JPWO2016163444A1 - 液状の培地組成物の製造方法、およびそのための製造装置とキット - Google Patents
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Abstract
Description
細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。
また、当該技術により培養された細胞及び/又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。
特許文献1に記載された液状の培地組成物は、特定の化合物(特に、アニオン性官能基を有する高分子化合物)が2価金属カチオン等を介して集合し不定形の構造体となり、該構造体が液体培地中に分散して浮遊した状態となっているものである。以下、アニオン性官能基を有する高分子化合物などといった上記特定の化合物を「特定化合物」ともいい、該特定化合物同士を結びつける2価金属カチオン等の物質を「連結物質」ともいう。
該培地組成物は、細胞等の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに、細胞等を浮遊状態にて培養することができる好ましい液状の培地となる。
しかしながら、本願発明者らが、該液状の培地組成物の実際の作製工程を詳細に検討したところ、そのような好ましい状態を得るためには、構造体が培地組成物中の局所に偏在して形成されないように留意しなければならないことがわかった。例えば、特定化合物が脱アシル化ジェランガムの場合、該脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の連結物質(例えば、カルシウムイオン)を介して不定形な構造体を形成し、これが細胞等を浮遊させるための担体となる。しかし、連結物質を含んだ液体培地を攪拌しながら、その中に、特定化合物を高濃度に含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が合流した瞬間に特定化合物が連結物質と接して構造体となり、よって該構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊する状態(または、紐状の構造体が塊状に絡み合った状態)となり、本来意図された分散状態にはならない場合がある。また、そのような状態は、比較的高速で攪拌を行なったとしても発生することがわかった。また、液体培地中にそのような紐状の構造体がいったん形成されると、分子鎖が形成するダブルへリックスがお互いに連結物質(例えば、カルシウムイオン)を介して強固な三次元ネットワークを形成しているという該構造体の性質上、それを細かく切断して母材中に分散させることは容易ではない。
しかしながら、そのような分散のための特別な処理は手間を要し、また、一般的な液体培地や特殊な液体培地では、そのような特別な処理を行なうことが困難な場合があり、よって培養すべき細胞等も制限されていた。
〔1〕液状の培地組成物の製造方法であって、
下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体を、1.7mL/秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積0.01mm2〜5.00mm2の貫通孔を通過させ、
前記第1の液体を前記流量にて、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体中に射出し、それにより、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体を形成し、かつ、前記両液体の混合液中に該構造体を分散させる工程を有する、
前記製造方法。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
(ii)2価金属カチオンである連結物質。
〔2〕下記(a)の容器に第2の液体を収容し、供給装置から第1の液体を送り出しかつ前記流量となるように下記(a)の容器の貫通孔を通過させ、それにより第1の液体を前記流量にて該容器内の第2の液体中に射出する、
上記〔1〕記載の製造方法。
(a)本体と蓋とを有する容器であって、該本体または該蓋には、容器外と容器内とを連通する貫通孔を持ったノズル部が設けられ、該貫通孔の横断面積が0.01mm2〜5.00mm2である、前記容器。
〔3〕前記供給装置がシリンジであり、
前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
上記〔2〕記載の製造方法。
〔4〕容器に第2の液体を収容し、第1の液体を収容した下記(b)の供給装置のノズル部の先端を前記容器内に挿入し、該供給装置から第1の液体を送り出しかつ前記流量となるように該供給装置のノズル部の貫通孔を通過させ、それにより第1の液体を前記流量にて容器内の第2の液体中に射出する、
上記〔1〕記載の製造方法。
(b)液体を収容するための収容部と、収容した液体を貫通孔を通して射出するためのノズル部とを有する供給装置であって、該ノズル部の貫通孔の横断面積が0.01mm2〜5.00mm2である、前記供給装置。
〔5〕前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着された注射針であり、
前記容器の蓋には、前記注射針の針管部を容器外から容器内へと貫通させ得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
上記〔4〕記載の製造方法。
〔6〕前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地である、
上記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の製造方法。
〔7〕上記〔1〕記載の製造方法を実施するための製造装置であって、
第1の液体を送り出すための供給装置と、
第2の液体を収容するための、かつ、前記供給装置から送り出された第1の液体を受け入れるための容器と、
第1の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき貫通孔を持ったノズル部とを有し、
前記貫通孔の横断面積は0.01mm2〜5.00mm2であり、
前記供給装置は、1.7mL/秒以上の流量にて第1の液体を送り出すことができるように構成されており、
第1の液体を前記流量にて前記貫通孔を通過させることにより、第1の液体を1.7mL/秒以上の流量として、前記容器内に射出し得る構成となっている、
前記製造装置。
〔8〕貫通孔を持ったノズル部が前記容器の一部として設けられており、
前記容器は、本体と蓋とを有する容器であって、前記貫通孔が容器外と容器内とを連通するように、前記ノズル部が容器の本体または蓋に設けられている、
上記〔7〕記載の製造装置。
〔9〕前記供給装置がシリンジであり、
前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
上記〔8〕記載の製造装置。
〔10〕前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着される注射針であり、
前記容器の蓋には、前記注射針が容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、さらに、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
上記〔7〕記載の製造装置。
〔11〕上記〔1〕記載の製造方法を実施するためのキットであって、
第1の容器と、シリンジと、第2の容器とを少なくとも有して構成され、
第1の容器は、上記〔1〕記載の第1の液体を収容した容器であり、
シリンジは、前記第1の液体を送り出すための供給装置として機能する上記〔3〕記載のシリンジであり、
第2の容器は、上記〔1〕記載の第2の液体を収容するための上記〔2〕記載の(a)の容器であって、上記〔3〕記載のとおり、ノズル部が該容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
前記キット。
〔12〕さらに、第2の容器には、該容器の本体内を密封し得るように構成された、ノズル部を持たない密封用蓋が付帯しており、上記〔2〕記載の(a)の容器の蓋と、前記密封用蓋とは、互換性を持って該容器の本体の開口部に装着し得るようになっている、
上記〔11〕記載のキット。
〔13〕さらに、上記シリンジには、第1の容器内に挿入して第1の液体を吸引するために用いられる管状部品が付帯しており、該管状部品は、
第1の容器内に挿入し得る外径と、第1の容器内から第1の液体を吸引し得る長さとを持った細管部を有し、かつ、
前記細管部の一端に、前記シリンジの外筒の先端部に装着し得る連結部を有している、上記〔11〕または〔12〕記載のキット。
これを改善するためには、例えば、第1の液体が注ぎ入れられる合流部分に攪拌子を近づけて合流を切断しながら攪拌するといった構成が考えられるが、そのためには生物的なコンタミネーションを回避する観点で無菌または密閉状態での運用可能な特殊な攪拌装置が必要となる。また、多数の小容量容器においてそれぞれ個別に培地組成物を作製したい場合などには、容器へ攪拌機を挿入する際に開放系となることから、クリーンルームやクリーンブースなど無菌状態を担保する特殊な施設の設置が必要などの点から、そのような特殊な攪拌装置を小容量の容器毎に個別に使用することは困難である。
これに対し、本発明の製造方法、製造装置における両液体の混合手法の原理は、上記した従来の混合手法の原理とは真逆であって、第2の液体を高速で攪拌するのではなく、第1の液体を、所定の横断面積Sを持った貫通孔を通して所定値以上の流量Q(または、流速V)となるよう射出し、該流量Q(または、流速V)にて第1の液体を第2の液体中に突入させるというものである。これにより、両液体が合流する部分における両液の速度差を確実に高くすることができ、両液体は衝撃的に接触し、よって、構造物が長く紐状に連なることが十分に抑制される。尚、いったん細かい構造物が形成されたならば、その細かい構造物が混合液中の一部に集まっていても、さらなる攪拌を行うことで、細かい構造物を容器内の混合液全体に均等に分散させることが可能である。
貫通孔の出口を通過する第1の液体の流量Qと、貫通孔の横断面積Sと、該貫通孔の出口を通過する第1の液体の流速Vとの間には、Q=S×Vの関係がある。
先ず、上記横断面積を上回るような大口径の貫通孔を用いた場合、第1の液体は太い流れとなって第2の液体中に突入することになる。そのような太い流れでは、その中心部分にある第1の液体は失速前に第2の液体と接触し得ない場合が生じる。これに対して、貫通孔の横断面積が上記の範囲にあれば、射出流は常に細い流れとなり、その流れの中心にある第1の液体は、失速前に第2の液体と接触し得る確率が高くなる。よって、本発明では、貫通孔の横断面積を上記範囲に限定する。
また、細胞等の培養の現場において、第1の液体を送り出すために用いられる実使用上好ましい供給装置は、後述のとおり手動のシリンジである。よって、上記横断面積を上回るような大口径の貫通孔では、好ましい流速を達成し得るような流量での送り出しを確実に行うことは容易ではなくなる。
よって、本発明では、大量の培地組成物を大容量の容器内で一度に作製する場合にも、常に、上記範囲の横断面積を持った貫通孔を用いる。尚、必要に応じて複数の貫通孔を用い、第1の液体を第2の液体中に並列的に射出してもよく、また、単一の貫通孔を用い、第1の液体を第2の液体中に複数回射出してもよい。その場合の供給装置は、その吐出能力に応じて1つであってもよいし貫通孔の数だけ並列に設けてもよい。
本発明の製造方法は、上記特許文献1に記載されたような液状の培地組成物を好ましく製造する方法であって、図1に示すように、下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体Aを、1.7mL/秒以上の流量Qとなるように、ノズル部2に設けられた0.01mm2〜5.00mm2の横断面積Sを持った貫通孔21を通過させて、前記流量Qの該第1の液体を、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体B中に射出することによって両液体を混合する工程を有する。
ここで、上記(i)の特定化合物は、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である。
また、上記(ii)の連結物質は、2価金属カチオンである。
前記の特定化合物、連結物質、および、それぞれを含有する第1の液体、第2の液体の詳細は後述する。
上記流量Qでの射出を行うことによって、特定化合物が連結物質を介して結びついた構造体を、前記両液体A、Bの混合液中に形成しながらも、該構造体が該混合液中に細かく分散した液状の培地組成物を得ることができる。
流量の上限は、特に限定はされないが、貫通孔の横断面積Sを考慮した場合の第1の液体の送り出し能力の点からは、10mL/秒程度が挙げられ、5mL/秒程度が実際の操作上ではより適切である。
ノズル部の貫通孔21の横断面積Sは、0.01mm2〜5.00mm2であればよいが、0.05mm2〜2.00mm2がより好ましく、0.10mm2〜0.70mm2が特に好ましい。貫通孔の横断面積を前記の範囲に限定することによって、供給装置から送り出される第1の液体の液量に多少のばらつきがあっても、好ましい攪拌結果(即ち、構造体の好ましい分散結果)が得られる。
第1の液体を第2の液体中に射出する際の、第1の液体の流れの方向は、特に限定はされず、図1に示すように、上から下方へ射出してもよいし、横から側方への射出、下から上方への射出であってもよい。
前記供給装置1は、第1の液体Aを送り出すための装置であって、上記した流量Q(mm3/秒)にて第1の液体を送り出すことができるように構成されている。
容器3は、第2の液体Bを収容しておくための容器であり、かつ、前記供給装置1から送り出された第1の液体を受入れて、両液体からなる混合液(即ち、製造すべき液状の培地組成物)を形成するための容器である。
ノズル部2は、第1の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき上記横断面積(mm2)の貫通孔21を持っている。ノズル部2は、供給装置1に属する部品であってもよく、容器の本体や蓋に属する部分であってもよく、また、いずれにも属さず、供給装置と容器との間に介在する独立した継手部材であってもよい。
当該製造装置の使用時には、第1の液体Aが、上記流量Q(mm3/秒)にて供給装置1から送り出され、ノズル部2に設けられた上記横断面積S(mm2)の貫通孔21を通過し、容器3内に収容された第2の液体中に突入する。この一連の操作は、本発明の製造方法の実施であり、それによって好ましい液状の培地組成物が得られることは上記したとおりである。
実際の細胞等の培養操作では、大容量の1つの容器に大量の培地組成物を一度に作製して各小容量の容器に分配してストックするよりも、新鮮な培地組成物を用時調製する観点から、1〜1000mL程度、好ましくは10〜200mL程度の各小容量の容器毎に個別に培地組成物を作製する方が好ましい場合がある。
前記のような小容量の容器毎に培地組成物を作製する場合には、混合される両液体のそれぞれの具体的な体積としては、容器に収容される第2の液体を1mL〜1000mL程度、より好ましくは10mL〜200mL程度とし、その中に射出される第1の液体を0.01mL〜100mL程度、より好ましくは0.1mL〜20mL程度とすることが好ましい。
このような組合せに応じて、供給装置1と容器3の容量を適宜選択すればよい。
第1の液体と第2の液体との混合液は、製造目的の培地組成物であってもよいが、該混合液に添加物をさらに加えることで製造目的の培地組成物となるものであってもよい。
尚、本発明でいう「シリンジ」とは、外筒とプランジャー(押し子)とを有して構成される装置である。本発明は、シリンジをそのまま用いる態様と、シリンジの先端にさらに注射針を装着する態様とを含んでいる。
シリンジを供給装置として用いる場合、図2に示すように、第1の液体Aを貫通孔21を通過させて前記流量または流速とし得る押圧力(荷重)Fにて、プランジャー(ピストン部分)12を押し進め、外筒11内に収容した第1の液体Aを送り出せばよい。
即ち、本発明でいう「第1の液体を、1.7mL/秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積0.01mm2〜5.00mm2の貫通孔を通過させ」とは、第1の液体が1.7mL/秒以上の流量となって該横断面積の貫通孔を通過し得るように、第1の液体に供給装置1を通じて押圧力Fを加え、該押圧力により前述の吐出流量にて該貫通孔内へと第1の液体を押し出すことを意味する。
シリンジを供給装置として用いる場合、プランジャーの全行程の移動に要する時間を調節することによって、該シリンジから送り出される第1の液体の流量を調節することができる。即ち、シリンジは、人力で押圧する場合でも、プランジャーのストロ−クに要する時間の調節によって、目的の流量(mm3/秒)を調節することができるので好ましい。
シリンジを人力で押圧する場合に得られる流量の上限は、個人の力によっても異なるが、概ね5mL/秒程度である。
少容量のシリンジを用いる場合の例として、貫通孔の横断面積を0.2mm2とし、シリンジがテルモ社製予防接種用テルモシリンジ(1mL、型番SS-01P)であり、該シリンジ内に1.7mLの第1の液体を収容する場合、第1の液体を全て押し出すのに要するプランジャーの全移動時間T1が1秒以下であれば、1.7mL/秒以上の流量での送り出しを達成し得る。シリンジを手動で操作する場合、プランジャーを押し出す力を考慮すると、プランジャーの全移動時間T1は、0.2秒〜1秒程度が適当であり、その場合に得られる流量は、1.7mL/秒〜8.5mL/秒である。
また、大容量のシリンジを用いる場合の例として、貫通孔の横断面積を上記と同じ0.2mm2とし、シリンジがテルモ社製テルモシリンジ(50mL、型番SS-50ESZ)であって、該シリンジ内に20mLの第1の液体を収容する場合、同じ口径の貫通孔では、第1の液体を全て押し出すのに要するプランジャーの全移動時間T2は、12秒以下であれば、1.7mL/秒以上の流量での送り出しを達成し得る。シリンジを手動で操作する場合、プランジャーを押し出す力を考慮すると、プランジャーの全移動時間T2は、2.5秒〜12秒程度が適当であり、その場合に得られる流量は、1.7mL/秒〜8.0mL/秒である。その際に必要な押圧力(荷重)は、上記した少容量のシリンジを用いた場合と同様である。
プランジャーを人力で押圧する場合、該プランジャーの移動速度を厳密に一定に保つことは困難であるが、上記した移動時間の範囲であれば、人力であっても該範囲から逸脱することなく該プランジャーを移動させることが可能であり、目的の流量とそれによる貫通孔の出口での流速を大きな誤差なく達成することができる。
貫通孔の横断面の形状は、特に限定はされず、円形、楕円形、長円形、矩形、長方形、異形などであってもよい。貫通孔の形成が容易である点からは、貫通孔の横断面の形状は、円形が好ましい。また、射出された第1の液体の流れを意図的に乱して拡散させるために、貫通孔の横断面の形状を適宜変形させてもよい。
貫通孔の長さは、特に限定はされない。ノズル部を容器(本体または蓋)に設ける場合には、貫通孔の長さは0.01mm〜10mm程度が好ましく、ノズル部がシリンジの注射針であれば、貫通孔の長さは1.0mm〜100mm程度が好ましい。
また、ノズル部2は、図3に示すように、容器の中央から縁部へと偏心した位置に第1の液体を射出するように、該容器の開口の中央から偏心した位置にあってもよい。容器の中央から縁部へと偏心した位置に第1の液体が突入することによって、図3の容器内に矢印で示すように、第1の液体は第2の液体中に深く入り込んだ後、容器の底で大きく曲がり、1つの流れとして容器内を回る効果が得られる。
ノズル部の位置は、例えば、第1、第2の液体の粘性や液量、容器の形状などに応じて、適宜決定すればよい。
該容器の容量は、特に限定されないが、上記した具体的な混合比率の点からは、5mL〜1000mL程度が好ましい容量として例示される。容器の横断面形状は、特に限定されないが、混合時の対流によるスムーズな循環を達成する点からは、円形が好ましい。
容器の内部の深さL1と口径D1との比率(L1/D1)は、特に限定はされないが、同じ容量の容器であっても、比率(L1/D1)が過度に大きいと、全体として過度に細長い容器となり、混合時の対流が妨げられるので好ましくない。また、比率(L1/D1)が過度に小さいと、全体として浅い皿のような容器となり、混合時の対流が妨げられるので好ましくない。好ましい比率(L1/D1)は、0.5〜30程度、好ましくは1.0〜15程度、さらに好ましくは2.0〜8.0の範囲から適宜決定すればよい。
容器内に第2の液を収容した場合の該液が占める部分(液浸部)の深さZと口径dとの比率(Z/d)もまた、特に限定はされないが、0.5〜20程度、好ましくは1.0〜10程度、さらに好ましくは1.3〜4.0程度の範囲から適宜決定すればよい。
図2、図3、図6の例では、容器の底部の形状を、最深部に向かって細くなる円錐状として描いているが、半球状や平坦状などであってもよく、特に限定はされない。液量や粘性により対流状態の変化が想定される点、細胞等を遠心分離して効率的に沈降させて回収率を向上させるなど実用面での取扱いの点からは、図2、図3、図6のような、最深部に向かって細くなる円錐状の底部を持った容器(コニカルチューブとも呼ばれる)が好ましい場合がある。好ましい容器の製品例としては、日本ベクトン・ディッキンソン社製ラウンドチューブ5mL(352003)、コニカルチューブ15mL(352095)、コニカルチューブ50mL(352070)、コニカルチューブ175mL(352076)、コニカルチューブ225mL(352075)、住友ベークライト社製15mL遠沈管(MS−56150)、50mL遠沈管(MS−56500)、旭硝子社製遠沈管15mL(2322−015)、遠沈管50mL(2342−050)、遠沈管230mL(2386−230)等が挙げられる。
該容器の材料は、特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネートなどのプラスチックの他、ガラス、金属などが挙げられる。容器の本体と蓋の材料は、互いに異なっていてもよい。
ノズル部が容器の一部として設けられる場合、該ノズル部は、該容器の本体に設けられてもよく(図示せず)、また、蓋に設けられてもよい(図2、図3)。これらの場合の貫通孔は、該ノズル部を貫通して容器外と容器内とを連通する流路である。第1の液体は、該貫通孔を通過して、容器内の第2の液体中に射出される。
理化学機器としての一般的な容器の本体を利用し得る点からは、図2、図3に示すように、ノズル部2が蓋32に設けられる態様が好ましい。ノズル部2は、蓋32に一体的に設けられる態様が好ましいが、別途形成した部品を蓋に組み込む態様であってもよい。
上記したように、ノズル部2は、蓋の中央に位置していても(図2)、蓋の中央から縁部へと偏心して位置していてもよい(図3)。
ノズル部を偏心させる場合、容器の開口形状を円形とし、該開口の半径をR(mm)とし、該開口の中心から縁部へ偏心させる距離をr(mm)として、Rに占めるrの割合〔(r/R)×100〕が40%〜80%程度であれば、偏心の効果が顕著になる。ノズル部の偏心が過度に大きいと、第1の液体の流れが容器の壁部に接近し過ぎることになり、適当な攪拌が阻害される可能性がある。
図4(b)に示すように、ノズル部2の先端(容器内部側)は、貫通孔21の長さを確保し該貫通孔から出て行く際の第1の液体の流れができる限り該貫通孔の横断面を保ったままの線状の流れとするために、容器内部側に突起している。該ノズル部の先端と、容器に収容される第2の液体の液面との間には空間があってもよく、また、ノズル部の先端は、第2の液体と接触するようにより長く延びていてもよい。
また、好ましいオプションとして、図4(a)〜(c)の例では、蓋の外面から突き出した筒状部33の先端部には、ルアーロック型のシリンジの先端のメネジと係合するための突起部34、35が側方に突起しており、該シリンジをねじ込んで固定することが可能になっている。該突起部34、35のそれぞれの下部には、図4(c)に現れているように、該シリンジの先端のメネジに係合し得る勾配34a、35aが設けられている。
容器の本体31と蓋32との間の連結構造やシール性、シリンジの先端部11aと蓋の筒状部33との間の連結構造、該先端部11aと筒状部の内面33aとのハメアイ、シール性は適宜設定すればよい。
図5(b)に示すように、該蓋32の内側には、市販の理化学実験用の容器の本体の開口部に螺合できるように、ネジ山36が設けられている。また、該蓋32の内側の最奥面には、該蓋を容器の開口部に螺合させたときに該開口をシールするための環状のシール部37が突起している。また、図5(a)に示すように、蓋の外周側面には本来の蓋と同様にローレット38が設けられ、手で蓋を回す際に滑らないようにしている。
同図の態様では、針管部の内部の管路が本発明における貫通孔となっており、その横断面積は0.01mm2〜5.00mm2である。同図の態様では、針管部の先端が、容器内に収容される第2の液体の内部に入り込むようになっている。
容器の蓋32には、注射針13の針管部13bが容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分39が設けられており、該貫通可能部分39の容器外部側には、注射針の針基部13aを嵌め込むための筒状部33が、該蓋32の外面から突き出している。該筒状部33は必須ではないが、使用時にシリンジを保持するためには好ましい構造である。
貫通可能部分39は、針管部が使用時に通過し得るように形成されていればよく、針管部の外径に適合した貫通孔であってもよいし、針管部が突き破ることが可能な脆弱部や薄膜部であってもよい。
攪拌方法としては、例えば、手動振盪、機械的振盪(直線往復動、偏心旋回動及び8の字旋回動)、超音波振動、ボルテックス攪拌等を、容器に加え、それによって容器内の第2の液体を攪拌した状態とする方法が挙げられる。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上が含まれていてもよい。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG−LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)HT」等を使用することができる。
本態様においては、本発明の製造方法により、第1の液体と第2の液体を混合することにより、第1の液体に含まれていた特定化合物が第2の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む、目的とする液状の培地組成物を直ちに得ることができる。
DAG又はその塩:0.005〜0.02%(好ましくは0.01〜0.02%)(w/v)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.1〜0.4%(w/v)
アルギン酸ナトリウム:0.0001〜0.4%(w/v)(好ましくは、0.1〜0.4%(w/v))
ネイティブジェランガム:0.0001〜0.4%(w/v)
ローカトビーンガム:0.1〜0.4%(w/v)
メチルセルロース:0.1〜0.4%(w/v)(好ましくは0.2〜0.4%(w/v))
カラギーナン:0.05〜0.1%(w/v)
ダイユータンガム:0.05〜0.1%(w/v)
濃度[%(w/v)]=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(mL)×100
該液状培地組成物には、DAGがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体が均一に分散して含まれることにより、粘度が実質的に高められること無く、細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことができる。
図7に示すように、本発明のキットには、上記した第1の液体を収容した第1の容器K1が含まれており、かつ、上記で説明した前記第1の液体を送り出すための供給装置1であるシリンジK2と、図2〜図5を参照して説明した容器3である第2の容器K3とを少なくとも有して構成される。第2の容器K3は、上記で容器3について説明をしたとおり、ノズル部が付いた蓋K32と本体K31とを有してなる容器であって、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している。
第1の容器K1は、上記した第1の液体をユーザーが必要とする量だけ収容しユーザーへ送達し得る容器であれば、材料やサイズに限定はない。第1の容器K1は、容器本体と、該容器本体の開口を閉じる蓋と有する態様が好ましく、蓋は、容器本体に螺合する態様が好ましい。
第2の液体は、キットに含めて提供してもよいが、ユーザーが通常使用している液体培地であってもよい。
該密封用蓋K32を提供することで、ノズル部を持った蓋K32を用いて容器の本体K31内に液状の培地組成物の製造した後、容器の本体K31内に該液状の培地組成物を密封することが可能になる。
容器の本体K31が、市販品である場合、該密封用蓋K32は、その市販品の容器の本体に本来付属していた蓋であってもよい。
尚、各試験で使用した培地中の2価カチオン濃度は、下記表1のとおりである。
以下に、本発明の製造装置の一態様を製作し、それを用いて本発明の製造方法を実施し、得られた培地組成物中における構造体の分散の様子を観察した試験の結果を示す。また、比較例として、第1の液体の射出の流量を低下させた場合の試験の結果を示す。
実施例1〜9および比較例1〜16では、特定化合物を脱アシル化ジェランガムとし、第1の液体を脱アシル化ジェランガム溶液とし、脱アシル化ジェランガムを連結し構造体とするための連結物質としてカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有する液体培地を第2の液体とした。
実施例1〜9および比較例1〜16では、図3に示すタイプの製造装置を製作した。
容器としては、市販のコニカルチューブ(容量225mL(225000mm3)または容量50mL(50000mm3)、住友ベークライト社製)の本体部分を用い、これに適合するよう図5に示す蓋を製作した。貫通孔の口径はいずれも0.5mmとした。よって、貫通孔の横断面積は約0.2mm2である。
供給装置としては、容量5mL(5000mm3)または容量1mL(1000mm3)のディスポーザブルシリンジを用い、該シリンジの外筒の先端部を蓋の外側に突起した円筒部33に嵌め込んで連結し得るようにした。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.75%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。
第2の液体として、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium;DMEM 高グルコース、和光純薬社製)200mLを、225mLコニカルチューブ(住友ベークライト社製)に収容し、4℃に冷却した。DMEM中のカルシウムイオン濃度は1.80mM、マグネシウムイオン濃度は0.8mMであった。
4℃に冷却された第2の液体が充填されている前記コニカルチューブのキャップを外し、本発明の製造装置として製作した蓋を装着した。
上記の滅菌された脱アシル化ジェランガム水溶液4mL(4000mm3)を充填したディスポーザブルシリンジの先端部を蓋の円筒部に嵌め込んで接続し、図3に示すタイプの本発明の製造装置を構成した。
この状態で、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、等速で移動させながら、シリンジ内の脱アシル化ジェランガム水溶液を容器内へと射出し、培地組成物を作製した。
各液体の濃度や体積、第1の液体の射出の流量等の条件を変えて、実施例1〜9、および、比較例1〜16とした。ここで、各例の第1の液体の流量は、シリンジのプランジャーの移動時間を調節することで達成した。また、実施例3、5、8、比較例3、5、10、14、16では、ボルテックスミキサー(2500rpm)を用いて第2の液体を渦状の攪拌状態にしながら第1の液体を射出した。
射出の後、それぞれ、アダプターキャップをコニカルチューブのキャップへ交換し、密栓した。
作製した培地組成物中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ(直径500〜600μm、Polysciences Inc.製)を添加して攪拌し、攪拌停止から10分後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。
構造体が液中に適切に細かく分散している場合、ビーズも液中に分散して浮遊したままになる。一方、構造体の分散が十分でないと、それに応じてビーズも沈降する。
また、構造体が液中に適切に細かく分散している場合、該構造体は目視では確認できない。一方、構造体が紐状に連なったり集合していると、該構造体は、光を散乱させる物体として、または、透明ではあるが光の屈折によって不定形の紐状の物体として、視認できる。
実施例1〜9、および、比較例1〜16におけるそれぞれの試験条件、結果物におけるビーズの分散状態、構造体の状態を表2に示す。
表2では、ビーズの分散状態については、好ましく分散し浮遊した状態を○、分散しているが一部が沈降した状態を△、全てのビーズが沈降した状態を×として表している。
また、構造体が視認できない状態(適切に細かく分散しているとみなす)か、または、紐状・塊状となっているかは、次のとおり、○、△、×で表した。
○は、市販の液状の培地組成物であるFCeM(登録商標)と同等、構造体が浮遊物として視認できない状態を示す。
△は、光にかざすと、光を散乱させる物体、または、透明ではあるが光の屈折によって不定形の紐状の物体の浮遊が視認できる状態を示す。
×は、構造体が明らかな繊維状の析出物の浮遊または沈降が視認できる状態を示す。
本試験例2では、同じ仕様のシリンジから同じ量の第一の液体を同様の押圧力にて射出する場合において、ノズル部の貫通孔の口径を段階的に変化させたときの、流量と流速の変化、および、上記試験例1と同様のビーズの分散状態(浮遊性)、構造体の状態(析出物)の様子を評価した。
使用した第1の液体、シリンジ、第2の液体、コニカルチューブは、上記試験例1と同様である。尚、本試験例2では、ノズル部の貫通孔の口径を段階的に変化させるために、シリンジの先端に種々のゲージ(内径)の注射針を装着した。即ち、本試験例では、注射針の内部通路が貫通孔となっている。ビーズの分散状態(浮遊性)、構造体の状態(析出物)の様子の評価の基準は、上記試験例1と同様である。
本試験例2では、実施例10としてケージ番号18の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長く(流量を小さく)した試験例を比較例17とした。
同様に、実施例11としてケージ番号20の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長くした試験例を比較例18、19とした。
同様に、実施例12としてケージ番号22の注射針を用い、それに対して、同じケージ番号で添加時間を長くした試験例を比較例20、21とした。
さらに、参考試験として、小口径であるケージ番号25の注射針を用い、添加時間を変化させた試験を行い、比較例21、22、23とした。
各試験例(実施例、比較例)におけるビーズの分散状態、構造体の状態を表3に示す。
また、比較例17〜24の結果からも明らかなとおり、貫通孔の断面積が本発明の範囲内であっても、第1の液体を1.7mL/秒以下の流量で第2の液体へ添加した場合、良好なビーズの分散状態(良好な浮遊性)と、良好な構造体の状態(析出物なし)とを同時に満たすことができないことがわかった。
本試験例2では、シリンジから第一の液体を容器内に射出するに際して、射出の方向を上から下方へ射出する場合と、容器を上下逆にし、射出の方向を下から上方へ射出する場合とで、ビーズの分散状態(浮遊性)が異なるかどうかを評価した。
使用した第1の液体、シリンジ、第2の液体、コニカルチューブは、上記試験例1と同様である。
各試験例におけるビーズの分散状態(浮遊作用)を表5に示す。
本試験例4では、容器の長さ(深さ方向の寸法)Lと容器の外径Dとの比(縦横比L/D)、容器内に保持された第2の液体の深さZと容器の内径dとの比(縦横比Z/d)、および、ノズル部の出口から液面までの距離が、混合時の浮遊性能にどのように影響するかを調べた。
各試験例におけるビーズの分散状態(浮遊作用)を表6に示す。
本試験例5では、第2の液体である培地の種類を変更して液状の培地組成物を作製した場合の浮遊性を調べた。容器内に収容した第2の液体の温度を37℃に維持し、第1の液体の温度を室温(RT)とした。
各試験例におけるビーズの分散状態(浮遊作用)と構造体の状態を表7に示す。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)或いは0.75%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。0.3%溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。従来法(特許第5629893号実施例記載のホモミキサーを使用した方法)または、実施例7で調製した培地組成物へ、胎児ウシ血清を10%(v/v)となるように添加した。
ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、33333細胞/mLとなるように上記の胎児ウシ血清を含む脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物(従来法)或いは実施例7の培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり150μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて7日間静置状態で培養した。播種直後の0日間及び7日間培養後の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。以上の試験を3回実施した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)或いは0.75%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。0.3%溶液を用いて10%(v/v)胎児ウシ血清を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。また、実施例7で調製した培地組成物へ胎児ウシ血清を10%(v/v)となるように添加した。
ヒト肺癌細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製)を、14800細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物(従来法)或いは実施例7の培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にA549細胞を懸濁したものを分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度0.001から30μMになるように、10倍濃度の各抗がん剤と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(従来法および本発明の製造方法)および10倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物(未添加法)をそれぞれ15μLずつ添加し、引き続き培養を7日間継続した。抗がん剤はTrametinib(Santa Cruz社製、MEK阻害剤)およびMK−2206(Santa Cruz社製、Akt阻害剤)を用いた。5日目および8日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)を0.75%(w/v)となるように超純水(Milli−Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの攪拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。実施例7と同様にして胎児ウシ血清を15%(v/v)となるようにRPMI1640培地(WAKO社製)に終濃度0.02%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を作製したものを実施例13とした。
ヒト膵臓癌細胞株Panc02,03(ATCC社製)を、37000細胞/mLとなるように前述実施例13の培地組成物(本発明の製造方法によって作製)に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にPanc02,03細胞を懸濁したものを分注した。単層培養法は、ヒト膵臓癌細胞株Panc02,03細胞を、2200細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり135μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度30, 100ng/mLになるように10倍濃度のヒトHB−EGF(PEPROTECH社製)、3, 30ng/mLになるように10倍濃度のヒトEGF(PEPROTECH社製)、10, 100ng/mLになるように10倍濃度のヒトFGF2(PEPROTECH社製)、3, 30ng/mLになるように10倍濃度のヒトTGF−β1(PEPROTECH社製)、10ng/mLになるように10倍濃度のヒトPDGF−BB(PEPROTECH社製)および10, 100ng/mLになるように10倍濃度のヒトIGF−1(PEPROTECH社製)と終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物(従来法および本発明の製造方法によって作製)をそれぞれ15μLずつ添加した。単層培養群或いは陰性対照群では、10倍濃度の各増殖因子のみの培地組成物をそれぞれ15μLずつ添加した。培養は5日間継続した。6日目の培養液に対してATP試薬150μL(CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
Claims (13)
- 液状の培地組成物の製造方法であって、
下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体を、1.7mL/秒以上の流量となるように、ノズル部に設けられた横断面積0.01mm2〜5.00mm2の貫通孔を通過させ、
前記第1の液体を前記流量にて、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体中に射出し、それにより、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体を形成し、かつ、前記両液体の混合液中に該構造体を分散させる工程を有する、
前記製造方法。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
(ii)2価金属カチオンである連結物質。 - 下記(a)の容器に第2の液体を収容し、供給装置から第1の液体を送り出しかつ前記流量となるように下記(a)の容器の貫通孔を通過させ、それにより第1の液体を前記流量にて該容器内の第2の液体中に射出する、
請求項1記載の製造方法。
(a)本体と蓋とを有する容器であって、該本体または該蓋には、容器外と容器内とを連通する貫通孔を持ったノズル部が設けられ、該貫通孔の横断面積が0.01mm2〜5.00mm2である、前記容器。 - 前記供給装置がシリンジであり、
前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
請求項2記載の製造方法。 - 容器に第2の液体を収容し、第1の液体を収容した下記(b)の供給装置のノズル部の先端を前記容器内に挿入し、該供給装置から第1の液体を送り出しかつ前記流量となるように該供給装置のノズル部の貫通孔を通過させ、それにより第1の液体を前記流量にて容器内の第2の液体中に射出する、
請求項1記載の製造方法。
(b)液体を収容するための収容部と、収容した液体を貫通孔を通して射出するためのノズル部とを有する供給装置であって、該ノズル部の貫通孔の横断面積が0.01mm2〜5.00mm2である、前記供給装置。 - 前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着された注射針であり、
前記容器の蓋には、前記注射針の針管部を容器外から容器内へと貫通させ得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
請求項4記載の製造方法。 - 前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地である、
請求項1〜5のいずれか1項記載の製造方法。 - 請求項1記載の製造方法を実施するための製造装置であって、
第1の液体を送り出すための供給装置と、
第2の液体を収容するための、かつ、前記供給装置から送り出された第1の液体を受け入れるための容器と、
第1の液体が前記供給装置から前記容器内に送り出される際に通過すべき貫通孔を持ったノズル部とを有し、
前記貫通孔の横断面積は0.01mm2〜5.00mm2であり、
前記供給装置は、1.7mL/秒以上の流量にて第1の液体を送り出すことができるように構成されており、
第1の液体を前記流量にて前記貫通孔を通過させることにより、第1の液体を1.7mL/秒以上の流量として、前記容器内に射出し得る構成となっている、
前記製造装置。 - 貫通孔を持ったノズル部が前記容器の一部として設けられており、
前記容器は、本体と蓋とを有する容器であって、前記貫通孔が容器外と容器内とを連通するように、前記ノズル部が容器の本体または蓋に設けられている、
請求項7記載の製造装置。 - 前記供給装置がシリンジであり、
前記ノズル部が容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
請求項8記載の製造装置。 - 前記供給装置がシリンジであり、前記ノズル部が前記シリンジに装着される注射針であり、
前記容器の蓋には、前記注射針が容器外から容器内へと貫通し得る貫通可能部分が設けられており、かつ、該貫通可能部分の容器外部側には、さらに、注射針の針基部を嵌め込むための筒状部が蓋の外面から突き出している、
請求項7記載の製造装置。 - 請求項1記載の製造方法を実施するためのキットであって、
第1の容器と、シリンジと、第2の容器とを少なくとも有して構成され、
第1の容器は、請求項1記載の第1の液体を収容した容器であり、
シリンジは、前記第1の液体を送り出すための供給装置として機能する請求項3記載のシリンジであり、
第2の容器は、請求項1記載の第2の液体を収容するための請求項2記載の(a)の容器であって、請求項3記載のとおり、ノズル部が該容器の蓋に設けられており、かつ、該ノズル部の容器外部側には、さらに、前記シリンジの先端部を嵌め込むための筒状部が該蓋の外面から突き出している、
前記キット。 - さらに、第2の容器には、該容器の本体内を密封し得るように構成された、ノズル部を持たない密封用蓋が付帯しており、請求項2記載の(a)の容器の蓋と、前記密封用蓋とは、互換性を持って該容器の本体の開口部に装着し得るようになっている、
請求項11記載のキット。 - さらに、上記シリンジには、第1の容器内に挿入して第1の液体を吸引するために用いられる管状部品が付帯しており、該管状部品は、
第1の容器内に挿入し得る外径と、第1の容器内から第1の液体を吸引し得る長さとを持った細管部を有し、かつ、
前記細管部の一端に、前記シリンジの外筒の先端部に装着し得る連結部を有している、請求項11または12記載のキット。
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