JP7382602B2 - 組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、微小気泡を含む対象物の製造方法、細胞の保存方法、細胞の培養方法、および細胞製剤の製造方法 - Google Patents
組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、微小気泡を含む対象物の製造方法、細胞の保存方法、細胞の培養方法、および細胞製剤の製造方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、微小気泡を含む対象物の製造方法、細胞の保存方法、細胞の培養方法、および細胞製剤の製造方法に関する。
血小板製剤は、原料となる血液から製造後、３日間程度保存される。そして、前記保存期間中に使用されない場合、血小板製剤は、廃棄処分される。このように、血小板製剤は、極めて短期間の保存しかできない。このため、血小板製剤は、慢性的に不足している。また、輸血を受ける人の約８割を高齢者が占め、高齢化の進展により、今後、輸血を受ける人の数が増加すると考えられている。他方、日本では献血者が減少し、２０２７年には、約１００万人分の献血者の血液から得られる血小板製剤が不足すると予測されている（非特許文献１）。このため、血小板等の細胞の保存方法が求められている。
政府広報オンライン、"あなたもご協力を！命が救える身近なボランティア「献血」"、［online］、［平成３０年５月３１日検索］、インターネット<https://www.gov-online.go.jp/useful/article/201307/3.html#anc02>
そこで、本発明は、細胞を保存可能な組成物を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の組成物は、微小気泡を含む。
本発明の細胞保存組成物は、前記本発明の組成物を含む。
本発明の細胞培養組成物は、前記本発明の組成物を含む。
本発明の細胞製剤は、細胞および微小気泡を含む。
本発明の微小気泡を含む対象物の製造方法（以下、「対象物の製造方法」ともいう）は、対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む。
本発明の細胞の保存方法（以下、「保存方法」ともいう）は、微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む。
本発明の細胞の培養方法（以下、「培養方法」ともいう）は、微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む。
本発明の細胞製剤の製造方法は、細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む。
本発明の組成物によれば、細胞を保存できる。
＜組成物＞
本発明の組成物は、前述のように、微小気泡を含む。本発明の組成物は、前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下の抑制、細胞の活性／不活性化の制御、および／または代謝の制御が可能である（以下、「細胞保存効果」ともいう）。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制または機能の保持が可能である（以下、「血小板保存効果」ともいう）。
本発明の組成物は、前述のように、微小気泡を含む。本発明の組成物は、前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下の抑制、細胞の活性／不活性化の制御、および／または代謝の制御が可能である（以下、「細胞保存効果」ともいう）。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制または機能の保持が可能である（以下、「血小板保存効果」ともいう）。
本発明において、「微小気泡」は、気体以外により囲まれた、気体からなる閉じた微小な空間を意味し、例えば、微細気泡ということもできる。前記微小気泡は、例えば、ファインバブルがあげられる。前記ファインバブルは、通常、気泡径が１００μｍ未満の微小気泡を意味する。前記気泡径は、気泡の球相当径を意味する。前記気泡径は、後述の測定方法により得られる微小気泡の平均径（算術平均径）でもよい。前記ファインバブルは、マイクロバブルでもよいし、ウルトラファインバブルでもよい。前記マイクロバブルは、通常、気泡径が１μｍ以上、１００μｍ未満の微小気泡を意味する。前記ウルトラファインバブルは、通常、気泡径が１μｍ未満の微小気泡を意味する。
前記微小気泡は、媒体中に分散して存在する。前記微小気泡は、前記媒体の全体または一部に分散して存在する。後者の場合、前記微小気泡は、前記媒体の一部に局在するということもできる。前記媒体は、例えば、液体または固体があげられる。前記液体は、例えば、水を含む水性溶媒、油性溶媒、またはこれらの混合溶媒等があげられる。また、前記液体は、ゾルを含む。前記固体は、例えば、前記液体を凝固させたものがあげられる。また、前記固体は、ゲルを含む。前記液体および前記固体は、例えば、後述の本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。
前記微小気泡は、任意の種類の気体を含んでよい。前記気体（気体成分）は、例えば、一酸化炭素（ＣＯ）、一酸化窒素（ＮＯ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、水素（Ｈ２）等の生体ガス；ヘリウム（Ｈｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）等の希ガス；二酸化炭素（ＣＯ２）、酸素（Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、窒素（Ｎ２）、メタン（ＣＨ４）、エタン（ＣＨ３ＣＨ３）、プロパン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ３）、フルオロメタン（ＣＨ３Ｆ）、ジフルオロメタン（ＣＨ２Ｆ２）、四フッ化炭素（ＣＦ４）、酸化エチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）、空気等があげられる。本発明において、「生体ガス」は、一酸化炭素（ＣＯ）、一酸化窒素（ＮＯ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、もしくは水素（Ｈ２）を含む気体、またはこれらのうち２種類以上を含む混合気体を意味する。前記微小気泡は、前記細胞保存効果および前記血小板保存効果をより増強できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の組成物において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡がＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、前記細胞保存効果および前記血小板保存効果をさらに増強できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。本発明において、前記「空気」は、例えば、前記微小気泡を製造する際に使用した空気（大気）を意味する。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
前記微小気泡の密度は、前記媒体の体積に対する微小気泡の数を意味する。前記「密度」は、個数濃度ということもできる。前記微小気泡の密度の下限値は、例えば、５×１０５個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ、１×１０７個／ｍＬ、５×１０７個／ｍＬ、１×１０８個／ｍＬ、５×１０８個／ｍＬ、１×１０９個／ｍＬであり、好ましくは、１×１０６個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ、１×１０７個／ｍＬ、５×１０７個／ｍＬ、１×１０８個／ｍＬ、５×１０８個／ｍＬである。前記微小気泡の密度の上限値は、例えば、１．５×１０９個／ｍＬ、２×１０９個／ｍＬ、３×１０９個／ｍＬ、５×１０９個／ｍＬ、７×１０９個／ｍＬ、９×１０９個／ｍＬ、１×１０１０個／ｍＬ、５×１０１０個／ｍＬ、１×１０１１個／ｍＬ、５×１０１１個／ｍＬ、１×１０１２個／ｍＬ、５×１０１２個／ｍＬである。前記微小気泡の密度の範囲は、例えば、５×１０５個／ｍＬ～５×１０１２個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ～１×１０１２個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ～５×１０１１個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ～１×１０１１個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ～５×１０１０個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ～１×１０１０個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ～９×１０９個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ～９×１０９個／ｍＬ、１×１０７個／ｍＬ～７×１０９個／ｍＬ、５×１０７個／ｍＬ～７×１０９個／ｍＬ、１×１０８個／ｍＬ～５×１０９個／ｍＬ、５×１０８個／ｍＬ～５×１０９個／ｍＬ、１×１０９個／ｍＬ～３×１０９個／ｍＬ、５×１０８個／ｍＬ～２×１０９個／ｍＬ、５×１０８個／ｍＬ～１．５×１０９個／ｍＬである。
前記微小気泡の密度、気泡径および平均径（以下、「特性」ともいう）は、前記微小気泡が分散されている媒体に応じて、適宜測定できる。前記微小気泡が液体の媒体に分散されている場合、前記微小気泡の特性は、本発明の組成物における気泡について粒子軌跡解析法で解析することにより算出できる。前記粒子軌跡解析法は、例えば、後述の実施例１に準じ、NanoSight（登録商標）NS300（Malvern Instrument社製）を用いて実施できる。前記微小気泡の特性は、粒子軌跡解析法以外の他の解析方法により算出してもよい。この場合、他の解析方法で得られた微小気泡の特性は、前記粒子軌跡解析法で得られる算出値に変換した際に前述の例示を満たす。前記微小気泡が固体の媒体に分散されている場合、前記微小気泡の特性は、前記媒体の固化前の液体における微小気泡の特性および固体の媒体を溶解することで得られる液体における微小気泡の特性に基づき、算出できる。
前記気体がＣＯを含む場合、前記気体に占めるＣＯの割合は、例えば、０％を超え、１００％以下、１０～９０％、１０～８０％、１５～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％であり、好ましくは、２０～３０％である。
前記気体がＨ２Ｓを含む場合、前記気体に占めるＨ２Ｓの割合は、例えば、０％を超え、１００％以下、１０～９０％、１０～８０％、１５～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％であり、好ましくは、２０～３０％である。
前記気体がＯ２を含む場合、前記気体に占めるＯ２の割合は、例えば、０％を超え、１００％未満、１０～９０％、２０～９０％、３０～９０％、４０～８５％、５０～８５％、６０～８５％、好ましくは、７０～８０％である。
前記気体が、ＣＯおよびＯ２を含む場合、一酸化炭素の体積（ＶＣＯ）と酸素の体積（ＶＯ２）との体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、例えば、１：９～９：１である。前記体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、例えば、後述の細胞の保存または培養時において、前記細胞の生存率の低下を抑制でき、また、血小板保存時において、血小板の減少を抑制できることから、好ましくは、１．５：８．５～２．５：７．５、２：８～３：７である。前記体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、例えば、前記空気における体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）を除く。
前記気体が、Ｈ２ＳおよびＯ２を含む場合、硫化水素の体積（ＶＨ２Ｓ）と酸素の体積（ＶＯ２）との体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）は、例えば、１：９～９：１である。前記体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、例えば、後述の細胞の保存または培養時において、前記細胞の生存率の低下を抑制でき、また、血小板保存時において、血小板の減少を抑制できることから、好ましくは、１．５：８．５～２．５：７．５、２：８～３：７である。前記体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）は、例えば、前記空気における体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）を除く。
本発明の組成物は、例えば、任意の気体を用いて、ファインバブル等の微小気泡の製造方法により製造できる。このため、本発明の組成物の製造方法は、例えば、任意の気体と、媒体とを用いて、微小気泡を製造する気泡製造工程を含む。具体例として、本発明の組成物が液体の場合、前記液体の組成物は、例えば、任意の気体と、前記媒体と、旋回流方式、エゼクター式、ベンチュリ式、スタティックミキサー方式、微細孔方式、加圧溶解式、または超音波キャビテーション式の微小気泡の製造装置とを用いて、製造できる。また、本発明の組成物が固体の場合、前記固体の組成物は、前記液体の組成物を、公知の方法で凝固することにより製造できる。前記固体がゲルの場合、ゲルの組成物は、例えば、前記液体の組成物を、ゲル化剤と混合することにより製造できる。前記気泡製造工程の開始時において、前記任意の気体の状態は、気体、液体、または固体である。本発明の組成物は、例えば、後述の本発明の対象物の製造方法により製造できる。前記任意の気体は、前述の気体の説明を援用できる。前記任意の気体は、複数種類の気体でもよい。この場合、各気体を別個に、前記気泡製造工程に供してもよいし、前記任意の気体の全部または一部を同時に前記気泡製造工程に供してもよい。具体例として、前記気体がＣＯおよびＯ２の場合、ＣＯおよびＯ２は、同時に導入されてもよいし、別個に導入されてもよい。
本発明の組成物は、例えば、界面活性剤等の他の成分を含んでもよい。前記界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等のイオン性界面活性剤、または非イオン界面活性剤があげられる。前記アニオン系界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等のモノアルキルアニオン性界面活性剤等があげられる。前記カチオン性界面活性剤は、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド等のジアルキルカチオン界面活性剤等があげられる。前記非イオン系界面活性剤は、例えば、オクチルフェノールエトキシレート等のエーテル型非イオン系界面活性剤等があげられる。本発明の組成物は、例えば、界面活性剤、好ましくは、カチオン性界面活性剤を含むことにより、前記微小気泡の密度を向上させることができる。
本発明の組成物は、前述のように、血小板等の細胞を保存できる。このため、本発明の組成物は、例えば、細胞保存液、細胞凍結保存液等の細胞保存組成物；培地等の細胞培養組成物；細胞製剤等として好適に使用できる。
＜細胞保存組成物＞
本発明の細胞保存組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞保存組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞保存組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の保存方法を簡便に実施できる。本発明の細胞保存組成物は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞保存組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞保存組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞保存組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の保存方法を簡便に実施できる。本発明の細胞保存組成物は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
本発明において、「細胞」は、単離された細胞、細胞から構成される細胞シート、および細胞成分を意味し、いずれを意味してもよい。具体例として、前記細胞は、例えば、精子、卵子等の生殖細胞；embryonic stem（ＥＳ）細胞、induced pluripotent stem（ｉＰＳ）細胞等の多能性細胞；赤血球、白血球等の血球系細胞；ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸部類上皮腫）等の培養細胞等があげられる。前記細胞シートは、例えば、心筋シート、粘膜細胞シート等があげられる。前記細胞シートは、例えば、１種類以上の細胞シートを積層した積層体でもよい。前記細胞成分は、例えば、血小板、ミトコンドリア等があげられる。前記細胞は、例えば、生体から単離した細胞でもよいし、embryonic stem（ＥＳ）細胞、induced pluripotent stem（ｉＰＳ）細胞等の多能性細胞、幹細胞等の細胞から分化および誘導することで調製した細胞、細胞シートまたは細胞成分でもよい。前記細胞は、生体の一部および臓器を除く。
前記細胞の由来は、例えば、動物である。前記動物は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類動物、ハエ等の非哺乳類動物があげられる。
本発明の細胞保存組成物において、「細胞保存」は、細胞をそのままの状態に保つこと、および保存後の使用時において、前記細胞がその機能を発揮できる状態に保つことを意味し、いずれを意味してもよい。
本発明の細胞保存組成物において、前記微小気泡は、任意の種類の気体を含んでよい。前記気体は、例えば、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記微小気泡は、細胞保存時における細胞の生存率の低下をより抑制でき、血小板保存時における血小板数の減少をより抑制できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の細胞保存組成物において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡がＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、細胞保存時における細胞の生存率の低下をさらに抑制でき、血小板保存時における血小板数の減少をさらに抑制できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
本発明の細胞保存組成物において、前記微小気泡は、媒体中に分散して存在する。前記媒体は、例えば、液体または固体があげられる。前記液体および前記固体は、例えば、前記本発明の組成物の説明および後述の本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。
本発明の細胞保存組成物において、前記微小気泡の特性、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞保存組成物は、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、細胞の保存に用いられる一般的な成分があげられ、例えば、緩衝剤；アミノ酸、糖、ビタミン等の栄養成分；成長因子等のタンパク質；ＤＭＳＯ等の凍結保存剤；塩；血清、血漿等の血液成分；前記界面活性剤；等があげられる。前記他の成分は、例えば、CELL BANKER（登録商標）、Cryostem（商標）Freezing Medium等の市販の製品を含んでもよい。
＜細胞培養組成物＞
本発明の細胞培養組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞培養組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞培養組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の培養方法を簡便に実施できる。本発明の細胞培養組成物は、例えば、前記本発明の組成物および細胞保存組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞培養組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞培養組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞培養組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の培養方法を簡便に実施できる。本発明の細胞培養組成物は、例えば、前記本発明の組成物および細胞保存組成物の説明を援用できる。
本発明において、「細胞培養」は、例えば、細胞の生育、増殖および維持（継代維持）を意味し、いずれを意味してもよい。
本発明の細胞培養組成物において、前記微小気泡は、任意の気体を含んでよい。前記気体は、例えば、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記微小気泡は、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の細胞培養組成物において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡がＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
本発明の細胞培養組成物において、前記微小気泡は、媒体中に分散して存在する。前記媒体は、例えば、液体または固体があげられる。前記液体および前記固体は、例えば、前記本発明の組成物の説明および後述の本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。
本発明の細胞培養組成物において、前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞培養組成物は、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、細胞の培養に用いられる一般的な成分があげられる。前記他の成分は、例えば、前記本発明の細胞保存組成物における他の成分の説明を援用できる。本発明の細胞培養組成物は、例えば、前記他の成分として、抗生物質を含んでもよい。
＜細胞製剤＞
本発明の細胞製剤は、前述のように、細胞および微小気泡を含む。本発明の細胞製剤は、前記細胞および前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる血小板の血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞製剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、および細胞培養組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤は、前述のように、細胞および微小気泡を含む。本発明の細胞製剤は、前記細胞および前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる血小板の血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞製剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、および細胞培養組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤において、前記微小気泡は、媒体中に分散して存在する。前記媒体は、例えば、液体または固体があげられる。前記液体および前記固体は、例えば、前記本発明の組成物の説明および後述の本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤において、前記細胞と前記微小気泡とは、共存しており、前記細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をより抑制でき、前記細胞製剤に含まれる血小板の血小板数の減少をより抑制できることから、前記細胞と前記微小気泡とは、混在していることが好ましい。
本発明の細胞製剤において、前記微小気泡、前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。また、本発明の細胞製剤は、例えば、後述の本発明の細胞製剤の製造方法により、製造できる。
前記細胞製剤は、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、血小板等の細胞の安定化剤等があげられる。また、前記他の成分は、前記本発明の細胞保存組成物における他の成分を含んでもよい。
＜微小気泡を含む対象物の製造方法＞
本発明の微小気泡を含む対象物の製造方法は、前述のように、対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む。本発明の対象物の製造方法は、前記導入工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制可能な対象物を製造できる。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の血小板保存時における血小板数の減少を抑制可能な対象物を製造できる。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、本発明の組成物を製造できる。このため、本発明の対象物の製造方法は、本発明の組成物の製造方法ということもできる。本発明の対象物の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、および細胞製剤の説明を援用できる。
本発明の微小気泡を含む対象物の製造方法は、前述のように、対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む。本発明の対象物の製造方法は、前記導入工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制可能な対象物を製造できる。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の血小板保存時における血小板数の減少を抑制可能な対象物を製造できる。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、本発明の組成物を製造できる。このため、本発明の対象物の製造方法は、本発明の組成物の製造方法ということもできる。本発明の対象物の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、および細胞製剤の説明を援用できる。
前記導入工程では、対象物に微小気泡を導入する。前記導入工程において、前記対象物の物性は、液体でもよいし、固体でもよい。前記液体は、ゾルを含み、前記固体は、ゾルを含む。前記対象物は、例えば、水等の水性溶媒；油性溶媒；細胞保存液、細胞凍結保存液等の細胞保存組成物；培地等の細胞培養組成物；製剤用の基剤、これらの混合溶媒等があげられる。
前記導入工程において、前記対象物への微小気泡の導入方法は、例えば、前記対象物と、任意の気体とを用いて、前記微小気泡を導入してもよいし、前記対象物と、前記微小気泡を含む媒体とを接触させる、または混合することにより、前記微小気泡を導入してもよい。前者の場合、前記導入工程は、例えば、前記本発明の組成物における気泡製造工程と同様にして実施できる。後者の場合、前記導入工程は、例えば、前記対象物と、前記本発明の組成物とを接触させる、または混合することにより実施できる。前記導入工程は、前記細胞保存効果または前記血小板保存効果をより増強できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を用いて、前記微小気泡を導入することが好ましい。また、前記導入工程において、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を用いて微小気泡を導入する場合、前記導入工程は、前記細胞保存効果または前記血小板保存効果をさらに増強できることから、Ｏ２を用いて、前記微小気泡を導入することが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
前記対象物に導入する気体は、任意の気体である。前記任意の気体は、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記任意の気体は、複数種類の気体でもよい。前記対象物に対して、複数種類の気体を含む微小気泡を導入する場合、１種類以上の気体を別個に導入してもよいし、複数種類の気体を同時に導入してもよい。具体例として、前記気体がＣＯおよびＯ２の場合、ＣＯおよびＯ２は、同時に導入されてもよいし、別個に導入されてもよい。前記対象物に導入する気体は、例えば、空気のみを除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
前記導入工程において、前記対象物に導入される前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
前記導入工程は、例えば、界面活性剤の存在下で実施してもよい。前記導入工程を界面活性剤の存在下で実施することにより、得られた対象物における微小気泡の密度を向上できる。
＜細胞の保存方法＞
本発明の細胞の保存方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む。本発明の保存方法は、前記微小気泡の存在下、前記細胞を保存する保存工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の保存方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、および対象物の製造方法の説明を援用できる。
本発明の細胞の保存方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む。本発明の保存方法は、前記微小気泡の存在下、前記細胞を保存する保存工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の保存方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、および対象物の製造方法の説明を援用できる。
前記保存工程では、微小気泡の存在下、細胞を保存する。具体的に、前記保存工程では、前記微小気泡を含む媒体の存在下、細胞を保存する。前記媒体は、例えば、前記本発明の組成物における媒体の説明および前記本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。具体例として、前記保存工程では、前記細胞を含む液体と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を保存してもよいし、前記細胞と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を保存してもよい。
前記保存工程において、前記細胞を保存する保存条件は、例えば、前記細胞の種類および公知の保存条件に基づき、実施できる。具体例として、前記媒体が液体であり、常圧（約1013hPa）の場合、前記細胞の保存温度は、例えば、－１９３℃～３７℃、０～３７℃、４～３７℃である。また、前記媒体が固体であり、常圧の場合、保存温度は、例えば、－１９３℃～０℃である。前記媒体が液体であり、常圧の場合、保存温度は、例えば、４～３７℃である。前記細胞の保存期間の下限は、例えば、０日である。前記保存期間の上限は、特に制限されない。前記媒体が液体であり、保存温度が常温の場合、前記保存期間は、例えば、７日である。前記保存工程において、前記細胞は、無菌状態であることが好ましい。また、前記保存工程において、保存時のｐＨは、例えば、６．５～８．５である。
本発明の保存方法において、前記微小気泡は、気体として、任意の気体を含んでよい。前記気体は、例えば、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記微小気泡は、細胞保存時における細胞の生存率の低下をより抑制でき、血小板保存時における血小板数の減少をより抑制できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の保存方法において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡がＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、細胞保存時における細胞の生存率の低下をさらに抑制でき、血小板保存時における血小板数の減少をさらに抑制できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
本発明の保存方法において、前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物および対象物の製造方法の説明を援用できる。
＜細胞の培養方法＞
本発明の細胞の培養方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む。本発明の培養方法は、前記微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の培養方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の培養方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、および保存方法の説明を援用できる。
本発明の細胞の培養方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む。本発明の培養方法は、前記微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の培養方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の培養方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、および保存方法の説明を援用できる。
前記培養工程では、微小気泡の存在下、細胞を培養する。具体的に、前記培養工程では、前記微小気泡を含む媒体の存在下、細胞を培養する。前記媒体は、例えば、前記本発明の組成物における媒体の説明および前記本発明の対象物の製造方法における対象物の説明を援用できる。具体例として、前記培養工程では、前記細胞を含む液体と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を培養してもよいし、前記細胞と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を培養してもよい。
前記培養工程において、前記細胞を培養する培養条件は、例えば、前記細胞の種類および公知の培養条件に基づき、実施できる。具体例として、前記媒体が液体であり、常圧の場合、前記細胞の培養温度は、例えば、３５～４２℃、３６～４０℃、３７～３９℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、５～１５％である。Ｏ２濃度は、例えば、１５～２５％、２０％である。前記細胞を継代しない場合、前記細胞の培養期間は、例えば、０～７日である。前記細胞を継代する場合、前記培養期間は、例えば、０～９０日である。前記細胞培養は、５％程度のＣＯ２雰囲気下で実施することが好ましい。また、前記細胞培養は、湿度１００％程度で実施することが好ましい。
本発明の培養方法において、前記微小気泡は、気体として、任意の気体を含んでもよい。前記気体は、例えば、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記微小気泡は、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の培養方法において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡がＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
本発明の培養方法において、前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物および対象物の製造方法の説明を援用できる。
＜細胞製剤の製造方法＞
本発明の細胞製剤の製造方法は、前述のように、細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む。本発明の細胞製剤の製造方法は、前記細胞と前記微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をより抑制できる。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる血小板数の減少をより抑制できる。また、本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、前記本発明の細胞製剤を製造できる。本発明の細胞製剤の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤の製造方法は、前述のように、細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む。本発明の細胞製剤の製造方法は、前記細胞と前記微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をより抑制できる。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる血小板数の減少をより抑制できる。また、本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、前記本発明の細胞製剤を製造できる。本発明の細胞製剤の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
前記製剤工程では、前記細胞と前記微小気泡とを接触させる、または混合することにより、細胞製剤を製造する。具体例として、前記製剤工程では、前記細胞を含む液体と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を前記細胞製剤としてもよいし、前記細胞と前記微小気泡を含む媒体とを接触または混合し、得られた混合物を前記細胞製剤としてもよい。また、前記製剤工程では、他の成分を添加してもよい。前記他の成分は、例えば、前記本発明の細胞製剤における他の成分の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤の製造方法において、前記微小気泡は、任意の気体を含んでもよい。前記気体は、例えば、前記本発明の組成物における気体（気体成分）の説明を援用できる。前記微小気泡は、得られた細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をより抑制でき、得られた細胞製剤に含まれる血小板数の減少をより抑制できることから、ＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含むことが好ましい。前記微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。後者の場合、本発明の細胞製剤の製造方法において、各微小気泡は、１種類または複数種類の気体を含む。前記微小気泡が、気体としてＣＯおよびＨ２Ｓの少なくとも一方を含む場合、前記微小気泡は、得られた細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をさらに抑制でき、得られた細胞製剤に含まれる血小板数の減少をさらに抑制できることから、Ｏ２を含むことが好ましい。前記微小気泡は、例えば、気体が、空気のみである場合を除く。前記微小気泡における気体は、医療用ガスグレードが存在する気体である場合、医療用ガスに由来する気体であることが好ましい。
本発明の細胞製剤の製造方法において、前前記微小気泡の特性、気体の濃度、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、またはＯ２の割合、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）、製造方法等は、例えば、前記本発明の組成物および対象物の製造方法の説明を援用できる。
＜微小気泡の密度向上剤＞
本発明の微小気泡の密度向上剤（以下、「向上剤」ともいう）は、有効成分として、界面活性剤を含む。本発明の微小気泡の密度向上剤は、有効成分として、界面活性剤を含むことが特徴であり、その他の構成および特徴は、特に制限されない。本発明の向上剤によれば、微小気泡を含む媒体を製造する際に、得られた生産物における微小気泡の密度を向上できる。本発明の向上剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
本発明の微小気泡の密度向上剤（以下、「向上剤」ともいう）は、有効成分として、界面活性剤を含む。本発明の微小気泡の密度向上剤は、有効成分として、界面活性剤を含むことが特徴であり、その他の構成および特徴は、特に制限されない。本発明の向上剤によれば、微小気泡を含む媒体を製造する際に、得られた生産物における微小気泡の密度を向上できる。本発明の向上剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
本発明の向上剤の剤型は、特に制限されず、例えば、錠剤、液剤、顆粒剤、散剤等があげられる。本発明の向上剤は、界面活性剤以外の成分を含んでもよい。この場合、本発明の向上剤は、例えば、微小気泡の密度向上組成物ということもできる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
［実施例１］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
（１）組成物の製造
本発明の組成物は、図１に示すベンチュリ式の微小気泡の製造装置１００を用いて製造した。図１に示すように、製造装置１００は、モータ１を基準として、チューブ２ａ、ベンチュリ管３ａ、接続管４ａ、４ｂ、チューブ２ｂ、ベンチュリ管３ｂ、および接続管４ｃが、この順序で互いに連通するように接続された循環系の流路を有する。ベンチュリ管３ａの側面の突出部に形成された開口は、封止されている。また、ベンチュリ管３ｂの側面の突出部に形成された開口は、三方活栓５と連通するように接続されている。まず、三方活栓５を開放し、三方活栓５からＤＭＥＭ培地を製造装置１００内の流路に導入した。この際に、前記流路内に気体が含まれないように充填した。また、充填したＤＭＥＭ培地の液量を併せて測定した。つぎに、一酸化炭素（住友精化株式会社製、ＣＯ濃度：99.999(v/v)%）および医療用酸素（住友精化株式会社製、Ｏ２濃度：99.999(v/v)%）を、導入したＤＭＥＭ培地１００ｍＬに対して約２０ｍＬ（約１０ｍＬガス／５０ｍＬ溶媒（ＤＭＥＭ培地））となるように前記流路に導入し、三方活栓５を閉鎖した。前記流路に導入された一酸化炭素および酸素の体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９、または０：１０とした。そして、モータ１にて、前記流路内のＤＭＥＭ培地水および空気を５～１０分間循環させることにより、微小気泡を形成することで、組成物を製造した。なお、モータ１で前記ＤＭＥＭ培地を循環させる際の流速は、３．６Ｌ／分とした。
本発明の組成物は、図１に示すベンチュリ式の微小気泡の製造装置１００を用いて製造した。図１に示すように、製造装置１００は、モータ１を基準として、チューブ２ａ、ベンチュリ管３ａ、接続管４ａ、４ｂ、チューブ２ｂ、ベンチュリ管３ｂ、および接続管４ｃが、この順序で互いに連通するように接続された循環系の流路を有する。ベンチュリ管３ａの側面の突出部に形成された開口は、封止されている。また、ベンチュリ管３ｂの側面の突出部に形成された開口は、三方活栓５と連通するように接続されている。まず、三方活栓５を開放し、三方活栓５からＤＭＥＭ培地を製造装置１００内の流路に導入した。この際に、前記流路内に気体が含まれないように充填した。また、充填したＤＭＥＭ培地の液量を併せて測定した。つぎに、一酸化炭素（住友精化株式会社製、ＣＯ濃度：99.999(v/v)%）および医療用酸素（住友精化株式会社製、Ｏ２濃度：99.999(v/v)%）を、導入したＤＭＥＭ培地１００ｍＬに対して約２０ｍＬ（約１０ｍＬガス／５０ｍＬ溶媒（ＤＭＥＭ培地））となるように前記流路に導入し、三方活栓５を閉鎖した。前記流路に導入された一酸化炭素および酸素の体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）は、１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９、または０：１０とした。そして、モータ１にて、前記流路内のＤＭＥＭ培地水および空気を５～１０分間循環させることにより、微小気泡を形成することで、組成物を製造した。なお、モータ１で前記ＤＭＥＭ培地を循環させる際の流速は、３．６Ｌ／分とした。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）により得られた組成物について、約２時間静置後、NanoSight（登録商標）NS300（Malvern Instrument社製）を用い、デフォルトのパラメータで、前記組成物の物性を測定した。なお、前記測定は、２５℃で行なった。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１１４．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．４６×１０８個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）により得られた組成物について、約２時間静置後、NanoSight（登録商標）NS300（Malvern Instrument社製）を用い、デフォルトのパラメータで、前記組成物の物性を測定した。なお、前記測定は、２５℃で行なった。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１１４．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．４６×１０８個／ｍＬであった。
（３）細胞の保存
ラット心臓横紋筋細胞（H9c2細胞、浜松医科大学より入手）の細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種後、１～２日間培養した。培地の組成は、前記組成物に、１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を添加したものとした。また、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。なお、１０％ＦＣＳ添加後の培養液における微小気泡の密度は、５．８１×１０８個／ｍＬであると推定される。
ラット心臓横紋筋細胞（H9c2細胞、浜松医科大学より入手）の細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種後、１～２日間培養した。培地の組成は、前記組成物に、１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を添加したものとした。また、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。なお、１０％ＦＣＳ添加後の培養液における微小気泡の密度は、５．８１×１０８個／ｍＬであると推定される。
前記添加後、４℃の条件下で、２４時間前記ディッシュを保存した。さらに、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間培養後、ＭＴＴアッセイキット（CellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、プロメガ株式会社製）を用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた以外は同様にして、測定した。これらの結果を図２に示す。
図２は、細胞の生存率を示すグラフである。図２において、横軸は、微小気泡が含む気体の種類および体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）を示し、縦軸は、吸光度を示す。図２に示すように、ＣＯおよびＯ２またはこれらの混合気体を含む微小気泡を含む組成物は、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。また、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝２：８～３：７の組成物は、細胞の生存率が著しく向上した。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることがわかった。
［実施例２］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、血小板を保存できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、血小板を保存できることを確認した。
（１）組成物の製造
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とした以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とした以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例２（１）の組成物を用い、約２時間静置した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、９３．６ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．８７×１０８個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例２（１）の組成物を用い、約２時間静置した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、９３．６ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．８７×１０８個／ｍＬであった。
（３）血小板の保存
血小板は、ウサギの耳静脈由来の末梢血から調製した。具体的には、ウサギの耳静脈から１回につき８ｍＬの採血後、得られた血液に対して、３ｍＬの抗凝固液（１０％ＡＣＤ－Ａ液、３．１３％クエン酸ナトリウム）を加え軽く振とうした。つぎに、振とう後の血液に対して２回遠心分離を実施することにより血小板を分離した。まず、２４℃の条件下で、ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：多血小板血漿）の調製法に準じて２００×ｇで１０分間遠心分離を実施した。つぎに、得られたＰＲＰに対して、２４℃の条件下で、２０００×ｇで１０分間、再度遠心分離を実施し、血小板を分離した。得られた血小板５×１０６個／ｍＬ～２×１０７個／ｍＬに対し、微小気泡の密度が、５×１０８個／ｍＬとなるように、前記組成物を添加した。得られた混合物について、常温（約２５℃）で３日間保存した。また、保存開始時および保存後、１、２、または３日目において、血小板の数をカウントした。そして、保存開始時の血小板数を１００％として、保存後１、２、または３日目における血小板数の増減率を算出した（実施例）。比較例は、ＡＣＤ－Ａ液を用いた以外は、同様にして血小板数の増減率を算出した。これらの結果を図３に示す。
血小板は、ウサギの耳静脈由来の末梢血から調製した。具体的には、ウサギの耳静脈から１回につき８ｍＬの採血後、得られた血液に対して、３ｍＬの抗凝固液（１０％ＡＣＤ－Ａ液、３．１３％クエン酸ナトリウム）を加え軽く振とうした。つぎに、振とう後の血液に対して２回遠心分離を実施することにより血小板を分離した。まず、２４℃の条件下で、ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：多血小板血漿）の調製法に準じて２００×ｇで１０分間遠心分離を実施した。つぎに、得られたＰＲＰに対して、２４℃の条件下で、２０００×ｇで１０分間、再度遠心分離を実施し、血小板を分離した。得られた血小板５×１０６個／ｍＬ～２×１０７個／ｍＬに対し、微小気泡の密度が、５×１０８個／ｍＬとなるように、前記組成物を添加した。得られた混合物について、常温（約２５℃）で３日間保存した。また、保存開始時および保存後、１、２、または３日目において、血小板の数をカウントした。そして、保存開始時の血小板数を１００％として、保存後１、２、または３日目における血小板数の増減率を算出した（実施例）。比較例は、ＡＣＤ－Ａ液を用いた以外は、同様にして血小板数の増減率を算出した。これらの結果を図３に示す。
図３は、血小板数の増減率を示すグラフである。図３において、横軸は、保存日数を示し、縦軸は、血小板数の増減率を示す。図３に示すように、いずれの保存日数においても、実施例は、比較例と比較して、血小板数が極めて増加しており、且つ血小板数が保存日数によらず一定であった。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、血小板を保存できることがわかった。
［実施例３］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、腎臓を保存できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、腎臓を保存できることを確認した。
（１）組成物の製造
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、ＤＭＥＭに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック（大塚製薬株式会社製）またはUniversity of Wisconsin（ＵＷ）液とした。以下、ラクテックおよびＵＷ液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Ｌおよび組成物ＵＷともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例１（１）および（２）と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、ＤＭＥＭに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック（大塚製薬株式会社製）またはUniversity of Wisconsin（ＵＷ）液とした。以下、ラクテックおよびＵＷ液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Ｌおよび組成物ＵＷともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例１（１）および（２）と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
（２）腎臓の調製
死後３０または４０分経過したラットより腎臓を摘出し、前記組成物Ｌを腎臓の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物ＵＷに浸漬した。この状態で、４℃で１時間または２時間、腎臓を保存した。前記保存後の腎臓に対して、前記組成物ＵＷを用いて体外循環を実施した。そして、体外循環開始後、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分後において、尿管から得られた尿量（積算値）を計測することにより腎機能を評価した（実施例）。また、比較例は、前記灌流保存液を用いた以外は、同様にして腎機能を評価した。これらの結果を図４に示す。
死後３０または４０分経過したラットより腎臓を摘出し、前記組成物Ｌを腎臓の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物ＵＷに浸漬した。この状態で、４℃で１時間または２時間、腎臓を保存した。前記保存後の腎臓に対して、前記組成物ＵＷを用いて体外循環を実施した。そして、体外循環開始後、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００分後において、尿管から得られた尿量（積算値）を計測することにより腎機能を評価した（実施例）。また、比較例は、前記灌流保存液を用いた以外は、同様にして腎機能を評価した。これらの結果を図４に示す。
図４は、死後４０分間経過した腎臓について、１時間保存後の腎臓の尿量を示すグラフである。図４において、横軸は、体外循環開始後の時間を示し、縦軸は、尿量を示す。図４の示すように、いずれの時間においても、実施例は、比較例と比較して、尿量が増加した。すなわち、実施例は、比較例と比較して、腎機能が維持されていることがわかった。また、実施例と比較例との尿量差は、体外循環開始後５０分以降において特に顕著となった。この結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物によれば、再灌流時の腎臓障害を抑制でき、これにより、移植後に腎機能を回復できることがわかった。なお、死後３０分間経過した腎臓を４℃で２時間保存した場合も同様であった。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、腎臓を保存できること、すなわち、細胞シートの積層体のような複雑な構造物を保存できることがわかった。
［実施例４］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
（１）組成物の製造
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素（住友精化株式会社製）および医療用酸素を用い、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）＝２：８とした以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素（住友精化株式会社製）および医療用酸素を用い、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）＝２：８とした以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例４（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１１５．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．３２×１０８個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例４（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１１５．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．３２×１０８個／ｍＬであった。
（３）細胞の保存
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例４（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた以外は、同様にして測定した。これらの結果を図５に示す。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例４（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた以外は、同様にして測定した。これらの結果を図５に示す。
図５は、細胞の生存率を示すグラフである。図５において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、吸光度を示す。図５に示すように、Ｈ２Ｓを含む微小気泡を含む組成物は、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることがわかった。
［実施例５］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、肺を保存できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、肺を保存できることを確認した。
（１）組成物の製造
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、ＤＭＥＭに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック（大塚製薬株式会社製）またはUniversity of Wisconsin（ＵＷ）液とした。以下、ラクテックおよびＵＷ液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Ｌおよび組成物ＵＷともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例１（１）および（２）と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、ＤＭＥＭに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック（大塚製薬株式会社製）またはUniversity of Wisconsin（ＵＷ）液とした。以下、ラクテックおよびＵＷ液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Ｌおよび組成物ＵＷともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例１（１）および（２）と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
（２）肺の調製
生体のラットまたは塩化カリウムによる犠死後４０分または２時間経過したラットより肺を摘出し、前記組成物Ｌを肺の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物ＵＷに浸漬した状態とした。この状態で、４℃で２４時間、肺を保存した。前記保存後、肺の重量を測定することにより、臓器が保存できているかを評価した（実施例）。コントロール１は、摘出後保存をしなかった以外は同様にして、コントロール２は、前記組成物Ｌおよび組成物ＵＷに代えて、前記ラクテックおよびＵＷ液を用いた以外は同様にして、評価した。これらの結果を図６に示す。
生体のラットまたは塩化カリウムによる犠死後４０分または２時間経過したラットより肺を摘出し、前記組成物Ｌを肺の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物ＵＷに浸漬した状態とした。この状態で、４℃で２４時間、肺を保存した。前記保存後、肺の重量を測定することにより、臓器が保存できているかを評価した（実施例）。コントロール１は、摘出後保存をしなかった以外は同様にして、コントロール２は、前記組成物Ｌおよび組成物ＵＷに代えて、前記ラクテックおよびＵＷ液を用いた以外は同様にして、評価した。これらの結果を図６に示す。
図６は、保存後の肺の重量を示すグラフである。図６において、（Ａ）は、生体のラットから摘出した肺の結果を示し、（Ｂ）は、犠死後２時間経過したラットより肺の結果を示す。また、図６において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、肺の重量を示す。図６に示すように、コントロール２では、肺の重量が増加しているのに対し、実施例では、肺の重量の増加が抑制されており、コントロール１と同程度であった。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物によれば、保存時における肺の重量増、すなわち、肺の浮腫を防止できることがわかった。なお、犠死後４０分のラット由来の肺を用いた場合も同様であった。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、肺を保存できること、すなわち、細胞シートの積層体のような複雑な構造物を保存できることがわかった。
［実施例６］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
（１）組成物の製造
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、空気（住友精化株式会社製）を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。HUVEC用培地は、EGM2（Endothelial Cell Basal Medium 2）培地を使用した。
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、空気（住友精化株式会社製）を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。HUVEC用培地は、EGM2（Endothelial Cell Basal Medium 2）培地を使用した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例６（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１２６．２ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．８４×１０８個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例６（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１２６．２ｎｍであり、微小気泡の密度は、６．８４×１０８個／ｍＬであった。
（３）細胞の保存
ヒト血管内皮細胞（HUVEC細胞、Promo Cell社より入手）を前記組成物に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種した。そして、下記条件１または２で培養した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記HUVEC用培地を用いた以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を１００％として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図７に示す。
ヒト血管内皮細胞（HUVEC細胞、Promo Cell社より入手）を前記組成物に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種した。そして、下記条件１または２で培養した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記HUVEC用培地を用いた以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を１００％として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図７に示す。
条件１：
組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８時間培養後、前記組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、４℃の条件で２４時間培養
条件２：
HUVEC用培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８時間培養後、組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、４℃の条件で２４時間培養
組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８時間培養後、前記組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、４℃の条件で２４時間培養
条件２：
HUVEC用培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８時間培養後、組成物（微小気泡の密度：６．８４×１０８個／ｍＬ）の存在下、４℃の条件で２４時間培養
図７は、細胞の生存率を示すグラフである。図７において、（Ａ）は、前記条件１の結果を示し、（Ｂ）は、前記条件２の結果を示す。また、図７において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図７に示すように、いずれの条件においても、微小気泡を含む組成物の存在下で保存（培養）した場合、コントロールの存在下で保存（培養）した場合と比較して、細胞の生存率が向上した。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることがわかった。
［実施例７］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
（１）組成物の製造
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、前記HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、異なる体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝０：１０、１：９、２：８、３：７、６：４、７：３、８：２、９：１、または１０：０の組成物を製造した。
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、前記HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、異なる体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝０：１０、１：９、２：８、３：７、６：４、７：３、８：２、９：１、または１０：０の組成物を製造した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例７（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１３２．３ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．８９×１０８個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例７（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、１３２．３ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．８９×１０８個／ｍＬであった。
（３）細胞の保存
ヒト血管内皮細胞をHUVEC用培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、９６ウェルディッシュに播種した。そして、コンフルエントとなるまで培養後、さらに、下記条件３または４で培養した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、測定した。これらの結果を図８および９に示す。
ヒト血管内皮細胞をHUVEC用培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、９６ウェルディッシュに播種した。そして、コンフルエントとなるまで培養後、さらに、下記条件３または４で培養した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、測定した。これらの結果を図８および９に示す。
条件３：
組成物（微小気泡の密度：８．８９×１０８個／ｍＬ）の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で５日間（１２０時間）培養後、HUVEC用培地の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で１時間培養
条件４：
HUVEC用培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で１８時間培養後、組成物（微小気泡の密度：８．８９×１０８個／ｍＬ）の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養し、HUVEC用培地の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で１時間培養
組成物（微小気泡の密度：８．８９×１０８個／ｍＬ）の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で５日間（１２０時間）培養後、HUVEC用培地の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で１時間培養
条件４：
HUVEC用培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で１８時間培養後、組成物（微小気泡の密度：８．８９×１０８個／ｍＬ）の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養し、HUVEC用培地の存在下、５％ＣＯ２、３７℃の条件で１時間培養
図８は、前記条件３における細胞の生存率を示すグラフである。図８において、横軸は、微小気泡が含む気体の種類および体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）を示し、縦軸は、吸光度を示す。図８に示すように、ＣＯおよびＯ２またはこれらの混合気体を含む微小気泡を含む組成物は、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
つぎに、図９は、前記条件４における細胞の生存率を示すグラフである。図９において、横軸は、微小気泡が含む気体の種類および体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）を示し、縦軸は、吸光度を示す。図９に示すように、ＣＯおよびＯ２またはこれらの混合気体を含む微小気泡を含む組成物は、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることがわかった。
［実施例８］
異なる気泡密度の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、異なる気泡密度の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
異なる気泡密度の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、異なる気泡密度の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
（１）組成物の製造
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例１（１）と同様にして、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７の組成物（組成物（CO/O2））を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、前記空気を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例１（１）と同様にして、組成物（組成物（Air））を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素および医療用酸素を用い、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）＝２：８とし、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物（組成物（H2S/O2））を製造した。
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例１（１）と同様にして、体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７の組成物（組成物（CO/O2））を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、前記空気を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例１（１）と同様にして、組成物（組成物（Air））を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素および医療用酸素を用い、体積比（ＶＨ２Ｓ：ＶＯ２）＝２：８とし、前記ＤＭＥＭ培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物（組成物（H2S/O2））を製造した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例８（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、各組成物における微小気泡の平均径および微小気泡の密度は、下記の通りであった。
組成物（CO/O2） 平均径：１３２．３ｎｍ、密度：８．８９×１０８個／ｍL
組成物(Air) 平均径：１２６．２ｎｍ、密度：６．８４×１０８個／ｍＬ
組成物(H2S/O2) 平均径：１１５．８ｎｍ、密度：８．３２×１０８個／ｍＬ
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例８（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、各組成物における微小気泡の平均径および微小気泡の密度は、下記の通りであった。
組成物（CO/O2） 平均径：１３２．３ｎｍ、密度：８．８９×１０８個／ｍL
組成物(Air) 平均径：１２６．２ｎｍ、密度：６．８４×１０８個／ｍＬ
組成物(H2S/O2) 平均径：１１５．８ｎｍ、密度：８．３２×１０８個／ｍＬ
（３）細胞の保存
前記ラット心臓横紋筋細胞（H9c2細胞）または前記ヒト血管内皮細胞（HUVEC細胞）の細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種後、下記条件５～９で培養した。各条件の組成物添加培地では、各組成物が所定倍率（１倍（未希釈）、１／２倍、１／５倍、１／１０倍、１／５０倍、１／１００倍、または１／１０００倍）に希釈されるように、前記組成物を添加した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を１００％として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図１０～１４に示す。
前記ラット心臓横紋筋細胞（H9c2細胞）または前記ヒト血管内皮細胞（HUVEC細胞）の細胞懸濁液を、８０％コンフルエント／ウェルとなるように、９６ウェルディッシュに播種後、下記条件５～９で培養した。各条件の組成物添加培地では、各組成物が所定倍率（１倍（未希釈）、１／２倍、１／５倍、１／１０倍、１／５０倍、１／１００倍、または１／１０００倍）に希釈されるように、前記組成物を添加した。前記培養後、各細胞について、前記ＭＴＴアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を１００％として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図１０～１４に示す。
条件５（H9c2細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件６（H9c2細胞）：
組成物（Air）添加後の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件７（H9c2細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（CO/O2）添加後の培地の存在下、５％ＣＯ２、４℃の条件で６時間培養
条件８（HUVEC細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件９（HUVEC細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８間培養後、組成物（H2S/O2）添加後の培地の存在下、４℃の条件で２４時間培養
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件６（H9c2細胞）：
組成物（Air）添加後の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件７（H9c2細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（CO/O2）添加後の培地の存在下、５％ＣＯ２、４℃の条件で６時間培養
条件８（HUVEC細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で２４間培養後、組成物（Air）添加後の培地の存在下、４℃の条件で６時間培養
条件９（HUVEC細胞）：
組成物未添加の培地の存在下、０．５～１％Ｏ２、３７℃の条件で４８間培養後、組成物（H2S/O2）添加後の培地の存在下、４℃の条件で２４時間培養
図１０は、前記条件５における細胞の生存率を示すグラフである。図１０において、横軸は、前記組成物の希釈系列を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図１０に示すように、前記組成物の濃度（微小気泡の密度）依存的に、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
図１１は、前記条件６における細胞の生存率を示すグラフである。図１１において、横軸は、前記組成物の希釈系列を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図１１に示すように、前記組成物の濃度（微小気泡の密度）依存的に、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
図１２は、前記条件７における細胞の生存率を示すグラフである。図１２において、横軸は、前記組成物の希釈系列を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図１２に示すように、前記組成物の濃度（微小気泡の密度）依存的に、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
図１３は、前記条件８における細胞の生存率を示すグラフである。図１３において、横軸は、前記組成物の希釈系列を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図１３に示すように、前記組成物の濃度（微小気泡の密度）依存的に、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
図１４は、前記条件９における細胞の生存率を示すグラフである。図１４において、横軸は、前記組成物の希釈系列を示し、縦軸は、生存率の相対値を示す。図１４に示すように、前記組成物の濃度（微小気泡の密度）依存的に、コントロールと比較して、細胞の生存率が向上した。
以上のことから、異なる気泡密度の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、異なる気泡密度の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることがわかった。また、微小気泡の含む気体の種類によらず、微小気泡の密度依存的に、細胞保存効果が増強されることから、前記微小気泡が細胞保存効果をもたらしていることがわかった。さらに、各組成物の微小気泡の含有量から、５×１０５個／ｍＬ以上、好ましくは、１×１０６個／ｍＬ以上、より好ましくは、５×１０６個／ｍＬ以上、または１×１０７個／ｍＬ以上に微小気泡の密度を設定することにより、細胞保存効果が更に増強されることがわかった。また、後述の参考例１に示すように、実施例８において用いている組成物では、溶存気体が実質的に存在しない。さらに、後述の参考例２に示すように、静置後の組成物においても、微小気泡が存在する。したがって、溶媒中の微小気泡の密度が、細胞保存効果と関連していると推定された。
［実施例９］
本発明の組成物または細胞保存組成物により、心臓を保存できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、心臓を保存できることを確認した。
（１）組成物の製造
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、前記蒸留水に代えてＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液（ＥＴＫ、大塚製薬株式会社製）を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝３：７とし、前記蒸留水に代えてＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液（ＥＴＫ、大塚製薬株式会社製）を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、組成物を製造した。
（２）組成物の特性
前記ＥＴＫと類似する生理食塩水を用いて前記組成物を調製した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記ＥＴＫを用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
前記ＥＴＫと類似する生理食塩水を用いて前記組成物を調製した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、１３１ｎｍであり、微小気泡の密度は、８．０４×１０８個／ｍＬであった。このため、前記ＥＴＫを用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
（３）心臓の調製
６週齢のＬＥＷ／ＳｓＮ Ｓｌｃ雄ラット（ｎ＝５）に、５０ｍｇ／ｋｇ（薬剤／体重）となるようペントバルビタール（共立製薬社製）を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開後、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を調製した。
６週齢のＬＥＷ／ＳｓＮ Ｓｌｃ雄ラット（ｎ＝５）に、５０ｍｇ／ｋｇ（薬剤／体重）となるようペントバルビタール（共立製薬社製）を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開後、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を調製した。
（４）心臓の保存
心臓の保存は、特開２０１５－１７４８２３号公報の保存装置を用いて実施した。具体的には、特開２０１５－１７４８２３号公報の図２の保存装置内に、蒸留水が入ったフラスコを配置した。さらに、前記フラスコ内に生体材料吊り下げ手段を配置し、前記生体材料吊り下げ手段に前記心臓を吊り下げた。そして、医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧（ＰＣＯ）が、０．１５ＭＰａ、酸素の分圧（ＰＯ２）が、０．２ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。そして、この状態で、心臓を４℃の冷蔵庫内で４８時間保存した。
心臓の保存は、特開２０１５－１７４８２３号公報の保存装置を用いて実施した。具体的には、特開２０１５－１７４８２３号公報の図２の保存装置内に、蒸留水が入ったフラスコを配置した。さらに、前記フラスコ内に生体材料吊り下げ手段を配置し、前記生体材料吊り下げ手段に前記心臓を吊り下げた。そして、医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧（ＰＣＯ）が、０．１５ＭＰａ、酸素の分圧（ＰＯ２）が、０．２ＭＰａとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。そして、この状態で、心臓を４℃の冷蔵庫内で４８時間保存した。
前記保存後、前記心臓をラットに移植し、前記心臓の大きさおよび拍動を確認した。コントロール１は、前記組成物に代えて、微小気泡を含まないＥＴＫを用いて灌流した以外は同様にして実施した。また、コントロール２は、前記組成物に代えて、ＣＯおよびＯ２を溶解したＥＴＫを用いて灌流した以外は同様にして実施した。なお、ＣＯおよびＯ２を溶解したＥＴＫは、密閉容器内にＣＯおよびＯ２とＥＫＴを導入後、容器を密閉し、１０分間転倒混和することにより調製した。これらの結果を図１５に示す。
図１５は、移植後の心臓を示す写真であり、図１５の左上に示す図は、前記保存装置における保存状態を示す模式図である。図１５において、（Ａ）は、コントロール１の結果を示し、（Ｂ）は、前記組成物を用いた結果を示し、（Ｃ）は、コントロール２の結果を示す。図１５に示すように、前記組成物を用いて心臓を灌流し、保存した場合、コントロール１および２と比較して、心臓の鬱血による腫脹または浮腫が抑制されており、保存前の心臓の大きさが維持されていた。また、コントロール１では、心臓の拍動が確認できず、コントロール２では、心臓の拍動がほとんど確認できなかった。これに対して、前記組成物を用いて心臓を灌流し、保存した場合、前記心臓の拍動が確認できた。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、心臓を保存できること、すなわち、細胞シートの積層体のような複雑な構造物を保存できることがわかった。
［実施例１０］
気体の種類によらず、同程度の密度の微小気泡を含む組成物が製造できることを確認した。
気体の種類によらず、同程度の密度の微小気泡を含む組成物が製造できることを確認した。
（１）組成物の製造
一酸化炭素および医療用酸素に加えて、二酸化炭素（住友精化株式会社製）および窒素（住友精化株式会社製）を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて生理食塩水を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、気体として、酸素、一酸化炭素、酸素および一酸化炭素の混合気体、二酸化炭素または窒素を含む微小気泡を含む組成物を製造した。なお、気体以外の製造条件は全て同じとした。
一酸化炭素および医療用酸素に加えて、二酸化炭素（住友精化株式会社製）および窒素（住友精化株式会社製）を用い、前記ＤＭＥＭ培地に代えて生理食塩水を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、気体として、酸素、一酸化炭素、酸素および一酸化炭素の混合気体、二酸化炭素または窒素を含む微小気泡を含む組成物を製造した。なお、気体以外の製造条件は全て同じとした。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例１０（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。なお、各組成物について、３回、同様の測定を実施した。この結果、前記組成物における各気体を含む微小気泡の平均径は、下記のとおりであった。各気体の微小気泡の密度を図１６に示す。
組成物（O2） 平均径：１０４．５ｎｍ
組成物（CO） 平均径：１１７．０ｎｍ
組成物（CO／O2） 平均径：１１２．３ｎｍ
組成物（CO2） 平均径：１１７．５ｎｍ
組成物（N2） 平均径：１３２．７ｎｍ
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例１０（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。なお、各組成物について、３回、同様の測定を実施した。この結果、前記組成物における各気体を含む微小気泡の平均径は、下記のとおりであった。各気体の微小気泡の密度を図１６に示す。
組成物（O2） 平均径：１０４．５ｎｍ
組成物（CO） 平均径：１１７．０ｎｍ
組成物（CO／O2） 平均径：１１２．３ｎｍ
組成物（CO2） 平均径：１１７．５ｎｍ
組成物（N2） 平均径：１３２．７ｎｍ
図１６は、各気体を含む微小気泡の密度を示すグラフである。図１６において、横軸は、微小気泡が含む気体の種類を示し、縦軸は、微小気泡の密度を示す。図１６に示すように、同条件で製造した場合、微小気泡に導入する気体の種類によらず、微小気泡の密度は、約１×１０９個／ｍＬであった。これらの結果から、気体の種類によらず、同程度の密度の微小気泡を含む組成物が製造できることがわかった。
［実施例１１］
本発明の組成物または細胞保存組成物で心臓を前処理することにより、心臓を保存できることを確認した。
本発明の組成物または細胞保存組成物で心臓を前処理することにより、心臓を保存できることを確認した。
（１）組成物の製造
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、前記生理食塩水を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、異なる体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝１０：０の組成物を製造した。
前記ＤＭＥＭ培地に代えて、前記生理食塩水を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、異なる体積比（ＶＣＯ：ＶＯ２）＝１０：０の組成物を製造した。
（２）組成物の特性
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例１１（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、約１００ｎｍであり、微小気泡の密度は、約１×１０９個／ｍＬであった。
前記実施例１（１）の組成物に代えて、前記実施例１１（１）の組成物を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、約１００ｎｍであり、微小気泡の密度は、約１×１０９個／ｍＬであった。
（３）心臓の前処理
６週齢のＬＥＷ／ＳｓＮ Ｓｌｃ雄ラット（ｎ＝６）に、５０ｍｇ／ｋｇ（薬剤／体重）となるようペントバルビタール（共立製薬社製）を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開し、摘出した。
６週齢のＬＥＷ／ＳｓＮ Ｓｌｃ雄ラット（ｎ＝６）に、５０ｍｇ／ｋｇ（薬剤／体重）となるようペントバルビタール（共立製薬社製）を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開し、摘出した。
（４）心臓の保存
つぎに、得られた心臓に対して、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を前処理した。前記前処理後、前記心臓に対して、ＵＷ液を注入して灌流した。そして、前記心臓を、ＵＷ液に浸漬し、４℃の冷蔵庫内で２４時間保存した。
つぎに、得られた心臓に対して、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を前処理した。前記前処理後、前記心臓に対して、ＵＷ液を注入して灌流した。そして、前記心臓を、ＵＷ液に浸漬し、４℃の冷蔵庫内で２４時間保存した。
前記保存後、前記心臓をラットに移植し、前記拍動を確認した。前記拍動は、心室および心房の両者で拍動が生じているか、心室のみで拍動が生じているかに基づき評価した。具体的には、心臓の心室および心房の両者が拍動している場合、心臓の機能が維持されていると評価し、心臓の心室のみが拍動している場合、心臓の機能が維持されていないと評価した。コントロールは、前記組成物に代えて、微小気泡を含まない生理食塩水を用いて灌流した以外は同様にして実施した。これらの結果を図１７に示す。
図１７は、保存後の心臓の評価結果を示すグラフである。図１７において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、サンプル数を示す。図１７に示すように、本発明の組成物で前処理を行なった実施例の心臓では、６例中４例で心臓の機能が維持されていたのに対して、コントロールの心臓では、６例中１例のみが、保存後も心臓の機能を維持していた。なお、図示していないが、実施例の心臓は、鮮紅色であり、心臓内の血液循環が良好であることが示唆されたのに対して、コントロールの心臓は、暗褐色であり、心臓内の血液循環が悪く、還元型ヘモグロビンが心筋間に貯留していることが示唆された。これらの結果から、本発明の組成物で心臓を前処理することにより、心臓を保存できることがわかった。これらの結果から、本発明の組成物または細胞保存組成物により、心臓を保存できること、すなわち、細胞シートの積層体のような複雑な構造物を保存できることがわかった。
［実施例１２］
界面活性剤存在下で微小気泡を製造することにより、溶媒中の微小気泡の密度を向上できることを確認した。
界面活性剤存在下で微小気泡を製造することにより、溶媒中の微小気泡の密度を向上できることを確認した。
カチオン性界面活性剤であるジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（富士フィルム和光純薬株式会社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した蒸留水と図１８の製造装置２００とを用いて、本発明の組成物を製造した。図１８に示すように、製造装置２００は、２つのシリンジ２０ａ、ｂ（１０ｍＬシリンジ）と、ベンチュリ式の三方活栓２１（狭窄部を有する三方活栓）とを備える。２つのシリンジ２０ａ、ｂは、その先端部が三方活栓２１と嵌合している。まず、シリンジ２０ａ、ｂを三方活栓２１から解除した。つぎに、シリンジ２０ａの内部に、前記カチオン性界面活性剤を含有する蒸留水５ｍＬをシリンジ２０ａ内に空気が含まれないように導入し、再度、三方活栓２１と嵌合させた。前記嵌合後、シリンジ２０ａ内の蒸留水を三方活栓２１に導入し、三方活栓２１のシリンジ２０ｂの嵌合口まで押し出した。他方、シリンジ２０ｂに対して、シリンジ２０ａに導入した蒸留水５ｍＬに対して約５ｍＬとなるように、空気を導入し、再度、三方活栓２１と嵌合させた。その後、シリンジ２０ａ、ｂ内でピストンを１０回往復（約２秒／１回往復）させ、さらにシリンジ２１ａ、ｂを５～１０秒間超音波処理（６０Ｗ）した。同様の処理をさらに２回実施することにより、組成物（実施例１２－１）を製造した。また、前記カチオン性界面活性剤を添加しなかった以外は同様にして、組成物（実施例１２－２）を製造した。さらに、前記ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリドに代えて、１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、アニオン系界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、和光純薬株式会社製）を、または１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように非イオン系界面活性剤であるオクチルフェノールエトキシレート（Triton X-100、和光純薬株式会社製）を添加した以外は同様にして、組成物（ＳＤＳ：実施例１２－３、Triton X-100：実施例１２－４）を製造した。そして、得られた各組成物について、前記実施例１（２）と同様にして、前記組成物の物性を測定した。なお、前記測定は、２５℃で行なった。この結果、実施例１２－１の組成物における微小気泡の平均径は、２２２．１ｎｍであり、微小気泡の密度は、１．７９×１０１２個／ｍＬであった。実施例１２－２の組成物における微小気泡の平均径は、１０９．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、１．３０×１０１０個／ｍＬであった。実施例１２－３の組成物における微小気泡の平均径は、９２．５ｎｍであり、微小気泡の密度は、１．０１×１０１０個／ｍＬであった。実施例１２－４の組成物における微小気泡の平均径は、１１１．８ｎｍであり、微小気泡の密度は、５．７８×１０９個／ｍＬであった。これらの結果から、界面活性剤、特に、カチオン性界面活性剤の存在下で、微小気泡を製造することにより、溶媒中の微小気泡の密度を向上できることがわかった。
［参考例１］
実施例１～１２の組成物において、微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
実施例１～１２の組成物において、微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
図１に示すベンチュリ式の微小気泡の製造装置１００を用いて、参考例１で使用する組成物を製造した。まず、図１の装置１００内に４０ｍＬの超純水（Milli-Q水）を導入後、装置１００を揺らすことにより、装置１００内の気泡を装置１００外に除外した。つぎに、５ｍＬの一酸化炭素をシリンジに採取後、三方活栓５に接続した。そして、モータ１の駆動開始後、三方活栓５を開放し、装置１００内に一酸化炭素を導入した。この状態で、５、１０、または３０分間、モータ１を駆動させ、組成物を製造した。モータ１の駆動停止後、得られた組成物をビーカに回収した。回収時の組成物の温度は、２７℃（５分間循環）、２９～３０℃（１０分間循環）、３８～３９℃（３０分間循環）であった。前記組成物を３０分間静置し、大きな気泡を脱気させた。
脱気後の組成物について、さらに、所定時間（０、１、２または３時間）静置し、静置後の組成物に含まれる一酸化炭素の量を下記ＧＣ（ガスクロマトグラフ）の測定条件で測定した。一酸化炭素は、一酸化炭素をメタン化後、得られたメタンを測定することにより測定した。また、一酸化炭素に代えて、硫化水素を用い、５分間モータ１を駆動させ、脱気後の組成物について、所定時間（０、１、２、３または１９時間）静置後、下記ＧＣの測定条件で測定することにより、前記組成物に含まれる硫化水素の量を測定した。なお、所定時間経過後の各組成物について、レーザポインタを用いて、微小気泡が含有されていることを確認した。一酸化炭素の測定結果を下記表１に、硫化水素の結果を下記表２に示す。
（ＧＣ条件（一酸化炭素））
装置： ＧＣ－２０１４ ＦＩＤ（島津製作所社製）
充填剤の種類：ＭＳ－１３Ｘ（Molecular Sieve 13X）（ジーエルサイエンス株式会社製）
カラムの種類：島津ＧＣ用ステンレスカラム（内径３ｍｍ、長さ３ｍ、島津製作所社製）
温度
気化器：２２０℃
カラム：５０℃
検出器：２５０℃
キャリア
Ｎ２（窒素ガス）
流量：２０ｍＬ／分
メタナイザー：４００℃
装置： ＧＣ－２０１４ ＦＩＤ（島津製作所社製）
充填剤の種類：ＭＳ－１３Ｘ（Molecular Sieve 13X）（ジーエルサイエンス株式会社製）
カラムの種類：島津ＧＣ用ステンレスカラム（内径３ｍｍ、長さ３ｍ、島津製作所社製）
温度
気化器：２２０℃
カラム：５０℃
検出器：２５０℃
キャリア
Ｎ２（窒素ガス）
流量：２０ｍＬ／分
メタナイザー：４００℃
（ＧＣ条件（硫化水素））
装置： ＧＣ－２０１４ ＦＰＤ（島津製作所社製）
カラムの種類：5rings Shimalite（登録商標）TPA（Polyphenyl Ether(5 rings) OS-124/Shimalite TPA）
（内径３．２ｍｍ、長さ３．１ｍ、信和化工株式会社製）
温度
気化器：２００℃
カラム
開始温度：５０℃
開始温度での保持時間：３分間
昇温速度：５０℃／分
終了温度：１００℃
終了温度での保持時間：５分間
検出器：２５０℃
キャリア
Ｎ２（窒素ガス）
流量：２０ｍＬ／分
装置： ＧＣ－２０１４ ＦＰＤ（島津製作所社製）
カラムの種類：5rings Shimalite（登録商標）TPA（Polyphenyl Ether(5 rings) OS-124/Shimalite TPA）
（内径３．２ｍｍ、長さ３．１ｍ、信和化工株式会社製）
温度
気化器：２００℃
カラム
開始温度：５０℃
開始温度での保持時間：３分間
昇温速度：５０℃／分
終了温度：１００℃
終了温度での保持時間：５分間
検出器：２５０℃
キャリア
Ｎ２（窒素ガス）
流量：２０ｍＬ／分
前記表１に示すように、前記組成物中の一酸化炭素は、静置後、急速に脱気し、１時間後以降は、ほぼ検出限界未満の量となった。また、前記表２に示すように、前記組成物中の硫化水素は、静置後、急速に脱気し、２時間後以降は、ほぼ検出限界未満の量となった。
これらの結果から、実施例１～１２の組成物は、製造後約２時間静置し、使用していることから、微小気泡以外の気体が実質的に存在しないこと、すなわち、溶存気体が実質的に存在しないことがわかった。また、溶存気体が存在しないことから、各実施例で証明されている細胞保存効果または血小板保存効果等は、本発明の組成物に含まれる微小気泡の作用によることが確認された。
［参考例２］
実施例１～１２の組成物において、使用時に微小気泡が存在していることを確認した。
実施例１～１２の組成物において、使用時に微小気泡が存在していることを確認した。
４０ｍＬの超純水に代えて、５０ｍＬの生理食塩水を用い、５ｍＬのＣＯに代えて１０ｍＬのＣＯを用いた以外は、参考例１と同様にして、参考例２で使用する組成物を製造した。得られた組成物を３０分間静置し、大きな気泡を脱気させた後、さらに、所定時間（０、１、２、３、４、５または６時間）静置し、静置後の組成物に含まれる微小気泡の密度および平均径を前記実施例１（２）と同様にして測定した（参考例２－１）。同様の組成物の製造および測定を、さらに２回実施した（参考例２－２および２－３）。これらの結果を下記表３に示す。
前記表３に示すように、静置後１～２時間において、参考例２－１～２－３のいずれの組成物においても、約１×１０８個／ｍＬの微小気泡を含んでいた。また、静置後１～２時間における微小気泡の平均径は、組成物の製造後における微小気泡の平均径から大きな変化はなかった。これらの結果から、実施例１～１２の組成物は、製造後約２時間静置し、使用していることから、約１×１０８個／ｍＬの微小気泡を含むことがわかった。また、前記微小気泡を含むことから、各実施例で証明されている細胞保存効果または血小板保存効果等は、本発明の組成物に含まれる微小気泡の作用によることが確認された。
［参考例３］
Ｎ２Ｏを含む組成物において、製造後１時間の時点で微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
Ｎ２Ｏを含む組成物において、製造後１時間の時点で微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
一酸化炭素に代えて、医療用Ｎ２Ｏ（住友精化株式会社製、Ｎ２Ｏ濃度：99.999(v/v)%）を用い、５分間、モータ１を駆動させた以外は、前記参考例１と同様にして組成物を製造した。モータ１の駆動停止後、得られた組成物をビーカに回収した。回収時の組成物の温度は、２７℃であった。前記組成物を３０分間静置し、大きな気泡を脱気させた。
脱気後の組成物について、さらに、所定時間（０または１時間）静置し、静置後の組成物に含まれるＮ２Ｏの量を下記ＧＣ（ガスクロマトグラフ）の測定条件で測定した（ｎ＝３、サンプル１～３）。なお、所定時間経過後の各組成物について、レーザポインタを用いて、微小気泡が含有されていることを確認した。この結果を下記表４に示す。
（ＧＣ条件（Ｎ２Ｏ））
装置： ＧＣ－２０１４ ＴＣＤ（島津製作所社製）
充填剤の種類：Porapak（登録商標）Q（ジーエルサイエンス株式会社製）
カラムの種類：島津ＧＣ用ステンレスカラム（内径３ｍｍ、長さ２ｍ、島津製作所社製）
温度
気化器：１５０℃
カラム：４０℃
検出器：１００℃
キャリア
Ｈｅ（ヘリウムガス）
流量：３０ｍＬ／分
装置： ＧＣ－２０１４ ＴＣＤ（島津製作所社製）
充填剤の種類：Porapak（登録商標）Q（ジーエルサイエンス株式会社製）
カラムの種類：島津ＧＣ用ステンレスカラム（内径３ｍｍ、長さ２ｍ、島津製作所社製）
温度
気化器：１５０℃
カラム：４０℃
検出器：１００℃
キャリア
Ｈｅ（ヘリウムガス）
流量：３０ｍＬ／分
前記表４に示すように、前記組成物中のＮ２Ｏは、静置後、急速に脱気し、１時間で、検出限界未満の量となった。これらの結果から、製造後約１時間静置して使用した場合、微小気泡以外の気体が実質的に存在しないこと、すなわち、溶存気体が実質的に存在しないことがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
この出願は、２０１８年５月３１日に出願された日本出願特願２０１８－１０５４０４および２０１８年１２月３日に出願された日本出願特願２０１８－２２６９０１を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
微小気泡を含む、組成物。
（付記２）
前記微小気泡は、水素（Ｈ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、酸素（Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、ヘリウム（Ｈｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）、窒素（Ｎ２）、空気、メタン（ＣＨ４）、エタン（ＣＨ３ＣＨ３）、プロパン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ３）、フルオロメタン（ＣＨ３Ｆ）、ジフルオロメタン（ＣＨ２Ｆ２）、四フッ化炭素（ＣＦ４）、および酸化エチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）からなる群から選択された少なくとも１つを含む、付記１記載の組成物。
（付記３）
前記微小気泡は、気体として、生体ガスを含む、付記１または２記載の組成物。
（付記４）
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素（ＣＯ）および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の少なくとも一方を含む、付記１から３のいずれかに記載の組成物。
（付記５）
前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、付記４記載の組成物。
（付記６）
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬである、付記１から５のいずれかに記載の組成物。
（付記７）
さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、付記１から６のいずれかに記載の組成物。
（付記８）
付記１から７のいずれかに記載の組成物を含む、細胞保存組成物。
（付記９）
付記１から７のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養組成物。
（付記１０）
細胞および微小気泡を含む、細胞製剤。
（付記１１）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１０記載の細胞製剤。
（付記１２）
前記細胞は、血小板である、付記１０または１１記載の細胞製剤。
（付記１３）
対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む、微小気泡を含む対象物の製造方法。
（付記１４）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１３記載の対象物の製造方法。
（付記１５）
前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、付記１３または１４記載の対象物の製造方法。
（付記１６）
微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む、細胞の保存方法。
（付記１７）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１６記載の細胞の保存方法。
（付記１８）
前記細胞は、血小板である、付記１６または１７記載の細胞の保存方法。
（付記１９）
微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む、細胞の培養方法。
（付記２０）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１９記載の細胞の培養方法。
（付記２１）
細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む、細胞製剤の製造方法。
（付記２２）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記２１記載の細胞製剤の製造方法。
（付記２３）
有効成分として、界面活性剤を含む、微小気泡の密度向上剤。
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
微小気泡を含む、組成物。
（付記２）
前記微小気泡は、水素（Ｈ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、酸素（Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、ヘリウム（Ｈｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キセノン（Ｘｅ）、窒素（Ｎ２）、空気、メタン（ＣＨ４）、エタン（ＣＨ３ＣＨ３）、プロパン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ３）、フルオロメタン（ＣＨ３Ｆ）、ジフルオロメタン（ＣＨ２Ｆ２）、四フッ化炭素（ＣＦ４）、および酸化エチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）からなる群から選択された少なくとも１つを含む、付記１記載の組成物。
（付記３）
前記微小気泡は、気体として、生体ガスを含む、付記１または２記載の組成物。
（付記４）
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素（ＣＯ）および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の少なくとも一方を含む、付記１から３のいずれかに記載の組成物。
（付記５）
前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、付記４記載の組成物。
（付記６）
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬである、付記１から５のいずれかに記載の組成物。
（付記７）
さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、付記１から６のいずれかに記載の組成物。
（付記８）
付記１から７のいずれかに記載の組成物を含む、細胞保存組成物。
（付記９）
付記１から７のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養組成物。
（付記１０）
細胞および微小気泡を含む、細胞製剤。
（付記１１）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１０記載の細胞製剤。
（付記１２）
前記細胞は、血小板である、付記１０または１１記載の細胞製剤。
（付記１３）
対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む、微小気泡を含む対象物の製造方法。
（付記１４）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１３記載の対象物の製造方法。
（付記１５）
前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、付記１３または１４記載の対象物の製造方法。
（付記１６）
微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む、細胞の保存方法。
（付記１７）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１６記載の細胞の保存方法。
（付記１８）
前記細胞は、血小板である、付記１６または１７記載の細胞の保存方法。
（付記１９）
微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む、細胞の培養方法。
（付記２０）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記１９記載の細胞の培養方法。
（付記２１）
細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む、細胞製剤の製造方法。
（付記２２）
前記微小気泡は、付記１から７のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記２１記載の細胞製剤の製造方法。
（付記２３）
有効成分として、界面活性剤を含む、微小気泡の密度向上剤。
以上説明したように、本発明によれば、細胞を保存できる。また、本発明は、例えば、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。このため、本発明は、例えば、細胞の保存、培養等を実施する生命科学分野、医療分野、医薬分野等において極めて有用である。
Claims (20)
- 微小気泡を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素（ＣＯ）および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の少なくとも一方を含み、
前記微小気泡が気体として硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含む場合、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除く、動物由来細胞保存用組成物。 - 前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、請求項１記載の動物由来細胞保存用組成物。
- さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項１または２に記載の動物由来細胞保存用組成物。 - 微小気泡を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含み、
ただし、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除く、動物由来細胞培養用組成物。 - 前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、請求項４記載の動物由来細胞培養用組成物。
- さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項４または５に記載の動物由来細胞培養用組成物。 - 細胞および請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞保存用組成物または請求項４から６のいずれか一項に記載の細胞培養用組成物を含み、
前記細胞が、動物由来細胞である、細胞製剤。 - 前記細胞は、血小板である、請求項７記載の細胞製剤。
- 対象物に微小気泡を導入する導入工程を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素（ＣＯ）および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の少なくとも一方を含み、
前記微小気泡が気体として硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含む場合、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除く、微小気泡を含む動物由来細胞保存用対象物の製造方法。 - 前記微小気泡は、請求項１または２に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項９記載の動物由来細胞保存用対象物の製造方法。
- 前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項９または１０記載の動物由来細胞保存用対象物の製造方法。
- 微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素（ＣＯ）および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の少なくとも一方を含み、
前記微小気泡が気体として硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含む場合、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除き、
前記細胞が、動物由来細胞である、細胞の保存方法。 - 前記微小気泡は、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項１２記載の細胞の保存方法。
- 前記細胞は、血小板である、請求項１２または１３に記載の細胞の保存方法。
- 対象物に微小気泡を導入する導入工程を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含み、
ただし、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除く、微小気泡を含む動物由来細胞培養用対象物の製造方法。 - 前記微小気泡は、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項１５記載の動物由来細胞培養用対象物の製造方法。
- 前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項１５または１６記載の動物由来細胞培養用対象物の製造方法。
- 微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含み、
前記微小気泡の密度は、５×１０５～５×１０１２個／ｍＬであり、
前記微小気泡は、気体として、硫化水素（Ｈ２Ｓ）を含み、
ただし、前記微小気泡を構成する気体は、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および硫化水素（Ｈ２Ｓ）の組み合わせである場合を除き、
前記細胞が、動物由来細胞である、細胞の培養方法。 - 前記微小気泡は、請求項４から６のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項１８記載の細胞の培養方法。
- 前記細胞は、血小板である、請求項１８または１９に記載の細胞の培養方法。
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