CN109880798B - 一种体外培养nk细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外培养NK细胞的方法。本发明发现，诃子酸既可以促进NK细胞体外增殖，又可以显著提高其广谱杀伤活性(杀伤活性标志分子CD107a的表达显著升高)以及对肿瘤细胞(对MKN‑45人胃癌细胞的杀伤力显著)的杀伤力，而且诃子酸干预培养时不会改变NK细胞的表型和含量。因此，可以用诃子酸体外培养NK细胞，促进NK细胞增殖并提高其杀伤力，可以将诃子酸添加到培养基中开发成NK细胞体外培养专用培养基。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及免疫细胞培养，具体涉及一种体外培养NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK)是人体内第一道与生俱来的免疫防线成员之一，也是对抗癌细胞或病毒最强、最有效的免疫淋巴细胞，与其他抗癌免疫细胞如毒性T细胞(CTL)或树突状细胞(DC)相比，NK细胞具有广谱性、不受组织兼容性抗原限制且不需要致敏作用的启动即可直接发动对癌细胞的攻击，因此称为自然杀伤细胞。临床实验表明：获得肿瘤患者的免疫细胞后，进行体外刺激、扩增培养后回输到患者体内，可以直接杀伤肿瘤细胞、恢复或增强患者的免疫机能达到抑制肿瘤生长的作用。
其中，NK细胞数量和活性对NK细胞的过继治疗效果至关重要，因此，如何在体外获得足量高活性的NK细胞是成功开展临床规模化应用的关键。
徐丽等(大蒜素对大鼠NK细胞肿瘤杀伤活性的影响，中国病理生理杂志，2010年)通过免疫磁珠分选法分离大鼠脾脏NK细胞，流式细胞仪检测不同浓度的大蒜素对NK细胞的增殖和凋亡的影响，ELISA检测大鼠脾脏NK细胞IFN-γ的分泌水平，乳酸脱氢酶(LDH)法检测大鼠脾脏NK细胞对小鼠淋巴瘤Yac-1细胞的杀伤活性，发现大蒜素对体外培养的NK细胞有明显的促进增殖和抑制NK细胞自然凋亡的作用，并能提高NK细胞分泌IFN-γ的水平和增强对Yac-1细胞的杀伤毒性，且在一定的浓度范围内呈剂量依赖性，得出大蒜素可能通过上调NK细胞分泌IFN-γ的水平增强其体外肿瘤杀伤能力的结论。
许琳等(汉黄芩素对人NK细胞杀伤MKN-45人胃癌细胞的影响及其机制研究，免疫学杂志，2014年)通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，在体外经rhIL-2诱导培养NK细胞；不同浓度的汉黄芩素分别作用于NK细胞24h、48h及72h后CCK8法检测NK细胞增殖情况；不同浓度汉黄芩素作用NK细胞48h后：流式细胞术(FCM)检测NK细胞GraB、IFN-γ、PFP、CD107a的表达；Westernblot检测NK细胞p-Akt、β-catenin、Bcl-2、p-ERK的表达；乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞对胃癌细胞株MKN45的杀伤活性，发现0.2～50μg/ml的汉黄芩素作用NK细胞24h、48h及72h后，NK细胞的增殖率增高；同一质量浓度汉黄芩素作用48h后的NK细胞的增殖率最高且在12.5μg/ml时达最高峰；汉黄芩素3.1～12.5μg/ml作用NK细胞48h后：NK细胞的GraB、IFN-γ、PFP、CD107a表达增加、NK细胞的p-Akt、β-catenin表达增加、NK细胞对MKN-45人胃癌细胞的杀伤活性增高，得出结论汉黄芩素能够促进NK细胞的增殖，其促进NK细胞的增殖可能与Wnt信号传导通路及PI3K/Akt信号通路有关；汉黄芩素增加NK细胞对胃癌细胞的杀伤活性可能与汉黄芩素上调NK细胞GraB、PFP、IFN-γ及CD107a的表达有关。
孙飞等(云芝多糖增强人NK细胞杀伤功能的体外研究，生物医学工程与临床，2017年)探讨了云芝多糖(PSK)对体外培养的人自然杀伤(NK)细胞杀伤功能的影响，结果发现PSK在一定质量浓度下能促进NK细胞的生长，且增强NK细胞的杀伤功能。
诃子酸(Chebulinic acid)是从诃子中分离得到的一种鞣酸。已知诃子酸具有多种药理活性，但是还没有见诃子酸促进NK细胞体外增殖并提高其杀伤活性的报道。
发明内容
本发明目的在于努力在体外获得足量高活性的NK细胞，提供一种体外培养NK细胞的方法，提供诃子酸用于促进NK细胞体外增殖并提高其杀伤活性的用途。
本发明目的通过如下技术方案实现：
诃子酸在提高NK细胞增殖活性方面的应用。体外实验表明：低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著促进NK细胞增殖，且呈现一定的浓度依赖性。
诃子酸在提高NK细胞杀伤活性方面的应用。体外实验表明：一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著促进NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达，且呈现一定的浓度依赖性；另一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现一定的浓度依赖性。
一种促进NK细胞体外增殖的培养方法，在培养基中添加诃子酸干预。体外实验表明：低浓度和高浓度诃子酸均可以显著促进NK细胞增殖，且呈现一定的浓度依赖性。
一种提高NK细胞杀伤活性的培养方法，在培养基中添加诃子酸干预。体外实验表明：一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著促进NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达，且呈现一定的浓度依赖性；另一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现一定的浓度依赖性。
一种促进NK细胞体外增殖的培养基，含有诃子酸。体外实验表明：低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著促进NK细胞增殖，且呈现一定的浓度依赖性。
一种提高NK细胞杀伤活性的培养基，含有诃子酸。体外实验表明：一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著促进NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达，且呈现一定的浓度依赖性；另一方面，低浓度(2μg/ml)和高浓度(8μg/ml)诃子酸均可以显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现一定的浓度依赖性。
一种用于NK细胞体外培养的诃子酸，纯度≥95％。
技术效果：
本发明发现，诃子酸既可以促进NK细胞体外增殖，又可以显著提高其广谱杀伤活性(杀伤活性标志分子CD107a的表达显著升高)以及对肿瘤细胞(对MKN-45人胃癌细胞的杀伤力显著)的杀伤力，而且诃子酸干预培养时不会改变NK细胞的表型和含量。因此，可以用诃子酸体外培养NK细胞，促进NK细胞增殖并提高其杀伤力，可以将诃子酸添加到培养基中开发成NK细胞体外培养专用培养基。
附图说明
图1为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养10d后的流式细胞术检测结果；该结果表明单个核细胞已基本诱导成NK细胞；
图2为NK细胞增殖率测定结果，低浓度和高浓度诃子酸均可以显著促进NK细胞增殖，且呈现一定的浓度依赖性；
图3为CD107a的流式细胞术检测结果，该结果表明低浓度和高浓度诃子酸均可以显著促进NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达，且呈现一定的浓度依赖性；
图4为NK细胞表型的流式细胞术检测结果，其中：A为2μg/ml诃子酸干预培养48h后的NK细胞表型流式检测结果，B为8μg/ml诃子酸干预培养48h后的NK细胞表型流式检测结果，与诃子酸干预培养前无显著变化，该结果表明诃子酸不会影响NK细胞表型和含量；
图5为NK细胞对肿瘤细胞杀伤率测定结果，低浓度和高浓度诃子酸均可以显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现一定的浓度依赖性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。
一、实验材料
淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；rhIL-2购自厦门特宝生物工程股份有限公司；人AB血浆购自上海慧颖生物科技有限公司；SCGM无血清培养基购自上海微科生物技术有限公司；FITC-Anti-CD56、PE-Anti-CD3、APC-Anti-CD107a购自美国BD公司；PBS溶液自制；诃子酸购自成都普瑞法科技，纯度≥95％；CCK-8试剂购自碧云天；MKN-45人胃癌细胞购自上海康朗生物科技有限公司。
二、实验方法
1、NK细胞的培养和表型鉴定
取健康成年志愿者外周静脉血，低分子肝素钠抗凝后加入淋巴细胞分离液，2000r/min离心13min，离心半径10cm。吸取单个核细胞层，PBS洗涤3次，加入含有300U/mlrhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2～3d半量换液1次。收集培养10d的NK细胞，PBS洗涤3次后调整细胞浓度为1×106/ml。在细胞悬液中加入FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室温避光孵育15min，PBS洗涤并重悬细胞，采用流式细胞术检测NK细胞表型。
2、CCK-8法检测NK细胞的增殖率
取培养10d的NK细胞，用含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基制成5×104/ml的细胞悬液，以5×103/孔接种于96孔板(即每孔100μl)，培养4h后，按如下分组更换培养基，每组5个复孔。
对照组：用含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基培养；
实验组(低浓度)：在对照组基础上还含有2μg/ml诃子酸；
实验组(高浓度)：在对照组基础上还含有8μg/ml诃子酸；
另设有只含有培养基不添加NK细胞的空白组。
更换培养基继续培养48h后，每孔加入CCK-8液20μL，继续培养4h后弃去上清，在450nm波长酶标仪上测定各孔吸光值(OD)，求其平均值，扣除空白孔本底OD值按下式计算实验组细胞增殖率(％)：
NK细胞增殖率(％)＝(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100％。
3、流式细胞术检测杀伤活性标志分子CD107a的表达
取培养10d的NK细胞，分别用含有0μg/ml、2μg/ml、8μg/ml诃子酸的培养基(含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基)培养48h，PBS洗涤3次后调整细胞浓度为1×106/ml。在细胞悬液中分别加入FITC-Anti-CD56、PE-Anti-CD3和APC-Anti-CD107a，室温避光孵育15min，PBS洗涤并重悬细胞，采用流式细胞术检测NK细胞表型和NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达。
4、CCK-8法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
取培养10d的NK细胞，分别用含有0μg/ml、2μg/ml、8μg/ml诃子酸的培养基(含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基)培养48h，PBS充分洗涤3次去除诃子酸，配成2×106/ml的细胞悬液，作为效应细胞；将对数生长期的MKN-45人胃癌细胞配成2×105/ml的细胞悬液，作为靶细胞。将效应细胞悬液和靶细胞悬液等体积(即效靶比10:1)接种于96孔培养板，同时设单独效应细胞孔、单独靶细胞孔和空白孔，每组5个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养8h；加入CCK8试剂10μL，孵育4h后，在450nm波长酶标仪上测定各孔吸光值(OD)，求其平均值，扣除空白孔本底OD值按下式计算杀伤活性。
杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞OD值]×100％。
5、统计学方法
数据采用SPSS17.0软件处理，以均数±标准差表示，组间的比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、NK细胞表型鉴定结果
NK细胞表型为CD3-CD56+，单个核细胞经含有300U/ml rhIL-2和10％人AB血浆的SCGM培养基培养10d后，CD3-CD56+细胞由培养前的7.4％增加到培养后的85.6％，如图1所示，图1中A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，B为单个核细胞培养10d后的流式细胞术检测结果。该结果表明，单个核细胞已基本诱导成NK细胞。
2、不同浓度诃子酸对NK细胞增殖的影响
结果如表1和图2所示，低浓度和高浓度诃子酸均可以显著促进NK细胞增殖，且呈现一定的浓度依赖性。
表1 NK细胞增殖率测定结果
3、不同浓度诃子酸对NK细胞杀伤活性的影响
CD107a的流式细胞术检测结果如表2和图3所示，低浓度和高浓度诃子酸均可以显著促进NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达，且呈现一定的浓度依赖性。
表2 CD107a的流式细胞术检测结果
| 0μg/ml诃子酸 | 2μg/ml诃子酸 | 8μg/ml诃子酸 | |
| CD107a表达率 | 65.1％ | 74.5％ | 85.2％ |
图4中A为2μg/ml诃子酸干预培养48h后的NK细胞表型流式检测结果，图4中B为8μg/ml诃子酸干预培养48h后的NK细胞表型流式检测结果，CD3-CD56+细胞表达率分别为83.8％、82.5％，与诃子酸干预培养前无显著变化，说明诃子酸不会影响NK细胞表型和含量。
4、不同浓度诃子酸对NK细胞杀伤肿瘤细胞活力的影响
不同浓度诃子酸对NK细胞杀伤肿瘤细胞活力的影响如表3和图5所示，低浓度和高浓度诃子酸均可以显著提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现一定的浓度依赖性。
表3 NK细胞对肿瘤细胞杀伤率测定结果
| 0μg/ml诃子酸 | 2μg/ml诃子酸 | 8μg/ml诃子酸 | |
| 杀伤率 | 43.3％±4.5％ | 57.5％±5.1％ | 79.4％±4.9％ |
以上实施例表明，诃子酸既可以促进NK细胞体外增殖，又可以显著提高其广谱杀伤活性(杀伤活性标志分子CD107a的表达显著升高)以及对肿瘤细胞(对MKN-45人胃癌细胞的杀伤力显著)的杀伤力，而且诃子酸干预培养时不会改变NK细胞的表型和含量。因此，可以用诃子酸体外培养NK细胞，促进NK细胞增殖并提高其杀伤力，可以将诃子酸添加到培养基中开发成NK细胞体外培养专用培养基。
Claims (1)
1.一种促进NK细胞体外增殖的培养方法，其特征在于：在培养基中添加诃子酸干预。
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