WO2011036722A1 - Ｎｋ活性増強剤およびその利用 - Google Patents

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WO2011036722A1
WO2011036722A1 PCT/JP2009/004863 JP2009004863W WO2011036722A1 WO 2011036722 A1 WO2011036722 A1 WO 2011036722A1 JP 2009004863 W JP2009004863 W JP 2009004863W WO 2011036722 A1 WO2011036722 A1 WO 2011036722A1
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WO
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activity
lymphocytes
enhancing
blood
cells
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PCT/JP2009/004863
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English (en)
French (fr)
Inventor
田中裕之
若村恒吉
立藤智基
Original Assignee
Tanaka Hiroyuki
Wakamura Tsunekichi
Tatefuji Tomoki
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0004—Homeopathy; Vitalisation; Resonance; Dynamisation, e.g. esoteric applications; Oxygenation of blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors

Definitions

  • the present invention relates to an NK (natural killer) activity enhancer.
  • the present invention also provides lymphocytes or mononuclear cells preferably used in cellular immunotherapy such as malignant tumors, specifically, lymphocytes or mononuclear cells whose NK activity has been enhanced by the NK activity enhancer (the present invention).
  • lymphocytes or mononuclear cells preferably used in cellular immunotherapy such as malignant tumors, specifically, lymphocytes or mononuclear cells whose NK activity has been enhanced by the NK activity enhancer (the present invention).
  • NK activity-enhancing lymphocytes or “NK activity-enhancing mononuclear cells”, respectively, and cell immunity preparations, infusions and blood preparations containing the NK activity-enhancing lymphocytes or mononuclear cells, and methods for preparing them.
  • NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity-enhancing mononuclear cells
  • NK cells are components of lymphocytes that have functions such as cytokine production and cytotoxic activity against tumor cells and virus-infected cells, and play an important role in early biological defense reactions and suppression of tumor metastasis and recurrence. It is known to fulfill. Interferons, interleukins, and the like have been known to function as biological response modifiers (biological response modifiers, hereinafter referred to as “BRM”) that induce the activation of NK cells.
  • BRM biological response modifiers
  • lymphocytes are taken out of the body, cultured in the presence of BRM, and then lymphokine-activated killer cells (hereinafter referred to as “LAK cells”).
  • LAK cells lymphokine-activated killer cells
  • Cellular immunotherapy in which this is prepared and then transfused into a patient is used (for example, see Non-Patent Documents 1 to 4). More specifically, as such cellular immunotherapy, circulating lymphocytes extracted in large quantities using a blood cell separator are activated with interferon- ⁇ in a collection bag for 30 minutes and then infused into a patient (IFNANK) ) Therapy can be exemplified.
  • IFNANK interferon- ⁇
  • Non-Patent Document 5 describes that oxygen nanobubbles have no direct action on the respiratory system and metabolic system and do not serve as a supply source of oxygen.
  • the present invention relates to a lymphocyte that exhibits a higher cellular immunotherapy effect by enhancing NK activity, a mononuclear cell containing the lymphocyte, a cell immunity preparation containing the NK activity-enhanced lymphocyte or mononuclear cell, and
  • the object is to provide a preparation method.
  • the present invention relates to a method for preparing an infusion or blood product using the NK activity-enhanced lymphocytes or mononuclear cells, or a cell immunologic product containing the lymphocytes or mononuclear cells, and the infusion solution or blood prepared by the method.
  • the purpose is to provide a formulation. *
  • nanobubble water containing fine bubbles having a number average particle size of 300 nm or less is enhanced with NK activity as in the conventional BRM.
  • lymphocytes with enhanced NK activity using the nanobubble water and mononuclear cells containing the same are targeted for various diseases such as malignant tumors and various infectious diseases.
  • Is effective as a cellular immunity preparation, and an infusion preparation or blood preparation containing lymphocytes or mononuclear cells with enhanced NK activity using the nanobubble water is useful in cellular immunotherapy I was convinced that
  • NK activity enhancer (I) An NK activity enhancer comprising, as an active ingredient, nanobubble water containing bubbles having a number average diameter determined by a dynamic light scattering method of 300 nm or less.
  • NK activity-enhancing lymphocytes NK activity-enhancing mononuclear cells, cell immunity preparations and preparation methods thereof
  • II-1 Presence of NK activity-enhancing agents described in (I-1) NK activity-enhanced lymphocytes, which are prepared by culturing under NK.
  • II-2) A method for preparing NK activity-enhancing lymphocytes, comprising culturing lymphocytes collected from a living body in the presence of the NK activity-enhancing agent described in (I-1).
  • II-3) NK activity-enhancing mononuclear cells prepared by culturing mononuclear cells containing lymphocytes collected from a living body in the presence of the NK activity-enhancing agent described in (I-1).
  • (II-4) A method for preparing NK activity-enhancing mononuclear cells, comprising culturing mononuclear cells containing lymphocytes collected from a living body in the presence of the NK activity-enhancing agent described in (I-1). .
  • (II-5) A cell immunity preparation containing the NK activity-enhancing lymphocyte or the NK activity-enhancing mononuclear cell described in (II-1).
  • (II-6) having a step of culturing lymphocytes or mononuclear cells containing lymphocytes from a living body in the presence of the NK activity enhancer described in (I-1); A method for the preparation of the cell immunity preparation described.
  • II-7) An NK activity-enhancing lymphocyte as described in (II-1), an NK activity-enhancing mononuclear cell as described in (II-3), or an infusion solution containing the cell immunity preparation as described in (II-5) Formulation.
  • NK activity enhancing blood preparation and preparation method thereof (III-1) Prepared by culturing blood containing at least lymphocytes collected from a living body in the presence of the NK activity enhancing agent described in (I-1) NK activity-enhancing blood product. (III-2) A method for preparing an NK activity-enhancing blood product, comprising culturing blood containing at least lymphocytes collected from a living body in the presence of the NK activity-enhancing agent described in (I-1).
  • the NK activity enhancer of the present invention comprising nanobubble water containing bubbles having a number average diameter of 300 nm or less determined by a dynamic light scattering method as an active ingredient, peripheral blood, bone marrow fluid of humans or mammals other than humans, or By culturing mononuclear cells or lymphocytes derived from umbilical cord fluid outside the body, its NK activity can be efficiently enhanced.
  • the mononuclear cells or lymphocytes thus prepared can be effectively used as a cellular immunotherapeutic agent for diseases such as cancer.
  • Experimental example 1 the result of having measured NK activity% of various test substances including oxygen nano bubble water is shown.
  • Experimental example 2 the result of having measured NK activity% of hydrogen nanobubble water, oxygen nanobubble water, and hydrogen and oxygen nanobubble water is shown (Table 5).
  • Experimental example 4 (2) the result of having measured NK activity% of sample A (oxygen nano bubble water), sample B (atmosphere nano bubble water), and sample C (oxygen nano bubble water) is shown.
  • Experimental Example 4 (3) the results of measuring NK activity% using IL-2 as a test substance in combination with the above test substance are shown.
  • NK activity enhancer The NK activity enhancer of the present invention is characterized in that nanobubble water containing fine bubbles having a number average diameter determined by a dynamic light scattering method of 300 nm or less is an active ingredient.
  • the type of air bubble is not particularly limited, and may be oxygen, hydrogen, or air (air) containing oxygen, carbon dioxide, nitrogen, and the like.
  • Nanobubble water containing fine oxygen bubbles is already known as “oxygen nanobubble”, for example, in JP-A-2005-246294 (Patent No. 4080440), including its production method.
  • nanobubble water containing fine hydrogen bubbles is already known as “hydrogen nanobubble”, for example, in WO99 / 10286 pamphlet (Japanese Patent No. 3349710), including its production method.
  • nanobubble water containing fine air bubbles is already known as “atmospheric nanobubbles”, for example, in JP-A-2008-246486, including its production method.
  • normal water, ultrapure water, electrolyzed water, alkaline water or acidic water using ion-exchanged water, and a solution obtained by adding inorganic ions to these, for example, applying ultrasonic waves or electrolysis Can generate nanobubbles.
  • oxygen nanobubble water is available from NAGA MRE Co., Ltd., product name ⁇ Naga no Tsuji '' or Japan autoimmune Co., Ltd.
  • the product name is “Beautiful water” and the hydrogen nano bubble water is sold by ND Aqua Co., Ltd. under the product name “Shin hydrogen water”.
  • the nanobubble water targeted by the present invention is nanobubble water including fine bubbles having a number average diameter of 300 nm or less determined by the dynamic light scattering method.
  • the number average diameter can be measured by subjecting nanobubble water to a dynamic light scattering particle size / particle size analyzer.
  • the detection preferably uses a heterodyne method.
  • the heterodyne method is a method for detecting a difference component between incident light and scattered light, unlike the homodyne method that detects only scattered light.
  • the number, particle size, and volume have the following relationship: Number: n1, n2, ..., ni, ..., nk Particle size: d1, d2, ..., di, ..., dk Volume: v1, v2, ..., vi, ..., vk.
  • the number average diameter MN ( ⁇ m) can be calculated by the following equation.
  • the nanobubble water targeted by the present invention may be fine bubbles having a number average diameter calculated by the above formula of 300 nm or less, but the number average diameter is preferably 200 nm or less, more preferably 100 nm or less.
  • the lower limit of the number average diameter is not particularly limited, but can usually be 0.01 nm or more.
  • the nanobubble water targeted by the present invention is preferably fine bubbles having a volume average diameter MV ( ⁇ m) calculated by the following formula of 400 nm or less.
  • the volume average diameter is 200 nm or less, and more preferably 100 nm or less.
  • the lower limit of the volume average diameter is not particularly limited, but can usually be 0.01 nm or more.
  • the nanobubble water of the present invention is preferably a fine bubble having a standard deviation SD calculated by the following formula of 0.08 ⁇ m or less for the volume average diameter and 0.110 ⁇ m or less for the number average diameter.
  • SD standard deviation
  • the standard deviation (SD) here is a measure of the distribution width of the bubble distribution, and is a concept different from the statistical standard deviation (statistical error).
  • Such nanobubble water is NK activity (cytotoxic activity) by culturing lymphocytes or mononuclear cells containing lymphocytes collected from a living body in the presence of the nanobubble water, as shown in the experimental examples described later. Therefore, it can be effectively used as an NK activity enhancer.
  • NK activity means cytotoxic activity. Preferably, it has an activity of specifically damaging cancer cells without damaging normal cells. Such “NK activity” can be evaluated by measuring cytotoxic activity against cancer cells such as K562 cells derived from human chronic myeloid leukemia, as shown in the following experimental examples.
  • NK activity-enhanced lymphocytes, NK activity-enhanced mononuclear cells and methods for preparing them are lymphocytes and mononuclear cells sorted from the living body, respectively. Can be prepared by culturing in the presence of the aforementioned NK activity enhancer.
  • the lymphocytes used for culture can be prepared from blood obtained by collecting blood from a living body.
  • blood means a blood component containing lymphocytes, for example, whole blood or mononuclear cells.
  • the blood may be peripheral blood, umbilical cord blood, or bone marrow fluid.
  • PBMC mononuclear cells
  • examples of the target organism from which blood is collected include humans and mammals other than humans.
  • blood of the same animal species as that of the cell immunotherapy is used in principle.
  • NK activity-enhancing lymphocytes and mononuclear cells used for human cellular immunotherapy are prepared from human-derived blood.
  • lymphocytes from blood is performed using the specific gravity centrifugation method (B ⁇ yum, A., Separation of leucocytes from Blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21, suppl. 97 (1968)).
  • cultivation can be prepared from the blood containing the mononuclear cell acquired by blood collection from the biological body similarly to a lymphocyte.
  • Separation of lymphocytes and mononuclear cells by this specific gravity centrifugation method is performed using Lymphoprep (registered trademark) (manufactured by Axis-Shield), Ficoll-Paque PLUS (manufactured by Amersham), etc. (Trademark) tube (made by Axis-Shield) etc., and blood component separation apparatuses (for example, the product made by Amco Co., Ltd.) etc. can be used for easy implementation.
  • Lymphoprep registered trademark
  • the sorted lymphocytes or mononuclear cells can be obtained by using a medium suitable for culturing lymphocytes and mononuclear cells such as RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium, AIM-V medium, DMEM medium, IMDM medium, etc.
  • the concentration is adjusted to, for example, about 0.5 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably about 1 to 3 ⁇ 10 6 cells / ml, more preferably about 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the cell concentration can be measured using a hemocytometer.
  • the lymphocyte solution or the mononuclear cell solution thus prepared can be used as a lymphocyte culture stock solution or a mononuclear cell culture stock solution, respectively, which can be diluted and used as a lymphocyte solution or a mononuclear cell solution having a desired concentration. .
  • examples of the medium used for the culture include those suitable for lymphocyte and mononuclear cell culture, such as RPMI-1640 medium, AIM-V medium, DMEM medium, and IMDM medium.
  • RPMI-1640 medium Preferably, it is RPMI-1640 medium.
  • a general cell culture method is used for the culture. For example, in a CO 2 incubator, it is usually performed by adjusting the CO 2 concentration to about 1 to 10% by volume, particularly about 5% by volume, and adjusting the temperature to about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. .
  • NK activity enhancer that is, nanobubble water containing fine bubbles having a number average diameter determined by a dynamic light scattering method of 300 nm or less.
  • NK activity-enhancing lymphocytes NK activity-enhancing mononuclear cells.
  • the presence or absence of induction or enhancement of NK activity (enhancement of NK activity) in lymphocytes or mononuclear cells is determined by cytotoxicity against cancer cells such as K562 cells derived from human chronic myeloid leukemia, as shown in the experimental examples described later. It can be evaluated by measuring the activity.
  • the culture conditions described above can be used in the same manner for the culture for inducing and enhancing the NK activity.
  • the culture time is not particularly limited as long as it can achieve induction or enhancement of NK activity. Usually, it can be appropriately set in the range of several hours to several weeks, specifically, for example, in the range of 10 hours to 4 weeks. Within this range, for example, 10 to 30 hours may be selected, or 2 to 4 weeks may be selected.
  • the concentration of lymphocytes or mononuclear cells in the medium is usually about 0.5 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably about 1 to 3 ⁇ 10 6 cells / ml, more preferably 2 ⁇ 10 6 cells. About / ml can be mentioned.
  • the concentration of nanobubble water in the medium is usually 1 to 99% by volume, preferably 15 to 95% by volume, and more preferably 15 to 65% by volume.
  • NK activity-enhanced lymphocytes or NK activity-enhanced mononuclear cells can be prepared, the prepared NK activity-enhanced lymphocytes or mononuclear cells are further used in a physiological state that does not contain nanobubble water. It is preferable to culture under specific cell conditions.
  • bacteria, endotoxin and the like are not mixed in the culture solution after culturing.
  • the presence or absence of bacteria can be examined by a colony formation assay, and the presence or absence of endotoxin can be examined by a colorimetric method such as a commercially available ELISA or a turbidimetric method such as a Limulus test.
  • the NK activity-enhanced lymphocytes or NK activity-enhanced mononuclear cells thus obtained have induced and enhanced NK activity, and are useful as active ingredients in cell immunity preparations effective for the prevention and treatment of tumors and various infectious diseases. is there. Therefore, the present invention also provides a cell immunization preparation containing such NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity-enhancing mononuclear cells as an active ingredient.
  • (III) Cell immunity preparation and infusion preparation Malignant tumor by formulating the above-mentioned NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity-enhancing mononuclear cells in a form suspended in an infusion physiological saline containing human albumin, for example. (Cancer) or a cellular immunity preparation for preventing or treating various infectious diseases.
  • cell immunity preparation refers to a preparation containing the above-mentioned NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity-enhancing mononuclear cells and exhibiting a biological defense function based on the enhanced (induced / enhanced) NK activity. means.
  • the form is not particularly limited.
  • NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity-enhancing mononuclear cells may be suspended in a suitable solution.
  • NK activity-enhancing lymphocytes or NK activity may be added to a physiological saline solution containing human albumin as described above.
  • Infusion preparations infusion preparations in a form in which enhanced mononuclear cells are suspended are preferred, but are not limited thereto.
  • Such cellular immunity preparations can be widely used for the prevention (including prevention of recurrence) and treatment of patients with malignant tumors (cancer patients), immunodeficiency patients, autoimmune diseases, allergic patients, and various infectious disease patients. it can. Preferably, it is used for prevention and treatment of malignant tumor patients (cancer patients).
  • malignant tumors that is, cancers include lung cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectal cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, uterine cancer, testicular cancer, prostate cancer, leukemia, sarcoma, brain tumor and the like.
  • immunodeficiency include congenital and acquired immune deficiencies.
  • congenital immunodeficiencies include severe combined immunodeficiency, Wiscott Aldrich syndrome, adenosine deaminase deficiency, purine nucleotide phosphorylase deficiency, etc., but are not limited to these immunodeficiencies. .
  • Examples of acquired immunodeficiencies include secondary immunodeficiency due to the use of anticancer agents, immunosuppressive agents, steroids, etc., and AIDS due to infection with human immunodeficiency virus. It is not limited to the disease.
  • Examples of autoimmune diseases include systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, pernicious anemia, and Hashimoto's disease, but are not limited to these autoimmune diseases. .
  • the cellular immunity preparation of the present invention can be used prophylactically or therapeutically not only for patients with reduced immunity but also for patients who lack or have reduced immunity against specific viruses. It is.
  • allergic diseases include bronchial asthma, cedar pollinosis, urticaria, etc., but are not limited to these allergic diseases, and are used to treat various allergies or reduce symptoms. It is also possible to do.
  • infectious diseases include viral infections, bacterial infections, fungal infections, protozoal infections, chlamydia infections, mycoplasma infections, and the like.
  • viral infections include cytomegalovirus, Epstein-Barr virus infection and the like, but are not limited to these viral infections, and various other viral infections such as influenza It can also be widely used for the prevention and treatment of infectious diseases caused by herpes viruses such as viruses, herpes simplex viruses, and varicellozoster viruses, or various retroviruses such as human leukemia viruses and human immunodeficiency viruses.
  • the above bacterial infections can be used for those caused by Pseudomonas aeruginosa, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, etc.
  • infections caused by bacteria that are pathogenic to humans may also be used. It can be used for any infection.
  • the dosage of such cell immunity preparation and infusion preparation can be appropriately selected depending on the patient's condition, treatment subject, etc., but is usually converted into the number of cells such as NK activity-enhancing lymphocytes or mononuclear cells per kg body weight. Examples include 1 ⁇ 10 2 cells to 1 ⁇ 10 10 cells. The range is preferably 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 9 cells.
  • the administration form of the cell immunity preparation preferably has a liquid form so that it can be applied as an injection in addition to an infusion such as an infusion preparation. More preferred is an injection or instillation in which NK activity-enhancing lymphocytes or mononuclear cells are dispersed in physiological saline formulated so that human serum albumin is 0.01 to 5%.
  • the amount of liquid to be administered varies depending on the administration method, the place of administration, etc., but is preferably 1 to 500 ml, and more preferably the amount of cells is contained in this liquid volume.
  • the NK activity-enhancing blood product of the present invention is prepared by culturing blood containing at least lymphocytes collected from a living body in the presence of the aforementioned NK activity-enhancing agent. can do.
  • the blood may be peripheral blood, umbilical cord blood, or bone marrow fluid.
  • Peripheral blood is preferred for ease of acquisition. Further, it may be anything as long as it contains at least lymphocytes, and is not necessarily whole blood. For example, it may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC) obtained from peripheral blood.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Peripheral blood mononuclear cells can be prepared from blood collected from a living body using the specific gravity centrifugation method described in (II).
  • target organisms for collecting blood include humans and mammals other than humans.
  • blood of the same animal species as that of the cell immunotherapy is used in principle.
  • it is a human.
  • the inside of the syringe that collects blood is coated with a blood coagulation inhibitor such as heparin, or about 50 units of blood coagulation inhibitor is added to 1 ml of whole blood. It is necessary to take measures to prevent clotted blood from coagulating.
  • a blood coagulation inhibitor such as heparin
  • the culture for enhancing the NK activity can be performed by the same method as the culture described in (II) above.
  • the collected peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are in the presence of nanobubble water containing fine bubbles having a number average diameter of 300 nm or less determined by the above-mentioned NK activity enhancer, that is, the dynamic light scattering method.
  • the cell concentration is, for example, about 0.5 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably Serum or plasma that has been inactivated so that the volume ratio is about 5 to 10%, adjusted to about 1 to 3 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably about 2 ⁇ 10 6 cells / ml And a method of culturing using the one to which is added.
  • the concentration of nanobubble water used during the culture is usually 1 to 99% by volume, preferably 15 to 95% by volume, more preferably 15 to 65% by volume.
  • a general cell culture method is used for the culture. For example, in a CO 2 incubator, it is usually performed by adjusting the CO 2 concentration to about 1 to 10% by volume, particularly about 5% by volume, and adjusting the temperature to about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. .
  • the NK activity of collected blood can be induced and enhanced.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the presence or absence of induction or enhancement of the NK activity can be evaluated by measuring cytotoxic activity against cancer cells such as K562 cells derived from human chronic myeloid leukemia, as shown in the experimental examples described later.
  • bacteria, endotoxin and the like are not mixed in the culture solution after culturing.
  • the presence or absence of bacteria can be examined by a colony formation assay, and the presence or absence of endotoxin can be examined by a colorimetric method such as a commercially available ELISA or a turbidimetric method such as a Limulus test.
  • PBMC prepared in this way As an NK activity-enhancing blood product, it is necessary to remove the medium and NK activity-enhancing agent used for the culture following the above culture. These removals can be performed by transferring the culture solution obtained in the above culture to a sterilized centrifuge tube and centrifuging at 1200 rpm for about 8 minutes at room temperature.
  • the target PBMC can be recovered as a precipitate separated from the supernatant containing the NK activity enhancer and the medium.
  • the recovered PBMC is preferably further washed with physiological saline twice or more in order to sufficiently remove the medium and the NK activity enhancer.
  • the washed PBMC is prepared with physiological saline so that the cell concentration is 1.2 to 1.2 ⁇ 10 9 cells / ml, preferably 1.2 ⁇ 10 to 1.2 ⁇ 10 8 cells / ml, so that the NK of the present invention is prepared.
  • An activity-enhanced blood product can be obtained.
  • the blood product with enhanced NK activity can be used immediately after production, or at a low temperature of about 4 ° C. to 6 ° C. for a predetermined period, or at a very low temperature (about ⁇ 80 ° C.) by adding a preservative solution or liquid nitrogen. It can be stored for a long period of several years.
  • a preservative solution or liquid nitrogen it can be stored for a long period of several years.
  • the preservation solution it is convenient to use a commercially available activated lymphocyte preservation solution. For example, bun bunker (Nippon Genetics), CM bunker II (Cosmo Bio) can be used.
  • RPMI-1640 medium used in the following experimental examples are as follows: RPMI-1640 medium (0.03% glutamine, 10% FBS, 100 U / ml penicillin-100 ⁇ g / ml streptomycin, 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) included).
  • the RPMI-1640 medium used was Sigma-Aldrich Japan, FBS (fetal bovine serum) was purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., penicillin, streptomycin and NEAA were all purchased from Invitrogen Corporation.
  • the particle size of nanobubbles contained in nanobubble water was measured by Nikkiso Co., Ltd. Higashimurayama Seisakusho, dynamic light scattering particle size and particle size analyzer Nanotrac UPA-UT151 (light source: semiconductor laser) 780 nm, detector: silicon photodiode), manufactured by Nikkiso Co., Ltd.).
  • cancer cells K562 cells derived from human chronic myeloid leukemia: American Type Culture Collection
  • labeled cancer cells a fluorescent substance (Europium: Eu 3+ )
  • the cells are mixed with the lymphocytes cultured as described above, and further cultured for 4 hours under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using RPMI-1640 medium.
  • the mixing ratio (E / T ratio) of lymphocytes (E: effector cells) and labeled cancer cells (T: target cells) is 40: 1.
  • the amount of the fluorescent substance (Eu 3+ ) released from the labeled cancer cell into the culture solution was measured by a time-resolved fluorescence measurement method (DELFIA Research Fluorometer: Pharmacia Biotech).
  • the liberation rate (%) is calculated. This release rate (%) is defined as the degree to which the labeled cancer cells are damaged by lymphocytes, that is, NK activity (%).
  • Maximum release amount The amount of fluorescent substance released when all the labeled cancer cells are artificially destroyed.
  • Spontaneous release amount The amount of fluorescent substance released from the labeled cancer cells when lymphocytes are not added (background value)
  • test substance (a) Oxygen nanobubble water, (b) organic germanium powder, and (c) Hanabiratake prepared by the following method were used as test substances.
  • test substances (b) and (c) are substances that have been reported to have NK cell activity (see JP-A-10-330207 and JP-A-2004-292415).
  • test substances For these test substances, as a preliminary test, endotoxin measurement by turbidimetric method (using Toxinometer MT-358: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the 15th revised Japanese Pharmacopoeia Manual Endotoxin Test Method (B427-448) Manufactured), and cancer cells (K562 cells) were tested, and it was confirmed that the test substance does not contain endotoxin and does not have an action of damaging cancer cells. In both tests, each test substance was used by adjusting to the same concentration as when measuring NK activity.
  • 500 ml of oxygen nanobubble water product name: Naga no Tsuji) (expiration date: September 20, 2008) (raw water) sold by NAGA MRE Co., Ltd. was used.
  • the raw water was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter and used for the test. Specifically, a mixture of raw water and medium and diluted raw water 6 times during culture (containing 16.7% of raw water) is set to the test concentration “1 time”. The diluted sample (containing 1.67% of raw water) was used as the test concentration “1/10”.
  • the dynamic light scattering method detection method: heterodyne method
  • the above apparatus employs a frequency analysis method (FFT-power spectrum method) as an analysis method. That is, a power spectrum obtained by fast Fourier transform of the autocorrelation function of the scattering intensity is obtained, and this power spectrum is converted into a particle size distribution by a log linear scale algorithm.
  • FFT-power spectrum method a frequency analysis method
  • ⁇ Calculation method of volume average diameter (MN)> Assume a population of powders. In this order, particles having particle diameters ( ⁇ m) of d1, d2,..., Di,. Suppose there are nk. Further, the volume ( ⁇ m 3 ) per particle is assumed to be v1, v2,..., Vi,. That is, the number, particle diameter, and volume have the following relationship. Number: n1, n2, ..., ni, ..., nk Particle size: d1, d2, ..., di, ..., dk Volume: v1, v2, ..., vi, ..., vk.
  • the volume average diameter MV ( ⁇ m) can be calculated by the equation described in [Expression 2].
  • the number average diameter MN ( ⁇ m) can be calculated by the formula described in [Expression 1] described above.
  • Hanabiratake A dry powder product (Hanaburatake 100: trade name) purchased from Mineta Co., Ltd. was used as Hanabiratake. This was suspended in RPMI-1640 medium and dissolved by stirring at room temperature for 1 hour. This was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter, and then RPMI-1640 The culture medium was diluted to a final concentration of 0.022 mg / ml and used for the test.
  • the concentration of the above organic germanium powder and Hanabiratake is the concentration when the blood volume of a standard human (body weight 60 kg) is 4.5 L, and the daily dose of 100 mg is absorbed into 100% phlebotomy (0.022 mg / ml) as a standard, the final concentration during culture was adjusted to this concentration.
  • NK activity of lymphocytes treated with test substance was measured. Specifically, first, the specific gravity centrifugation (B ⁇ yum, A., Scand. JClin. Lab. Invest.) was performed from the peripheral blood of one subject (male in their 60s) (used within 30 hours after whole blood collection). , 21, suppl. 97 (1968)) was used to separate the lymphocyte layer, and then a lymphocyte solution having a constant concentration (culture concentration: 2 ⁇ 10 6 cells / ml) was prepared.
  • IL-2 human recombinant: manufactured by PEPROTECH
  • OK-432 anti-neoplastic agent: Picibanil, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Table 1 Substances (concentrated in the table (1 time) and 1/10 concentration (1/10 time)) were added and cultured for 20 hours.
  • cancer cells K562 cells labeled with a fluorescent substance (Eu 3+ ) were added, and further cultured for 4 hours.
  • the amount of the fluorescent substance released in the culture solution was measured by time-resolved fluorescence measurement, and the ratio of injured cancer cells was determined from the release rate (%), and the NK activity (%) was calculated.
  • the NK activity of the control was 4.6%, but 31.0% or 41.9% by adding IL-2 or antineoplastic agent (OK-432), respectively.
  • IL-2 or antineoplastic agent OK-432
  • IL-2 or an antineoplastic agent OK-432
  • IL-2 or an antineoplastic agent induces and enhances NK activity (enhancement of NK activity).
  • oxygen nanobubble water (sample D) is 7.4%, which is lower than IL-2 or OK-432, but significantly induces NK activity of lymphocytes by 1.6 times compared to control. ⁇ It was confirmed that it was increasing. From this, it was found that water containing oxygen nanobubbles having a number average diameter of less than 300 nm (enzyme nanobubble water) has a function of inducing and enhancing NK activity of lymphocytes.
  • mice were treated in the same manner as in Experimental Example 1 using hydrogen nanobubble water instead of NK activity-enhancing oxygen nanobubble water using hydrogen nanobubble water, and NK activity of lymphocytes was measured.
  • test substance Hydrogen nanobubble water Hydrogen nanobubble water produced by ND Aqua Co., Ltd. obtained from electrolysis as hydrogen nanobubble water (trade name: “true hydrogen water”, expiration date 12/12/2008, lot number 2008.12.12) (raw water) was used.
  • the raw water was sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter and used for the test. Specifically, a mixture of raw water and medium and diluted raw water 6 times during culture (containing 16.7% of raw water) is set to the test concentration “1 time”. The diluted sample (containing 1.67% of raw water) was used as the test concentration “1/10”.
  • hydrogen bubbles in alkaline ionized water obtained by electrolysis are 3 to 200 nm, and hydrogen nanobubble water is known to have bubbles with a diameter of 200 nm or less (“Science of Electrolytic Alkaline Water”, Water Research Society Bulletin, No.8, p.5 (2001)).
  • the hydrogen nanobubble water is used as a pre-inspection for endotoxin measurement by turbidimetry in accordance with the 15th revised Japanese Pharmacopoeia Manual Endotoxin Test Method (B427-448) (using Toxinometer MT-3568: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Manufactured), and cancer cells (K562 cells) were tested, and it was confirmed that the test substance itself did not contain endotoxin and did not have any action of damaging cancer cells. In both tests, the hydrogen nanobubble water was used so as to have the same concentration as in the NK activity measurement.
  • lymphocytes treated with test substance hydrophilicity of lymphocytes treated with test substance
  • the NK activity of lymphocytes treated with the test substance was measured according to the method described in Experimental Example 1 (1). Specifically, first, lymphocytes were obtained from the peripheral blood (used within 30 hours after whole blood collection) of two subjects (male in their 50s: subject 1, male in their 60s: subject 2) using specific gravity centrifugation. After separating the layers, a lymphocyte solution having a constant concentration (concentration during culture: 2 ⁇ 10 6 cells / ml) was prepared.
  • IL-2 human recombinant: manufactured by PEPROTECH
  • OK-432 antimalignant tumor agent: Pisibanil, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Hydrogen nanobubble water or oxygen nanobubble water was added and cultured for 20 hours (the culture conditions were the same as those described in Experimental Example 1 (1)).
  • cancer cells K562 cells
  • a fluorescent substance Eu 3+
  • the amount of the fluorescent substance released in the culture solution was measured by time-resolved fluorescence measurement, the ratio of damaged cancer cells was determined from the obtained release rate (%), and the NK activity (%) was calculated.
  • NK activity enhancing action As a result, as shown in Table 4 and Table 5, although it does not reach IL-2 or OK-432, NK activity is induced in hydrogen nanobubble water as well as oxygen nanobubble water confirmed in Experimental Example 1. It has been confirmed that there is an enhancing action (NK activity enhancing action), and even if hydrogen nanobubble water and oxygen nanobubble water are used in combination, their NK activity enhancing effect is maintained without being impaired. Specifically, for hydrogen nanobubble water, NK activity increased about 1.5 times or more for subject 1 (Table 4: sample A) and about 1.3 times for subject 2 (Table 5: sample A) compared to control. It was. For oxygen nanobubble water, an increase in NK activity of 1.4 times or more was obtained (Table 4: Sample B).
  • Experimental Example 3 Enhancement of NK Activity Using Atmospheric Nano-Bubbled Water Lymphocytes were treated in the same manner as in Experimental Example 1 using atmospheric nano-bubble water instead of oxygen nano-bubble water, and NK activity of lymphocytes was measured.
  • test substance atmospheric nanobubble water
  • Atmospheric nanobubble water (lot number 08121602) (raw water) manufactured by Japan ijk Co., Ltd. was used as the atmospheric nanobubble water.
  • the atmosphere contains about 78% nitrogen, about 20.9% oxygen, and about 0.03% carbon dioxide.
  • air Oshinomura, Yamanashi Prefecture
  • FCS500 Series polypropylene + urethane hollow fiber membrane, filtration accuracy 0.01 ⁇ , removal efficiency 99.99% filter
  • the raw water was sterilized by filtration with a 0.22 ⁇ m filter and used for the test. Specifically, the raw water and culture medium are mixed and diluted 6-fold in raw water (containing 16.7% of raw water) to a test concentration of “1 ⁇ ”. The raw water and culture medium are mixed and the raw water is 60-fold in culture. The diluted one (containing 1.67% raw water) was used as the test concentration “1/10”.
  • the air nanobubble water is used as a preliminary test. Endotoxin measurement by the turbidimetric method (using Toxinometer MT-3568: Wako Pure Chemical Industries, in accordance with the 15th revised Japanese Pharmacopoeia Manual Endotoxin Test Method (B427-448) Manufactured), and cancer cells (K562 cells) were tested to confirm that no endotoxin was contained in the atmospheric nanobubble water itself and that it did not have any action of damaging cancer cells. In both tests, the atmospheric nanobubble water was used by adjusting so as to have the same concentration as in the NK activity measurement.
  • NK activity of lymphocytes treated with test substance (atmospheric nanobubble water)
  • test substance atmospheric nanobubble water
  • NK activity of lymphocytes treated with the above test substance was measured. . Specifically, first, the lymphocyte layer was separated from peripheral blood (used within 30 hours after whole blood collection) of (seven healthy men and women: average age 47.3 ⁇ 13.7 years old) using specific gravity centrifugation. Thereafter, a lymphocyte solution having a constant concentration (culture concentration: 2 ⁇ 10 6 cells / ml) was prepared using a medium containing 65% atmospheric nanobubble water.
  • the lymphocytes thus prepared were cultured for 20 hours (culture conditions are the same as those described in Experimental Example 1 (1)). After culturing for 20 hours, cancer cells (K562 cells) labeled with a fluorescent substance (Eu 3+ ) were added and further cultured for 4 hours (the culture conditions were the same as those described in Experimental Example 1 (1)). After the culture, the amount of the fluorescent substance released in the culture solution was measured by time-resolved fluorescence measurement, and the ratio of the injured cancer cells was determined from the obtained release rate (%), and the NK activity (%) was calculated.
  • the atmospheric nanobubble water also has an action to induce and enhance NK activity (NK activity enhancing action), similar to the oxygen nanobubble water confirmed in Experimental Example 1 and the hydrogen nanobubble water confirmed in Experimental Example 2. It was confirmed.
  • nanobubble medium RPMI-1640 medium (pH 7.2) (this is referred to as “nanobubble medium”), after sterilizing by filtration with a 0.22 ⁇ m filter, Used for testing.
  • the content of nanobubble water in each nanobubble medium used during lymphocyte culture is 65% by volume.
  • lymphocyte layers were obtained from the peripheral blood (used within 30 hours after whole blood collection) of 7 subjects (7 healthy men and women: average age 47.3 ⁇ 13.7 years old) using specific gravity centrifugation. Then, a lymphocyte solution having a constant concentration (culture concentration: 2 ⁇ 10 6 cells / ml) was prepared.
  • the lymphocytes thus prepared were cultured for 20 hours using the above-mentioned various nanobubble media (nanobubble media A to C) (culture conditions are the same as those described in Experimental Example 1 (1)).
  • cancer cells K562 cells labeled with a fluorescent substance (Eu 3+ ) were added and further cultured for 4 hours (the culture conditions were the same as those described in Experimental Example 1 (1)).
  • the amount of the fluorescent substance released in the culture solution was measured by time-resolved fluorescence measurement, and the ratio of the injured cancer cells was determined from the obtained release rate (%), and the NK activity (%) was calculated.
  • NK activity (%) was calculated in the same manner using a medium not containing nanobubble water (RPMI-1640 medium (pH 7.2)) instead of nanobubble medium.
  • the average value (control value) of NK activity (%) of 7 persons is 36.5 ⁇ 15.0 (mean ⁇ standard deviation)%, and any nanobubble water (nanobubble water A to C) increases NK activity.
  • the relative ratio (%) when the NK activity (control value) of the control is 100% is shown in FIG.
  • any nanobubble water containing fine bubbles (oxygen, hydrogen, air) with a number average diameter of less than 300 nm increased NK activity by 1.2 to 1.3 times compared to the control without nanobubble water.
  • NK activity was allowed to.
  • lymphocytes isolated from the above seven subjects were cultured in a medium containing the above-mentioned IL-2 (0-50 ng / ml) (RPMI-1640 medium (pH 7.2)) or IL-2 (0- Culture was performed for 20 hours using the above-mentioned various nanobubble media (nanobubble media A to C) containing 50 ng / ml) (the culture conditions were the same as those described in Experimental Example 1 (1)). After culturing for 20 hours, cancer cells (K562 cells) labeled with a fluorescent substance (Eu 3+ ) were added and further cultured for 4 hours (the culture conditions were the same as those described in Experimental Example 1 (1)). After the culture, the amount of the fluorescent substance released in the culture solution was measured by time-resolved fluorescence measurement, and the ratio of the injured cancer cells was determined from the obtained release rate (%), and the NK activity (%) was calculated.
  • IL-2 RPMI-1640 medium (pH 7.2)
  • IL-2 IL-2
  • the concentration-response curve is shown in FIG.
  • the vertical axis represents NK activity (%) (average of 7 subjects), and the horizontal axis represents IL-2 concentration (ng / ml). From these results, it was found that NK activity increases when IL-2 is used in combination with the nanobubble water rather than IL-2 alone. While IL-2 is known as a biological response modifier (BRM) in cellular immunotherapy, its side effects have also been reported. According to the cellular immunotherapeutic agent comprising nanobubble water of the present invention as an active ingredient, the combined use with IL-2 supplements the NK cell activation function of IL-2. As a result, the amount of IL-2 used It is considered that side effects caused by IL-2 can be reduced.

Abstract

【課題】ＮＫ活性増強剤、悪性腫瘍等の細胞免疫療法において好適に使用されるＮＫ活性が増強されたリンパ球または単核球（「ＮＫ活性増強リンパ球」または「ＮＫ活性増強単核球」）、並びに当該ＮＫ活性増強リンパ球または単核球を含む細胞免疫製剤、輸液および血液製剤、並びにこれらの調製方法を提供する。 【解決手段】　ＮＫ活性増強剤として動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の気泡を含むナノバブル水を用いる。ＮＫ活性増強リンパ球または単核球は、生体から分取したリンパ球または単核球を、上記ＮＫ活性増強剤の存在下で培養することによって調製される。

Description

ＮＫ活性増強剤およびその利用
　本発明は、ＮＫ（ナチュラルキラー）活性増強剤に関する。また本発明は、悪性腫瘍等の細胞免疫療法において好適に使用されるリンパ球または単核球、具体的には上記ＮＫ活性増強剤でＮＫ活性が増強されたリンパ球または単核球（本発明ではこれらをそれぞれ「ＮＫ活性増強リンパ球」または「ＮＫ活性増強単核球」という）、並びに当該ＮＫ活性増強リンパ球または単核球を含む細胞免疫製剤、輸液および血液製剤、並びにこれらの調製方法に関する。
ＮＫ細胞は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞に対してサイトカイン産生や細胞傷害活性等の機能を有するリンパ球の成分であり、初期の生体防御反応や、腫瘍の転移及び再発の抑制において重要な役割を果たすことが知られている。インターフェロンやインターロイキンなどは、従来よりこのＮＫ細胞の活性化を誘導する生体応答調節剤（バイオロジカル・レスポンス・モディファイアー：以下、「ＢＲＭ」）ともいう）として機能することが知られており、これまで様々な研究が行われている。
　これらの研究結果をもとに、悪性腫瘍治療の現場では、体外にリンパ球を取り出して、ＢＲＭの存在下で培養してリンホカイン活性化キラー細胞（lymphokine activated cells:以下、「LAK細胞」ともいう）を調製した後、これを患者に輸注する「細胞免疫療法」が利用されている（例えば、非特許文献１～４等参照）。かかる細胞免疫療法として、より具体的には、血球分離装置を用いて大量に取り出した循環リンパ球を、採取バック内でインターフェロン－αと共に30分間活性化させた後、患者に輸注するイフナンク（IFNANK）療法を例示することができる。
　このように、ＮＫ細胞を含むリンパ球の増加・活性化を誘導するＢＲＭを用いた細胞免疫療法は種々実施され、また提案されているが（例えば、特許文献１～４）、必ずしも満足のいく治療効果が得られていないのが現状であり、副作用の報告もあることから、より有効で且つ安全な細胞免疫療法が求められている。
　一方、近年、直径が１μｍ未満の微細気泡（ナノバブル）を含むナノ流体の生体に対する機能が注目されており、例えば特許文献５には、ナノバブル水の効用として疾病の回復、細菌やウイルス等による感染症の予防、および皮膚病の回復等の生物に対する生理活性作用が挙げられている。その一方で、非特許文献５には、酸素ナノバブルは呼吸器系や代謝系には直接的な作用はないこと、酸素の供給源にならないことが記載されている。
特開2000-245451号公報 WO2001/029191 特開2001-314183号公報 特開2002-255849号公報 特開2005-246294号公報
J.Clin.Oncol.1989;7:250-261 J.Immunol.1989;142:4520-4526 J.Immunol.1991;146:1700-1707 Biotherapy 1998;11:241-253 "マイクロバブル・ナノバブルの最新技術"、310-311頁、シーエムシー出版（2007）
　本発明は、ＮＫ活性が増強されることによって、より高い細胞免疫治療効果を発揮するリンパ球およびこれを含む単核球、並びに当該ＮＫ活性増強リンパ球または単核球を含む細胞免疫製剤およびその調製方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記ＮＫ活性増強リンパ球若しくは単核球、または当該リンパ球若しくは単核球を含む細胞免疫製剤を用いた輸液や血液製剤の調製方法、および当該方法で調製された輸液または血液製剤を提供することを目的とする。　
上記課題の下、本発明者らが鋭意検討を重ねたところ、動的光散乱法において個数平均粒径が300nm以下の微細気泡を含むナノバブル水に、従来のＢＲＭと同様に、ＮＫ活性を増強させる作用があることを見出し、かかる知見に基づいて、さらに当該ナノバブル水を用いてＮＫ活性が増強されたリンパ球およびそれを含む単核球が、悪性腫瘍や各種感染症などの各種疾患を対象とした細胞免疫療法において、細胞免疫製剤として有効であること、また当該ナノバブル水を用いてＮＫ活性が増強されたリンパ球または単核球を含有する輸液製剤または血液製剤が、細胞免疫療法において有用であることを確信した。
　本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的な実施態様を含む：
（Ｉ）ＮＫ活性増強剤
（I-1）動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の気泡を含むナノバブル水を有効成分とする、ＮＫ活性増強剤。
（II）ＮＫ活性増強リンパ球、ＮＫ活性増強単核球、細胞免疫製剤およびその調製方法
（II-1）生体から分取したリンパ球を（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強リンパ球。
（II-2）生体から分取したリンパ球を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、ＮＫ活性増強リンパ球の調製方法。
（II-3）生体から分取したリンパ球を含む単核球を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強単核球。
（II-4）生体から分取したリンパ球を含む単核球を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、ＮＫ活性増強単核球の調製方法。
（II-5）（II-1）に記載するＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を含有する細胞免疫製剤。
（II-6）生体から分取したリンパ球またはリンパ球を含む単核球を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、（II-5）に記載する細胞免疫製剤の調製方法。
（II-7）（II-１）に記載するＮＫ活性増強リンパ球、（II-3）に記載するＮＫ活性増強単核球、または（II-5）に記載する細胞免疫製剤を含有する輸液製剤。
（III）ＮＫ活性増強血液製剤およびその調製方法
（III-1）生体から分取した少なくともリンパ球を含む血液を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強血液製剤。
（III-2）生体から分取した少なくともリンパ球を含む血液を、（I-1）に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、ＮＫ活性増強血液製剤の調製方法。
　動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の気泡を含むナノバブル水を有効成分とする本発明のＮＫ活性増強剤を用いて、ヒトやヒト以外の哺乳動物の末梢血、骨髄液または臍帯液に由来する単核球またはリンパ球を体外で培養することで、そのＮＫ活性を効率よく増強することができる。斯くして調製される単核球またはリンパ球は、ガンなどの疾病の細胞免疫療法剤として有効に使用することができる。
実験例１において、酸素ナノバブル水を始めとする各種被験物質のＮＫ活性％を測定した結果を示す。 実験例２において、水素ナノバブル水、酸素ナノバブル水、および水素と酸素のナノバブル水のＮＫ活性％を測定した結果を示す（表５）。 実験例４（２）において、サンプルＡ（酸素ナノバブル水）、サンプルＢ（大気ナノバブル水）、及びサンプルＣ（酸素ナノバブル水）のＮＫ活性％を測定した結果を示す。 実験例４（３）において、被験物質としてＩＬ－２と上記被験物質を併用してＮＫ活性％を測定した結果を示す。
（Ｉ）ＮＫ活性増強剤
　本発明のＮＫ活性増強剤は、動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の微細気泡を含むナノバブル水を有効成分とすることを特徴とする。
　ここで対象とする気泡は、その種類を特に制限するものではなく、酸素でも、水素でも、また酸素、二酸化炭素および窒素等を含む大気（空気）であってもよい。酸素の微細気泡（いわゆる酸素ナノバブル）を含むナノバブル水は「酸素ナノバブル」として、例えば特開2005-246294号公報（特許第4080440号）において、その製造方法も含めて既に公知である。また、水素の微細気泡（いわゆる水素ナノバブル）を含むナノバブル水は「水素ナノバブル」として、例えばWO99/10286パンフレット（特許第3349710号）において、その製造方法も含めて既に公知である。さらに大気の微細気泡（いわゆる大気ナノバブル）を含むナノバブル水は「大気ナノバブル」として、例えば特開2008-246486号公報において、その製造方法も含めて既に公知である。これらからわかるように、通常の水、超純水、電解水、イオン交換水によるアルカリ水或いは酸性水、およびこれらに無機イオンを加えた溶液中で、例えば超音波を付与するか、或いは電気分解によってナノバブルを発生させることができる。
　また、これらのナノバブル水は、後述する実験例において示すように商業的に入手可能であり、例えば、酸素ナノバブル水は(株)NAGA MREから製品名「ナーガの雫」またはジャパンエコール(株)から製品名「美粒水」として、また水素ナノバブル水はエヌディーアクア(株)から製品名「真・水素水」として販売されている。
　なお、本発明が対象とするナノバブル水は、なかでも動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の微細気泡を含むナノバブル水である。
　ここで個数平均径は、ナノバブル水を動的光散乱式粒子径・粒度分析計に供することで測定することができる。ここで検出はヘテロダイン法を使用することが好ましい。ヘテロダイン法は、散乱光のみを検出するホモダイン法とは異なり、入射光と散乱光の差成分を検出する方法である。
　例えば、一つの粉体の集団があると仮定した場合、この中に粒子径の小さな順から、「d1、d2、・・・、di、・・・、dk」の粒子径（μｍ）を有する粒子がそれぞれ「n1、n2、・・・、ni、・・・、nk個」あるとする。また粒子１個当たりの体積（μm３）を「v1、v2、・・・、vi、・・・、vk」とする。すなわち、個数と粒子径と体積は下記の関係にある：
個数　：n1、n2、・・・、ni、・・・、nk
粒子径：d1、d2、・・・、di、・・・、dk
体積　：v1、v2、・・・、vi、・・・、vk。
　この場合、個数平均径MN（μm）は、下式で算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本発明が対象とするナノバブル水は上記式で算出される個数平均径が300nm以下の微細気泡であればよいが、好ましくは個数平均径が200nm以下、より好ましくは100nm以下である。なお、個数平均径の下限は特定制限されないが、通常0.01nm以上を挙げることができる。
　さらに本発明が対象とするナノバブル水は下記式で算出される体積平均径MV（μm）が400nm以下である微細気泡であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
より好ましくは体積平均径が200nm以下、より好ましくは100nm以下である。なお、体積平均径の下限は特定制限されないが、通常0.01nm以上を挙げることができる。
　また特に制限されないが、本発明のナノバブル水は下記式で算出される標準偏差SDが体積平均径については0.08μm以下、個数平均径については0.1010μm以下である微細気泡であることが好ましい。ここでいう標準偏差（Standard　Deviation：SD）は、気泡の分布の分布幅の目安となるものであり、統計学上の標準偏差（統計的誤差）とは相違する概念である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　かかるナノバブル水は、後述する実験例に示すように、生体から分取したリンパ球またはリンパ球を含む単核球を当該ナノバブル水の存在下で培養することで、そのＮＫ活性（細胞傷害活性）を増強する作用を有しており、このためＮＫ活性増強剤として有効に使用することができる。
　なお、ここで「ＮＫ活性」とは細胞傷害活性を意味する。好ましくは正常細胞を傷害することなく、ガン細胞を特異的に傷害する活性である。かかる「ＮＫ活性」は、後述する実験例で示すように、ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞等のガン細胞に対する細胞傷害活性を測定することによって評価することができる。
（II）ＮＫ活性増強リンパ球、ＮＫ活性増強単核球およびそれらの調製方法
　本発明が対象とするＮＫ活性増強リンパ球および単核球は、それぞれ生体から分取したリンパ球および単核球を、前述するＮＫ活性増強剤の存在下で培養することにより調製することができる。
　ここで培養に使用するリンパ球は、生体から採血により取得された血液から調製することができる。ここで血液とは、リンパ球を含む血液成分を意味し、例えば全血や単核球が該当する。この限りにおいて血液は末梢血であっても臍帯血であってもよく、また骨髄液であってもよい。好ましくは、末梢血から得られる全血または単核球（PBMC）である。
　なお、血液を採取する対象生物としては、ヒト又はヒト以外の哺乳動物を挙げることができる。細胞免疫療法の使用においては、原則として細胞免疫療法を行う動物種と同一の動物種の血液が用いられる。例えば、ヒトの細胞免疫療法に使用するＮＫ活性増強リンパ球および単核球は、ヒト由来の血液から調製される。制限はされないが、細胞免疫療法において拒絶反応の可能性を限りなく排除するうえでは、細胞免疫療法を行う動物と同一の動物の血液を用いることが好ましい。つまりこの場合、細胞免疫療法を受ける患者自身から採取した血液が使用される。従って、この場合は採取する生体が健常個体である必要はなく、ガンやウイルス感染症に罹患した患者から採取した血液であってもよい。なお、血液の採取にあたっては、血液を採取するシリンジ内部をヘパリンなどの血液凝固阻止剤等でコーティングしておくなど、採取した血液が凝固しないような手段を講じておく必要がある。
　血液からのリンパ球の分取は、定法である比重遠心分離法（Bφyum, A., Separation of leucocytes from
blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21, suppl.97 (1968)）を用いて行うことができる。また、培養に使用する単核球もリンパ球と同様、生体から採血により取得された単核球を含む血液から調製することができる。かかる比重遠心分離法によるリンパ球および単核球の分離は、Lymphoprep（登録商標）（Axis-Shield社製）やFicoll-Paque PLUS(Amersham社製)等として市販されている分離液、Lymphoprep（登録商標）チューブ（Axis-Shield社製）等の分離用チューブ、並びに血液成分分離装置（例えば、(株)アムコ社製など）を用いることで簡便に実施することができる。
　分取したリンパ球または単核球は、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）1640培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等のリンパ球や単核球の培養に適した培地により、所定の細胞濃度、例えば０．５～５×１０６cells/ml程度、好ましくは１～３×１０６cells/ml程度、より好ましくは２×１０６cells/ml程度に調整して使用される。
ここで細胞濃度の測定は血球計算板を使用して行うことができる。斯くして調製したリンパ球溶液または単核球溶液を、それぞれリンパ球培養原液または単核球培養原液とし、これを希釈して所望濃度のリンパ球溶液または単核球溶液として使用することもできる。
　なお、培養に使用する培地として、前述するように、リンパ球や単核球の培養に適した培地である、例えばRPMI-1640培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等を挙げることができるが、好ましくはRPMI-1640培地である。特にこれらの培地に容量比が5～10％程度になるように非働化処理済みの血清（例えばウシ胎児血清や正常ヒト血清）若しくは血漿（正常ヒト血漿）を添加したものを使用することが、増殖効果に優れているため好ましい。また、必要に応じて、培地中に、ストレプトマイシン、ペニシリン、カナマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質を添加配合してもよい。
　培養には、一般的な細胞培養の方法が使用される。例えば、CO２インキュベーター内で、通常CO２濃度を１～１０容量％程度、特に５容量％程度に調整し、温度を３０～４０℃程度、好ましくは３７℃程度に調整して行うことが好ましい。
　分取したリンパ球または単核球を、前述するＮＫ活性増強剤、すなわち動的光散乱法で求められる個数平均径が300ｎｍ以下の微細気泡を含むナノバブル水の存在下で、培養することで、そのＮＫ活性を誘導させ、また増強することができる（ＮＫ活性増強リンパ球、ＮＫ活性増強単核球）。なお、リンパ球または単核球におけるＮＫ活性の誘導または増強（ＮＫ活性の増強）の有無は、後述する実験例に示すように、ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞等のガン細胞に対する細胞傷害活性を測定することによって評価することができる。こうしたＮＫ活性の誘導・増強のための培養には、前述する上記培養条件が同様に使用できる。培養時間としてはＮＫ活性の誘導または増強が達成できる時間であればよく、特に制限されない。通常数時間～数週間の範囲、具体的には例えば10時間～４週間の範囲で適宜設定することができる。この範囲であれば、例えば10～30時間を選択しても、また２～４週間を選択してもよい。
　また、培地中のリンパ球または単核球の濃度として、通常０．５～５×１０６cells/ml程度、好ましくは１～３×１０６cells/ml程度、より好ましくは２×１０６cells/ml程度を挙げることができる。
　また、培地中のナノバブル水の濃度として、通常１～９９容量％、好ましくは１５～９５容量％、より好ましくは１５～６５容量％を挙げることができる。
　斯くしてＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を調製することができるが、調製されたＮＫ活性増強リンパ球または単核球は、使用に際して、さらにこれを、ナノバブル水を含まない生理的細胞条件で培養することが好ましい。
　なお、培養後は、培養液中に細菌やエンドトキシン等が混入していないことを確認することが好ましい。菌の有無は、コロニー形成アッセイ法により、またエンドトキシンの有無は市販のELISAなどの比色法やリムルステストなどの比濁法によって調べることができる。
　こうして得られたＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球はいずれもＮＫ活性が誘導・増強されており、腫瘍や各種感染症の予防や治療に有効な細胞免疫製剤の有効成分として有用である。従って、本発明はかかるＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を有効成分として含有する細胞免疫製剤を提供するものでもある。
（III）細胞免疫製剤および輸液製剤
　前述するＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を、例えばヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液中に懸濁した形態で製剤化することにより、悪性腫瘍（ガン）あるいは各種感染症を予防または治療するための細胞免疫製剤として用いることができる。
　なおここで「細胞免疫製剤」とは、前述のＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を含有し、増強（誘導・増強）されたＮＫ活性に基づいて生体防御機能を発揮する製剤を意味する。その形態は特に制限されない。例えば、適当な溶液にＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を懸濁させた形態のものでもよく、特に上記したヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液にＮＫ活性増強リンパ球またはＮＫ活性増強単核球を懸濁した形態の輸液製剤（点滴製剤）が好ましいが、これに限定されるものではない。
　かかる細胞免疫製剤は、悪性腫瘍患者（ガン患者）、免疫不全症患者、自己免疫性疾患、アレルギー患者等の患者や、各種感染症患者に対する予防（再発予防を含む）や治療に広く用いることができる。好ましくは悪性腫瘍患者（ガン患者）に対する予防および治療への使用である。
ここで悪性腫瘍、すなわちガンとしては、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌、白血病、肉腫、脳腫瘍等が挙げられる。
また免疫不全症に関しては、先天性の免疫不全症と後天的な免疫不全症等が挙げられる。 先天性の免疫不全症としては、重症複合免疫不全症、Wiscott Aldrich 症候群、アデノシン・デアミネース欠損症、プリンヌクレオチド・ホスホリラーゼ欠損症等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。さらに後天的な免疫不全症としては、抗がん剤、免疫抑制剤、ステロイド剤等の使用による続発性免疫不全や、ヒト免疫不全ウイルスの感染によるエイズ等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。
また自己免疫性疾患としては、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シューグレン症候群、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病等が例示されるが、これらの自己免疫性疾患のみに限定されるものでない。
　また本発明の細胞免疫製剤は、免疫能が低下した患者だけでなく、特定のウイルス等に対しての免疫能が欠如あるいは低下した患者に対しても予防的あるいは治療的に使用することが可能である。アレルギー性疾患としては、気管支喘息、スギ花粉症、じんま疹等が例示されるが、これらのアレルギー性疾患のみに限定されるものではなく、また各種アレルギーの治療あるいは症状の軽減を目的として使用することも可能である。
さらに感染症としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、クラミジア感染症、マイコプラズマ感染症等が例示される。上記のウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス感染症等が例示されるが、これらのウイルス感染症のみに限定されるものでなく、これ以外の各種ウイルス感染症、例えばインフルエンザウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、バリセロゾスターウイルス等のヘルペス属ウイルス、あるいはヒト白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の各種レトロウイルスによる感染症の予防及び治療用にも広く使用することが可能である。
　また上記の細菌感染症としては、緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌等を原因とするものに使用することができるが、これらのほかにも人に病原性を示す細菌による感染症であればいずれの感染症に対しても使用が可能である。
　かかる細胞免疫製剤および輸液製剤の投与量は、患者の状態や治療対象等により、適宜選択できるが、通常、ＮＫ活性増強リンパ球または単核球等の細胞の数に換算して、体重１kgあたり1×10２cells～1×1010cellsを挙げることができる。好ましくは1×10３cells～1×109cellsの範囲である。
細胞免疫製剤の投与形態としては、輸液製剤などの点滴剤のほか、注射剤として適用できるように液体形状を有していることが好ましい。ＮＫ活性増強リンパ球または単核球をヒト血清アルブミンが0.01～5％となるように配合された生理食塩液に分散させてなる注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、１～５００ｍｌとするのが好ましく、この液量に前記の量の細胞が含まれるようにするのがより好ましい。
　（IV）ＮＫ活性増強血液製剤およびその調製方法
　本発明のＮＫ活性増強血液製剤は、生体から分取した少なくともリンパ球を含む血液を、前述するＮＫ活性増強剤の存在下で培養することで調製することができる。ここで血液は、末梢血、臍帯血、または骨髄液であってもよい。取得の容易性から好ましくは末梢血である。また、少なくともリンパ球を含むものであればよく、必ずしも全血である必要はなく、例えば末梢血から得られる末梢血単核球(PBMC)であってもよい。なお、末梢血単核球は、生体から採取した血液から（II）で説明する比重遠心分離法を用いて調製することができる。
　また、血液を採取する対象生物としては、ヒト又はヒト以外の哺乳動物を挙げることができる。細胞免疫療法の使用においては、原則として細胞免疫療法を行う動物種と同一の動物種の血液が用いられる。好ましくはヒトである。また制限はされないが、細胞免疫療法において拒絶反応の可能性を限りなく排除するうえでは、細胞免疫療法を行う動物と同一の動物の血液を用いることが好ましい。つまりこの場合、細胞免疫療法を受ける患者自身から採取した血液が使用される。従って、この場合は採取する生体が健常個体である必要はなく、がんやウイルス感染症に罹患した患者から採取した血液であってもよい。
　なお、血液の採取にあたっては、血液を採取するシリンジ内部をヘパリンなどの血液凝固阻止剤でコーティングしたり、採取した血液に血液凝固阻止剤を全血１mlに対して50ユニット程度配合するなど、採取した血液が凝固しないような手段を講じておく必要がある。
　ＮＫ活性増強のための培養は、上記（II）で説明した培養と同様の方法で実施することができる。具体的には、分取した末梢血単核球(PBMC)を、前述するＮＫ活性増強剤、すなわち動的光散乱法で求められる個数平均径が300ｎｍ以下の微細気泡を含むナノバブル水の存在下で、RPMI-1640培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等の単核球の培養に適した培地により、細胞濃度が、例えば０.５～５×１０６cells/ml程度、好ましくは１～３×１０６cells/ml程度、好ましくは２×１０６cells/ml程度になるように調整し、これに容量比が5～10％程度になるように非働化処理済みの血清若しくは血漿を添加したものを用いて培養する方法が挙げられる。この場合、拒絶反応を回避するうえで、非働化処理済みの血清若しくは血漿として細胞免疫療法を受ける患者の自己血液から調製されるものを使用することが好ましい。培養時に使用するナノバブル水の濃度として、通常１～９９容量％、好ましくは１５～９５容量％、より好ましくは１５～６５容量％を挙げることができる。
　培養には、一般的な細胞培養の方法が使用される。例えば、CO２インキュベーター内で、通常CO２濃度を１～１０容量％程度、特に５容量％程度に調整し、温度を３０～４０℃程度、好ましくは３７℃程度に調整して行うことが好ましい。
　斯くして、採取した血液、特に末梢血単核球(PBMC)のＮＫ活性を誘導しまた増強させることができる。なお、当該ＮＫ活性の誘導または増強の有無は、後述する実験例に示すように、ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞等のガン細胞に対する細胞傷害活性を測定することで評価することができる。
　なお、培養後は、培養液中に細菌やエンドトキシン等が混入していないことを確認することが好ましい。菌の有無は、コロニー形成アッセイ法により、またエンドトキシンの有無は市販のELISAなどの比色法やリムルステストなどの比濁法によって調べることができる。
　このように調製したＰＢＭＣをＮＫ活性増強血液製剤として使用する場合には、上記培養に引き続いて、培養に使用した培地やＮＫ活性増強剤を除去する必要がある。これらの除去は、上記培養で得られた培養液を滅菌済み遠心チューブに移し、1200rpmにて８分間ほど室温にて遠心することによって実施することができる。斯くして目的とするＰＢＭＣは沈殿物として、ＮＫ活性増強剤や培地を含む上清と分離して回収することができる。回収されたＰＢＭＣは、培地やＮＫ活性増強剤を十分に除去するために、さらに２回以上生理食塩水で洗浄することが望ましい。最後に、洗浄したＰＢＭＣを細胞濃度が1.2～1.2×109cells/ml、好ましくは1.2×10～1.2×108cells/mlとなるように生理食塩水で調製することで、本発明のＮＫ活性増強血液製剤を得ることができる。
　当該ＮＫ活性増強血液製剤は、製造後直ちに使用することもできるし、４℃から６℃程度の低温下で所定の期間、又は保存液等を加えて超低温下（約－８０℃）若しくは液体窒素中で数年に渡る長期間保存することも可能である。前記保存液としては、市販の活性化リンパ球保存液を用いると便利である。例えば、バンバンカー（日本ジェネティックス社）、ケーエムバンカーＩＩ（コスモバイオ社）等が利用できる。
　以下、本発明を、実験例を用いて詳細に説明する。但し、本発明はかかる実験例により何ら制限されるものではない。なお、下記実験例で培養に使用する「RPMI-1640培地」の詳細は、RPMI-1640培地（0.03%グルタミン、10%FBS、100U/mlペニシリン-100μg/mlストレプトマイシン、0.1mM MEM Non-Essential Amino
Acids(NEAA)を含む）である。なお、RPMI-1640培地はシグマアルドリッチジャパン株式会社、FBS（ウシ胎児血清）は大日本製薬株式会社、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびNEAAはいずれもインビトロジェン株式会社より購入したものを使用した。なお、下記の実験例でナノバブル水に含まれるナノバブルの粒径の測定は、日機装（株）東村山製作所において、動的光散乱式粒子径・粒度分析計ナノトラックUPA-UT151型（光源：半導体レーザー780nm、検出器：シリコンンフォトダイオード）、日機装(株)製）を用いて実施した。
実験例１　酸素ナノバブル水を用いたＮＫ活性の増強
（１）ＮＫ活性の測定方法
　まず被験者の末梢血からＮＫ細胞を含むリンパ球を分取し、これに被験物質を添加して、RPMI-1640培地を用いて、5％CO2、37℃の条件で20時間培養する。
　別途、蛍光物質（ユーロピウム：Eu3+）で標識したガン細胞（ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞：American Type Culture Collection）を調製し（以下、これを「標識ガン細胞」という）、これを上記で培養したリンパ球と混合し、さらにRPMI-1640培地を用いて、5％CO2、37℃の条件で4時間培養する。このとき、リンパ球（Ｅ：エフェクター細胞）と標識ガン細胞（Ｔ：ターゲット細胞）との混合比率（Ｅ／Ｔ比）は、40:1とする。
　次いで、標識ガン細胞から培養液中に遊離した蛍光物質（Eu3+）の量を、時間分解蛍光測定法（DELFIA Research蛍光光度計：Pharmacia Biotech社製）により測定し、下式から蛍光物質の遊離率（％）を算出する。この遊離率（％）を標識ガン細胞がリンパ球で傷害された程度、すなわちＮＫ活性（％）とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　最大放出量：人為的に標識ガン細胞のすべてを壊した時に遊離する蛍光物質量
自然放出量：リンパ球を加えない時に標識ガン細胞から遊離する蛍光物質量（バックグランド値）
（２）被験物質の調製
　被験物質として、下記の方法で調製した(a)酸素ナノバブル水、(b)有機ゲルマニウム粉末、および(c)ハナビラタケを使用した。これらの被験物質のうち、(b)と(c)は、ＮＫ細胞活性作用があると報告されている物質である（特開平10-330207号公報、特開2004-292415号公報参照）。
　これらの被験物質は事前検査として、第十五改正日本薬局方解説書エンドトキシン試験法（B427-448）に則して比濁法によるエンドトキシン測定（トキシノメーターMT-358使用：和光純薬工業(株)製）、及びガン細胞（K562細胞）に対する傷害活性試験を実施し、被験物質そのものはエンドトキシンを含有しないこと、そしてガン細胞を傷害する作用を有するものでないことを確認した。なお、両試験には、各被験物質をＮＫ活性測定時と同じ濃度になるように調整して使用した。
　（a）酸素ナノバブル水
　酸素ナノバブル水として、（株）ＮＡＧＡ　ＭＲＥ販売の５００ｍｌ入り酸素ナノバブル水（製品名：ナーガの雫）（賞味期限2008年9月20日）（原水）を使用した。原水を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し試験に使用した。具体的には、原水と培地とを混合し培養時に原水が６倍希釈されたもの（原水を16.7％含有）を試験濃度「１倍」とし、原水と培地とを混合し培養時に原水が６０倍希釈されたもの（原水を1.67％含有）を試験濃度「1/10倍」とした。なお、当該酸素ナノバブル水中に含まれる酸素ナノバブルの粒径を動的光散乱法（検出法：ヘテロダイン法）に基づいて測定したところ（動的光散乱式粒子径・粒度分析計ナノトラックUPA-UT151型、日機装(株)製）、下記に説明する方法で算出される体積平均径（MV）が0.3734μｍ（標準偏差:SD＝0.0784μｍ）、個数平均径（MN）が0.2995μｍ（標準偏差:SD＝0.1002μｍ）と、動的光散乱法による個数平均径が300nm未満のナノバブルであることが確認された。
　なお、上記装置（動的光散乱式粒子径・粒度分析計ナノトラックUPA-UT151型）は、解析法として周波数解析法（FFT-パワースペクトル法）を採用している。すなわち、散乱強度の自己相関関数を高速フーリエ変換したパワースペクトルを求め、このパワースペクトルをログリニアースケール・アルゴリズムで粒度分布に変換する方法である。
＜体積平均径（MN）の算出方法＞
　一つの粉体の集団を仮定する。この中に粒子径の小さな順から、d1、d2、・・・、di、・・・、dkの粒子径（μｍ）を有する粒子がそれぞれn1、n2、・・・、ni、・・・、nk個あるとする。また粒子１個当たりの体積（μm３）をv1、v2、・・・、vi、・・・、vkとする。すなわち、個数と粒子径と体積は下記の関係にある。
個数　：n1、n2、・・・、ni、・・・、nk
粒子径：d1、d2、・・・、di、・・・、dk
体積　：v1、v2、・・・、vi、・・・、vk。
　この場合、体積平均径MV（μm）は、前述する[数２]に記載する式で算出することができる。また、個数平均径MN（μm）は、前述する[数１]に記載する式で算出することができる。また気泡の分布の分布幅の目安となる標準偏差(SD)（体積平均径と個数平均径の各々について）は、前述する[数３]に記載する式で算出することができる。
 (b)有機ゲルマニウム粉末
　有機ゲルマニウム粉末として、(株)浅井ゲルマニウム研究所製のものを使用した。　これをRPMI-1640 培地に懸濁し、室温で1時間撹拌し溶解した。これを0.22μmフィルターで濾過滅菌した後、RPMI-1640
培地で培養時の最終濃度が0.022mg/mlとなるように希釈し、試験に使用した。
 (c)ハナビラタケ
　ハナビラタケとして、(株)ミネターから購入した乾燥粉末製品（ハナビラタケ100：商品名）を使用した。これをRPMI-1640 培地に懸濁し、室温で1時間撹拌し溶解した。これを0.22μmフィルターで濾過滅菌した後、RPMI-1640
培地で培養時の最終濃度が0.022mg/mlとなるように希釈し、試験に使用した。
　なお、上記有機ゲルマニウム粉末およびハナビラタケの濃度は、標準的なヒト（体重60kg）の血液量を4.5Lとし、1日の服用量100mg が100％ 血中に吸収された場合の濃度（0.022 mg/ml）を基準として、培養時の最終濃度がこの濃度になるように調整した。
（３）被験物質で処理したリンパ球のＮＫ活性測定
　上記（１）に記載する方法に従って、上記各種の被験物質で処理したリンパ球のＮＫ活性を測定した。具体的には、まず、被験者（60代男性）１名の末梢血（全血採血後、30時間以内に使用）から比重遠心分離法（Bφyum, A., Scand.J.C lin. Lab. Invest.,
21,suppl. 97(1968)）を用いてリンパ球層を分離した後、一定濃度（培養時濃度：2×10６cells/ml）のリンパ球溶液を調製した。
　斯くして調製したリンパ球溶液に、IL-2（ヒトリコンビナント：PEPROTECH社製）、OK-432（抗悪性腫瘍剤：ピシバニール、中外製薬(株)製）、または表１に記載する各種の被験物質（表中の濃度（1倍）とその1/10濃度（1/10倍）の２濃度で実施）を添加し、20時間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　20時間培養した後、蛍光物質（Eu3+）で標識したガン細胞（K562細胞）を添加し、さらに４時間培養した。
　培養後、培養液中に遊離した蛍光物質量を、時間分解蛍光測定により測定し、その遊離率(％)から傷害されたガン細胞の割合を求め、ＮＫ活性（％）を算出した。
　結果を表２および図１に示す。
[規則26に基づく補充 19.11.2009]　
Figure WO-DOC-TABLE-2
　その結果、表２に示すように、コントロールのＮＫ活性は４.６％であるものの、ＩＬ－２添加または抗悪性腫瘍剤（OK-432）添加により、それぞれ３１.０％または４１.９％となり、ＩＬ－２または抗悪性腫瘍剤（OK-432）により、ＮＫ活性が誘導・増強されることが確認された（ＮＫ活性の増強）。
　これに対して、酸素ナノバブル水（サンプルＤ）は７.４％と、IL-2やOK-432よりも低いものの、コントロールと比較して１.６倍と有意にリンパ球のＮＫ活性を誘導・増強していることが確認された。このことから、個数平均径が300nm未満の酸素ナノバブルを含む水（酵素ナノバブル水）には、リンパ球のＮＫ活性を誘導・増強させる機能があることが判明した。
　なお、この実験では、有機ゲルマニウム粉末（サンプルＧ）およびハナビラタケ（サンプルＦ）でＮＫ活性の低下が認められた。また有機ゲルマニウムおよびハナビラタケを併用した試験サンプル（サンプルＥ）はＮＫ活性を若干誘導することが確認された。しかしこれらの被験物質を酸素ナノバブル水と併用した場合（サンプルＡ、Ｂ、Ｃ）、酸素ナノバブル水単独の場合（サンプルＤ）のＮＫ活性と、ほぼ同じか若干増加することが認められた。これから、酸素ナノバブル水は、他のＮＫ活性増強剤と併用することが可能であると考えられる。
実験例２　水素ナノバブル水を用いたＮＫ活性増強
　酸素ナノバブル水に代えて水素ナノバブル水を用いて実験例１と同様にしてリンパ球を処理して、リンパ球のＮＫ活性を測定した。
（１）被験物質の調製
(a) 水素ナノバブル水
　水素ナノバブル水として、電気分解から得られた、エヌディーアクア株式会社製の水素ナノバブル水（商標名：「真・水素水」、賞味期限2008年12月12日、ロット番号2008.12.12）（原水）を用いた。原水を０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し試験に使用した。具体的には、原水と培地とを混合し培養時に原水が６倍希釈されたもの（原水を16.7％含有）を試験濃度「１倍」とし、原水と培地とを混合し培養時に原水が６０倍希釈されたもの（原水を1.67％含有）を試験濃度「1/10倍」とした。ちなみに電気分解によって得られたアルカリイオン水中の水素気泡は3～200nmであり、水素ナノバブル水には200nm以下の径のバブルが存在することが知られている（“電解性アルカリ性水の科学”、ウォーター研究会会報、No.8、p.5(2001)）。そこで、当該水素ナノバブル水中に含まれる水素ナノバブルの粒径を、実験例１に記載する方法に従って動的光散乱法に基づいて測定したところ（動的光散乱式粒子径・粒度分析計ナノトラックUPA-UT151型、日機装(株)製）、実験例１で説明する方法で算出される体積平均径（MV）は0.0027μｍ（標準偏差SD＝0.0004μｍ）、個数平均径（MN）が0.0024μｍ（標準偏差SD＝0.0005μｍ）と、動的光散乱法による個数平均径が300nm未満（3nm未満）のナノバブルであることが確認された。
　当該水素ナノバブル水は事前検査として、第十五改正日本薬局方解説書エンドトキシン試験法（B427-448）に則して比濁法によるエンドトキシン測定（トキシノメーターMT-3568使用：和光純薬工業(株)製）、及びガン細胞（K562細胞）に対する傷害活性試験を実施し、被験物質そのものにエンドトキシンが含まれておらず、またガン細胞を傷害する作用を有するものでないことを確認した。なお、両試験には、当該水素ナノバブル水をＮＫ活性測定時と同じ濃度になるように調整して使用した。
（２）被験物質で処理したリンパ球のＮＫ活性測定
　実験例１（１）に記載する方法に従って、上記被験物質（水素ナノバブル水）で処理したリンパ球のＮＫ活性を測定した。具体的には、まず、被験者２名（50代男性：被験者１、60代男性：被験者２）の末梢血（全血採血後、30時間以内に使用）から比重遠心分離法を用いてリンパ球層を分離した後、一定濃度（培養時濃度：2×10６cells/ml）のリンパ球溶液を調製した。
　斯くして調製したリンパ球溶液に、表３に示すように、被験物質としてIL-2（ヒトリコンビナント：PEPROTECH社製）、OK-432（抗悪性腫瘍剤：ピシバニール、中外製薬(株)製）、水素ナノバブル水、または酸素ナノバブル水（実験例１で調製したものと同じ）をそれぞれ添加し、20時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。20時間培養した後、蛍光物質（Eu3+）で標識したガン細胞（K562細胞）を添加し、さらに４時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。
　培養後、培養液中に遊離した蛍光物質量を、時間分解蛍光測定により測定し、得られた遊離率(％)から傷害されたガン細胞の割合を求め、ＮＫ活性（％）を算出した。
[規則26に基づく補充 19.11.2009]　
Figure WO-DOC-TABLE-3
被験者１に関する結果を表４と図２に、被験者２に関する表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ＊１倍　　：培養時の水素ナノバブル水の濃度16.7%(v/v)
**1/10倍 ：培養時の水素ナノバブル水の濃度1.67%(v/v)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ＊１倍　　：培養時の水素ナノバブル水の濃度16.7%(v/v)
**1/10倍 ：培養時の水素ナノバブル水の濃度1.67%(v/v)
　その結果、表４及び表５に示すように、IL-2やOK-432には及ばないものの、水素ナノバブル水にも、実験例１で確認した酸素ナノバブル水と同様に、ＮＫ活性を誘導・増強する作用があること（ＮＫ活性増強作用）、また水素ナノバブル水と酸素ナノバブル水とを併用してもそれらのＮＫ活性増強効果は損なわれることなく維持されることが確認された。具体的には、水素ナノバブル水については、コントロールに比べ、被験者１（表４：サンプルＡ）は1.5倍以上、また被験者２（表５：サンプルＡ）は1.3倍程度ＮＫ活性の上昇が得られた。また、酸素ナノバブル水については、1.4倍以上のＮＫ活性の上昇が得られた（表４：サンプルＢ）。
実験例３　大気ナノバブル水を用いたＮＫ活性の増強
　酸素ナノバブル水に代えて大気ナノバブル水を用いて実験例１と同じ方法でリンパ球を処理してリンパ球のＮＫ活性を測定した。
（１）被験物質（大気ナノバブル水）の調製
 　大気ナノバブル水として、ジャパンエコール株式会社製の大気ナノバブル水（ロット番号08121602）（原水）を用いた。大気中には窒素が約78％、酸素が約20.9％および二酸化炭素が約0.03％含まれている。なお、大気ナノバブル水の作成にあたり、空気（山梨県忍野村）を「インライン型クリーンフィルター、FCS500シリーズ」（ポリプロピレン＋ウレタン製中空糸膜、濾過精度0.01μ、除去効率99.99％のフィルター）（CKD社製）に通して調製した大気を使用した。
　原水を０.２２μｍフィルターで濾過滅菌し試験に使用した。具体的には、原水と培地とを混合し培養時に原水が６倍希釈されたもの（原水16.7％含有）を試験濃度「１倍」とし、原水と培地とを混合し培養時に原水が６０倍希釈されたもの（原水1.67％含有）を試験濃度「1/10倍」とした。
　当該大気ナノバブル水中に含まれる大気ナノバブルの粒径を、実験例１に記載する方法に従って動的光散乱法に基づいて測定したところ（動的光散乱式粒子径・粒度分析計ナノトラックUPA-UT151型、日機装(株)製）、実験例１で説明する方法で算出される体積平均径（MV）は0.0019μｍ（標準偏差SD＝0.0003μｍ）、個数平均径（MN）が0.0018μｍ（標準偏差SD＝0.0003μｍ）と、動的光散乱法による個数平均径が300nm未満（2nm未満）のナノバブルであることが確認された（標準偏差SD＝0.0003μm）。
　当該大気ナノバブル水は事前検査として、第十五改正日本薬局方解説書エンドトキシン試験法（B427-448）に則して比濁法によるエンドトキシン測定（トキシノメーターMT-3568使用：和光純薬工業(株)製）、及びガン細胞（K562細胞）に対する傷害活性試験を実施し、大気ナノバブル水そのものにエンドトキシンが含まれておらず、またガン細胞を傷害する作用を有するものでないことを確認した。なお、両試験には、当該大気ナノバブル水をＮＫ活性測定時と同じ濃度になるように調整して使用した。
（２）被験物質（大気ナノバブル水）で処理したリンパ球のＮＫ活性測定
　実験例１（１）に記載する方法に従って、上記被験物質（大気ナノバブル水）で処理したリンパ球のＮＫ活性を測定した。具体的には、まず、（健常な男女7名：平均年齢47.3±13.7歳）の末梢血（全血採血後、30時間以内に使用）から比重遠心分離法を用いてリンパ球層を分離した後、大気ナノバブル水を65％含む培地を使用して、一定濃度（培養時濃度：2×10６cells/ml）のリンパ球溶液を調製した。
　斯くして調製したリンパ球を20時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。20時間培養した後、蛍光物質（Eu3+）で標識したガン細胞（K562細胞）を添加し、さらに４時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。培養後、培養液中に遊離した蛍光物質量を、時間分解蛍光測定により測定し、得られた遊離率(％)から傷害されたガン細胞の割合を求め、ＮＫ活性（％）を算出した。
　結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
これからわかるように、大気ナノバブル水にも、実験例１で確認した酸素ナノバブル水および実験例２で確認した水素ナノバブル水と同様に、ＮＫ活性を誘導・増強する作用（ＮＫ活性増強作用）があることが確認された。
実験例４　ＩＬ－２との併用によるＮＫ活性の増強
（１）酸素ナノバブル水および大気ナノバブル水によるＮＫ活性の増強
　被験物質として下記のナノバブル水を使用して、実験例１の記載に従ってリンパ球を処理して、ＮＫ活性（％）を測定した。
＜被験物質＞
Ａ：酸素ナノバブル水（ナーガの雫：(株)ＮＡＧＡ　ＭＲＥ製）、体積平均径（MV）：0.3734μm（標準偏差SD=0.0784μm）、個数平均径（MN）：0.2995μm（標準偏差SD=0.1002μm）
Ｂ：大気ナノバブル水（Lot.08121602、ジャパンエコール(株)製）、体積平均径（MV）：0.0019μm（標準偏差SD=0.0003μm）、個数平均径（MN）：0.0018μm（標準偏差SD=0.0003μm）
Ｃ：酸素ナノバブル水（美粒水：ジャパンエコール(株)製）、体積平均径（MV）：0.0015μm（標準偏差SD=0.0002μm）、個数平均径（MN）：0.0014μm（標準偏差SD=0.0002μm）
　具体的には、上記各種のナノバブル水と精製水を用いて、RPMI-1640培地（pH7.2）（これを「ナノバブル培地」という）を調製し、これを0.22μmフィルターで濾過滅菌した後、試験に使用した。リンパ球培養時に使用する各ナノバブル培地中のナノバブル水の含有率は65容量％である。
　具体的には、まず、被験者７名（健常な男女7名：平均年齢47.3±13.7歳）の末梢血（全血採血後、30時間以内に使用）から比重遠心分離法を用いてリンパ球層を分離した後、一定濃度（培養時濃度：2×10６cells/ml）のリンパ球溶液を調製した。
　斯くして調製したリンパ球を、上記の各種ナノバブル培地（ナノバブル培地Ａ～Ｃ）を用いて20時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。20時間培養した後、蛍光物質（Eu3+）で標識したガン細胞（K562細胞）を添加し、さらに４時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。培養後、培養液中に遊離した蛍光物質量を、時間分解蛍光測定により測定し、得られた遊離率(％)から傷害されたガン細胞の割合を求め、ＮＫ活性（％）を算出した。なお、コントロール試験として、ナノバブル培地に代えて、ナノバブル水を配合しない培地（RPMI-1640培地（pH7.2））を用いて同様に処理して、ＮＫ活性（％）を算出した。
　その結果、７名のＮＫ活性（％）の平均値（コントロール値）は36.5±15.0（平均±標準偏差）％であり、いずれのナノバブル水（ナノバブル水Ａ～Ｃ）もＮＫ活性を上昇させることが確認された。コントロールのＮＫ活性（コントロール値）を100％とした場合の相対比（％）を図３に示す。
　この結果から、個数平均径が300nm未満の微細気泡（酸素、水素、大気）を含むいずれのナノバブル水も、ナノバブル水を含まないコントロールに比べて１.２～１.３倍、ＮＫ活性を増強させることが認められた。
（２）ＩＬ－２との併用効果     
　被験物質としてＩＬ－２単独（0～50ng/ml）、およびＩＬ－２（0～50ng/ml）と上記ナノバブル水Ａ～Ｃとを組み合わせて使用し、実験例１の記載に従ってリンパ球を処理して、ＮＫ活性を測定した。
　具体的には上記被験者７名から単離したリンパ球を、上記のＩＬ－２（0～50ng/ml）を含有する培地（RPMI-1640培地（pH7.2））またはＩＬ－２（0～50ng/ml）を含有する上記各種ナノバブル培地（ナノバブル培地Ａ～Ｃ）を用いて20時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。20時間培養した後、蛍光物質（Eu3+）で標識したガン細胞（K562細胞）を添加し、さらに４時間培養した（培養条件は、実験例１（１）に記載する方法と同じ）。培養後、培養液中に遊離した蛍光物質量を、時間分解蛍光測定により測定し、得られた遊離率(％)から傷害されたガン細胞の割合を求め、ＮＫ活性（％）を算出した。
　濃度－反応曲線を図４に示す。縦軸はＮＫ活性（％）（7名の平均値）、横軸はIL-2の濃度（ng/ml）を示す。この結果から、ＩＬ－２単独よりも、ＩＬ－２に上記ナノバブル水を併用したほうが、ＮＫ活性が増加することが判明した。ＩＬ－２は、細胞免疫療法における生体応答調節剤（ＢＲＭ）として知られている一方で、その副作用も報告されている。本発明のナノバブル水を有効成分とする細胞免疫療法剤によれば、これをＩＬ－２と併用することで、ＩＬ－２のＮＫ細胞活性化機能を補足し、その結果ＩＬ－２の使用量が低減でき、ひいてはＩＬ－２による副作用を低減させることができると考えられる。

Claims (8)

  1. 　動的光散乱法で求められる個数平均径が300nm以下の気泡を含むナノバブル水を有効成分とする、ＮＫ活性増強剤。
  2. 　生体から分取したリンパ球を、請求項１に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強リンパ球。
  3. 　生体から分取したリンパ球を含有する単核球を、請求項１に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強単核球。
  4. 　請求項２に記載のＮＫ活性増強リンパ球または請求項３に記載のＮＫ活性増強単核球を有効成分とする細胞免疫製剤。
  5. 　請求項２に記載するＮＫ活性増強リンパ球、請求項３に記載するＮＫ活性増強単核球、または請求項４に記載する細胞免疫製剤を含有する輸液製剤。
  6. 　生体から分取したリンパ球または単核球を、請求項１に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、ＮＫ活性増強リンパ球、ＮＫ活性増強単核球、または細胞免疫製剤の調製方法。
  7. 　生体から分取した少なくともリンパ球を含む血液を、請求項１に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養して調製される、ＮＫ活性増強血液製剤。
  8. 　生体から分取した少なくともリンパ球を含む血液を、請求項１に記載するＮＫ活性増強剤の存在下で培養する工程を有する、ＮＫ活性増強血液製剤の調製方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015057951A (ja) * 2013-09-17 2015-03-30 独立行政法人農業環境技術研究所 微生物培養培地、微生物の増殖方法及び有機塩素系化合物の分解方法、並びにナノバブル液体、ナノバブル液体製造装置及びナノバブル液体の製造方法
JP2016112031A (ja) * 2014-12-11 2016-06-23 株式会社メニコン 微細気泡含有滅菌液の製造方法、該製造方法により得られる微細気泡含有滅菌液、および微細気泡含有滅菌液

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005246294A (ja) * 2004-03-05 2005-09-15 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 酸素ナノバブル水およびその製造方法
JP2008063258A (ja) * 2006-09-06 2008-03-21 Tokyo Medical & Dental Univ 組織保存液

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005246294A (ja) * 2004-03-05 2005-09-15 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 酸素ナノバブル水およびその製造方法
JP2008063258A (ja) * 2006-09-06 2008-03-21 Tokyo Medical & Dental Univ 組織保存液

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Dai 67 Kai Annual Meeting of the Japan Cancer Association Yoshishu", 30 September 2008, article KAZUO MARUYAMA: "Application of ultrasound and nanobublles for cancertherapy.", pages: 251 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015057951A (ja) * 2013-09-17 2015-03-30 独立行政法人農業環境技術研究所 微生物培養培地、微生物の増殖方法及び有機塩素系化合物の分解方法、並びにナノバブル液体、ナノバブル液体製造装置及びナノバブル液体の製造方法
JP2016112031A (ja) * 2014-12-11 2016-06-23 株式会社メニコン 微細気泡含有滅菌液の製造方法、該製造方法により得られる微細気泡含有滅菌液、および微細気泡含有滅菌液

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