JP7328729B2 - 細胞の保存方法 - Google Patents
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Description
臍帯由来間葉系幹細胞(臍帯MSC、CET社から提供)、骨髄由来間葉系幹細胞(骨髄MSC、ロンザ、PT-3001)、マウス胚性線維芽細胞(MEF、Chemicon International)、iPS細胞由来心筋細胞(iPS-CM、マイオリッジ、H-013506)の4種類の細胞について、従来の凍結解凍法(以下、従来法と称する)と、細胞濃縮物を用いた凍結解凍法(以下、ペレット法と称する)を実施した。また、解凍後の生細胞率、解凍後の細胞数と3日間培養後の細胞数を比較した。
1.1.1 従来法
トリプシン溶液又はTrypLETM Select溶液(サーモフィッシャー)によって単一細胞にした各種細胞(1×10e7cells)を含むコニカルチューブについて、400g×5minで遠心した。上清のトリプシン液をデカント及びチップにより除去し、ゼノアック社のStem Cell Banker(臍帯MSC、骨髄MSCに使用)凍結保護液(10%(v/v)DMSO)、又はCell Banker 1plus(MEF、iPS-CMに使用)凍結保護液(10%(v/v)DMSO)に4mlで置換した。得られた細胞懸濁液全量をゴム栓付きバイアル(マルエム社、5-111-02、容量5ml)に移した後、緩慢凍結用容器BICELL(日本フリーザー)で-80℃フリーザーにてオーバーナイト緩慢凍結した。次に、バイアルを37℃で数分間温めて解凍した。バイアルにPBSを16ml添加し希釈して回収した。細胞懸濁液を遠心管に移し、生細胞率と細胞数をセルカウンターで測定した。その後、細胞培養評価を続けるために、400g×5minで遠心後、上清のPBSを除去した後、各種細胞培養液を適量加えてピペッティングで懸濁し、培養皿に播種し3日間培養した。トリプシン溶液で単一細胞にして再度細胞数を計測した。
ペレット法の一例の概念図を図1に示す。トリプシン溶液又はTrypLETM Select溶液によって単一細胞にした各種細胞(1×10e7cells)を含むコニカルチューブについて、400g×5minで遠心した。上清のトリプシン液をデカント及びチップにより除去し、ゼノアック社のStem Cell Banker(臍帯MSC、骨髄MSCに使用)凍結保護液(10%(v/v)DMSO)、又はCell Banker 1plus(MEF、iPS-CMに使用)凍結保護液(10%(v/v)DMSO)に4mlで置換した。得られた細胞懸濁液全量をゴム栓付きバイアル(マルエム社、5-111-02、容量5ml)に移し、5分間4℃冷蔵庫に静置した後、400g×5minで遠心し細胞ペレットを形成させた。その後1000ulのチップと20ulのチップを用いて上清の凍結保護液を可能な限り除去(トータル3.9~3.96mlを除去)した後、緩慢凍結用容器BICELLで-80℃フリーザーにてオーバーナイト緩慢凍結した。次に、バイアルを37℃で数分間温めて解凍した。16mlのPBSを満たした注射器と21Gの注射針を用いて、ゴム栓に針を突き刺すことでPBSを添加し、バイアルを軽くタッピングしペレットを浮遊させた後、ゆっくりと細胞懸濁液を注射針で吸い上げて細胞を回収した。細胞懸濁液を遠心管に移し、生細胞率と細胞数をセルカウンターで測定した。その後、細胞培養評価を続けるために、400g×5minで遠心後、上清のPBSを除去した後、各種細胞培養液を適量加えてピペッティングで懸濁し、培養皿に播種し3日間培養した。トリプシン溶液で単一細胞にして再度細胞数を計測した。
1.2.1 凍結保護液の残存量
従来法とペレット法において、細胞凍結時の凍結保護液の残存量を、バイアルから除去した凍結保護液の量から計算し、グラフ化した(図2)。ペレット法では従来法と比べて、1/40~1/100に凍結保護液の残存量が少なくなった。
従来法とペレット法において、細胞解凍後の生細胞率をセルカウンターで計測した(図3)。その結果、両者において大きな違いは見られなかった。
2.1 実験手順
凍結保護液として、実施例1のゼノアック社のStem Cell Bankerの代わりに、5%DMSO含有ウシ胎児血清(FBS)(5%DMSO/FBS.溶液)(DMSO(シグマ社製)、FBS(ギブコ社製))、10%グリセロール含有ウシ胎児血清(FBS)(10%グリセロール/FBS溶液)(グリセロール(シグマ社製)、FBS(ギブコ社製))、又はStem Cell Banker DMSO free GMP grade(ゼノアック社)を用いて臍帯MSCの凍結解凍を行った。他の実験手順は実施例1に従って行った。
細胞凍結時の凍結保護液の残存量は、実施例1と同様に、ペレット法では従来法と比べて非常に少なくなった。各凍結保護液において、従来法とペレット法で解凍後の生細胞率と生細胞数をセルカウンターで計測したところ、大きな違いは見られなかった(図5)。
3.1 実験手順
3.1.1 従来法
フローズバッグ F-050(ニプロ社、容量25ml)を用いて臍帯MSCの凍結解凍を行った。TrypLETM Select溶液によって単一細胞にした臍帯MSC(10x10e7cells)を含むコニカルチューブについて、400gx5minで遠心後、上清のトリプシン液を除去し、Stem Cell Banker凍結保護液(10%(v/v)DMSO)に20mlで置換した。得られた細胞懸濁液全量をフローズバッグに充填し、断熱材の発泡スチロール箱に入れ、0.1~1℃/分のスピードで、-80℃フリーザーにてオーバーナイト緩慢凍結した。細胞の解凍は、バッグを37℃で数分間温めて解凍後、シリンジをコネクタに取り付け、チューブからゆっくりと細胞懸濁液を吸い上げて細胞を回収した。細胞懸濁液を遠心管に移し、生細胞率と細胞数をセルカウンターで測定した。その後、細胞培養評価を続けるために、400gx5minで遠心後、上清の凍結保護液を除去した後、各種細胞培養液を適量加えてピペッティングで懸濁し、培養皿に播種し3日間培養した。TrypLETM Select溶液で単一細胞にして再度細胞数を計測した。
フローズバッグ F-050(ニプロ社、容量25ml)を用いて臍帯MSCの凍結解凍を行った。TrypLETM Select溶液によって単一細胞にした臍帯MSC(10x10e7cells)を含むコニカルチューブについて、400gx5minで遠心後、上清のトリプシン液を除去し、Stem Cell Banker凍結保護液(10%(v/v)DMSO)に20mlで置換した。得られた細胞懸濁液全量をフローズバッグに充填し、20分間4℃冷蔵庫に静置した後、TOMY遠心機LCX-200のマルチウェルプレートローターTS-41Cにバッグを横たえた状態で400gx10minで遠心し、バッグの広い面積の側面に細胞ペレットを形成させた(図6)。その後ペレットが浮遊しないようにゆっくりとフローズバッグを取り出し、コネクタにシリンジを装着してチューブから上清の凍結保護液を可能な限り除去(トータル約19mlを除去)した後、断熱材の発泡スチロール箱に入れ、0.1~1℃/分のスピードで、-80℃フリーザーにてオーバーナイト緩慢凍結した。細胞の解凍のために、バッグを37℃で数分間温めて解凍後、20mlのPBSを満たしたシリンジをバッグのチューブにセットして、バッグにPBSを注入添加し、バッグを手で軽くほぐしてペレットを浮遊させた。その後バッグ内の細胞懸濁液をコネクタに取り付けたシリンジでゆっくりとチューブから吸い上げて細胞を回収した。細胞懸濁液を遠心管に移し、生細胞率と細胞数をセルカウンターで測定した。その後、細胞培養評価を続けるために、400gx5minで遠心後、上清のPBSを除去した後、各種細胞培養液を適量加えてピペッティングで懸濁し、培養皿に播種し3日間培養した。TrypLETM Select溶液で単一細胞にして再度細胞数を計測した。
3.2.1 凍結保護液の残存量
従来法とペレット法で凍結時の凍結保護液の残存量を、バッグから除去した凍結保護液の量から計算し、グラフ化した。ペレット法では通常法と比べて、約1/20に残存量が少なくなった(図7)。
従来法とペレット法で解凍後の生細胞率をセルカウンターで計測したところ、大きな違いは見られなかった(図8)。従来法とペレット法で解凍後の細胞数と培養3日後の細胞数をセルカウンターで計測したところ、大きな違いは見られなかった(図9)。
Claims (19)
- 細胞と凍結保護剤とを含む組成物を含むバッグであって、前記組成物は前記バッグ内の側面に対して細胞ペレットを形成している、バッグ。
- 前記組成物は再生医療用組成物である、請求項1に記載のバッグ。
- 前記再生医療は、前記バッグ内に溶液を添加して細胞懸濁液を生成する工程、及び前記細胞懸濁液を対象に投与する工程、を含む、請求項2に記載のバッグ。
- 前記細胞ペレットは、前記バッグを横たえた状態で遠心することによって形成された細胞ペレットである、請求項1~3のいずれかに記載のバッグ。
- 前記細胞ペレットは、前記バッグ内の側面に細胞が広く広がっている、請求項1~4いずれかに記載のバッグ。
- 前記再生医療は、前記細胞ペレットを手でほぐして浮遊させ、懸濁する工程を含む、請求項2又は3に記載のバッグ。
- 前記組成物は凍結物である、請求項1~6のいずれかに記載のバッグ。
- 前記組成物は2.0×107個/mL以上の細胞を含む、請求項1~7のいずれかに記載のバッグ。
- 前記組成物は0.5~10%(v/v)の前記凍結保護剤を含む、請求項1~8のいずれかに記載のバッグ。
- 前記細胞は幹細胞である、請求項1~9のいずれかに記載のバッグ。
- 前記細胞は間葉系幹細胞である、請求項1~10のいずれかに記載のバッグ。
- 前記細胞ペレットは、バッグの側面方向に遠心力が向く遠心分離で形成された細胞ペレットである、請求項1~11のいずれかに記載のバッグ。
- 前記細胞ペレットは、前記バッグ内の片方のみの側面に対して形成された細胞ペレットである、請求項1~12のいずれかに記載のバッグ。
- 請求項1~13のいずれかに記載のバッグと、シリンジとを含み、前記バッグと前記シリンジとが一体化したデバイス。
- 請求項1~13のいずれかに記載のバッグ内に溶液を添加して細胞懸濁液を生成する工程を含む、再生医療に使用するための前記細胞懸濁液の生産方法。
- 前記溶液は、生理食塩水又は緩衝液である、請求項15に記載の生産方法。
- 細胞と凍結保護剤とを含む組成物であって、前記組成物はバッグ内の側面に対して細胞ペレットを形成しており、前記組成物は再生医療用組成物であり、前記再生医療は前記バッグ内に溶液を添加して細胞懸濁液を生成する工程、及び前記細胞懸濁液を対象に投与する工程、を含む、組成物。
- 前記組成物は2.0×107個/mL以上の細胞を含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記組成物は凍結物である、請求項17又は18に記載の組成物。
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