WO2016163444A1

WO2016163444A1 - 液状の培地組成物の製造方法、およびそのための製造装置とキット

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Publication number: WO2016163444A1
Application number: PCT/JP2016/061357
Authority: WO
Inventors: 林　寿人; 康一郎猿橋; 達朗金木
Original assignee: 日産化学工業株式会社
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2016-10-13
Also published as: JP6658739B2; EP3282006A1; EP3282006A4; EP3282006B1; TW201643239A; CN107406820B; US20180112013A1; KR20170134663A; US11345762B2; CN107406820A; KR102055490B1; TWI714568B; JPWO2016163444A1; US20220267480A1

Abstract

　本発明は、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体に対して、特定化合物を含んだ液体を容易に混合し得、かつ、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を製造し得る方法、および、そのための製造装置とキットを提供する。特定化合物を含有する第１の液体を、所定の流量となるように、ノズル部に設けられた所定の横断面積の貫通孔を通過させ、該第１の液体を前記所定の流量にて、第２の液体中に射出する。この簡単な操作によって、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が形成され、かつ、前記両液体の混合液中に該構造体が好ましく分散する。

Description

液状の培地組成物の製造方法、およびそのための製造装置とキット

　本発明は、液状の培地組成物の製造方法、およびそれを実施するための製造装置とキットに関するものである。より詳細には、本発明は、前記培地組成物を形成するために混合すべき少なくとも２種類の液体（特定の化合物を含有する第１の液体、および、該特定の化合物同士を結びつけて構造体を形成する物質を含有する第２の液体）を適切に混合し、前記構造体が分散した培地組成物を製造する方法と、その分散を可能にする製造装置とキットに関するものである。

　近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。
　細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。
　また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。

　細胞等（器官、組織、細胞）を培養するための培地の１つとして、液体培地が挙げられ、本発明者らは、細胞等を浮遊状態で培養することが可能な液状の培地組成物の開発に成功した（特許文献１及び２）。
　特許文献１に記載された液状の培地組成物は、特定の化合物（特に、アニオン性官能基を有する高分子化合物）が２価金属カチオン等を介して集合し不定形の構造体となり、該構造体が液体培地中に分散して浮遊した状態となっているものである。以下、アニオン性官能基を有する高分子化合物などといった上記特定の化合物を「特定化合物」ともいい、該特定化合物同士を結びつける２価金属カチオン等の物質を「連結物質」ともいう。
　該培地組成物は、細胞等の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに、細胞等を浮遊状態にて培養することができる好ましい液状の培地となる。

国際公開第２０１４／０１７５１３号ＵＳ２０１４／０１０６３４８　Ａ１

　上記特許文献１に記載された液状の培地組成物の本来意図された好ましい状態は、特定化合物同士が少量ずつ互いに結びつき、微小な構造体となって液中に多数分散した状態である。
　しかしながら、本願発明者らが、該液状の培地組成物の実際の作製工程を詳細に検討したところ、そのような好ましい状態を得るためには、構造体が培地組成物中の局所に偏在して形成されないように留意しなければならないことがわかった。例えば、特定化合物が脱アシル化ジェランガムの場合、該脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して不定形な構造体を形成し、これが細胞等を浮遊させるための担体となる。しかし、連結物質を含んだ液体培地を攪拌しながら、その中に、特定化合物を高濃度に含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が合流した瞬間に特定化合物が連結物質と接して構造体となり、よって該構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊する状態（または、紐状の構造体が塊状に絡み合った状態）となり、本来意図された分散状態にはならない場合がある。また、そのような状態は、比較的高速で攪拌を行なったとしても発生することがわかった。また、液体培地中にそのような紐状の構造体がいったん形成されると、分子鎖が形成するダブルへリックスがお互いに連結物質（例えば、カルシウムイオン）を介して強固な三次元ネットワークを形成しているという該構造体の性質上、それを細かく切断して母材中に分散させることは容易ではない。

　前記構造体が液体培地中に細かく分散した状態を得るためには、粉末状の培地または濃縮培地等の成分既知の液体培地を用い、特定化合物を含有する液体を希釈し、両者を混合することによって微細な構造体が分散した状態を作り出すといったような、分散のための特別な処理を行なえばよい。
　しかしながら、そのような分散のための特別な処理は手間を要し、また、一般的な液体培地や特殊な液体培地では、そのような特別な処理を行なうことが困難な場合があり、よって培養すべき細胞等も制限されていた。

　本発明の目的は、上記の問題を解決し、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体に対して、特定化合物を高濃度に含んだ液体を容易に混合し得、かつ、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を製造し得る方法、およびそのための製造装置とキットを提供することにある。

　本発明者らは、鋭意検討の結果、特定化合物を含有する液体を、特定の値以上の流量となるように、特定範囲の断面積を持った貫通孔を通過させ、該流量にて、連結物質を含んだ液体中に突入させるだけで、特殊な攪拌装置を用いることなく、微細な構造体が液体培地中に好ましく分散してなる液状の培地組成物が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　本発明の主たる構成は、以下のとおりである。
〔１〕液状の培地組成物の製造方法であって、
　下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を、１．７ｍＬ／秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２の貫通孔を通過させ、
　前記第１の液体を前記流量にて、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体中に射出し、それにより、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体を形成し、かつ、前記両液体の混合液中に該構造体を分散させる工程を有する、
前記製造方法。
　　（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
　　（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
〔２〕下記（ａ）の容器に第２の液体を収容し、供給装置から第１の液体を送り出しかつ前記流量となるように下記（ａ）の容器の貫通孔を通過させ、それにより第１の液体を前記流量にて該容器内の第２の液体中に射出する、
上記〔１〕記載の製造方法。
　（ａ）本体と蓋とを有する容器であって、該本体または該蓋には、容器外と容器内とを連通する貫通孔を持ったノズル部が設けられ、該貫通孔の横断面積が０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２である、前記容器。
〔３〕前記供給装置がシリンジであり、
　前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
上記〔２〕記載の製造方法。
〔４〕容器に第２の液体を収容し、第１の液体を収容した下記（ｂ）の供給装置のノズル部の先端を前記容器内に挿入し、該供給装置から第１の液体を送り出しかつ前記流量となるように該供給装置のノズル部の貫通孔を通過させ、それにより第１の液体を前記流量にて容器内の第２の液体中に射出する、
上記〔１〕記載の製造方法。
　（ｂ）液体を収容するための収容部と、収容した液体を貫通孔を通して射出するためのノズル部とを有する供給装置であって、該ノズル部の貫通孔の横断面積が０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２である、前記供給装置。
〔５〕前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着された注射針であり、
　前記容器の蓋には、前記注射針の針管部を容器外から容器内へと貫通させ得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
上記〔４〕記載の製造方法。
〔６〕前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
　前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地である、
上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕上記〔１〕記載の製造方法を実施するための製造装置であって、
　第１の液体を送り出すための供給装置と、
　第２の液体を収容するための、かつ、前記供給装置から送り出された第１の液体を受け入れるための容器と、
　第１の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき貫通孔を持ったノズル部とを有し、
　前記貫通孔の横断面積は０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２であり、
　前記供給装置は、１．７ｍＬ／秒以上の流量にて第１の液体を送り出すことができるように構成されており、
　第１の液体を前記流量にて前記貫通孔を通過させることにより、第１の液体を１．７ｍＬ／秒以上の流量として、前記容器内に射出し得る構成となっている、
前記製造装置。
〔８〕貫通孔を持ったノズル部が前記容器の一部として設けられており、
　前記容器は、本体と蓋とを有する容器であって、前記貫通孔が容器外と容器内とを連通するように、前記ノズル部が容器の本体または蓋に設けられている、
上記〔７〕記載の製造装置。
〔９〕前記供給装置がシリンジであり、
　前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
上記〔８〕記載の製造装置。
〔１０〕前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着される注射針であり、
　前記容器の蓋には、前記注射針が容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、さらに、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
上記〔７〕記載の製造装置。
〔１１〕上記〔１〕記載の製造方法を実施するためのキットであって、
　第１の容器と、シリンジと、第２の容器とを少なくとも有して構成され、
　第１の容器は、上記〔１〕記載の第１の液体を収容した容器であり、
　シリンジは、前記第１の液体を送り出すための供給装置として機能する上記〔３〕記載のシリンジであり、
　第２の容器は、上記〔１〕記載の第２の液体を収容するための上記〔２〕記載の（ａ）の容器であって、上記〔３〕記載のとおり、ノズル部が該容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
前記キット。
〔１２〕さらに、第２の容器には、該容器の本体内を密封し得るように構成された、ノズル部を持たない密封用蓋が付帯しており、上記〔２〕記載の（ａ）の容器の蓋と、前記密封用蓋とは、互換性を持って該容器の本体の開口部に装着し得るようになっている、
上記〔１１〕記載のキット。
〔１３〕さらに、上記シリンジには、第１の容器内に挿入して第１の液体を吸引するために用いられる管状部品が付帯しており、該管状部品は、
　第１の容器内に挿入し得る外径と、第１の容器内から第１の液体を吸引し得る長さとを持った細管部を有し、かつ、
　前記細管部の一端に、前記シリンジの外筒の先端部に装着し得る連結部を有している、上記〔１１〕または〔１２〕記載のキット。

　上記背景技術の説明で述べたとおり、連結物質を含んだ液体培地（第２の液体）を攪拌しながら、その中に特定化合物を高濃度に含んだ液体（第１の液体）を注ぎ入れるといった一般的な攪拌・混合方法では、構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊してしまう場合がある。その原因は、液体培地中で攪拌子を高速で回転させたとしても、確実に高速で移動しているのは攪拌子だけであって、第２の液体全体（とりわけ、第１の液体が注ぎ入れられる液面付近）は攪拌子ほどの高速では移動していないからである。
　これを改善するためには、例えば、第１の液体が注ぎ入れられる合流部分に攪拌子を近づけて合流を切断しながら攪拌するといった構成が考えられるが、そのためには生物的なコンタミネーションを回避する観点で無菌または密閉状態での運用可能な特殊な攪拌装置が必要となる。また、多数の小容量容器においてそれぞれ個別に培地組成物を作製したい場合などには、容器へ攪拌機を挿入する際に開放系となることから、クリーンルームやクリーンブースなど無菌状態を担保する特殊な施設の設置が必要などの点から、そのような特殊な攪拌装置を小容量の容器毎に個別に使用することは困難である。
　これに対し、本発明の製造方法、製造装置における両液体の混合手法の原理は、上記した従来の混合手法の原理とは真逆であって、第２の液体を高速で攪拌するのではなく、第１の液体を、所定の横断面積Ｓを持った貫通孔を通して所定値以上の流量Ｑ（または、流速Ｖ）となるよう射出し、該流量Ｑ（または、流速Ｖ）にて第１の液体を第２の液体中に突入させるというものである。これにより、両液体が合流する部分における両液の速度差を確実に高くすることができ、両液体は衝撃的に接触し、よって、構造物が長く紐状に連なることが十分に抑制される。尚、いったん細かい構造物が形成されたならば、その細かい構造物が混合液中の一部に集まっていても、さらなる攪拌を行うことで、細かい構造物を容器内の混合液全体に均等に分散させることが可能である。

　本発明では、第１の液体を１．７ｍＬ／秒（Ｌはリットルを表す）以上の流量とするために、ノズル部の貫通孔の横断面積Ｓを０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２に限定している。貫通孔の横断面とは、該貫通孔の入口から出口に至る中心軸線に垂直に切断したときの、該貫通孔の断面であり、貫通孔の横断面積とは、該貫通孔の横断面の面積である。
　貫通孔の出口を通過する第１の液体の流量Ｑと、貫通孔の横断面積Ｓと、該貫通孔の出口を通過する第１の液体の流速Ｖとの間には、Ｑ＝Ｓ×Ｖの関係がある。
　先ず、上記横断面積を上回るような大口径の貫通孔を用いた場合、第１の液体は太い流れとなって第２の液体中に突入することになる。そのような太い流れでは、その中心部分にある第１の液体は失速前に第２の液体と接触し得ない場合が生じる。これに対して、貫通孔の横断面積が上記の範囲にあれば、射出流は常に細い流れとなり、その流れの中心にある第１の液体は、失速前に第２の液体と接触し得る確率が高くなる。よって、本発明では、貫通孔の横断面積を上記範囲に限定する。
　また、細胞等の培養の現場において、第１の液体を送り出すために用いられる実使用上好ましい供給装置は、後述のとおり手動のシリンジである。よって、上記横断面積を上回るような大口径の貫通孔では、好ましい流速を達成し得るような流量での送り出しを確実に行うことは容易ではなくなる。
　よって、本発明では、大量の培地組成物を大容量の容器内で一度に作製する場合にも、常に、上記範囲の横断面積を持った貫通孔を用いる。尚、必要に応じて複数の貫通孔を用い、第１の液体を第２の液体中に並列的に射出してもよく、また、単一の貫通孔を用い、第１の液体を第２の液体中に複数回射出してもよい。その場合の供給装置は、その吐出能力に応じて１つであってもよいし貫通孔の数だけ並列に設けてもよい。

図１は、本発明の製造方法および製造装置の構成の概要を説明するための断面図である。領域を区別し強調するために、ノズル部の断面にハッチングを加えている。図１における各符号がそれぞれに示す構成要素は、Ａ；第１の液体、Ｂ；第２の液体、Ａ１；射出された第１の液体の流れ、１；供給装置、２；ノズル部、２１；貫通孔、３；容器である。図２は、本発明の製造方法および製造装置の具体的な実施態様例を示す断面図である。同図の実施態様例では、ノズル部は容器側に属しており、また、第１の液体は容器の中心に射出されるように構成されている。同図では、容器の本体と蓋の断面を端面図として表しており、供給装置であるシリンジ１は断面ではなく外観を示している（図３、図６も同様である）。また、断面に対するハッチングは省略している（図３～図７も同様である）。図３は、本発明の製造方法および製造装置の具体的な他の実施態様例を示す図である。同図の実施態様例では、ノズル部は容器側に属しており、また、第１の液体は容器の中心から偏心した位置に射出されるように構成されている。図４は、図２、図３におけるノズル部を部分的に拡大した図である。図４（ａ）は、ノズル部の上面図であり、図４（ｂ）は、図２、図３におけるノズル部を部分的に拡大した断面図であり、図４（ｃ）は、図４（ｂ）の上部だけを同図のＸ方向から見た側面図である。図５は、本発明の製造装置における容器の蓋の実施態様例を示す図である。図５（ａ）は該蓋の上面図であり、図５（ｂ）は該蓋の側面図であり、図５（ａ）におけるＹ－Ｙ線に沿って該蓋を切断したときの断面図である。図６は、本発明の製造方法および製造装置の具体的な他の実施態様例を示す図である。同図の実施態様例では、ノズル部は供給装置であるシリンジに属する部品（ニードル）となっており、また、第１の液体は容器の中心から偏心した位置に射出されるように構成されている。図７は、本発明のキットの一構成例を模式的に示した図である。同図では、容器と蓋は、断面図として示している。供給装置であるシリンジ１は断面ではなく外観を示している。

　以下に、本発明の製造装置の構成を説明しながら、本発明の製造方法の説明を行う。本発明の製造装置の具体的な構成の説明は、本発明の製造方法を具体的にどのように実施するかの説明でもある。また、本発明の製造方法の説明は、本発明の製造装置の使用方法の説明でもある。
　本発明の製造方法は、上記特許文献１に記載されたような液状の培地組成物を好ましく製造する方法であって、図１に示すように、下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体Ａを、１．７ｍＬ／秒以上の流量Ｑとなるように、ノズル部２に設けられた０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２の横断面積Ｓを持った貫通孔２１を通過させて、前記流量Ｑの該第１の液体を、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体Ｂ中に射出することによって両液体を混合する工程を有する。
　ここで、上記（ｉ）の特定化合物は、２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である。
　また、上記（ｉｉ）の連結物質は、２価金属カチオンである。
　前記の特定化合物、連結物質、および、それぞれを含有する第１の液体、第２の液体の詳細は後述する。
　上記流量Ｑでの射出を行うことによって、特定化合物が連結物質を介して結びついた構造体を、前記両液体Ａ、Ｂの混合液中に形成しながらも、該構造体が該混合液中に細かく分散した液状の培地組成物を得ることができる。

　第１の液体Ａの流量Ｑは、１．７ｍＬ／秒以上であればよいが、上記範囲の横断面積Ｓを持った貫通孔に対して流量Ｑが大きいほど、第１の液体は強い勢いで第２の液体に突入し、構造体が長く連なることが抑制される。
　流量の上限は、特に限定はされないが、貫通孔の横断面積Ｓを考慮した場合の第１の液体の送り出し能力の点からは、１０ｍＬ／秒程度が挙げられ、５ｍＬ／秒程度が実際の操作上ではより適切である。
　ノズル部の貫通孔２１の横断面積Ｓは、０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２であればよいが、０．０５ｍｍ^２～２．００ｍｍ^２がより好ましく、０．１０ｍｍ^２～０．７０ｍｍ^２が特に好ましい。貫通孔の横断面積を前記の範囲に限定することによって、供給装置から送り出される第１の液体の液量に多少のばらつきがあっても、好ましい攪拌結果（即ち、構造体の好ましい分散結果）が得られる。
　第１の液体を第２の液体中に射出する際の、第１の液体の流れの方向は、特に限定はされず、図１に示すように、上から下方へ射出してもよいし、横から側方への射出、下から上方への射出であってもよい。

　本発明の製造装置は、本発明の製造方法を実施し得るように構成された装置であって、図１に示すように、上記貫通孔２１を持ったノズル部２に加えて、供給装置１と容器３とを少なくとも有して構成される。
　前記供給装置１は、第１の液体Ａを送り出すための装置であって、上記した流量Ｑ（ｍｍ^３／秒）にて第１の液体を送り出すことができるように構成されている。
　容器３は、第２の液体Ｂを収容しておくための容器であり、かつ、前記供給装置１から送り出された第１の液体を受入れて、両液体からなる混合液（即ち、製造すべき液状の培地組成物）を形成するための容器である。
　ノズル部２は、第１の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき上記横断面積（ｍｍ^２）の貫通孔２１を持っている。ノズル部２は、供給装置１に属する部品であってもよく、容器の本体や蓋に属する部分であってもよく、また、いずれにも属さず、供給装置と容器との間に介在する独立した継手部材であってもよい。
　当該製造装置の使用時には、第１の液体Ａが、上記流量Ｑ（ｍｍ^３／秒）にて供給装置１から送り出され、ノズル部２に設けられた上記横断面積Ｓ（ｍｍ^２）の貫通孔２１を通過し、容器３内に収容された第２の液体中に突入する。この一連の操作は、本発明の製造方法の実施であり、それによって好ましい液状の培地組成物が得られることは上記したとおりである。

　混合すべき第１の液体と第２の液体の体積比率は、特に限定はされないが、（第１の液体：第２の液体）＝（１：１）～（１：１０００）程度、好ましくは（１：５）～（１：５００）程度、より好ましくは（１：１０）～（１：１００）程度が汎用的である。
　実際の細胞等の培養操作では、大容量の１つの容器に大量の培地組成物を一度に作製して各小容量の容器に分配してストックするよりも、新鮮な培地組成物を用時調製する観点から、１～１０００ｍＬ程度、好ましくは１０～２００ｍＬ程度の各小容量の容器毎に個別に培地組成物を作製する方が好ましい場合がある。
　前記のような小容量の容器毎に培地組成物を作製する場合には、混合される両液体のそれぞれの具体的な体積としては、容器に収容される第２の液体を１ｍＬ～１０００ｍＬ程度、より好ましくは１０ｍＬ～２００ｍＬ程度とし、その中に射出される第１の液体を０．０１ｍＬ～１００ｍＬ程度、より好ましくは０．１ｍＬ～２０ｍＬ程度とすることが好ましい。
　このような組合せに応じて、供給装置１と容器３の容量を適宜選択すればよい。
　第１の液体と第２の液体との混合液は、製造目的の培地組成物であってもよいが、該混合液に添加物をさらに加えることで製造目的の培地組成物となるものであってもよい。

　本発明とは逆に、容器に少量の第１の液体を収容しておき、そこへ大量の第２の液体を射出することによっても製造目的の培地組成物を得ることは可能であるが、第１の液体の粘度が高く混和し難いことや、全液量に対する壁面等への液の飛散量が無視できないことなど、大量の液体中に少量の液体を細く速い流速にて突入させる場合の接触状態や希釈条件とは大きく異なる。また、射出に時間を要する、容器内の圧力が上昇する、などの問題が生じる。よって、本発明では、上記比率にて、第２の液体中に第１の液体を射出することを推奨する。

　供給装置は、上記した流量Ｑ（１．７ｍＬ／秒以上）にて、第１の液体を送り出すことができる吐出能力を有するものであればよく、例えば、ペリスタポンプやダイヤフラムポンプ、シリンジなどが挙げられる。該供給装置の駆動源は、手動式であってもモーターなどの駆動装置を用いたものであってもよい。なかでも、図２、図３、図６に示すようなシリンジ（注射筒）は、簡単な構成で、取扱い易く、安価であり（よって使い捨ても可能であり）、手動による押圧であっても前記流量を達成できるので、好ましい供給装置である。例えば、テルモ社製予防接種用テルモシリンジ（１ｍＬ、型番SS-01P）～テルモ社製テルモシリンジ（５０ｍＬ、型番SS-50ESZ）などといったプラスチック製の使い捨て可能なシリンジは、上記した小容量の容器毎に培地組成物を作製するのに適したシリンジである。
　尚、本発明でいう「シリンジ」とは、外筒とプランジャー（押し子）とを有して構成される装置である。本発明は、シリンジをそのまま用いる態様と、シリンジの先端にさらに注射針を装着する態様とを含んでいる。

　第１の液体を送り出す際の流量Ｑ（流れの中の或る断面を単位時間に通過する体積：ｍｍ^３／秒）の上限は、特に限定されず、より大きい流量であれば、上記ノズル部の貫通孔を通過することによってより高い流速となり、第１の液体が第２の液体中により衝撃的に突入するので、構造体をより好ましく細分化し分散させることが可能になる。
　シリンジを供給装置として用いる場合、図２に示すように、第１の液体Ａを貫通孔２１を通過させて前記流量または流速とし得る押圧力（荷重）Ｆにて、プランジャー（ピストン部分）１２を押し進め、外筒１１内に収容した第１の液体Ａを送り出せばよい。
　即ち、本発明でいう「第１の液体を、１．７ｍＬ／秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２の貫通孔を通過させ」とは、第１の液体が１．７ｍＬ／秒以上の流量となって該横断面積の貫通孔を通過し得るように、第１の液体に供給装置１を通じて押圧力Ｆを加え、該押圧力により前述の吐出流量にて該貫通孔内へと第１の液体を押し出すことを意味する。
　シリンジを供給装置として用いる場合、プランジャーの全行程の移動に要する時間を調節することによって、該シリンジから送り出される第１の液体の流量を調節することができる。即ち、シリンジは、人力で押圧する場合でも、プランジャーのストロ－クに要する時間の調節によって、目的の流量（ｍｍ^３／秒）を調節することができるので好ましい。
　シリンジを人力で押圧する場合に得られる流量の上限は、個人の力によっても異なるが、概ね５ｍＬ／秒程度である。
　少容量のシリンジを用いる場合の例として、貫通孔の横断面積を０．２ｍｍ^２とし、シリンジがテルモ社製予防接種用テルモシリンジ（１ｍＬ、型番SS-01P）であり、該シリンジ内に１．７ｍＬの第１の液体を収容する場合、第１の液体を全て押し出すのに要するプランジャーの全移動時間Ｔ１が１秒以下であれば、１．７ｍＬ／秒以上の流量での送り出しを達成し得る。シリンジを手動で操作する場合、プランジャーを押し出す力を考慮すると、プランジャーの全移動時間Ｔ１は、０．２秒～１秒程度が適当であり、その場合に得られる流量は、１．７ｍＬ／秒～８．５ｍＬ／秒である。
　また、大容量のシリンジを用いる場合の例として、貫通孔の横断面積を上記と同じ０．２ｍｍ^２とし、シリンジがテルモ社製テルモシリンジ（５０ｍＬ、型番SS-50ESZ）であって、該シリンジ内に２０ｍＬの第１の液体を収容する場合、同じ口径の貫通孔では、第１の液体を全て押し出すのに要するプランジャーの全移動時間Ｔ２は、１２秒以下であれば、１．７ｍＬ／秒以上の流量での送り出しを達成し得る。シリンジを手動で操作する場合、プランジャーを押し出す力を考慮すると、プランジャーの全移動時間Ｔ２は、２．５秒～１２秒程度が適当であり、その場合に得られる流量は、１．７ｍＬ／秒～８．０ｍＬ／秒である。その際に必要な押圧力（荷重）は、上記した少容量のシリンジを用いた場合と同様である。
　プランジャーを人力で押圧する場合、該プランジャーの移動速度を厳密に一定に保つことは困難であるが、上記した移動時間の範囲であれば、人力であっても該範囲から逸脱することなく該プランジャーを移動させることが可能であり、目的の流量とそれによる貫通孔の出口での流速を大きな誤差なく達成することができる。

　ノズル部の貫通孔は、上記範囲の横断面積Ｓを有し、上記範囲の流量が得られるものであればよい。該貫通孔は直管状が好ましいが、樹脂成形のための抜き勾配があってもよい。該貫通孔から出て行く際の第１の液体の流れＡ１は、噴霧状に広がるよりも、できる限り該貫通孔の横断面を保ったままの線状の流れであることが好ましく、それにより、第２の液体中に強く深く突入することができる。貫通孔の孔内の形状は、そのような流れとなるように、適宜設計すればよい。
　貫通孔の横断面の形状は、特に限定はされず、円形、楕円形、長円形、矩形、長方形、異形などであってもよい。貫通孔の形成が容易である点からは、貫通孔の横断面の形状は、円形が好ましい。また、射出された第１の液体の流れを意図的に乱して拡散させるために、貫通孔の横断面の形状を適宜変形させてもよい。
　貫通孔の長さは、特に限定はされない。ノズル部を容器（本体または蓋）に設ける場合には、貫通孔の長さは０．０１ｍｍ～１０ｍｍ程度が好ましく、ノズル部がシリンジの注射針であれば、貫通孔の長さは１．０ｍｍ～１００ｍｍ程度が好ましい。

　ノズル部２は、図２に示すように、容器３の中央に第１の液体Ａを射出するように、該容器の開口の中央などに位置していてもよい。ノズル部から容器の中央に第１の液体が突入することによって、図２の容器内に矢印で示すように、第１の液体は第２の液体中に深く入り込んだ後、容器の底で分かれた流れとして容器内を回る効果が得られる。
　また、ノズル部２は、図３に示すように、容器の中央から縁部へと偏心した位置に第１の液体を射出するように、該容器の開口の中央から偏心した位置にあってもよい。容器の中央から縁部へと偏心した位置に第１の液体が突入することによって、図３の容器内に矢印で示すように、第１の液体は第２の液体中に深く入り込んだ後、容器の底で大きく曲がり、１つの流れとして容器内を回る効果が得られる。
　ノズル部の位置は、例えば、第１、第２の液体の粘性や液量、容器の形状などに応じて、適宜決定すればよい。

　容器は、上記第２の液体を収容し得、かつ、第１の液体の射出を受け入れて、これらの混合液を収容し得るものであればよい。第２の液体を収容した容器に、気密を保った状態で第１の液体を注入すると、容器内の圧力が上昇するが、上記した具体的な混合比率程度であれば、圧力の上昇は特に問題とならない。
　該容器の容量は、特に限定されないが、上記した具体的な混合比率の点からは、５ｍＬ～１０００ｍＬ程度が好ましい容量として例示される。容器の横断面形状は、特に限定されないが、混合時の対流によるスムーズな循環を達成する点からは、円形が好ましい。
　容器の内部の深さＬ１と口径Ｄ１との比率（Ｌ１／Ｄ１）は、特に限定はされないが、同じ容量の容器であっても、比率（Ｌ１／Ｄ１）が過度に大きいと、全体として過度に細長い容器となり、混合時の対流が妨げられるので好ましくない。また、比率（Ｌ１／Ｄ１）が過度に小さいと、全体として浅い皿のような容器となり、混合時の対流が妨げられるので好ましくない。好ましい比率（Ｌ１／Ｄ１）は、０．５～３０程度、好ましくは１．０～１５程度、さらに好ましくは２．０～８．０の範囲から適宜決定すればよい。
　容器内に第２の液を収容した場合の該液が占める部分（液浸部）の深さＺと口径ｄとの比率（Ｚ／ｄ）もまた、特に限定はされないが、０．５～２０程度、好ましくは１．０～１０程度、さらに好ましくは１．３～４．０程度の範囲から適宜決定すればよい。
　図２、図３、図６の例では、容器の底部の形状を、最深部に向かって細くなる円錐状として描いているが、半球状や平坦状などであってもよく、特に限定はされない。液量や粘性により対流状態の変化が想定される点、細胞等を遠心分離して効率的に沈降させて回収率を向上させるなど実用面での取扱いの点からは、図２、図３、図６のような、最深部に向かって細くなる円錐状の底部を持った容器（コニカルチューブとも呼ばれる）が好ましい場合がある。好ましい容器の製品例としては、日本ベクトン・ディッキンソン社製ラウンドチューブ５ｍＬ（３５２００３）、コニカルチューブ１５ｍＬ（３５２０９５）、コニカルチューブ５０ｍＬ（３５２０７０）、コニカルチューブ１７５ｍＬ（３５２０７６）、コニカルチューブ２２５ｍＬ（３５２０７５）、住友ベークライト社製１５ｍＬ遠沈管（ＭＳ－５６１５０）、５０ｍＬ遠沈管（ＭＳ－５６５００）、旭硝子社製遠沈管１５ｍＬ（２３２２－０１５）、遠沈管５０ｍＬ（２３４２－０５０）、遠沈管２３０ｍＬ（２３８６－２３０）等が挙げられる。

　理化学機器としての一般的な容器の本体を利用し得る点や、液体の出し入れの操作の点からは、容器３は、図２、図３、図６に示すように、開口を持った本体３１と、その開口部（開口とその周囲の壁部）に装着される蓋３２とを有してなるものであることが好ましい。
　該容器の材料は、特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネートなどのプラスチックの他、ガラス、金属などが挙げられる。容器の本体と蓋の材料は、互いに異なっていてもよい。

　ノズル部は、当該製造方法の当該製造装置の操作を簡単にする点からは、前記容器の一部（流入部）として設けられるか、または、前記供給装置の一部（吐出部）として設けられることが好ましい。
　ノズル部が容器の一部として設けられる場合、該ノズル部は、該容器の本体に設けられてもよく（図示せず）、また、蓋に設けられてもよい（図２、図３）。これらの場合の貫通孔は、該ノズル部を貫通して容器外と容器内とを連通する流路である。第１の液体は、該貫通孔を通過して、容器内の第２の液体中に射出される。
　理化学機器としての一般的な容器の本体を利用し得る点からは、図２、図３に示すように、ノズル部２が蓋３２に設けられる態様が好ましい。ノズル部２は、蓋３２に一体的に設けられる態様が好ましいが、別途形成した部品を蓋に組み込む態様であってもよい。

　図２、図３に例示する態様では、供給装置１がシリンジであり、ノズル部２は容器３の蓋３２に設けられている。いずれの態様でも、ノズル部２の容器外部側には、シリンジの外筒１１の先端部（筒先）１１ａを嵌め込むための筒状部３３が該蓋３２の外面から突き出している。
　上記したように、ノズル部２は、蓋の中央に位置していても（図２）、蓋の中央から縁部へと偏心して位置していてもよい（図３）。
　ノズル部を偏心させる場合、容器の開口形状を円形とし、該開口の半径をＲ（ｍｍ）とし、該開口の中心から縁部へ偏心させる距離をｒ（ｍｍ）として、Ｒに占めるｒの割合〔（ｒ／Ｒ）×１００〕が４０％～８０％程度であれば、偏心の効果が顕著になる。ノズル部の偏心が過度に大きいと、第１の液体の流れが容器の壁部に接近し過ぎることになり、適当な攪拌が阻害される可能性がある。

　ノズルの先端から液面までの距離は、０ｍｍから２００ｍｍ以内が好ましく、１５０ｍｍ以内がより好ましく、８５ｍｍ以内がさらに好ましい。

　図４は、図２、図３の態様において蓋に設けられたノズル部とその外側の構造例を詳細に示した部分拡大図である。
　図４（ｂ）に示すように、ノズル部２の先端（容器内部側）は、貫通孔２１の長さを確保し該貫通孔から出て行く際の第１の液体の流れができる限り該貫通孔の横断面を保ったままの線状の流れとするために、容器内部側に突起している。該ノズル部の先端と、容器に収容される第２の液体の液面との間には空間があってもよく、また、ノズル部の先端は、第２の液体と接触するようにより長く延びていてもよい。
　また、好ましいオプションとして、図４（ａ）～（ｃ）の例では、蓋の外面から突き出した筒状部３３の先端部には、ルアーロック型のシリンジの先端のメネジと係合するための突起部３４、３５が側方に突起しており、該シリンジをねじ込んで固定することが可能になっている。該突起部３４、３５のそれぞれの下部には、図４（ｃ）に現れているように、該シリンジの先端のメネジに係合し得る勾配３４ａ、３５ａが設けられている。
　容器の本体３１と蓋３２との間の連結構造やシール性、シリンジの先端部１１ａと蓋の筒状部３３との間の連結構造、該先端部１１ａと筒状部の内面３３ａとのハメアイ、シール性は適宜設定すればよい。

　図５は、図３に示した蓋の細部に実用的な構造を加えた実施例を示している。同図の例では、市販の理化学実験用の容器を本体として利用できるように、該容器に本来付属している蓋と互換性を持たせている。
　図５（ｂ）に示すように、該蓋３２の内側には、市販の理化学実験用の容器の本体の開口部に螺合できるように、ネジ山３６が設けられている。また、該蓋３２の内側の最奥面には、該蓋を容器の開口部に螺合させたときに該開口をシールするための環状のシール部３７が突起している。また、図５（ａ）に示すように、蓋の外周側面には本来の蓋と同様にローレット３８が設けられ、手で蓋を回す際に滑らないようにしている。

　図６に例示する態様では、ノズル部は供給装置の一部として設けられている。同図の例では、供給装置１はシリンジであり、ノズル部は、該シリンジの先端部に装着される注射針１３であって、該注射針１３は、針基部１３ａと針管部１３ｂとを有してなる。針管部１３ａは、必ずしも鋭利でなくてもよい。
　同図の態様では、針管部の内部の管路が本発明における貫通孔となっており、その横断面積は０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２である。同図の態様では、針管部の先端が、容器内に収容される第２の液体の内部に入り込むようになっている。
　容器の蓋３２には、注射針１３の針管部１３ｂが容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分３９が設けられており、該貫通可能部分３９の容器外部側には、注射針の針基部１３ａを嵌め込むための筒状部３３が、該蓋３２の外面から突き出している。該筒状部３３は必須ではないが、使用時にシリンジを保持するためには好ましい構造である。
　貫通可能部分３９は、針管部が使用時に通過し得るように形成されていればよく、針管部の外径に適合した貫通孔であってもよいし、針管部が突き破ることが可能な脆弱部や薄膜部であってもよい。

　本発明の製造方法によって、第１の液体を第２の液体中に射出するに際しては、第２の液体を攪拌した状態とし、その状態の第２の液体中に第１の液体を射出してもよい。
　攪拌方法としては、例えば、手動振盪、機械的振盪（直線往復動、偏心旋回動及び８の字旋回動）、超音波振動、ボルテックス攪拌等を、容器に加え、それによって容器内の第２の液体を攪拌した状態とする方法が挙げられる。

　第１の液体は、特定化合物として、２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。
　アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上が含まれていてもよい。

　本発明に用いられる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成される多糖類が例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、より好ましくは、ＤＡＧ又はその塩である。ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
　ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。

　これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。

　本発明においては、上記アニオン性の官能基を有する多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、２価金属カチオンを介して結びつくことにより上述の構造体を液体培地中に形成することのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ－カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。

　脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１－４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ_１、Ｒ_２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ_１がグリセリル基を、Ｒ_２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。

　特定化合物は、化学合成法で得られたものであってもよいが、当該特定化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得られたものであってもよい。例えば、ジェランガムは、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすることにより製造することができる。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
　脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ－ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。

　第１の液体は、通常、特定化合物の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第１の液体は、特定化合物の水溶液である。

　第１の液体中に含有される特定化合物の濃度は、第２の液体と混合した際に、混合液中で、特定化合物が２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成し、且つ該構造体が混合液中に均一に分散し、更に、最終的に得られる液状培地組成物が、当該構造体を含むことにより細胞又は組織を浮遊培養可能である限り、特に限定されない。下に詳述した、細胞又は組織を浮遊培養可能な培地組成物中の特定化合物の濃度と、最終産物で得られる培地組成物の体積に対する、第１の液体の体積の比率から、第１の液体中の特定化合物の濃度を算出することが可能である。例えば、体積Ｖ_１の第１の液体と、体積Ｖ_２の第２の液体とを混合して、体積Ｖ_１＋Ｖ_２の液状培地組成物を最終的に得る場合、当該液状培地組成物中の特定化合物の濃度をＣ％（ｗ／ｖ）とするためには、第１の液体中の特定化合物の濃度を、Ｃ×（Ｖ_１＋Ｖ_２）／Ｖ_１％（ｗ／ｖ）とすればよい。具体的な例としては、特定化合物としてＤＡＧ又はその塩を用いる場合、第１の液体中のＤＡＧ濃度は、例えば０．０２～２．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１～２．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５～１．５％（ｗ／ｖ）である。ＤＡＧ濃度が２．５％（ｗ／ｖ）を超えると、溶解度の観点からＤＡＧが溶媒中に溶解しにくくなり、また、第１の液体と第２の液体とを混合した際に、構造体が局所的に形成されて、塊状に絡みあった状態となり、培地組成物中に分散しにくくなるリスクが高くなる。一方、ＤＡＧ濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）を下回ると、目的とする培地組成物を製造するのに必要な第１の液体の体積が大きくなってしまう。その結果、第２の液体として通常の液体培地を採用した場合、第１の液体と混合すると、当該液体培地由来成分が大幅に希釈されてしまう。

　第１の液体中の２価金属カチオン濃度は、第１の液体中の特定化合物が、構造体を形成する濃度を下回る必要がある。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。特に、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方（以下、「カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン」とも表現する）が、ＤＡＧ等の特定化合物の構造体形成に寄与する。

　第１の液体には、特定化合物、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、生理的に許容可能な緩衝剤、塩、等張剤が挙げられるが、これらに限定されない。

　第１の液体の調製は、特定化合物を上記溶媒（例、水）に添加し、当該特定化合物が溶解可能な温度（例えば、６０℃以上、８０℃以上、９０℃以上）にて攪拌し、透明な状態になるまで溶解することにより行うことができる。上述の様に、脱２価金属カチオン処理をしたＤＡＧを用いると、加熱を要することなく水に溶解するので、溶解操作が容易である。必要であれば、得られた特定化合物の溶液を、脱２価金属カチオン処理に付し、溶液中の２価金属カチオン濃度が構造体形成濃度を下回るようにする。必要に応じて、溶媒中に予め特定化合物以外の因子を加えておいてもよいし、得られた特定化合物の溶液に特定化合物以外の因子を加えてもよい。第１の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。

　第２の液体は、連結物質として２価金属カチオンを含有する。２価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。２価金属カチオンの種類は、第１の液体中に含まれる特定化合物が、当該２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくはカルシウムイオンである。

　第２の液体は、通常、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の溶液である。当該溶液のための溶媒は、特定化合物を溶解可能なものである限り、特に限定されないが、通常、水又は親水性溶媒であり、好ましくは水である。即ち、好ましい態様において第２の液体は、連結物質（即ち、２価金属カチオン）の水溶液である。

　第２の液体には、第１の液体と第２の液体とが混合した際に、第１の液体中の特定化合物が構造体を形成するのに十分な濃度の２価金属カチオンが含まれる。例えば、連結物質としてカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンを用いる場合、第２の液体中のカルシウムイオンまたはマグネシウムイオン濃度は、通常０．００１ｍＭ以上、好ましくは０．０１ｍＭ以上である。第２の液体中の２価金属カチオン濃度の上限値は、理論的には飽和溶液の濃度（即ち、溶解度）であるが、２価金属カチオン濃度が高すぎると、製造した培地組成物中で培養する細胞等に悪影響を及ぼす恐れがある。従って、例えば、連結物質としてカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンを用いる場合、第２の液体中のカルシウムイオンまたはマグネシウムイオン濃度の上限値は、通常１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下とすることが好ましい。尚、第２の液体が、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの両方を含む場合には、これらの各イオン濃度の合計が、１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下であることが好ましい。

　第２の液体には、連結物質（即ち、２価金属カチオン）、溶媒以外の因子が含まれていてもよい。該因子としては、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分が挙げられる。当該培地構成成分としては、緩衝剤（炭酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ等）、無機塩（ＮａＣｌ等）、各種アミノ酸、各種ビタミン（コリン、葉酸等）、糖類（グルコース等）、抗酸化剤（モノチオグリセロール等）、ピルビン酸、脂肪酸、血清、抗生物質、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックス等を挙げることができるが、これらに限定されない。第２の液体は滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の方法としては、オートクレーブ、ろ過滅菌等を挙げることができるがこれらに限定されない。

　好ましい態様において、第２の液体は、構造体形成濃度の２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを含有する液体培地である。即ち、第２の液体には、構造体形成濃度の２価金属カチオン（好ましくは、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン）及び水に加えて、意図した細胞を培養するのに適した培地構成成分を含有する。一般的に使用される細胞培養用液体培地中のカルシウムイオン濃度の範囲は０．１～２．０ｍＭ程度、マグネシウムイオン濃度は０．１～１．０ｍＭ程度であるので、ＤＡＧ等の特定化合物による構造体形成に十分である。
　本態様においては、本発明の製造方法により、第１の液体と第２の液体を混合することにより、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む、目的とする液状の培地組成物を直ちに得ることができる。

　尤も、第２の液体には、上述の細胞培養用培地構成成分の一部又は全部が含まれていなくてもよい。その場合、本発明の製造方法において、第１の液体と第２の液体を混合し、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む混合液を得て、当該混合液中に、上記細胞培養用液体培地構成成分の一部又は全部を加えることにより、目的とする液状の培地組成物を得ることができる。

　本発明の製造方法により得ることができる液状培地組成物は、第１の液体に含まれていた特定化合物が第２の液体に含まれていた連結物質（即ち、２価金属カチオン）を介して結びついてなる構造体を含有し、且つ該培地組成物中に該構造体が均一に分散されているので、当該培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能である。

　培養の対象となる細胞や組織が由来する生物の種類は、特に限定されず、動物（昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等）のみならず、植物も含まれる。

　一態様において、培養の対象となる細胞は、足場依存性の細胞である。本発明の製造方法により得ることができる液状培地組成物を用いると、足場依存性の細胞を、足場となる担体を用いることなく、浮遊状態を維持したまま、培養することが可能である。

　本発明において、細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が底面に対し接触はし得るが付着しない状態（非接着）であることをいう。更に、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散しなおかつ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、５分以上、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。

　本発明の製造方法により得ることができる液体培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。

　浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、１５ｍＬコニカルチューブ中に１０ｍＬ注入し、少なくとも５分以上（例、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上）、３７℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの７０％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ　５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．製）に代替して評価してもよい。

　好ましい態様において、本発明の製造方法により得ることができる液状培地組成物は、上記構造体を含むことによって、その粘度が実質的に高められていない。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の製造方法により得ることができる液状培地組成物の粘度）は、３７℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。構造体を含む液体の粘度は、３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ－２２型粘度計、機種：ＴＶＥ－２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ　１°３４’×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。

　本発明の製造方法により得ることができる液状培地組成物中の特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液体培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧの場合、０．００１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５％乃至０．３％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（ｗ／ｖ）である。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（ｗ／ｖ）である。κ－カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、０．００１％乃至５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（ｗ／ｖ）である。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(ｗ／ｖ)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(ｗ／ｖ)である。

　特定化合物として上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地組成物中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５～０．０２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１～０．０２％（ｗ／ｖ）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５～０．４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１～０．４％（ｗ／ｖ）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）（ｗ／ｖ）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）
アルギン酸ナトリウム：０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは、０．１～０．４％（ｗ／ｖ））
ネイティブジェランガム：０．０００１～０．４％（ｗ／ｖ）
ローカトビーンガム：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）
メチルセルロース：０．１～０．４％（ｗ／ｖ）（好ましくは０．２～０．４％（ｗ／ｖ））
カラギーナン：０．０５～０．１％（ｗ／ｖ）
ダイユータンガム：０．０５～０．１％（ｗ／ｖ）

　なお該濃度は、以下の式で算出できる。
　濃度［％（ｗ／ｖ）］＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍＬ）×１００

　好ましい態様において、特定化合物としてＤＡＧ又はその塩を用い、連結物質としてカルシウムイオンを用いる。第１の液体は、ＤＡＧ又はその塩の水溶液である。当該水溶液中のＤＡＧ濃度は、通常０．０５～１．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１～１．２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５～１．０％（ｗ／ｖ）である。第２の液体は、カルシウムイオンを含有する液体培地である。該液体培地中のカルシウムイオン濃度は、ＤＡＧが構造体を形成する濃度であり、通常、０．１～２．０ｍＭ程度である。混合すべき第１の液体と第２の液体の体積比率は、（第１の液体：第２の液体）＝（０．５～１０：１００）、好ましくは（１～５：１００）、より好ましくは（１．５～３：１００）である。第１の液体の体積は、例えば０．１～２０ｍＬ、好ましくは０．３～１２ｍＬ、より好ましくは０．６～６ｍＬである。第２の液体の体積は、例えば１～１０００ｍＬ、好ましくは１０～５００ｍＬ、より好ましくは４０～２００ｍＬである。結果として得られる液状培地組成物中のＤＡＧ濃度は、好ましくは０．０１％～０．０５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０１％～０．０３％（ｗ／ｖ）である。
　該液状培地組成物には、ＤＡＧがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体が均一に分散して含まれることにより、粘度が実質的に高められること無く、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことができる。

　本発明の製造方法により得られる液状培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することもできる。当該培地組成物を用いると、従来プレート上で単層で、細胞容器に接着した状態での培養を要していた細胞を、浮遊状態にて培養することができるので、接着性の細胞をその機能を損なうことなく効率的に大量に調製することができる。

　次に、本発明のキットを説明する。本発明のキットは、図７に示すように、上記した本発明の製造方法を実施するための構成要素を集めてセットにしたものである。
　図７に示すように、本発明のキットには、上記した第１の液体を収容した第１の容器Ｋ１が含まれており、かつ、上記で説明した前記第１の液体を送り出すための供給装置１であるシリンジＫ２と、図２～図５を参照して説明した容器３である第２の容器Ｋ３とを少なくとも有して構成される。第２の容器Ｋ３は、上記で容器３について説明をしたとおり、ノズル部が付いた蓋Ｋ３２と本体Ｋ３１とを有してなる容器であって、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している。
　第１の容器Ｋ１は、上記した第１の液体をユーザーが必要とする量だけ収容しユーザーへ送達し得る容器であれば、材料やサイズに限定はない。第１の容器Ｋ１は、容器本体と、該容器本体の開口を閉じる蓋と有する態様が好ましく、蓋は、容器本体に螺合する態様が好ましい。
　第２の液体は、キットに含めて提供してもよいが、ユーザーが通常使用している液体培地であってもよい。

　本発明のキットの好ましい態様では、図７に示すように、さらに、第２の容器Ｋ３に対して、該容器の本体Ｋ３１内を密封し得るように構成された、ノズル部を持たない密封用蓋Ｋ３２が付帯する。該密封用蓋Ｋ３２は、容器の蓋Ｋ３２と互換性を持って該容器の本体Ｋ３１の開口部に装着し得るようになっている。
　該密封用蓋Ｋ３２を提供することで、ノズル部を持った蓋Ｋ３２を用いて容器の本体Ｋ３１内に液状の培地組成物の製造した後、容器の本体Ｋ３１内に該液状の培地組成物を密封することが可能になる。
　容器の本体Ｋ３１が、市販品である場合、該密封用蓋Ｋ３２は、その市販品の容器の本体に本来付属していた蓋であってもよい。

　本発明のキットの好ましい態様では、図７に示すように、さらに、上記シリンジＫ２の先端に装着し得る管状部品Ｋ２１が付帯する。該管状部品は、第１の容器内に挿入して第１の液体をシリンジ内に吸引するために用いられる吸引用チューブである。該管状部品は、第１の容器Ｋ１内に挿入し得る外径と、第１の容器内から第１の液体を吸引し得る長さとを持った細管部を有し、かつ、前記シリンジの外筒の先端部に装着し得る連結部を、前記細管部の一端に有している。該管状部品は、注射針であってもよいが、安価な樹脂成形部品が好ましい。

　以下に、本発明の製造装置および製造方法を評価した種々の試験例を示す。以下の各試験例における「比較例」とは、本発明の好ましい数値や条件を調べるために行った実験例であって、本発明の技術的思想に沿って行ったものであり、従来技術を示すものではない。
　尚、各試験で使用した培地中の２価カチオン濃度は、下記表１のとおりである。

（試験例１：本発明の製造装置および製造方法を評価するための試験）
　以下に、本発明の製造装置の一態様を製作し、それを用いて本発明の製造方法を実施し、得られた培地組成物中における構造体の分散の様子を観察した試験の結果を示す。また、比較例として、第１の液体の射出の流量を低下させた場合の試験の結果を示す。
　実施例１～９および比較例１～１６では、特定化合物を脱アシル化ジェランガムとし、第１の液体を脱アシル化ジェランガム溶液とし、脱アシル化ジェランガムを連結し構造体とするための連結物質としてカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有する液体培地を第２の液体とした。

〔製造装置の仕様〕
　実施例１～９および比較例１～１６では、図３に示すタイプの製造装置を製作した。
　容器としては、市販のコニカルチューブ（容量２２５ｍＬ（２２５０００ｍｍ^３）または容量５０ｍＬ（５００００ｍｍ^３）、住友ベークライト社製）の本体部分を用い、これに適合するよう図５に示す蓋を製作した。貫通孔の口径はいずれも０．５ｍｍとした。よって、貫通孔の横断面積は約０．２ｍｍ^２である。
　供給装置としては、容量５ｍＬ（５０００ｍｍ^３）または容量１ｍＬ（１０００ｍｍ^３）のディスポーザブルシリンジを用い、該シリンジの外筒の先端部を蓋の外側に突起した円筒部３３に嵌め込んで連結し得るようにした。

〔第１の液体の調製〕
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０.７５％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。

〔液状の培地組成物品の調製〕
　第２の液体として、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ　高グルコース、和光純薬社製）２００ｍＬを、２２５ｍＬコニカルチューブ（住友ベークライト社製）に収容し、４℃に冷却した。ＤＭＥＭ中のカルシウムイオン濃度は１．８０ｍＭ、マグネシウムイオン濃度は０．８ｍＭであった。
　４℃に冷却された第２の液体が充填されている前記コニカルチューブのキャップを外し、本発明の製造装置として製作した蓋を装着した。
　上記の滅菌された脱アシル化ジェランガム水溶液４ｍＬ（４０００ｍｍ^３）を充填したディスポーザブルシリンジの先端部を蓋の円筒部に嵌め込んで接続し、図３に示すタイプの本発明の製造装置を構成した。
　この状態で、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、等速で移動させながら、シリンジ内の脱アシル化ジェランガム水溶液を容器内へと射出し、培地組成物を作製した。
　各液体の濃度や体積、第１の液体の射出の流量等の条件を変えて、実施例１～９、および、比較例１～１６とした。ここで、各例の第１の液体の流量は、シリンジのプランジャーの移動時間を調節することで達成した。また、実施例３、５、８、比較例３、５、１０、１４、１６では、ボルテックスミキサー（２５００ｒｐｍ）を用いて第２の液体を渦状の攪拌状態にしながら第１の液体を射出した。
　射出の後、それぞれ、アダプターキャップをコニカルチューブのキャップへ交換し、密栓した。

〔評価〕
　作製した培地組成物中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ（直径５００～６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．製）を添加して攪拌し、攪拌停止から１０分後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。
　構造体が液中に適切に細かく分散している場合、ビーズも液中に分散して浮遊したままになる。一方、構造体の分散が十分でないと、それに応じてビーズも沈降する。
　また、構造体が液中に適切に細かく分散している場合、該構造体は目視では確認できない。一方、構造体が紐状に連なったり集合していると、該構造体は、光を散乱させる物体として、または、透明ではあるが光の屈折によって不定形の紐状の物体として、視認できる。
　実施例１～９、および、比較例１～１６におけるそれぞれの試験条件、結果物におけるビーズの分散状態、構造体の状態を表２に示す。
　表２では、ビーズの分散状態については、好ましく分散し浮遊した状態を○、分散しているが一部が沈降した状態を△、全てのビーズが沈降した状態を×として表している。
　また、構造体が視認できない状態（適切に細かく分散しているとみなす）か、または、紐状・塊状となっているかは、次のとおり、○、△、×で表した。
　○は、市販の液状の培地組成物であるＦＣｅＭ（登録商標）と同等、構造体が浮遊物として視認できない状態を示す。
　△は、光にかざすと、光を散乱させる物体、または、透明ではあるが光の屈折によって不定形の紐状の物体の浮遊が視認できる状態を示す。
　×は、構造体が明らかな繊維状の析出物の浮遊または沈降が視認できる状態を示す。

　表２の結果から、第２の液体を攪拌した状態と攪拌しない状態との差異が無いことがわかった。また、比較例１～１６から明らかなとおり、同じ貫通孔を用いても、第１の液体の流量が小さいと流速も低くなり、細かい構造体が分散しないことがわかった。以上から、本発明の製造方法によれば、単純な射出によって、構造体が好ましく分散した培地組成物が容易に得られることがわかった。

（試験例２：ノズル部の貫通孔の口径に関する試験）
　本試験例２では、同じ仕様のシリンジから同じ量の第一の液体を同様の押圧力にて射出する場合において、ノズル部の貫通孔の口径を段階的に変化させたときの、流量と流速の変化、および、上記試験例１と同様のビーズの分散状態（浮遊性）、構造体の状態（析出物）の様子を評価した。
　使用した第１の液体、シリンジ、第２の液体、コニカルチューブは、上記試験例１と同様である。尚、本試験例２では、ノズル部の貫通孔の口径を段階的に変化させるために、シリンジの先端に種々のゲージ（内径）の注射針を装着した。即ち、本試験例では、注射針の内部通路が貫通孔となっている。ビーズの分散状態（浮遊性）、構造体の状態（析出物）の様子の評価の基準は、上記試験例１と同様である。
　本試験例２では、実施例１０としてケージ番号１８の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長く（流量を小さく）した試験例を比較例１７とした。
　同様に、実施例１１としてケージ番号２０の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長くした試験例を比較例１８、１９とした。
　同様に、実施例１２としてケージ番号２２の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長くした試験例を比較例２０、２１とした。
　さらに、参考試験として、小口径であるケージ番号２５の注射針を用い、添加時間を変化させた試験を行い、比較例２１、２２、２３とした。
　各試験例（実施例、比較例）におけるビーズの分散状態、構造体の状態を表３に示す。

　さらに、下記表４は、上記表３における記載の順番を並べ変えて、実施例１０～１２と、比較例１７～２４とに分けて記載した表である。

　表４の結果からも明らかなとおり、貫通孔の内径が同じであっても、第一の液体を適切な流量にて射出しなければ、良好なビーズの分散状態（良好な浮遊性）と、良好な構造体の状態（析出物なし）とを同時に満たすことができないことがわかった。
　また、比較例１７～２４の結果からも明らかなとおり、貫通孔の断面積が本発明の範囲内であっても、第１の液体を１．７ｍＬ／秒以下の流量で第２の液体へ添加した場合、良好なビーズの分散状態（良好な浮遊性）と、良好な構造体の状態（析出物なし）とを同時に満たすことができないことがわかった。

（試験例３：第１の液体の射出方向に関する試験）
　本試験例２では、シリンジから第一の液体を容器内に射出するに際して、射出の方向を上から下方へ射出する場合と、容器を上下逆にし、射出の方向を下から上方へ射出する場合とで、ビーズの分散状態（浮遊性）が異なるかどうかを評価した。
　使用した第１の液体、シリンジ、第２の液体、コニカルチューブは、上記試験例１と同様である。
　各試験例におけるビーズの分散状態（浮遊作用）を表５に示す。

　表５の結果からも明らかなとおり、本発明の製造方法は、射出方向には関係なく、好ましい浮遊作用が得られることがわかった。

（試験例４：容器の形状、ノズル部の出口から液面までの距離に関する試験）
　本試験例４では、容器の長さ（深さ方向の寸法）Ｌと容器の外径Ｄとの比（縦横比Ｌ／Ｄ）、容器内に保持された第２の液体の深さＺと容器の内径ｄとの比（縦横比Ｚ／ｄ）、および、ノズル部の出口から液面までの距離が、混合時の浮遊性能にどのように影響するかを調べた。
　各試験例におけるビーズの分散状態（浮遊作用）を表６に示す。

　表６の結果からも明らかなとおり、同じ縦横比Ｌ／Ｄの容器を用いても、液浸部が浅く縦横比Ｚ／ｄが小さいと、また、ノズル部の出口から液面までの距離が大きいと、好ましい浮遊性が得られない傾向があることがわかった。上記試験例４の条件では、液浸部の縦横比Ｚ／ｄが１．２４以下であれば、好ましい浮遊性が得られず、縦横比Ｚ／ｄが１．２４を上回ると、好ましい浮遊性が得られる結果を得た。

（試験例５：培地種を変えた場合の浮遊性に関する試験）
　本試験例５では、第２の液体である培地の種類を変更して液状の培地組成物を作製した場合の浮遊性を調べた。容器内に収容した第２の液体の温度を３７℃に維持し、第１の液体の温度を室温（ＲＴ）とした。
　各試験例におけるビーズの分散状態（浮遊作用）と構造体の状態を表７に示す。

　表７の結果からも明らかなとおり、第２の液体が異なっても、第１の液体と第２の液体とを良好に混合し得、好ましい浮遊性が得られることがわかった。

（試験例６：低接着プレートを用いたＡ５４９細胞の細胞増殖試験）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）或いは０．７５％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。０．３％溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。従来法（特許第5629893号実施例記載のホモミキサーを使用した方法）または、実施例７で調製した培地組成物へ、胎児ウシ血清を１０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。
　ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３３３３３細胞／ｍＬとなるように上記の胎児ウシ血清を含む脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物（従来法）或いは実施例７の培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１５０μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて７日間静置状態で培養した。播種直後の０日間及び７日間培養後の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。以上の試験を３回実施した。

　本発明の製造方法による培地組成物を用いた方法は、従来法と比較して同程度のA549細胞の増殖性を示した。静置培養の培養日数０日および７日後のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）は３回の試験の平均値として表８に示す。

　表８の結果からも明らかなとおり、本発明の製造方法により製造した培地組成物は、従来法で製造した培地組成物と同様に、細胞の浮遊培養を可能とし、細胞の増殖を促進することが示唆された。

（試験例７：低接着プレートにおけるＴｒａｍｅｔｉｎｉｂおよびＭＫ－２２０６を用いたＡ５４９細胞増殖抑制試験）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）或いは０．７５％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。０．３％溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。また、実施例７で調製した培地組成物へ胎児ウシ血清を１０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。
　ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物（従来法）或いは実施例７の培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。各プレートはＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度０．００１から３０μＭになるように、１０倍濃度の各抗がん剤と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（従来法および本発明の製造方法）および１０倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物（未添加法）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を７日間継続した。抗がん剤はＴｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製、ＭＥＫ阻害剤）およびＭＫ－２２０６（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製、Ａｋｔ阻害剤）を用いた。５日目および８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　Ａ５４９細胞増殖に対する各抗がん剤の抑制効果は、本発明の製造方法を用いて製造した培地組成物と従来法で製造した培地組成物の違いを認めず同様の結果であり、本発明の培地組成物でもＭＫ－２２０６の薬効が強く示されることが分かった。また、静置培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表９に、静置培養７日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表１０に示す。

　表９、表１０の結果からも明らかなとおり、本発明の製造方法により製造した培地組成物は、従来法で製造した培地組成物と同様に、細胞の浮遊培養を可能とし、癌細胞に対する抗がん剤の増殖抑制効果を増強することが示唆された。

（試験例８：各増殖因子で刺激したPanc02,03細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．７５％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。実施例７と同様にして胎児ウシ血清を１５％（ｖ／ｖ）となるようにRPMI1640培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を作製したものを実施例１３とした。
　ヒト膵臓癌細胞株Panc02,03（ＡＴＣＣ社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように前述実施例１３の培地組成物（本発明の製造方法によって作製）に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にPanc02,03細胞を懸濁したものを分注した。単層培養法は、ヒト膵臓癌細胞株Panc02,03細胞を、２２００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度３０, １００ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、３, ３０ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトEGF（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１０, １００ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトFGF2（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、３, ３０ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１０ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）および１０, １００ｎｇ／ｍＬになるように１０倍濃度のヒトＩＧＦ－１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（従来法および本発明の製造方法によって作製）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。単層培養群或いは陰性対照群では、１０倍濃度の各増殖因子のみの培地組成物をそれぞれ１５μＬずつ添加した。培養は５日間継続した。６日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　その結果、本発明の製造方法による培地組成物を用いたPanc02,03細胞増殖試験法により、単層培養法や陰性対照群に比べてヒトHB-EGFとヒトEGFの薬効が強く示されることが分かった。また、培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表１１に示す。

　表１１の結果からも明らかなとおり、本発明の製造方法により製造した培地組成物は、従来法で製造した培地組成物と同様に、細胞の浮遊培養を可能とし、HB-EGF又はEGF刺激による細胞増殖を促進することが示唆された。

　本発明によって、２価金属カチオンなどの連結物質を含んだ任意の液体（とりわけ液体培地）に対して、特定化合物を含んだ液体を容易に混合し得、かつ、微細な構造体が分散した液状の培地組成物を製造することが可能になった。

　本出願は、日本で出願された特願２０１５－０７８７９５（出願日：２０１５年４月７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。

Claims

　液状の培地組成物の製造方法であって、
　下記（ｉ）の特定化合物を含有する第１の液体を、１．７ｍＬ／秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２の貫通孔を通過させ、
　前記第１の液体を前記流量にて、下記（ｉｉ）の連結物質を含有する第２の液体中に射出し、それにより、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体を形成し、かつ、前記両液体の混合液中に該構造体を分散させる工程を有する、
前記製造方法。
　　（ｉ）２価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
　　（ｉｉ）２価金属カチオンである連結物質。
　下記（ａ）の容器に第２の液体を収容し、供給装置から第１の液体を送り出しかつ前記流量となるように下記（ａ）の容器の貫通孔を通過させ、それにより第１の液体を前記流量にて該容器内の第２の液体中に射出する、
請求項１記載の製造方法。
　（ａ）本体と蓋とを有する容器であって、該本体または該蓋には、容器外と容器内とを連通する貫通孔を持ったノズル部が設けられ、該貫通孔の横断面積が０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２である、前記容器。
　前記供給装置がシリンジであり、
　前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
請求項２記載の製造方法。
　容器に第２の液体を収容し、第１の液体を収容した下記（ｂ）の供給装置のノズル部の先端を前記容器内に挿入し、該供給装置から第１の液体を送り出しかつ前記流量となるように該供給装置のノズル部の貫通孔を通過させ、それにより第１の液体を前記流量にて容器内の第２の液体中に射出する、
請求項１記載の製造方法。
　（ｂ）液体を収容するための収容部と、収容した液体を貫通孔を通して射出するためのノズル部とを有する供給装置であって、該ノズル部の貫通孔の横断面積が０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２である、前記供給装置。
　前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着された注射針であり、
　前記容器の蓋には、前記注射針の針管部を容器外から容器内へと貫通させ得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
請求項４記載の製造方法。
　前記（ｉ）の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第１の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
　前記（ｉｉ）の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第２の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地である、
請求項１～５のいずれか１項記載の製造方法。
　請求項１記載の製造方法を実施するための製造装置であって、
　第１の液体を送り出すための供給装置と、
　第２の液体を収容するための、かつ、前記供給装置から送り出された第１の液体を受け入れるための容器と、
　第１の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき貫通孔を持ったノズル部とを有し、
　前記貫通孔の横断面積は０．０１ｍｍ^２～５．００ｍｍ^２であり、
　前記供給装置は、１．７ｍＬ／秒以上の流量にて第１の液体を送り出すことができるように構成されており、
　第１の液体を前記流量にて前記貫通孔を通過させることにより、第１の液体を１．７ｍＬ／秒以上の流量として、前記容器内に射出し得る構成となっている、
前記製造装置。
　貫通孔を持ったノズル部が前記容器の一部として設けられており、
　前記容器は、本体と蓋とを有する容器であって、前記貫通孔が容器外と容器内とを連通するように、前記ノズル部が容器の本体または蓋に設けられている、
請求項７記載の製造装置。
　前記供給装置がシリンジであり、
　前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
請求項８記載の製造装置。
　前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着される注射針であり、
　前記容器の蓋には、前記注射針が容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、さらに、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
請求項７記載の製造装置。
　請求項１記載の製造方法を実施するためのキットであって、
　第１の容器と、シリンジと、第２の容器とを少なくとも有して構成され、
　第１の容器は、請求項１記載の第１の液体を収容した容器であり、
　シリンジは、前記第１の液体を送り出すための供給装置として機能する請求項３記載のシリンジであり、
　第２の容器は、請求項１記載の第２の液体を収容するための請求項２記載の（ａ）の容器であって、請求項３記載のとおり、ノズル部が該容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
前記キット。
　さらに、第２の容器には、該容器の本体内を密封し得るように構成された、ノズル部を持たない密封用蓋が付帯しており、請求項２記載の（ａ）の容器の蓋と、前記密封用蓋とは、互換性を持って該容器の本体の開口部に装着し得るようになっている、
請求項１１記載のキット。
　さらに、上記シリンジには、第１の容器内に挿入して第１の液体を吸引するために用いられる管状部品が付帯しており、該管状部品は、
　第１の容器内に挿入し得る外径と、第１の容器内から第１の液体を吸引し得る長さとを持った細管部を有し、かつ、
　前記細管部の一端に、前記シリンジの外筒の先端部に装着し得る連結部を有している、請求項１１または１２記載のキット。