JP2015057951A

JP2015057951A - 微生物培養培地、微生物の増殖方法及び有機塩素系化合物の分解方法、並びにナノバブル液体、ナノバブル液体製造装置及びナノバブル液体の製造方法

Info

Publication number: JP2015057951A
Application number: JP2013191563A
Authority: JP
Inventors: 高木　和広; Kazuhiro Takagi; 和広高木; 雅一中里; Masakazu Nakazato
Original assignee: NAT INST AGRO ENVIRONMENTAL SCIENCE; Kayaba Industry Co Ltd; National Institute for Agro Environmental Sciences
Current assignee: NAT INST AGRO ENVIRONMENTAL SCIENCE; National Institute for Agro Environmental Sciences; KYB Corp
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-03-30

Abstract

【課題】有機塩素系分解菌の培養に微細気泡を利用すること、および微生物の培養に適したナノバブル液体を提供すること。【解決手段】ナノバブル液体を用いて調製した培地である微生物培養培地とした。より詳しくは、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０?１０８個／ｍＬ以上含有し、ナノバブルの粒径の最頻値が５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体を用いて調製した。これにより、微生物を短期間に高密度に培養することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、微生物の増殖に影響を与えるナノバブル液体とそのナノバブル液体の製造方法及びナノバブル液体の製造装置、並びにそのナノバブル液体を用いた微生物培養培地と微生物の増殖方法及びそれを利用した有機塩素系化合物の分解方法に関する。

微生物の産業への利用として、微生物を用いた汚水の浄化方法が知られており、汚水中への微細気泡の導入が微生物の活性化のために有効であることが、例えば、特開平５−１４６７９４号公報（特許文献１）に開示されている。ここでは、水中に微細気泡を発生させる手段を用いて、好気性微生物へ酸素を供給している。
そうした一方で、微細気泡を含んだ液体が殺菌効果を有しており、びん、缶等の容器の洗浄のため、ナノオーダーの気泡を含んだ液体にびん、缶等を浸漬する技術が、例えば、特開２０１２−４５５２８号公報（特許文献２）に開示されている。
また、こうした技術とは別に、有機塩素系化合物（農薬）により汚染された農地に対し、その有機塩素系化合物を分解する分解菌を用いて浄化を行う技術が特開２０１２−２００１５５号公報（特許文献３）等に開示されている。

特開平５−１４６７９４号公報特開２０１２−４５５２８号公報特開２０１２−２００１５５号公報

上記特開平５−１４６７９４号公報（特許文献１）や特開２０１２−４５５２８号公報（特許文献２）で開示されているように、水中に存在する微細気泡は、微生物に対して良くも悪くも影響しており、微生物利用の目的に応じて、微細気泡を上手に利用することで、所望の効果の達成が期待できる。
そうした一方で発明者らは特開２０１２−２００１５５号公報（特許文献３）で開示したように、所定の有機塩素系化合物を分解可能な分解菌の研究を行っており、そこで用いる所望の好気性分解菌の増殖方法や、有機汚染物質の分解方法について研究を続けている。
こうした現状の下、発明者らは微生物の培養等に微細気泡を利用できるのではないかと鋭意検討を進めた結果、本発明を完成したものである。

そこで本発明は、所定のナノバブル液体を用いて調製した培地であることを特徴とする微生物培養培地を提供する。一般にナノバブル液体は１μｍ以下の粒径の気泡を含む液体のことであり、代表的な液体としては水であり、代表的な気泡としては空気や酸素、オゾン、窒素等が挙げられる。
本発明では、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、粒径の最頻値が５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体、または粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３０％以上含有するナノバブル液体を用いて調製した微生物培養培地とすることができる。ここでのナノバブル液体の初期の溶存酸素濃度は２８ｍｇ／Ｌ以上とすることができる。そして、水に空気ナノバブルまたは酸素ナノバブルを含有するナノバブル液体を用いることが好ましい。
そして、本発明はまた次の特徴を有するナノバブル液体を提供する。
粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有するナノバブル液体とすることができる。また、ナノバブルの粒径の最頻値が５０ｎｍ〜２００ｎｍまたは５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体としたり、初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であるナノバブル液体としたり、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上または３０％以上含有するナノバブル液体とすることができる。こうしたナノバブル液体には、水に空気ナノバブルまたは酸素ナノバブルを含有させたナノバブル液体が例示できる。

別の本発明は、ナノバブル液体を培地に含有させた微生物培養培地で増殖させる微生物の増殖方法を提供する。
特に、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、粒径の最頻値が５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体、または粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３０％以上含有するナノバブル液体を用いて調製した微生物培養培地を用いて微生物を増殖させることができる。

上記微生物培養培地で培養する微生物には好気性微生物が挙げられ、その好気性微生物を好気性グラム陰性菌や、好気性糸状菌とすることができる。そして、こうした微生物には、ＰＣＢｓやＨＣＨｓを分解する好気性グラム陰性菌であるＴＳＫ−１株や、ＰＣＮＢやシマジンを分解するＰＤ６５３株、アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェート等の環状ジエン系化合物を分解する好気性糸状菌であるＤＤＦ株等が挙げられる。

また別の本発明は、上記微生物培養培地や、上記微生物の増殖方法を利用することで、有機塩素系化合物を分解する有機塩素系化合物の分解方法を提供する。

さらに本発明は、ナノバブル液体の製造装置であって、液体を貯蔵する液体貯蔵部と、液体貯蔵部から供給される液体を気体とともに撹拌せん断してナノバブルを生成する気泡生成部と、液体を０℃〜２５℃に冷却可能な冷却部と、を備え、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有するナノバブル液体、ナノバブルの粒径の最頻値が５０ｎｍ〜２００ｎｍ若しくは５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体、初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であるナノバブル液体、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上若しくは３０％以上含有するナノバブル液体、または水に空気ナノバブルまたは酸素ナノバブルを含有するナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体製造装置を提供する。

また、０℃〜２５℃の液体を気体とともに攪拌せん断してナノバブルを生成する工程を含み、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有するナノバブル液体、ナノバブルの粒径の最頻値が５０ｎｍ〜２００ｎｍ若しくは５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブル液体、初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であるナノバブル液体、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上若しくは３０％以上含有するナノバブル液体、または水に空気ナノバブルまたは酸素ナノバブルを含有するナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体の製造方法も提供する。さらに、０℃〜２５℃の環境下でナノバブル液体製造装置を稼動して、前記ナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体の製造方法も提供する。

本発明の微生物培養培地、微生物の増殖方法によれば、微生物を短期間に高密度に培養することができる。特に好気性微生物に対し、激しい振とうを必要とせず、外部からの雑菌の混入等がし難い培養及び増殖を行うことができる。
また、こうした微生物培養培地や微生物の増殖方法を利用して有機塩素系化合物を分解することができる。
さらに、本発明のナノバブル液体の製造方法およびナノバブル液体の製造装置によれば、微生物を培養する好適な微生物培養培地に利用するナノバブル液体を製造することができる。そして本発明のナノバブル液体によれば、微生物を培養する好適な微生物培養培地を製造することができる。

ＴＳＫ−１株の増殖における培養日数とＯＤ_６００との関係を示すグラフ図である。ＴＳＫ−１株の増殖におけるピルビン酸の消費とＯＤ_６００とを表すグラフ図である。ナノバブル数の相違による培養日数とＯＤ_６００との関係を示すグラフ図である。所定の粒径のナノバブルを持つナノバブル酸素水含有培地での培養日数とＯＤ_６００との関係を示すグラフ図である。図４で用いたナノバブル酸素水の粒径分布を示すグラフ図である。ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株培養によるＫＣ４００分解を示すグラフ図である。ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株培養によるＫＣ４００分解によるＣｌ⁻濃度を示すグラフ図である。ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株培養によるＫＣ４００の各種ＰＣＢｓの分解を示すグラフ図である。

ナノバブル液体と、これを用いて調製した微生物培養培地等について、以下に詳細に説明する。
ナノバブル酸素水を含有した微生物培養培地：
ナノバブル液体を用いて調製した微生物培養培地の一例として水にナノバブル酸素水を含有する微生物培養培地について以下に説明する。ナノバブル酸素水を含有した微生物培養培地は、既存の培地の水分を所定のナノバブル酸素水に置き換えて作製したものである。

ナノバブル酸素水：
ナノバブル酸素水は、酸素のナノレベルの微細気泡（酸素ナノバブル）を、水に含有させた酸素水である。ナノレベルの微細気泡とは、直径が１μｍ以下の微細気泡である。こうしたナノバブル酸素水は、粒径が１μｍ以下のナノバブルのうち４００ｎｍ以下のナノバブル数（ナノバブルの気泡数）が、好ましくは５×１０^８個／ｍＬ以上、より好ましくは１０×１０^８個／ｍＬ以上含まれている。この理由は、４００ｎｍ以下のナノバブル数が５×１０^８個／ｍＬ未満であると、ＯＤ_６００の値が０．３まで到らず十分な培養ができないからであり、ナノバブル気泡数が１０×１０^８個／ｍＬ以上であれば、ＯＤ_６００が０．４を超え、ある程度の菌密度になるからである。

ナノバブルの大きさは、その大部分が３０ｎｍ〜４００ｎｍであり、粒径の最頻値は５０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ〜１００ｎｍである。その理由は、最頻値が５０ｎｍより小さくなるような状態は起こりにくく、また最頻値が２００ｎｍより大きいか、または粒径が４００ｎｍを超える気泡が多い場合は、所望の培養効果を奏し難い。ナノバブル液体の調製の容易さの見地からは、最頻値が８０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であることが好ましい。
また、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上含有することは好ましく、３０％以上含有することはより好ましい。粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上含有させれば微生物の増殖を好適に行うことができ、３０％以上含有させれば、微生物を増殖させてＯＤ_６００が０．４を超える場合もあり得る。

こうしたナノバブル酸素水は、初期の溶存酸素濃度（ＤＯ値）が常温（２５℃）で２８ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。この理由は、初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ未満のナノバブル酸素水を利用して微生物の培養をしても十分な培養ができない場合があり、初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であれば、ＯＤ_６００が０．４を超える菌密度になる場合があるからである。

ナノバブル数の測定には、液体中のナノ粒子のブラウン運動の速度を測定し、粒子径を算出する方法を用いることができ、例えば、ナノ粒子解析装置（「NanoSight LM10-SH（商品名）」日本カンタム・デザイン社）等を利用することができる。

初期の溶存酸素濃度は、ナノバブル酸素水製造時の常温での溶存酸素濃度であり、ナノバブル液体製造装置で製造したナノバブル酸素水を保存容器に詰めたときの濃度である。溶存酸素濃度は、ナノバブル酸素水を保存容器に詰めて密閉保存しても徐々に低下するが、初期濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であれば、ナノバブル数を高めることができ好ましい。

溶存酸素濃度の測定には、試薬を使い酸化還元反応を利用する分析法や、溶液中に金属を浸せきし、電圧をかけることで溶存酸素量に応じた電流が流れることを利用した電極法等が知られており、今回の測定には、ポーラロ型酸素電極を用いた。製品としてはポーラログラフ式の溶存酸素センサ（「InLab605（商品名）」メトラートレド社）が知られている。

ナノバブル酸素水を製造するには、水と酸素の混合液体を高速旋回で粉砕してナノバブルを発生させる方法や、酸素を加圧して過飽和の状態で水中に溶解させた後、減圧しナノバブル酸素を析出させる方法、界面活性剤を大量に添加して気液界面張力を十分に低下させてナノバブルを生成する方法、キャビテーションを利用してナノバブルを生成する方法等があるが、急激に収縮・拡大する管路と種々の邪魔板を設けた静的気液混合装置（気泡生成部）内で、気液混合液をせん断することでナノバブル酸素水を製造する方法が好ましい。所望のナノバブル気泡を含むナノバブル酸素水を製造することができるからである。

しかしながら、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有するナノバブル液体、粒径の最頻値が５０ｎｍ〜２００ｎｍまたは５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブルを含有するナノバブル液体、常温で初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上であるナノバブル液体、または粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上または３０％以上含有するナノバブル液体を製造するには、水を貯蔵する液体貯蔵部と、必要により酸素や空気などの気体を供給する気体供給部と、液体貯蔵部から供給された液体を気体とともに撹拌せん断して液体中にナノバブルを生成する気泡生成部と、液体を０℃〜２５℃に、好ましくは０℃〜１０℃に、より好ましくは０℃〜５℃に冷却可能な冷却部とを備えるナノバブル液体製造装置を用いることが好ましい。

特に液体の温度を上記温度に制御するために、液体貯蔵部や、液体貯蔵部から気泡生成部に到る配管、または液体貯蔵部から気泡生成部へ液体を送り出すポンプ、そして気泡生成部、の何れかまたは全てに冷却部を設けることが好ましい。
液体貯蔵部に設ける冷却部は、冷却水を循環させた冷却パイプを液体貯蔵部に入れたもの、同冷却パイプを液体貯蔵部の周囲に組み付けたもの等が挙げられる。こうすることで液体貯蔵部をそのまま冷却部とすることができる。配管やポンプ、気泡生成部に設ける冷却部は、これらの部位の周囲に冷却水の流れる冷却水路を設けたり、冷却パイプを組み付けたり、これらの部位を冷却タンクに浸漬させたりしたものが挙げられる。これらの冷却部の中でも、ポンプと気泡生成部の両方に冷却部を設けることが好ましい。これらの部位での液体の昇温が激しいからである。

上記ナノバブル液体製造装置は、０℃〜２５℃の環境下でナノバブル液体製造装置を稼動することも好適である。具体的には所望の温度に室内を保つ低温室や冷却室の中にナノバブル液体製造装置を設置したり、ナノバブル液体製造装置を設置した室内をエアコン等の冷却装置で所望温度に冷やしたりする方法が挙げられる。

培地：
ナノバブル酸素水を含有した微生物培養培地は、水分以外の成分は既存の培地と同じ組成とした培地である。したがって、培養する微生物の種類に応じて、その微生物に適した培地を選択することが可能である。培地の例として、例えば、ＴＳＫ−１株を培養可能なＴＳＫ培地や、ＰＤ６５３株を培養可能なＲ２Ａ（Ｄｉｆｃｏ）培地、ＤＤＦ株を培養可能なＰＤＡ培地、その他に無機塩培地などの各種培地を挙げることができる。

ＴＳＫ培地は、後述するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株（Sphingomonas sp. TSK-1）株（「ＴＳＫ−１株」ともいう）が生育可能で、Ｃｌ⁻濃度が低く、ＴＳＫ−１株による資化物質の脱塩素分解が判別可能な半合成培地として開発した培地である。
ＴＳＫ培地の組成は、その１Ｌにおいて、ペプトンＣＥ９０Ｍを１．０ｇ、酵母エキスＢＳＰ−Ｂを０．２５ｇ、メチオニンを０．５ｇ、ピルビン酸ナトリウムを０．６ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４を０．０８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを０．０５ｇ含みｐＨは７．２〜７．４である。

ＴＳＫ培地は、ＴＳＫ−１株の培養に適するＲ２Ａ（Ｄｉｆｃｏ）液体培地の Proteose Peptone
No.3 と Bacto Yeast Extract とカザミノ酸を、ペプトンＣＥ９０Ｍと酵母エキスＢＳＰ−Ｂとメチオニンに変えることで、培地中のＣｌ⁻濃度を約６８．１ｍｇ／Ｌから約０．６９ｍｇ／Ｌとして１／１００に減少させ、可溶性デンプンとグルコースを除外してメチオニンを加え、さらにピルビン酸ナトリウムを２倍量にすることで、炭素源を変更したものである。こうしてＴＳＫ培地はＲ２Ａ液体培地よりも増殖を速めることに成功した。

このように栄養源を変更したのは、ＴＳＫ−１株は、可溶性デンプンとグルコースを炭素源として利用する能力がなく、他の栄養源としてはピルビン酸を利用できることができ、また、ピルビン酸量を増やすことで生育を向上させることがわかったからである。メチオニンについては、窒素源を２０種類のアミノ酸の中から検討したところ、メチオニンが最も窒素源として優れており、またピルビン酸とメチオニンを組合せても生育に良い影響を与えることが判明している。

ＰＤＡ培地は、ＰＤＡ培地の１Ｌあたりに、ポテト浸出液末：４．０ｇ、グルコース：
２０．０ｇ、寒天：１５．０ｇ、
として残部を水としたものである。

微生物培養培地の滅菌：
微生物培養培地に対しては、フィルター滅菌による滅菌処理を行うことができる。フィルター滅菌では、ナノバブル気泡が通過し、雑菌を処理しえる０．２μｍ程度のフィルターを用いることが好ましい。フィルター滅菌では比較的大きなサイズのナノバブルの減少が懸念されるが、前記ナノバブル酸素水を用いて微生物培養培地を調製しておけば、その後のこれらの滅菌処理によって、ナノバブル数の減少はほとんどなく所望の培養効果を得ることができる。

培養する微生物：
培地と同様に、培養する微生物は適宜選択することができる。微生物には原核生物に属する細菌、放線菌、ラン藻、真核生物のカビ、酵母、キノコなどの菌類、単細胞藻類、原虫などが含まれるが、好気性グラム陰性菌や、好気性糸状菌を一例としてあげることができ、より具体的には、有機塩素系化合物分解菌であるＴＳＫ−１株や、ＰＤ６５３株、ＤＤＦ株を挙げることもできる。

[ＴＳＫ−１株]
農地には、古くから使われ近年では禁止された農薬などに起因する残留性有機塩素系化合物が微量含まれており、こうした有機塩素系化合物を分解できる種々の分解菌の一例にＴＳＫ−１株が挙げられる。
ＴＳＫ−１株は、スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１（Sphingomonas sp. TSK-1）の略称であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１に受託番号：ＦＥＲＭＰ−２２２２２、受託日：２０１２年３月１日として寄託された微生物である。
この分解菌は、置換塩素数が４までの低塩素化ＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル）や主に４つの異性体（α体、β体、γ体、δ体）を有するＨＣＨｓ（ヘキサクロロシクロヘキサン）を分解し得ることがわかっている。

この分解菌の形態的特徴は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜５．０μｍ）であり、培養的性質はＲ２Ａ寒天培地で３０℃で可能であり、黄色で光沢“＋”、色素産生“＋”であり、Ｒ２Ａ液体培地３０℃で表面発育の有無“−”、培地の混濁の有無“＋”であり、ゼラチン穿刺培地３０℃で生育状態“−”、ゼラチン液化“−”、リトマス・ミルク３０℃で凝固“−”、液化“−”である。
生理的性質は、グラム染色性“−”、硝酸塩の還元“−”、脱窒反応“−”、ＭＲテスト“−”、ＶＰテスト“−”、インドール産生“−”、硫化水素の生成“−”、デンプンの加水分解“−”、クエン酸の利用(Koser)“−”、クエン酸の利用(Christensen)“−”、無機窒素源の利用(硝酸塩)“−”、無機窒素源の利用(アンモニウム塩)“−”、ウレアーゼ活性“−”、カタラーゼ“−”、オキシダーゼ“＋”、生育の範囲はｐＨについてｐH５“−”、ｐH６“＋ｗ”、ｐH７〜９．５“＋”、生育の範囲は温度について１５℃“＋ｗ”、２０℃“＋”、２５℃“＋”、３７℃“−”、嫌気的生育性“−”、Ｏ−Ｆテスト(酸化／発酵)“−／−”である。

また、以下に示す酸産生試験培地組成において、糖類からの酸産生／ガス産生については、Ｌ−アラビノース“−／−”、Ｄ−グルコース“−／−”、Ｄ−フラノース“−／−”、マルトース“−／−”、ラクトース“−／−”、Ｄ−ソルビトール“−／−”、イノシトール“−／−”、Ｄ−キシロース“−／−”、Ｄ−マンノース“−／−”、Ｄ−ガラクトース“−／−”、サッカロース“−／−”、トレハロース“−／−”、Ｄ−マンニトール“−／−”、グリセリン“−／−”である。

酸産生試験培地組成は、Yeast Extract ０．５ｇ、Bacto Proteose Peptone No. 3 ０．５ｇ、Bacto Casamino Acid ０．５ｇ、Soluble Starch ０．５ｇ、Sodium Pyruvate ０．３ｇ、K₂HPO₄ ０．３ｇ、MgSO₄・7H₂O ０．０５ｇ、寒天０．０２ｇ、超純水１０００ｍＬ、0.2％ Phenol Red ０．０５ｍＬ、各糖１０ｇでｐＨは８．０である。
その他の生理学的性質は、β−ガラクトシダーゼ活性“−”、アルギニンジヒドロラーゼ“−”、リジンデカルボキシラーゼ活性“−”、トリプトファンデアミナーゼ活性“−”、ゼラチナーゼ活性“−”である。

なお“＋”は「陽性」、“−”は「陰性」、“ｗ”は「反応弱い」をそれぞれ表す。また、各試験の実施方法は、英国NCIMB研究所の試験方法および１）BARROW,(G.I.) and FELTHAM, (R.K.A): Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical
Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press. ２）坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新細菌培地学講座・下(第二版). 1988, 近大出版３）長谷川武治編著、微生物の分類と同定(下). 学会出版センター 1995. に基づき、また細菌同定キットAP120E,(bioMerieux, France)を用いている。

[ＰＤ６５３株]
ＰＤ６５３株は、ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３（Nocardioides sp. PD653）の略称であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−１０４０５として国際寄託されている分解菌であり、特開２００７−１４２０２号公報にも記載がある。
この分解菌は、ＰＣＮＢ（ペンタクロロニトロベンゼン）やHCB（ヘキサクロロベンゼン）等を分解することがわかっている。

ＰＤ６５３株の菌学的性質は次のとおりである。形態的特徴は、桿菌（０．７〜０．８×１．０〜１．２μｍ）であり、胞子形成は無く、淡黄色、円形、半レンズ状隆起状態、全縁スムーズで不透明、バター様の粘稠度を有するコロニーを形成する。培養的性質はＲ２Ａ寒天培地３０℃にて３〜７日、好気培養を行う。変異や培養条件、生理的状態によるコロニー形態の変化は認められない。運動性“−”、グラム染色“−”である。生理的性質は、カタラーゼ“＋”、オキシダーゼ“−”、酸／ガス産生（グルコース）：“−／−”、Ｏ／Ｆテスト（グルコース）“−／−”、ＧＣ含量：７０．８％である。“＋”、“−”の表記は上記と同様である。

[ＤＤＦ株]
ＤＤＦ株は、ムコールラセモサスＤＤＦ（Mucor racemosus DDF）の略称であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭＰ−２１７７５、受託日：２００９年２月２５日として寄託された微生物であり、詳しくは、特開２０１０−２５２６７３号公報に記載がある。このＤＤＦ株の形態的性状は次の通りである。液体培地中および寒天培地上で分岐を有する基生菌糸に加え、気中菌糸が発達し、胞子嚢を多数形成する。胞子嚢胞子は円形で、その中に数十個の胞子の含有が認められる。また、胞子のう柄先端には瓢箪型の柱軸が確認できる。また、培養性状は、各種栄養寒天培地において、３日間で９センチシャーレを菌糸が覆うほど生育は早い。可溶性色素の分泌は見られないが、気中菌糸に胞子嚢が形成されると、淡い黄色味を帯びてくる。また、１か月以上の長期培養にともない、接合胞子が多数形成され暗黒色を帯びてくるのが認められる。

微生物培養培地を用いた微生物の培養：
微生物培養培地を用いた微生物の培養は、通常の培地を用いた培養と同様に行うことができるが、好気性微生物の培養であっても、培養の最中に培地中に酸素を効果的に取り込む処理を施すことなく培養することができる。例えば振とう培養を行う場合に、振とうを激しくして気相の空気を液層に積極的に取り込む必要はないため振とうの程度を低くすることができ、具体的には４０ｒｐｍ〜１８０ｒｐｍ、好ましくは４０ｒｐｍ〜１２０ｒｐｍの振とうで培養することができる。
このように、培地中にナノバブルとして存在する酸素を利用できるので、培養中に外気を溶存酸素として取り込む必要がなく、密閉系であっても効果的な培養を行うことができる。

有機塩素系化合物の分解方法：
上述のＴＳＫ−１株やＰＤ６５３株、ＤＤＦ株等の有機塩素系化合物分解菌は、ナノバブル酸素水を含有する培地に、分解が必要な有機塩素系化合物を含有させることで、こうした有機塩素系化合物を分解することができる。
即ち、微生物培養培地に分解が必要な有機塩素系化合物を含ませ、微生物を培養すると、微生物の増殖が活発に行われて、有機塩素系化合物の取り込みも活発になり、これらの化合物をより効率的に分解することができる。
有機塩素系化合物の分解は、揮散等により有機塩素系化合物が系外に漏れて環境を汚染することが無いことが求められるが、ナノバブル酸素水を含む微生物培養培地での分解処理は系外に化合物が揮散し易い通気系ではなく、密閉系で行うことができるため、有機塩素系化合物の処理に好適な方法である。

有機塩素系化合物で汚染された土壌の浄化
上述の微生物培養培地や、ナノバブル酸素水の利用の応用として、有機塩素系農薬（またはその農薬が分解して生じた有機塩素系汚染物質）で汚染された農地の浄化を行うことができる。
ＴＳＫ−１株等の有機塩素系化合物分解菌を木炭等の担体に担持させ、この分解菌保持担体を汚染土壌に蒔いたり、混和したりするとともに、定期的に上述のナノバブル酸素水を散水する。こうすることで、汚染土壌が好気的になり分解菌の増殖が促進されて、汚染物質が速やかに分解除去される。こうして汚染土壌は浄化される。

実験例

＜実験例１＞
[ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株の培養（増殖）−その１]
ＴＳＫ培地をナノバブル酸素水（初期ＤＯが４０ｍｇ／Ｌ、ナノバブル数が１０．３×１０^８個／ｍＬ）４００ｍＬで調製しナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を作製した。滅菌処理には、０．２μｍのセルロースフィルターによるフィルター滅菌を行った。一方、対照として、ナノバブル酸素水に代えて蒸留水（ＤＷ）を用いたＴＳＫ培地も作製した。一方、既存の培地で培養していたＴＳＫ−１株（ＯＤ_６００＝０．４７８）の１０ｍＬを集菌し、そのＴＳＫ−１株を０．０５Ｍ、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２５）６ｍＬに再懸濁（ＯＤ_６００＝０．６２７）しておく。
そして、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地の１０ｍＬおよび蒸留水含有ＴＳＫ培地の１０ｍＬをそれぞれ１００ｍＬスリ付き三角フラスコに分注し、上記懸濁液：１ｍＬずつを先の三角フラスコに加え、パラフィルムで密栓した。

培養条件は、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたものは、３０℃、１８０ｒｐｍまたは１２０ｒｐｍ、対照は、３０℃、１８０ｒｐｍの振とう培養とした。培養中に定期的に採取し、増殖したＴＳＫ−１株の菌密度（ＯＤ_６００）を測定する。その結果を図１で示す。

図１より、蒸留水を用いた通常の培地（図１での◆印）では、ＴＳＫ−１株の菌密度がＯＤ値（ＯＤ_６００）で０．２にも満たなかったのに対して、ナノバブル酸素水を用いた微生物培養培地では、１８０ｒｐｍ（図１での▲印）と１２０ｒｐｍ（図１での×印）の何れの場合でもＯＤ値（ＯＤ_６００）が０．３以上になるまでＴＳＫ−１株を増殖できた。

なお、ＰＤ６５３株やＤＤＦ株についても、ＰＤＡ培地やＲ２Ａ（Ｄｉｆｃｏ）培地、無機塩培地等にナノバブル酸素水を用いて調製した培地で好適に増殖する。

＜実験例２＞
[ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株の培養（増殖）−その２]
実験例１と同一の条件でＴＳＫ−１株を培養し、培養７日後のピルビン酸濃度と濁度（ＯＤ_６００）を測定した。その結果を図２で示す。なおこの実験では、１２０ｒｐｍと１８０ｒｐｍのそれぞれの振とう培養において、ｎ数は２として実験を行った。また、実験例１と同様に、対照としては蒸留水を用いた培地を用い１８０ｒｐｍで振とう培養した。

図２で示すように、対照よりもナノバブル酸素水を用いた方が培養が進むことが明らかであり、培養条件の違いでは、１２０ｒｐｍで振とう培養した方が１８０ｒｐｍで振とう培養するよりも残存するピルビン酸の濃度が低く、１２０ｒｐｍの方が培養が進んだことがわかる。ところで、ＴＳＫ−１株は、高酸素の状態でないと増殖が難しい微生物であり、通常の蒸留水を用いて調製したＴＳＫ培地で培養する場合は、１２０ｒｐｍでは酸素の取り込みが少ないためか、１８０ｒｐｍで培養した方が増殖が進むことがわかっている。即ち、通常の蒸留水を用いたＴＳＫ培地では、１２０ｒｐｍよりも１８０ｒｐｍの方がＯＤ_６００は高く、残存するピルビン酸濃度も低い。そこで、今回の実験の対照として１８０ｒｐｍを取り上げているが、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地の場合は、蒸留水を用いた場合とは反対に、１２０ｒｐｍの方が１８０ｒｐｍよりも好ましい結果となった。このことから、ナノバブル酸素水を用いた場合は激しい振とうによって酸素を水中に取り込む必要はなく、菌体へのストレスが少ないゆるやかな振とうの方が増殖に適しているものと考えられる。実際にこの後、振とうの条件を８０ｒｐｍ、４０ｒｐｍにそれぞれ変えて培養する実験を行ったところ、１２０ｒｐｍの場合と略同等の結果となった。

＜実験例３＞
[ナノバブル数と微生物の増殖の関係−その１]
ナノバブル数が異なる３種類のナノバブル酸素水（ＤＯ値は２９．６〜３２．５ｍｇ／Ｌ）を用いてＴＳＫ−１培地を調製し、上記実験例１の手法にてＴＳＫ−１株の培養を行った。その結果を図３で示す。

図３で示すように、ナノバブル数が１１．９１×１０^８個／ｍＬであるナノバブル酸素水を用いた培地は、ＯＤ値（ＯＤ_６００）が０．４以上となったのに対し、ナノバブル数が３．６２×１０^８個／ｍＬ、および０．９２×１０^８個／ｍＬの場合は、ＯＤ値（ＯＤ_６００）が０．２以上、０．３未満であった。一方、通常の蒸留水（ＤＷ）を用いた場合はＯＤ値が０．１５にも満たなかった。この結果より、微生物の培養にナノバブル数が多いナノバブル酸素水含有微生物培養培地を用いた方が微生物の増殖に好適であることがわかる。

＜実験例４＞
[ナノバブル数と微生物の増殖の関係−その２]
粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３８．４％含むナノバブル酸素水（ＤＯ値は２９．６ｍｇ／Ｌ、ナノバブル数は１１．５×１０^８個／ｍＬ；「NBO2水１」）と、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを１０．１％含むナノバブル酸素水（ＤＯ値は３４．０ｍｇ／Ｌ、ナノバブル数は１３．１×１０^８個／ｍＬ；「NBO2水２」）とを用いてＴＳＫ−１培地を調製し、上記実験例３の手法にてＴＳＫ−１株の培養を行った。その結果を図４で示す。また、用いたナノバブル酸素水の粒径分布を図５で示す。

図４より、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３８．４％含むナノバブル酸素水を用いた培地は、培養４日目でＯＤ値（ＯＤ_６００）が０．４５を超え、最大で０．５以上となった。一方、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを１０．１％含むナノバブル酸素水を用いた培地は、ＯＤ_６００が０．２前後までしか上がらなかった。この結果から粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３０％以上含有するナノバブル酸素水を利用する場合にはより速やかに増殖が行われることがわかる。

＜実験例５＞
[ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株によるＰＣＢｓの分解−その１]
ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いて、ＫＣ４００(カネクロールの商品名で販売された塩素含有量約４８％の四塩素化ビフェニルを主成分とするＰＣＢ混合物）の分解試験を行った。
ナノバブル酸素水（初期ＤＯが３４．３ｍｇ／Ｌ、ナノバブル数が１４．３×１０^８個／ｍＬ）を用いて上記例と同様にナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を作製し、これに０．２μｍのフィルター滅菌処理をしておく。そして、ＫＣ４００を１０００ｐｐｍ含むアセトン溶液を準備し、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地にＫＣ４００の終濃度が５ｐｐｍになるようにこのアセトン溶液を添加した。

ＴＳＫ−１株培養液（組成は、培養液１Ｌあたり、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．５ｇ含むリン酸バッファーにＴＳＫ−１株を含みＯＤ_６００＝１．０である）を、前記ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地１０ｍＬに対し１ｍＬ添加し、それから、５０ｍＬの共栓つき三角フラスコで１８０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。１週間後に２２ｍＬのヘキサンを加え、１０分間振とう後、ヘキサン層を１０倍希釈してＧＣ−ＥＣＤでＫＣ４００濃度を分析した。また、水層のＣｌ⁻濃度をイオンクロマトグラフィーで測定した。対照としては、上記ナノバブル酸素水の代わりに蒸留水を用いたもの、およびＴＳＫ−１株を未接種のものを準備した。これらの結果を図６、図７に示す。

図６、図７で示す結果より、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地（ＮＢ−ＴＳＫ培地）を用いると、残存するＫＣ４００量からＫＣ４００を３１．８％脱塩素分解したことがわかる。一方、通常のＴＳＫ培地（ＤＷ−ＴＳＫ培地）を用いると残存するＫＣ４００量からＫＣ４００を１２．６％脱塩素分解したことがわかる。そして、測定したＣｌ⁻濃度から、脱塩素量は、ＮＢ−ＴＳＫ培地がＤＷ−ＴＳＫ培地の１．４倍であることがわかる。

＜実験例６＞
[ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株によるＰＣＢｓの分解−その２]
上記実験例５で行ったＫＣ４００の分解について、ＧＣ−ＥＣＤでの出力をＰＣＢの異性体ごとに分け、ＴＳＫ−１株未接種の対照に対するＰＣＢ残存率を示した。その結果を図８に示す。図８で「Ｎｏ．」は、分析した各種ＰＣＢの通しナンバーであり、ここでＮｏ．３４は、ＩＵＰＡＣナンバー８７の２，２’，３，４，５’−ペンタクロロビフェニルであり、Ｎｏ．３６は、ＩＵＰＡＣナンバー１１０の２，３，３’，４’，６−ペンタクロロビフェニルである。

図８より、ＴＳＫ−１株は、ナノバブル酸素水含有ＴＳＫ培地（ＮＢ−ＴＳＫ培地）で培養すると、蒸留水の場合（ＤＷ−ＴＳＫ培地）に比べ、ＫＣ４００の分解率が高いことがわかる。また、ＴＳＫ−１株は従来の分解菌と異なって、特にNo.３２，No.３５，No.３６，No.３７，No.４０，No.４６，No.５０で顕著なように５Ｃｌ、６Ｃｌを持つＰＣＢｓを効果的に分解することがわかる。

上記実施形態や実験例で説明した微生物や培地、培養条件等は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更すること、例えば上記以外の公知の微生物や培地を利用でき、加える試薬や温度条件等、その他の培養条件の変更も本発明の技術的思想の範囲に含まれるものである。

Claims

ナノバブル液体を用いて調製した培地である微生物培養培地であって、
前記ナノバブル液体は、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、ナノバブルの粒径の最頻値が５０ｎｍ〜１００ｎｍである微生物培養培地。
ナノバブル液体を用いて調製した培地である微生物培養培地であって、
前記ナノバブル液体は、粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有し、粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３０％以上含有する微生物培養培地。
前記ナノバブル液体の初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上である請求項１または請求項２記載の微生物培養培地。
粒径が４００ｎｍ以下のナノバブルを１０×１０^８個／ｍＬ以上含有することを特徴とするナノバブル液体。
粒径の最頻値が５０ｎｍ〜１００ｎｍであるナノバブルを含有する請求項４記載のナノバブル液体。
初期の溶存酸素濃度が２８ｍｇ／Ｌ以上である請求項４または請求項５記載のナノバブル液体。
粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを２０％以上含有する請求項４〜請求項６何れか１項記載のナノバブル液体。
粒径が１００ｎｍ以下のナノバブルを３０％以上含有する請求項４〜請求項６何れか１項記載のナノバブル液体。
ナノバブル液体を培地に含有させた請求項１〜請求項３何れか１項記載の微生物培養培地で増殖させることを特徴とする微生物の増殖方法。
微生物が好気性微生物である請求項９記載の微生物の増殖方法。
有機塩素系化合物の分解方法であって、請求項１〜請求項３何れか１項記載の微生物培養培地、または請求項９若しくは請求項１０記載の微生物の増殖方法を利用する有機塩素系化合物の分解方法。
微生物培養培地に有機塩素系化合物を含ませる請求項１１記載の有機塩素系化合物の分解方法。
ナノバブル液体の製造装置であって、液体を貯蔵する液体貯蔵部と、液体貯蔵部から供給される液体を気体とともに撹拌せん断してナノバブルを生成する気泡生成部と、液体を０℃〜２５℃に冷却可能な冷却部と、を備え、請求項４〜請求項８何れか１項記載のナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体製造装置。
０℃〜２５℃で液体を気体とともに攪拌せん断してナノバブルを生成する工程を含み、請求項４〜請求項８何れか１項記載のナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体の製造方法。
０℃〜２５℃の環境下でナノバブル液体製造装置を稼動する請求項４〜請求項８何れか１項記載のナノバブル液体を製造可能なナノバブル液体の製造方法。