腫瘍免疫にとって、本質なものである。申請された腫瘍免疫機構を裏付けるさらなる証拠として挙げられるのは、lacZ 構造物質のバイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalist ic))な導出の後の表皮中にβ-ガラストシダーゼを発現するという実証であり、しかも、興味深いことに、排出リンパ節の中の離散した特異性発現領域でということである。これらのリンパ節は、免疫処置を施した部位からは離れているので、直接の物理的な衝撃では、リンパ節での発現がおこりにくい。48時間目に表皮の角化細胞内でのDNA導出とlacZの発現から24時間経過後の、免疫処置をした皮膚（着色していない）の表皮および真皮中では、金粒子が優勢であった。排出リンパ節内でも、離散した特異的な着色領域がある。無関係なDNAで免疫処置をしたネズミからの標本を、全く同様に処理したところ、lacZの発現は示さなかった。この観測結果によって、第8節の実例に開示するさらなる分析を促された。８．実例：皮下投与による遺伝子的免疫処置粒子性ポリヌクレオチドの皮下投与による遺伝子的免疫処置の誘導のための物質と方法は、第6節および第7節の実例に述べたとおりである。このデータは、生体内条件での粒子性ポリヌクレオチドの皮下投与による遺伝子的免疫処置によって、リンパ細胞の食細胞性APCs、またはリンパ細胞へのトラフィッキングが可能なAPCsを、特異的にターゲッティングする能力を実証するものである。直接的な皮下注入または、バイオリスティック（バイオバリスティック）(bio listic(biobalistic))な注入によって、pAc-Neo-OVAで成る粒子性ポリヌクレオチドで免疫処置を施したネズミ群の内部では、腫瘍に対する防御効果は等しい( 図5)。例示の第7節の観測結果に従えば、無関係な抗体（例えばpIEgalcZ）のコードをなす粒子性ポリヌクレオチドによる免疫処置は、防御効果をもたらさなかった(図5)。粒子性物を伴わないpAc-Neo-OVAの皮下注入は、当該の腫瘍の投与に体して防御効果をもたらさなかった(図5)。こうしたデータから示されることは、粒子性ポリヌクレオチドの皮下注入は、少なくとも、バイオリスティック（バイオバリスティック）(biolistic(biobalistic))な粒子導出と同等の効果があるということである。さらに、皮下注入は、個々の宿主細胞の細胞質の中へポリヌクレオチド粒子を、直接物理的に衝撃を投射するのではなかったので、食作用／細胞内取り込みが可能な宿主細胞によるポリヌクレオチドの取り込み活性が、発現に必要になる傾向がある。粒子なしでpAc-Neo-OVAを皮下注入すると防御効果が得られなかったという観測結果も、形質導入の機構としての粒子導出／食作用を意味するものである。食作用による粒子性の形質導入が示すことは、転移遺伝子(transgene) の発現が、APCsを含め、食作用のある細胞を選択的にターゲッティングするということである。ここに申請する機構をさらに裏付けることは、卵白アルブミン（例7で述べたようにして得たもの）(pAc-Neo-OVA)のコードをなす粒子性ポリヌクレオチドと、生体内条件で共培養したAPCs（骨髄由来の樹枝状細胞）がOVA(SINFEKL⁺K^b)特異性のＴ細胞ハイブリドーマRF33.70を刺激してIL-2（図４）を生じることができるという観測結果である。こうしたデータは、これらAPCsが機能的に卵白アルブミン遺伝子を発現し、卵白アルブミンペプチドKb複合物を生じることを、実証している。その促進効果は、2mg/mlの可溶性OVA蛋白を適用したAPCsを用いて観測した結果に匹敵する。この分析では、粒子性ポリヌクレオチドは、粒子性基質として金または鉄を用いると効果的である。そして、粒子性ポリヌクレオチドを食細胞性APCsとともに生体内条件で培養すると、トランスフェクトされた抗原が内因性的に生成し、プロセッシングされて呈示される。こうした観測結果から実証されることは、粒子性ポリヌクレオチドがAPCsに取り込まれて発現されると、それに対応する蛋白が機能的に呈示されて抗原特異性の免疫反応が誘導されるということである。さらに、図6に示すように、抗原呈示性細胞は、このケースでは皮下注入によって注入された骨髄由来の樹枝状細胞であり、それは上述したとおり、生体内条件で抗原OVAをコード化する粒子性ポリヌクレオチドとともに培養されたものであるが、この抗原呈示性細胞が、抗原遺伝子を発現する腫瘍細胞に対して防御性の免疫効果を誘導できるのである。ここに出す例では、一個体あたり10⁵の(後ろ足1本あたり5×10⁴個の細胞を両足に)、照射を受けたトランスフェクトされた樹枝状細胞を一度の投与すると、腫瘍の投与に対して完全な防御効果が誘導された。すなわち、生体に投与された樹枝状細胞APCsは、生体内でペプチドを与えられると、抗原特異性CTLsおよび防御効果のある腫瘍免疫を効果的な促進剤になるので、少なくとも、粒子性ポリヌクレオチドとの共培養によって抗原を与えられるのと同様の免疫原性がある。以上の結果をまとめると、粒子性ポリヌクレオチドの皮下投与は、望ましくない有害な効果を減少させる一方で、遺伝子的な免疫処置の効果を潜在的に高めるので、食細胞性のAPCsへターゲッティングをするような抗原の導出に有利な方法であると示される。尚、この有害効果として、耐性の誘導や、ノーマルな非APCs 性の宿主細胞のトランスフェクションの結果生じる突然変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【手続補正書】【提出日】１９９８年４月８日【補正内容】請求の範囲１．抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントを発現するＤＮＡフラグメントが分布される表面を持つ粒子性ポリヌクレオチドからなる接種材料であって、該接種材料は、哺乳類宿主内の標的細胞の細胞質へ供給できることを特徴とし、これによって、抗原性蛋白又は抗原性蛋白フラグメントは、前記宿主のＭＨＣクラスＩ経路を通じて、前記標的細胞の細胞膜の表面上で発現され、呈示される。２．前記ＤＮＡフラグメントは、腫瘍拒絶性抗原、ウイルス性抗原又はその抗原性蛋白フラグメントを発現する、請求項１の接種材料。３．前記接種材料は、抗原呈示性細胞である標的細胞の細胞質へ供給できることを更に特徴とする、請求項２の接種材料。４．前記接種材料は、哺乳類宿主のリンパ組織内にあるか、又は該リンパ組織まで移動する抗原呈示性細胞へ供給できることを更に特徴とする、請求項３の接種材料。５．前記腫瘍拒絶性抗原は、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３から成る群から選択される、請求項２の接種材料。６．前記腫瘍拒絶性抗源はＭｅｌａｎ−Ａである、請求項２の接種材料。７．前記腫瘍拒絶性抗源はｇｐ１００である、請求項２の接種材料。８．前記腫瘍拒絶性抗源はｐ５３である、請求項２の接種材料。９．前記腫瘍拒絶性抗源はＣＥＡである、請求項２の接種材料。 10．前記腫瘍拒絶性抗源はＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項２の接種材料。 11．前記ウイルス性抗源はＨＩＶｇｐ１２０又はＨＩＶｇｐ１６０である、請求項２の接種材料。 12．前記ウイルス性抗源はインフルエンザウイルスの核蛋白である、請求項２の接種材料。 13．前記ウイルス性抗源はＢ型肝炎の表面抗原である、請求項２の接種材料。 14．バイオリスティック(biolistic)な装置の使用による哺乳類宿主の接種に有用なもの、又は、直接注入による哺乳類宿主の接種に有用なものであることを更に特徴とする、前記何れかの請求項の接種材料。 15．標的細胞へ、インビトロ又はインビボで供給できることを更に特徴とする、前記何れかの請求項の接種材料。 16．抗原呈示性細胞の抗原呈示作用を強化する蛋白を発現するＤＮＡフラグメントが分布される表面を持つ粒子性ポリヌクレオチドからなる接種材料であって、該接種材料は、哺乳類宿主の標的細胞の細胞質へ供給できることを特徴とし、これによって、前記抗原呈示強化蛋白は、前記標的細胞内で、生物学的に重要な形式且つ生物学的に重要なレベルで発現される。 17．前記粒子性ポリヌクレオチドは、抗原呈示性細胞である標的細胞の細胞質へ供給できることを更に特徴とする、請求項１６の接種材料。 18．前記粒子性ポリヌクレオチドは、前記ヒト宿主のリンパ組織内にあるか、又は該リンパ組織まで移動する抗原呈示性細胞へ供給できることを更に特徴とする、請求項１７の接種材料。 19．前記ＤＮＡフラグメントは、補刺激分子を発現する、請求項１６の接種材料。 20．前記補刺激分子は、ＣＤ８０及びＣＤ８６から成る群から選択される、請求項１９の接種材料。 21．前記ＤＮＡベクターフラグメントは、サイトカイン分予を発現する、請求項１６の接種材料。 22．前記サイトカイン分子は、ＩＬ−１２、ＩＬ−４及びＩＬ−２から成る群から選択される、請求項２１の接種材料。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６３５Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５６３７６３７Ｃ 47/48 47/48 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファロ，ルイスディ．ジュニアアメリカ合衆国 15237 ペンシルベニア, ピッツバーグ，ダンカンアベニュー 710，アパートメント 1409 (72)発明者ロック，ケネスエル. アメリカ合衆国 02167 マサチューセッツ，チェストナットヒル，ウォルナットヒルロード 145

Claims

【特許請求の範囲】１．(a)抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントを発現するDNAフラグメントを生じさせ、 (b)当該DNAフラグメントをある粒子表面上に分布させて、粒子性ポリヌクレオチドを得、 (c)当該哺乳類宿主を当該粒子性ポリヌクレオチドで接種し、 (d)発現される抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントが、MHCクラスＩ経路を経て細胞膜の表面に呈示されるように、当該哺乳類宿主の体内の標的細胞の細胞質に、当該粒子性ポリヌクレオチドを導出することを特徴とする、生体内条件における、哺乳類宿主に対する治療学的あるいは予防学的な、遺伝的な免疫処置の方法。２．当該哺乳類宿主はヒトである、請求項1の方法。３．当該DNAフラグメントは、腫瘍拒絶性抗原、あるいは、ウイルス性抗原、あるいは、抗原性蛋白フラグメントをそこから発現する、請求項2の方法。４．当該標的細胞は抗原呈示性を有する、請求項3の方法。５．当該抗原呈示性細胞は、当該ヒトのリンパ組織内にあるか、あるいは、当該ヒトのリンパ組織内に入る、請求項4の方法。６．当該腫瘍拒絶性抗原は、MAGE-1とMAGE-3から成る群から選択される、請求項5の方法。７．当該腫瘍拒絶性抗源はMelan-Aである、請求項5の方法。８．当該腫瘍拒絶性抗源はgp100である、請求項5の方法。９．当該腫瘍拒絶性抗源はp53である、請求項5の方法。 10．当該腫瘍拒絶性抗源はCEAである、請求項5の方法。 11．当該腫瘍拒絶性抗源はHER2/neuである、請求項5の方法。 12．当該ウイルス性抗源はHIV gp120、HIV gp160である、請求項5の方法。 13．当該ウイルス性抗源はインフルエンザウイルスの核蛋白である、請求項5の方法。 14．当該ウイルス性抗源はB型肝炎の表面抗原である、請求項5の方法。 15．(a)抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントを発現するDNAフラグメントを生じさせ、 (b)当該DNAフラグメントをある粒子表面上に分布させて、粒子性ポリヌクレオチドを得、 (c)当該哺乳類宿主を当該粒子性ポリヌクレオチドで、バイオリスティック( biolistic)な装置を使用して接種し、 (d)発現される抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントが、MHCクラスＩ経路を経て細胞膜の表面に呈示されるように、当該哺乳類宿主の体内の標的細胞の細胞質に、当該粒子性ポリヌクレオチドを導出することを特徴とする、生体内条件における、哺乳類宿主に対する治療学的あるいは予防学的な、遺伝的な免疫処置の方法。 16．当該哺乳類宿主はヒトである、請求項15の方法。 17．当該DNAフラグメントは、腫瘍拒絶性抗原、あるいは、ウイルス性抗原、あるいは、抗原性蛋白フラグメントをそこから発現する、請求項16の方法。 18．当該標的細胞は抗原呈示性を有する、請求項17の方法。 19．当該抗原呈示性細胞は、当該ヒトのリンパ組織内にあるか、あるいは、当該ヒトのリンパ組織内に入る、請求項18の方法。 20．当該腫瘍拒絶性抗原は、MAGE-1とMAGE-3から成る群から選択される、請求項 19の方法。 21．当該腫瘍拒絶性抗源はMelan-Aである、請求項19の方法。 22．当該腫瘍拒絶性抗源はgp100である、請求項19の方法。 23．当該腫瘍拒絶性抗源はp53である、請求項19の方法。 24．当該腫瘍拒絶性抗源はCEAである、請求項19の方法。 25．当該腫瘍拒絶性抗源はHER2/neuである、請求項19の方法。 26．当該ウイルス性抗源はHIV gp120、HIV gp160である、請求項5の方法。 27．当該ウイルス性抗源はインフルエンザウイルスの核蛋白である、請求項5の方法。 28．当該ウイルス性抗源はB型肝炎の表面抗原である、請求項5の方法。 29．(a)抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントを発現するDNAフラグメントを生じさせ、 (b)当該DNAフラグメントをある粒子表面上に分布させて、粒子性ポリヌクレオチドを得、 (c)当該哺乳類宿主を当該粒子性ポリヌクレオチドで、直接的注入によって接種し、 (d)発現される抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントが、MHCクラスＩ経路を経て細胞膜の表面に呈示されるように、当該哺乳類宿主の体内の標的細胞の細胞質に、当該粒子性ポリヌクレオチドを導出することを特徴とする、生体内条件における、哺乳類宿主に対する治療学的あるいは予防学的な、遺伝的な免疫処置の方法。 30．当該哺乳類宿主はヒトである、請求項29の方法。 31．当該直接的な注入は皮下注入である、請求項30の方法。 32．当該組み換えDNAベクターのフラグメントは、腫瘍拒絶性抗原、あるいは、ウイルス性抗原、あるいは、抗原性蛋白フラグメントをそこから発現する、請求項31の方法。 33．当該標的細胞は抗原呈示性を有する、請求項32の方法。 34．当該抗原呈示性細胞は、当該ヒトのリンパ組織内にあるか、あるいは、当該ヒトのリンパ組織内に入る、請求項33の方法。 35．当該腫瘍拒絶性抗原は、MAGE-1とMAGE-3から成る群から選択される、請求項 34の方法。 36．当該腫瘍拒絶性抗源はMelan-Aである、請求項34の方法。 37．当該腫瘍拒絶性抗源はgp100である、請求項34の方法。 38．当該腫瘍拒絶性抗源はp53である、請求項34の方法。 39．当該腫瘍拒絶性抗源はCEAである、請求項34の方法。 40．当該腫瘍拒絶性抗源はHER2/neuである、請求項34の方法。 41．当該ウイルス性抗源はHIV gp120、HIV gp160である、請求項34の方法。 42．当該ウイルス性抗源はインフルエンザウイルスの核蛋白である、請求項34の方法。 43．当該ウイルス性抗源はB型肝炎の表面抗原である、請求項34の方法。 44．(a)抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントを発現するDNAフラグメントを生じさせ、 (b)当該DNAフラグメントをある粒子表面上に分布させて、粒子性ポリヌクレオチドを得、 (c)発現される抗原性蛋白または抗原性蛋白フラグメントが、MHCクラスＩ経路を経て細胞膜の表面に呈示されるように、当該哺乳類宿主の体内の標的細胞の細胞質に、当該粒子性ポリヌクレオチドを導出し、 (d)当該哺乳類宿主を当該粒子性ポリヌクレオチドで、直接的な注入によって接種することを特徴とする、生体内条件における、哺乳類宿主に対する治療学的あるいは予防学的な、遺伝的な免疫処置の方法。 45．当該哺乳類宿主はヒトである、請求項44の方法。 46．当該直接的な注入は皮下注入である、請求項45の方法。 47．当該組み換えDNAベクターのフラグメントは、腫瘍拒絶性抗原、あるいは、ウイルス性抗原、あるいは、抗原性蛋白フラグメントをそこから発現する、請求項46の方法。 48．当該標的細胞は抗原呈示性を有する、請求項47の方法。 49．当該抗原呈示性細胞は、当該ヒトのリンパ組織内にあるか、あるいは、当該ヒトのリンパ組織内に入る、請求項48の方法。 50．当該腫瘍拒絶性抗原は、MAGE-1とMAGE-3から成る群から選択される、請求項 49の方法。 51．当該腫瘍拒絶性抗源はMelan-Aである、請求項49の方法。 52．当該腫瘍拒絶性抗源はgp100である、請求項49の方法。 53．当該腫瘍拒絶性抗源はp53である、請求項49の方法。 54．当該腫瘍拒絶性抗源はCEAである、請求項49の方法。 55．当該腫瘍拒絶性抗源はHER2/neuである、請求項49の方法。 56．当該ウイルス性抗源はHIV gp120、HIV gp160である、請求項49の方法。 57．当該ウイルス性抗源はインフルエンザウイルスの核蛋白である、請求項49の方法。 58．当該ウイルス性抗源はB型肝炎の表面抗原である、請求項49の方法。 59．(a)APCの抗原呈示機能を増強する分子を発現するDNAフラグメントを生じさせ、 (b)当該DNAフラグメントをある粒子表面上に分布させて、粒子性ポリヌクレオチドを得、 (c)当該発現される抗原呈示を増強する蛋白が生物学的に有意な形態で、また、生物学的に有意なレベルで発現されるように、当該哺乳類宿主の体内の標的細胞の細胞質に、当該粒子性ポリヌクレオチドを導出し、 (d)当該哺乳類宿主を当該粒子性ポリヌクレオチドで、直接的な注入によって接種することを特徴とする、生体内条件における、哺乳類宿主に対する治療学的あるいは予防学的な、遺伝的な免疫処置の方法。 60．当該哺乳類宿主はヒトである、請求項59の方法。 61．当該直接的な注入は皮下注入である、請求項60の方法。 62．当該標的細胞は抗原呈示性を有する、請求項61の方法。 63．当該抗原呈示性細胞は、当該ヒトのリンパ組織内にあるか、あるいは、当該ヒトのリンパ組織内に入る、請求項62の方法。 64．当該DNAベクターのフラグメントは、補刺激分子を発現する、請求項63の方法。 65．当該補刺激分子は、CD80とCD86から成る群から選択される、請求項64の方法。 66．当該DNAベクターのフラグメントは、サイトカイン分子を発現する、請求項6 3の方法。 67．当該サイトカイン分子は、IL-12とIL-4とIL-2から成る群から選択される、請求項66の方法。