WO2017146122A1 - スフェロイド形成促進方法 - Google Patents

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WO2017146122A1
WO2017146122A1 PCT/JP2017/006687 JP2017006687W WO2017146122A1 WO 2017146122 A1 WO2017146122 A1 WO 2017146122A1 JP 2017006687 W JP2017006687 W JP 2017006687W WO 2017146122 A1 WO2017146122 A1 WO 2017146122A1
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cell
cells
spheroid formation
promoter
culture
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圭 塚本
新司 入江
典弥 松▲崎▼
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凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting spheroid formation from cells, and a kit used in the method.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-031159 for which it applied to Japan on February 22, 2016, and uses the content here.
  • a spheroid (cell aggregate) culture method using the original agglutination reaction of adherent cells has been known (for example, (See Non-Patent Documents 1 to 3.)
  • spheroids are formed by culturing adherent cells on a non-adhesive scaffold or without using a scaffold. The formed spheroid is closer to the living tissue than the single cell layer attached to the scaffold. For this reason, by using spheroids, for example, the effect of a drug on a living tissue can be more easily evaluated.
  • the dedicated culture container examples include a culture container coated with a functional molecule to realize a non-adhesive scaffold, a culture container with a cell non-adhesive gel attached to the surface, and culture in microdroplets.
  • Containers (culture containers in microfluids) are commercially available.
  • a culture vessel having a concavo-convex structure functioning as a cell adhesion surface formed by continuously forming a plurality of cells having a minimum inner diameter of 3 ⁇ m or less has also been reported (see, for example, Patent Document 3). By culturing the cells in this fine cell, the proliferated cells do not spread into a single layer, but spheroids are formed.
  • the time required for spheroid formation is long because the original adhesive force of the cells is used as the driving force.
  • spheroid formation may take about 3 to 7 days. There have been few reports on methods that can reduce the time required for spheroid formation.
  • Patent Documents 4 and 5 report methods using body fluids of cephalopods and fish such as squid, octopus and geese. However, since these are derived from natural products, they are not suitable for producing inexpensive and stable spheroids.
  • An object of the present invention is to provide a method for promoting spheroid formation that promotes cell aggregation / organization and can form spheroids quickly and stably, and a kit for forming spheroids by the method. .
  • the method for promoting spheroid formation includes a preparation step of preparing a mixture in which a cell sample and an accelerator are mixed, and the mixture obtained in the preparation step in a container for spheroid formation culture.
  • the culture step may be performed after the mixing of the cell sample and the promoter is repeated a plurality of times in the preparation step.
  • an external force may be applied to the cells in the mixture obtained by the preparation step before the culturing step.
  • the external force may be a centrifugal force.
  • the number of cells contained in the cell sample may be 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 .
  • the cell sample may include cells collected from an animal.
  • the cell sample may include cells collected from a human.
  • the promoter may be heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, or dermatan sulfate.
  • the promoter may be heparin, chondroitin sulfate, or hyaluronic acid.
  • the kit for promoting spheroid formation according to the second aspect of the present invention, at least one selected from the group consisting of D-glucosamine, D-galactosamine, D-glucuronic acid, L-iduronic acid, and D-galactose is polymerized. It has an accelerator containing a polymer.
  • the promoter may be heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, or dermatan sulfate.
  • the spheroid formation promotion kit according to the second aspect may further include a spheroid formation culture container.
  • Example 1 it is the transmitted light photograph figure of the spheroid of the HT29 cell formed after culture
  • Example 2 it is the transmitted light photograph figure of the spheroid formed after culture
  • the spheroid formation promotion method which concerns on one Embodiment of this invention is a method of accelerating
  • (1) A step of preparing a mixture in which a cell sample and an accelerator are mixed (preparation step).
  • (2) A step of culturing the mixture obtained in the step (1) in a spheroid-forming culture vessel (culturing step).
  • an accelerator having a polymer having a specific structure is used.
  • spheroids By mixing the promoter with cells, spheroids can be formed more rapidly and stably than when only the adhesive force inherent in the cells is used as the driving force. The reason why such an effect is obtained by the accelerator is not clear, but the accelerator adheres to the surface of the cell, and the formed accelerator layer makes the aggregation or organization of cells faster and stabilizes. It is inferred to do.
  • spheroids can be stably formed even if the cells have weak cohesion due to the spheroid formation promoting effect of the promoter. That is, the spheroid formation promoting method according to the present embodiment can stably form spheroids even if the spheroids are difficult to form. Moreover, the spheroids formed by the spheroid formation promoting method according to the present embodiment have a shape close to a true sphere and have relatively uniform sizes. Although it is not clear why spheroids with a relatively uniform shape and size can be formed, the adhesion and cohesion between the cells in the system can be reduced by the interaction between the promoter layers formed on the cell surface. It is assumed that it is almost constant.
  • the accelerator used in the present embodiment includes a polymer obtained by polymerizing at least one selected from the group consisting of D-glucosamine, D-galactosamine, D-glucuronic acid, L-iduronic acid, and D-galactose.
  • D-glucosamine or the like is a constituent component of glycosaminoglycan (mucopolysaccharide), and the polymer has a glycosaminoglycan structure at least partially.
  • the polymer is a negatively charged electrolyte having a large number of sulfate groups and carboxyl groups.
  • Glycosaminoglycan is a polymer known as a factor that deeply contributes to cell organization and the like in vivo.
  • Examples of the accelerator used in this embodiment include glycosamino in which only one or more selected from the group consisting of D-glucosamine, D-galactosamine, D-glucuronic acid, L-iduronic acid, and D-galactose is polymerized. It may be a glycan or a polymer in which a molecule other than D-glucosamine is bound to the glycosaminoglycan. Examples of molecules other than D-glucosamine include saccharides other than D-glucosamine, uronic acids, sugar chains, amino acids, peptides, fatty acids, lipids, and the like.
  • Accelerators used in the present embodiment include heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, or dermatan sulfate, and heparin, chondroitin sulfate, or hyaluronic acid is preferable.
  • Heparin is more preferable because it has a high spheroid formation promoting effect and high versatility.
  • a cell sample in which cells for forming spheroids are suspended in a solvent and an accelerator are mixed.
  • the promoter adheres to the surface of the cells in the cell sample. Only one type of promoter may be mixed with the cell sample, or two or more types may be mixed and used.
  • the cells contained in the cell sample used in the present embodiment may be adhesive cells, may be cells collected from animals, may be cells obtained by culturing cells collected from animals, It may be a cell obtained by subjecting cells collected from animals to various treatments, or may be a cultured cell line.
  • the cell contained in the cell sample is a cell collected from an animal, the collection site is not particularly limited. It may be a somatic cell derived from bone, muscle, viscera, nerve, brain, bone, skin, blood, etc., a germ cell, or an embryonic stem cell (ES cell).
  • the type of animal from which the cells contained in the cell sample are derived is not particularly limited, and for example, cells derived from animals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, rats, etc. may be used. it can.
  • a cell obtained by culturing a cell collected from an animal may be a primary cultured cell or a subcultured cell. Examples of cells subjected to various treatments include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and cells after differentiation induction.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cell sample used in this embodiment may contain only one type of cell, or may be a suspension containing two or more types of cells.
  • a cell sample containing one type of cell By using a cell sample containing one type of cell, a spheroid consisting of only one type of cell can be formed.
  • a cell sample containing a plurality of types of cells By using a cell sample containing a plurality of types of cells, a spheroid containing a plurality of types of cells can be formed.
  • the cells contained in the cell sample used in the present embodiment may be cells in any cell cycle, may be undifferentiated cells, or may be differentiated cells. Moreover, it may be a normal cell or a cell collected from a pathological tissue such as a cancer tissue.
  • the cells contained in the cell sample include nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, hepatoma cells and other cancer cells, epithelial cells, cardiomyocytes, Examples include hepatocytes, islet cells, tissue stem cells, and smooth muscle cells.
  • spheroids of the cancer cells can be formed quickly and stably.
  • a mixed spheroid imitating a tissue in a living body can be formed by using a suspension containing two or more types of cells such as human-derived cancer cells, fibroblasts, and vascular cells.
  • the number of cells contained in the cell sample used in the present embodiment is not particularly limited, and can be arbitrarily set depending on the culture environment in consideration of the size of the target spheroid to be formed. For example, by setting the number of cells contained in the cell sample to 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 , spheroids that are large enough to be used for evaluation tests of drugs and the like can be formed. . If the number of cells contained in the cell sample is insufficient to form spheroids of the desired size, the cells are cultured until the required number of cells is obtained before performing step (1). May be allowed to grow.
  • the mixture of the cell sample cultured in the step (2) and the promoter is a cell suspension.
  • the cell sample is preferably a suspension in which cells are suspended in a solvent.
  • the cell sample only needs to be a cell suspension in a state of being mixed with the promoter, and the cell suspension is cultured in step (2) by mixing the pellet-shaped cell sample with a solution containing the promoter. May be prepared.
  • the solvent for preparing the cell suspension is not particularly limited as long as it is not toxic to cells and does not impair the growth and function, and water, buffer, cell culture medium, etc. may be used. Can do.
  • the buffer include phosphate physiological saline (PBS), HEPES buffer, Hanks buffer, and the like.
  • the culture medium include D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Ham's F-12, and the like.
  • the amount of the accelerator mixed with the cell sample may be sufficient to obtain a spheroid formation promoting effect, depending on the type of cells, the number of constituent cells, and the culture environment in the mixture of the cell sample and the accelerator. Can be set arbitrarily.
  • the amount of the promoter mixed with the cell sample is preferably such that the concentration of the promoter in the mixture of the cell sample and the promoter is 0.01 to 10 mg / mL, and 0.1 to 1 mg / mL. It is more preferable that the amount is mL.
  • the concentration of the promoter in the mixture is within the above range, the cells in the mixture and the promoter are likely to contact each other, and as a result of the promoter adhering to the surface of many cells, the effect of promoting spheroid formation is sufficiently obtained. .
  • the accelerator may be mixed with the cell sample in the form of a solid such as powder, but it is preferable to mix the accelerator with the cell sample in a state dissolved or suspended in a solvent.
  • a solvent for dissolving or suspending the promoter, the same solvent as the solvent for preparing the cell suspension can be used.
  • step (2) may be performed after step (1) is repeated a plurality of times. That is, in the step (1), the mixing of the cell sample and the promoter may be repeated a plurality of times.
  • step (2) the mixture obtained in step (1) is cultured in a spheroid-forming culture vessel.
  • a spheroid-forming culture vessel By culturing the mixture in a spheroid-forming culture vessel, spheroids are rapidly formed by the action of an accelerator attached to the cell surface.
  • Preparation of the mixture in the step (1) may be performed in a spheroid-forming culture vessel, or after being performed in another vessel, the obtained mixture is put into the spheroid-forming culture vessel, and the step (2). May be performed.
  • the spheroid-forming culture container used in the present embodiment may be any container in which adhesion other than between cells is suppressed, and a container used for cell culture by a general spheroid culture method can be used.
  • the container include a culture container coated with a functional molecule to realize a non-adhesive scaffold, a culture container in which a cell non-adhesive gel is attached to the surface, a micro liquid culture method (a micro drop culture method) ) And the like in a microfluid.
  • the material for the spheroid-forming culture vessel include, but are not limited to, glass, stainless steel, and plastic.
  • Examples of the spheroid-forming culture vessel include, but are not limited to, a dish, a tube, a flask, a bottle, and a plate.
  • the culture conditions in the spheroid-forming culture vessel may be any environment suitable for the cell type to be used.
  • a commercially available culture medium recommended for culturing the cell type to be used is used to culture the cell type to be used.
  • the recommended temperature conditions can be used.
  • the culture time can also be arbitrarily set depending on the cell type, the number of cells, and the size of the target spheroid.
  • a human-derived cancer cell pellet is mixed with a solution containing heparin to prepare a suspension, and the cancer cells and heparin are contacted in the suspension to attach heparin to the cell surface.
  • a prescribed amount of the suspension containing the cells to which heparin is attached is added to a culture container in a microfluid, and the environment is suitable for cancer cell culture, for example, in an environment of 5% CO 2 gas and 37 ° C. Hold for hours. Thereby, spheroid formation can be achieved rapidly.
  • the component used as the environment suitable for cell cultures, such as a culture medium is contained in the said suspension liquid.
  • the method for promoting spheroid formation it is preferable to apply an external force to the cells in the mixture obtained in step (1) before step (2). Due to the external force, cells that are widely diffused in the mixture are collected in a certain region, and the distance between the cells is shortened. As a result, spheroids can be formed more quickly.
  • the external force is not particularly limited as long as it is an external force that acts to move the cells in the mixture in a certain direction, and examples thereof include centrifugal force, pressure, and magnetic force.
  • the conditions for applying the centrifugal force and the pressure may be any conditions as long as the cells are collected in a certain region while maintaining the state of the cells in the spheroid-forming culture vessel. It can be set arbitrarily depending on the size of the spheroid.
  • centrifugal force for example, a well plate type culture vessel may be sufficiently applied with a centrifugal force for an arbitrary time using a plate centrifuge.
  • pressure for example, a well plate type culture vessel may be sufficiently applied with a pressure type or a pressure reduction type device.
  • a cell-magnetic substance complex is formed using a magnetic substance having a structure or function capable of specifically binding or adhering to a cell, and the complex is formed into a spheroid using magnetic force. It can be performed by a method such as collecting on the bottom of the culture vessel.
  • a human-derived cancer cell pellet is mixed with a solution containing heparin to prepare a suspension, and the cancer cells and heparin are contacted in the suspension to attach heparin to the cell surface.
  • a prescribed amount of a suspension containing cells to which heparin is attached is added to a culture container having a surface with low cell adhesion, and external force is applied.
  • an environment suitable for a cancer cell culture for example, 5% CO 2 gas, retains any time under 37 ° C. environment. Thereby, spheroid formation can be achieved rapidly.
  • the component used as the environment suitable for cell cultures, such as a culture medium is contained in the said suspension liquid.
  • the kit for promoting spheroid formation according to one embodiment of the present invention is characterized by including the above-mentioned promoter.
  • the kit preferably has a configuration including the spheroid-forming culture vessel.
  • a buffer for preparing a cell suspension, a cell culture medium, and the like may be included.
  • Example 1 Spheroids formed from one type of cell were formed.
  • Examples of cells include human colorectal adenocarcinoma cell line HT29 (HTB-38 (registered trademark) of ATCC (American Type Culture Collection)) as cells that easily form spheroids, and human breast cancer cells as cells that hardly form spheroids.
  • Two strains MCF7 ATCC HTB-22® were used.
  • PERFECTA 3D Biomatrix Hanging Drop Plate manufactured by 3D Biomatrix, NT-HDP1096, which is a culture container in a microfluid, was used.
  • a culture medium 10 vol / vol% bovine serum (Corning # 35-010-CV) and 1 vol / vol% penicillin / streptomycin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to D-MEM (043-30085 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 168-23191) was used.
  • the accelerator heparin (manufactured by SIGMA, H3149) was used.
  • the cell and heparin are added and mixed in a serum culture medium so that the heparin concentration is 1 mg / ⁇ L and the cell concentration is 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L, and the cells are mixed.
  • a suspension was prepared.
  • the prepared cell suspension is added to each of the three wells of the culture container in the microfluid (the number of cells per well is 1 ⁇ 10 4 ), and the temperature is 37 ° C., 5 ° C.
  • the cells were cultured for 72 hours in a% CO 2 gas environment, and the presence or absence of spheroid formation was evaluated over time. Moreover, the survival rate of the cell after 72-hour culture
  • Evaluation of spheroid formation was performed directly on the cell suspension using an inverted microscope at 10 points after 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 48, 72 hours from the start of culture. Image analysis by observation was performed and evaluated in three stages. Evaluation value 1 indicates no spheroid formation (in a dispersed state), evaluation value 2 indicates signs of spheroid formation (non-uniform aggregates such as island shapes are formed), and evaluation value 3 indicates spheroid formation. Yes (spheroid-like and uniform spheroids are made). The evaluation method is common to each embodiment.
  • Cell viability was determined by viable cell count analysis. Specifically, a trypan blue solution was added to the cell suspension after 72 hours of culture, and the number of stained cells was counted and evaluated using a cell counter (Countess II) manufactured by Life Technologies.
  • Table 1 shows the evaluation results of spheroid formation in each well (“N1”, “N2”, “N3”) for each cell.
  • Table 2 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • FIG. 1 shows a transmitted light photograph of a spheroid formed after culturing for 24 hours in HT29 cells.
  • the left two figures are the spheroids observed in the cell suspension without the promoter (upper figure: N1 well, the lower figure: N2 well), and the right two figures are the cell suspension with the promoter.
  • Spheroids observed inside upper figure: N1 well, lower figure: N2 well.
  • most of the spheroids observed in the cell suspension without the promoter were distorted in shape, whereas they were observed in the cell suspension with the promoter.
  • Spheroids were spherical and approximately the same size, and the formed spheroids were relatively homogeneous in shape and size.
  • Example 2 Spheroids formed from three types of cells were formed. Examples of cells include HT29 cells used in Example 1, human neonatal dermal fibroblasts (Lonza, CC-2509 Normal Human Dermal Fibroblasts: NHDF), human umbilical vein endothelial cells (Lonza, CC-2517A). Three types of Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) were used.
  • the cells were mixed with heparin in the same manner as in Example 1 except that a cell mixture in which HT29 cells, NHDF cells, and HUVEC cells were mixed at 20000: 12000: 8000 (cell number) was used.
  • a cell suspension was prepared and cultured in a culture vessel in a microfluid for 72 hours. Further, in the same manner as in Example 1, spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined. For comparison, the same procedure was performed for the condition without accelerator.
  • Table 3 shows the evaluation results of spheroid formation for each well (“N1”, “N2”, “N3”).
  • Table 4 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • the cell suspension without the promoter did not reach the evaluation value of 3 even after 72 hours of culturing, whereas the cell suspension with the promoter had all after 24 hours of culturing.
  • An evaluation value of 3 was reached in each of the wells.
  • the number of viable cells was about 1.5 times and the survival rate was about 1.5 times in the case with the accelerator, compared with the case without the accelerator.
  • FIG. 2 shows a transmitted light photograph of a spheroid formed after 24 hours of culture.
  • the left two figures are spheroids observed in a cell suspension without an accelerator
  • the right two figures are spheroids observed in a cell suspension with an accelerator.
  • most of the spheroids observed in the cell suspension without the promoter were distorted in shape, but were observed in the cell suspension with the promoter.
  • Spheroids were spherical and approximately the same size, and the formed spheroids were relatively homogeneous in shape and size.
  • Example 3 Spheroids formed from one type of cell were formed under the condition of applying external force after the addition of the promoter and before culturing.
  • MCF7 used in Example 1 was used.
  • a culture vessel a low cell adsorption plate GravityTRAP (registered trademark) ULA Plate (manufactured by Insphero, ISP-09-001) was used.
  • the serum culture medium used in Example 1 was used as the culture medium, and the heparin used in Example 1 was used as the promoter.
  • Example 2 heparin and cells were mixed with a serum culture medium to prepare a cell suspension.
  • the prepared cell suspension is added to each of the three wells of the low cell adsorption plate at 50 ⁇ L per well (the number of cells per well is 1 ⁇ 10 4 ), and then the low cell adsorption is performed.
  • the plate was centrifuged at 400 xg for 1 minute. Thereafter, the low cell adsorption plate was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 gas environment for 72 hours.
  • spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined. For comparison, the conditions were the same for the conditions in which no accelerator was used and no centrifugation treatment was performed, and the conditions in which an accelerator was present but no centrifugation treatment was performed.
  • Table 5 shows the evaluation results of spheroid formation for each well (“N1”, “N2”, “N3”).
  • Table 6 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • “No accelerator” is the result of the condition where there is no accelerator and no centrifugation treatment is performed
  • “With accelerator” is the presence of accelerator, but no centrifugation treatment is performed.
  • “accelerator / external force possessed” indicates the result of the condition where the accelerator is present and the centrifugal treatment is performed.
  • the cell suspension without the promoter did not reach the evaluation value of 3 even after 72 hours of culture, and the cell suspension with the promoter finally had 2 of the three wells after 72 hours of culture.
  • the evaluation value reached 3 in one well.
  • the evaluation value 3 was reached in all the wells after the culture for 10 hours. From these results, it was found that spheroid formation was further promoted by applying external force to the cell suspension before cell culture.
  • the survival rate of the cells was almost the same under any condition, and the viability of the cells was not impaired by the addition of an accelerator or external force.
  • Example 4 Spheroids formed from three types of cells were formed under the condition of applying external force before culturing after addition of the promoter.
  • the cells the HT29 cells, NHDF cells, and HUVEC cells used in Example 2 were used, and the low cell adsorption plate used in Example 3 was used as the culture container.
  • the serum culture medium used in Example 1 was used as the culture medium, and the heparin used in Example 1 was used as the promoter.
  • the cells were mixed with heparin in the same manner as in Example 3 except that a cell mixture in which HT29 cells, NHDF cells, and HUVEC cells were mixed at 20000: 12000: 8000 (cell number) was used.
  • the cell suspension was prepared and added to the wells of the low cell adsorption plate. Thereafter, in the same manner as in Example 3, the low cell adsorption plate was centrifuged and further cultured for 72 hours. Further, in the same manner as in Example 1, spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined.
  • the conditions were the same for the conditions in which no accelerator was used and no centrifugation treatment was performed, and the conditions in which an accelerator was present but no centrifugation treatment was performed.
  • Table 7 shows the evaluation results of spheroid formation for each well (“N1”, “N2”, “N3”).
  • Table 8 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • “No accelerator”, “With accelerator”, and “With accelerator / external force” are the same as in Table 5.
  • the cell suspension without the promoter did not reach the evaluation value of 3 even after 72 hours of culturing, and the cell suspension with the promoter finally evaluated in all wells after 24 hours of culture. 3 was reached.
  • the evaluation value 3 was reached in all the wells after the culture for 10 hours. From these results, it was found that even when spheroids were formed from a plurality of types of cells, spheroid formation was further promoted by applying an external force to the cell suspension before cell culture.
  • Example 5 Spheroids were formed using three types of glycosaminoglycans as promoters.
  • MCF7 used in Example 1 was used, as the culture container, the low cell adsorption plate used in Example 3 was used, and as the culture medium, the serum culture medium used in Example 1 was used.
  • the accelerator heparin used in Example 1, sodium chondroitin sulfate (manufactured by SIGMA, C3788) and sodium hyaluronate (manufactured by SIGMA, H1876) were used.
  • each promoter was added to each cell, and a cell suspension having a heparin concentration of 1 mg / ⁇ L and a cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L, Cell suspension with sodium chondroitin sulfate concentration of 1 mg / ⁇ L and cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L, and cell suspension with sodium hyaluronate concentration of 1 mg / ⁇ L and cell concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L A suspension was prepared for each.
  • each cell suspension was added to each well of the low cell adsorption plate, and then the cell low adsorption plate was centrifuged and further cultured for 72 hours. Further, in the same manner as in Example 1, spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined. For comparison, the same conditions were applied for the conditions in which no accelerator was used and no centrifugation treatment was performed.
  • Table 9 shows the evaluation results of spheroid formation for each well (“N1”, “N2”, “N3”) for the cell suspension added with each promoter.
  • Table 10 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • “chondroitin” indicates the result of the cell suspension added with sodium chondroitin sulfate
  • “hyaluron” indicates the result of the cell suspension added with sodium hyaluronate.
  • the cell suspension without the accelerator did not reach the evaluation value of 3 even after 72 hours of culturing, whereas the cell suspension with heparin added had all of the cells after 10 hours of culturing.
  • the evaluation value reached 3 in the well.
  • the cell suspension to which sodium chondroitin sulfate was added reached an evaluation value of 3 in all wells after 72 hours of culture, and the cell suspension to which sodium hyaluronate was added had 2 of 3 wells after 72 hours of culture.
  • the evaluation value reached 3 in the well. From these results, it was found that chondroitin sulfate and hyaluronic acid also have the effect of promoting spheroid formation, similar to heparin.
  • the cell survival rate was the same in any cell suspension, and it was confirmed that the cell viability was not impaired by the addition of the promoter.
  • Example 6 The effect of accelerator concentration in the cell suspension on spheroid formation was investigated.
  • MCF7 used in Example 1 was used, as the culture vessel, the low cell adsorption plate used in Example 3 was used, and as the culture medium, the serum culture medium used in Example 1 was used as the culture medium.
  • the agent heparin used in Example 1 was used.
  • Example 3 mixing with heparin in the same manner as in Example 3 except that heparin was added so that the final concentration in the cell suspension was 0.01, 0.1, 1, 10 mg / mL.
  • the cell suspension was prepared and added to the wells of the low cell adsorption plate. Thereafter, in the same manner as in Example 3, the low cell adsorption plate was centrifuged and further cultured for 72 hours. Further, in the same manner as in Example 1, spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined. For comparison, the same conditions were applied for the conditions in which no accelerator was used and no centrifugation treatment was performed.
  • Tables 11 and 12 show the evaluation results of spheroid formation for each cell suspension (“N1”, “N2”, “N3”) for each well.
  • Table 13 shows the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • “0.01 mg / mL”, “0.1 mg / mL”, “1 mg / mL”, and “10 mg / mL” indicate heparin of 0.01, 0.1, 1, 10 mg, respectively. The result of the cell suspension containing so that it may become / mL is shown.
  • the cell suspension without the promoter did not reach the evaluation value 3 even after 72 hours of culturing, whereas the cell suspension added with 0.01 mg / mL heparin. After 24 hours of culture, the evaluation value reached 3 in all wells.
  • the cell suspension added with 0.1 mg / mL heparin and the cell suspension added with 1 mg / mL heparin reached an evaluation value of 3 in all wells after 10 hours of culture.
  • the cell suspension supplemented with 10 mg / mL heparin reached an evaluation value of 3 in all wells after 18 hours of culture.
  • the survival rate of the cells was almost the same in any cell suspension.
  • Example 7 The effect of the number of cells in the cell suspension on spheroid formation was examined.
  • MCF7 used in Example 1 was used, as the culture vessel, the low cell adsorption plate used in Example 3 was used, and as the culture medium, the serum culture medium used in Example 1 was used as the culture medium.
  • the agent heparin used in Example 1 was used.
  • Example 3 the same as in Example 3 except that the cell suspension was prepared so that the number of cells was 1 ⁇ 10 3 , 1 ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 5 , 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L.
  • a cell suspension mixed with heparin was prepared and added to the wells of the low cell adsorption plate. Thereafter, in the same manner as in Example 3, the low cell adsorption plate was centrifuged and further cultured for 72 hours. Further, in the same manner as in Example 1, spheroid formation of the cell suspension was evaluated over time, and the survival rate of the cells after further cultivation for 72 hours was examined. For comparison, the same conditions were applied for the conditions in which no accelerator was used and no centrifugation treatment was performed.
  • Tables 14 and 15 show the evaluation results of spheroid formation in each well (“N1”, “N2”, “N3”) for each cell suspension.
  • Tables 16 and 17 show the average values of the three wells for the viable cell number and the survival rate (%) obtained by the viable cell number analysis.
  • “1 ⁇ 10 3 ”, “1 ⁇ 10 4 ”, “1 ⁇ 10 5 ”, and “1 ⁇ 10 6 ” indicate that the cell number is 1 ⁇ 10 3 , 1
  • the result of the cell suspension of ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 5 , 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L is shown.
  • the cell suspension without the accelerator did not reach the evaluation value of 3 even after 72 hours of culture, whereas the cell suspension added with heparin had any cell number. After 48 hours, an evaluation value of 3 was reached in all wells.
  • the cell counts of 1 ⁇ 10 3 cells / 50 ⁇ L and 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L of cells reached an evaluation value of 3 in all wells after 10 hours.
  • the evaluation value reached 3 in all wells after 18 hours.
  • the cell survival rate of the cell suspension with the promoter was higher than the survival rate of the cell suspension without the promoter under any condition.
  • the cell viability of the cell suspension with promoter is It was significantly higher than the viability of the cell suspension without accelerator.
  • spheroids can be formed quickly and stably in a simple process by using an accelerator. For this reason, for example, spheroids can be rapidly and stably formed from cells collected from patients in clinical settings, which can greatly reduce labor and time in drug susceptibility testing of patient-derived cells. However, it is possible to analyze even cases that are difficult to analyze.

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Abstract

スフェロイド形成促進方法は、細胞試料と促進剤とを混合した混合物を調製する調製工程と、前記調製工程にて得られた前記混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する培養工程と、を有し、前記促進剤が、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子である。

Description

スフェロイド形成促進方法
　本発明は、細胞からのスフェロイド形成を促進する方法、及び当該方法に用いられるキットに関する。
　本願は、２０１６年２月２２日に日本に出願された特願２０１６－０３１１５９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、ｉＰＳ細胞技術等を代表とした細胞・組織工学は目覚しい発展を遂げ、再生医療を含む医療分野を中心に応用化が進められている。例えば再生医療分野では、患者から採取された細胞から形成したシートが、人工皮膚、人工網膜として既に認可を受け、臨床の現場へ供給されている。また、細胞から形成されたシートを積層し、さらにシート内に血管網を構築することにより、生体内組織様の３次元組織構造を形成する手法についても報告されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
　より生体に近い三次元構造を保持した組織を形成する手法の一つとして、元来から、接着系細胞本来の凝集反応を利用したスフェロイド(細胞凝集体)培養法が知られている（例えば、非特許文献１～３参照。）。スフェロイド培養法では、接着系細胞を非接着性足場上で又は足場を用いることなく培養することにより、スフェロイドを形成させる。形成されたスフェロイドは、足場に付着させた単層の細胞層よりも生体組織に近い。このため、スフェロイドを用いることにより、例えば、薬剤の生体組織に対する効果をより簡便に評価することができる。
　スフェロイド培養法において、スフェロイドを形成するための専用培養容器が既に幾つか報告されている。当該専用培養容器としては、例えば、非接着性足場を実現する為に機能性分子をコートした培養容器や、細胞非接着性のゲルを表面に付着させた培養容器、微小液滴中で培養する容器（微小液中培養容器）等が市販されている。また、最小内径が３μｍ以下のセルを複数連続して形成された細胞接着面として機能する凹凸構造を有する培養容器も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。この微細なセル内で細胞を培養することにより、増殖した細胞が単層に広がるのではなく、スフェロイドが形成される。
日本国特許第５３２２３３２号公報 日本国特許第５３２２３３３号公報 日本国特許第４１５９１０３号公報 日本国特許第５８２２２１７号公報 日本国特許第５５７８６４８号公報
Davis，Journal of Embryology & Experimental Morphology，1978，vol.44, p.297～302. Folkman，et al.，The Journal of Experimental Medicine，1973，vol.138(4)，p.745～753． Sutherland, et al.，International Journal of Radiation Biology，　1970，vol.18(5)，p.491～495.
　しかしながら、スフェロイド培養法では、細胞種によっては形成できないものもある。また、形成されたスフェロイドの組織均一性にばらつきが出易く、非常に制御が困難である。臨床現場などの患者検体を用いた薬剤感受性試験等では、用いることのできる検体の量も限られている。そのため、スフェロイド形成における不安定性は、常に懸念材料として挙げられている。
　また、スフェロイド培養法では、細胞本来の接着力を駆動力としているため、スフェロイド形成に要する時間も長い。細胞数、細胞種にもよるが、例えば、スフェロイド形成に３～７日程度要する場合もある。スフェロイド形成に要する時間を短縮しうる方法については、これまでに報告された例は少ない。
　特許文献４、５には、イカ、タコ、ゲンゲ等の頭足類や魚類の体液を用いた方法が報告されている。しかしながら、これらは天然物由来であるため、安価で安定したスフェロイドの作製には不向きであった。
　本発明は、細胞凝集・組織化を促進し、速やかにかつ安定的にスフェロイドを形成することができるスフェロイド形成促進方法、及び当該方法によりスフェロイドを形成するためのキットを提供することを目的とする。
　本発明の第一態様に係るスフェロイド形成促進方法は、細胞試料と促進剤とを混合した混合物を調製する調製工程と、前記調製工程にて得られた前記混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する培養工程と、を有し、前記促進剤が、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子である。
　上記第一態様において、前記調製工程において前記細胞試料と前記促進剤との混合を複数回繰り返した後、前記培養工程を行ってもよい。
　上記第一態様において、前記培養工程の前に、前記調製工程により得られた前記混合物中の前記細胞に外力を加えてもよい。
　上記第一態様において、前記外力が、遠心力であってもよい。
　上記第一態様において、前記細胞試料に含まれている細胞数が、１×１０３～１×１０６個であってもよい。
　上記第一態様において、前記細胞試料が、動物から採取された細胞を含んでもよい。
　上記第一態様において、前記細胞試料が、ヒトから採取された細胞を含んでもよい。
　上記第一態様において、前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸であってもよい。
　上記第一態様において、前記促進剤が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸であってもよい。
　本発明の第二態様に係るスフェロイド形成促進用キットは、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子を含む促進剤を有する。
　上記第二態様において、前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、又はデルマタン硫酸であってもよい。
　上記第二態様に係るスフェロイド形成促進用キットは、さらに、スフェロイド形成培養用容器を含んでいてもよい。
　本発明の上記態様に係るスフェロイド形成促進方法及びスフェロイド形成促進用キットを用いて特定の高分子を有する促進剤を用いることにより、培養容器によらず、簡便な工程で迅速、かつ、安定的にスフェロイドを形成することができる。
実施例１において、２４時間培養後に形成されているＨＴ２９細胞のスフェロイドの透過光写真図である。 実施例２において、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図である。
　本発明の一実施形態に係るスフェロイド形成促進方法は、スフェロイド形成を促進する方法であって、下記工程（１）及び（２）を有することを特徴とする。
（１）細胞試料と促進剤とを混合した混合物を調製する工程（調製工程）。
（２）前記工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する工程（培養工程）。
　本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法では、特定の構造を有する高分子を有する促進剤を用いる。当該促進剤を細胞と混合することにより、細胞が本来有する接着力のみを駆動力として形成するよりも、より迅速かつ安定的にスフェロイドを形成することができる。当該促進剤によりこのような効果が得られる理由は明らかではないが、細胞の表面に促進剤が付着し、形成された促進剤層によって細胞同士の凝集又は組織化がより高速になりかつ安定化するためと推察される。
　本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法では、促進剤によるスフェロイド形成促進効果により、細胞同士の凝集力が弱い細胞であっても、安定してスフェロイドを形成することができる。つまり、本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法により、スフェロイドが形成し難い細胞であっても、スフェロイドを安定して形成させることができる。また、本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法により形成されたスフェロイドは、真球に近い形状であり、かつ大きさが比較的揃っている。形状や大きさが比較的均質なスフェロイドが形成可能である理由は明らかではないが、細胞表面に形成された促進剤層同士の相互作用により、系内の細胞間に働く接着力や凝集力がほぼ一定に揃うためと推察される。
　本実施形態において用いられる促進剤は、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子を含む。Ｄ－グルコサミン等は、グリコサミノグリカン（ムコ多糖類）の構成成分であり、当該高分子は、少なくとも一部分にグリコサミノグリカンの構造を有する。すなわち、当該高分子は、多数の硫酸基とカルボシキル基とを有しており、負に帯電している電解質である。グリコサミノグリカンは、生体内において細胞の組織化等に深く寄与している因子として知られている高分子である。
　本実施形態において用いられる促進剤としては、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上のみが重合したグリコサミノグリカンであってもよく、当該グリコサミノグリカンに、Ｄ－グルコサミン等以外の分子が結合した高分子であってもよい。Ｄ－グルコサミン等以外の分子としては、Ｄ－グルコサミン等以外の糖類やウロン酸、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、脂質等が挙げられる。
　本実施形態において用いられる促進剤としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸が挙げられ、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸が好ましい。スフェロイド形成促進効果が高く、かつ汎用性も高い点から、ヘパリンがより好ましい。
　本実施形態においては、まず、工程（１）として、スフェロイドを形成させる細胞を溶媒に懸濁させた細胞試料と促進剤とを混合する。細胞試料と促進剤とを混合することにより、細胞試料中の細胞の表面に促進剤が付着する。細胞試料と混合する促進剤は、１種類のみであってもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態において用いられる細胞試料に含まれる細胞は、接着性細胞であればよく、動物から採取された細胞であってもよく、動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。細胞試料に含まれる細胞が動物から採取された細胞の場合、採取部位は特に限定されない。骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、細胞試料に含まれる細胞の由来する動物の種類は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞を用いることができる。動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。
　本実施形態において用いられる細胞試料は、１種類のみの細胞を含んでいてもよく、２種類以上の細胞を含む懸濁物であってもよい。１種類の細胞を含む細胞試料を用いることにより、１種類の細胞のみからなるスフェロイドを形成することができる。複数種類の細胞を含む細胞試料を用いることにより、複数種類の細胞を含むスフェロイドを形成することができる。
　本実施形態において用いられる細胞試料に含まれる細胞としては、いずれの細胞周期にある細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよく、分化後の細胞であってもよい。また、正常な細胞であってもよく、癌組織等の病理組織から採取された細胞であってもよい。
　当該細胞試料に含まれる細胞としては、具体的には神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。例えば、癌細胞を含む細胞試料を用いることにより、当該癌細胞のスフェロイドを迅速かつ安定して形成することができる。また、例えば、ヒト由来の癌細胞、繊維芽細胞、血管細胞等の２種類以上の細胞を含む懸濁物を用いることにより、生体内組織を模した混合系スフェロイドを形成することもできる。
　本実施形態において用いられる細胞試料に含まれる細胞の数は、特に限定されるものではなく、形成する目的のスフェロイドの大きさを考慮し、培養環境によって任意に設定することができる。例えば、当該細胞試料に含まれている細胞数を１×１０３～１×１０６個にすることにより、薬剤等の評価試験に使用するために充分な大きさのスフェロイドを形成することができる。なお、細胞試料に含まれる細胞の数が、目的の大きさのスフェロイドを形成するためには不足している場合には、工程（１）を行う前に、必要な細胞数となるまで培養して増殖させてもよい。
　工程（２）で培養する細胞試料と促進剤との混合物は、細胞懸濁液である。このため、細胞試料は、細胞を溶媒中で懸濁させた懸濁液であることが好ましい。細胞試料は、促進剤と混合した状態で細胞懸濁液となっていればよく、ペレット状の細胞試料を、促進剤を含む溶液と混合して、工程（２）で培養する細胞懸濁液を調製してもよい。細胞懸濁液を調製するための溶媒としては、細胞に対する毒性がなく、増殖性や機能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、水、バッファー、細胞の培養培地等を用いることができる。当該バッファーとしては、例えば、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｈａｎｋｓバッファー等が挙げられる。培養培地としては、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２等が挙げられる。
　細胞試料と混合する促進剤の量は、スフェロイド形成促進効果が得られるために充分な量であればよく、細胞試料と促進剤との混合物中の細胞の種類、構成細胞数、培養環境に応じて任意に設定することができる。例えば、細胞試料と混合する促進剤の量は、細胞試料と促進剤との混合物中における促進剤の濃度が０．０１～１０ｍｇ／ｍＬとなる量であることが好ましく、０．１～１ｍｇ／ｍＬとなる量であることがより好ましい。混合物中の促進剤の濃度が前記範囲内であれば、混合物中の細胞と促進剤とが接触しやすく、多くの細胞の表面に促進剤が付着する結果、スフェロイド形成促進効果が充分に得られる。
　促進剤は、粉末状等の固形物の状態で細胞試料に混合してもよいが、溶媒に溶解又は懸濁させた状態で細胞試料に混合することが好ましい。促進剤を溶解又は懸濁させる溶媒としては、細胞懸濁液を調整するための溶媒と同様の溶媒を用いることができる。
　本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法においては、工程（１）を複数回繰り返した後、工程（２）を行ってもよい。つまり、工程（１）において、細胞試料と促進剤との混合を複数回繰り返し行ってもよい。
　工程（１）の後、工程（２）として、工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する。当該混合物をスフェロイド形成培養用容器内で培養することにより、細胞表面に付着した促進剤の作用によって迅速にスフェロイドが形成される。工程（１）における混合物の調製は、スフェロイド形成培養用容器内で行ってもよく、その他の容器内で行った後、得られた混合物をスフェロイド形成培養用容器内に投入して工程（２）を行ってもよい。
　本実施形態において用いられるスフェロイド形成培養用容器としては、細胞－細胞間以外の接着が抑制されている容器であればよく、一般的なスフェロイド培養法で細胞培養に用いられる容器を用いることができる。当該容器としては、例えば、非接着性足場を実現する為に機能性分子をコートした培養容器、細胞非接着性のゲルを表面に付着させた培養容器、微小液中培養法（微小滴培養法）で使用されるような微小液中培養容器等が挙げられる。スフェロイド形成培養用容器の素材としては、ガラス、ステンレス、プラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。スフェロイド形成培養用容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、プレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　スフェロイド形成培養用容器内での培養条件は、用いる細胞種に適した環境であればよく、例えば使用する細胞種の培養において推奨されている市販の培養培地を用いて、使用する細胞種の培養において推奨されている温度条件等にすることができる。また、培養時間についても、用いられる細胞種、細胞数、目的とするスフェロイドの大きさによって任意に設定することができる。
　例えば、ヒト由来癌細胞のペレットを、ヘパリンを含有する溶液と混合して懸濁液を調製し、癌細胞とヘパリンとを当該懸濁液中で接触させ、細胞表面にヘパリンを付着させる。次に、ヘパリンを付着させた細胞を含む懸濁液を、微小液中培養容器に規定量添加し、癌細胞培養に適した環境下、例えば、５％ＣＯ２ガス、３７℃環境下で任意の時間保持する。これにより、迅速にスフェロイド形成を達成しうる。なお、当該懸濁液中には、培養培地等の細胞培養に適した環境となる成分が含まれていることが好ましい。
　本実施形態に係るスフェロイド形成促進方法においては、工程（２）の前に、工程（１）により得られた混合物中の細胞に外力を加えることが好ましい。外力によって、混合物中で広く拡散している細胞が一定の領域に集められ、細胞同士の距離が短くなる。その結果、より迅速にスフェロイドを形成することができる。当該外力としては、混合物中の細胞に一定の方向に移動するように働く外力であれば特に限定されるものではなく、例えば、遠心力、圧力、磁力等が挙げられる。
　遠心力及び圧力をかける条件は、スフェロイド形成培養用容器中において細胞の状態を保持しつつ、細胞が一定の領域に集められる条件であればよく、使用する細胞種、細胞数、又は目的とするスフェロイドの大きさによって任意に設定することができる。遠心力の場合は、例えば、ウェルプレート型の培養容器をプレート遠心装置で任意の時間遠心力を十分に加えればよい。また、圧力の場合は、例えば、ウェルプレート型の培養容器を加圧式又は減圧式の装置で圧力を十分に加えればよい。また、磁力を用いる場合は、例えば、細胞と特異的に結合又は接着できる構造又は機能を有する磁性体を用いて、細胞－磁性体複合体を形成し、磁力を用いて当該複合体をスフェロイド形成培養用容器底面等に集める方法等により行うことができる。
　例えば、ヒト由来癌細胞のペレットを、ヘパリンを含有する溶液と混合して懸濁液を調製し、癌細胞とヘパリンとを当該懸濁液中で接触させ、細胞表面にヘパリンを付着させる。次に、ヘパリンを付着させた細胞を含む懸濁液を、細胞接着性の低い表面を有する培養容器に規定量添加し、外力を加える。その後、癌細胞培養に適した環境下、例えば、５％ＣＯ２ガス、３７℃環境下で任意の時間保持する。これにより、迅速にスフェロイド形成を達成しうる。なお、当該懸濁液中には、培養培地等の細胞培養に適した環境となる成分が含まれていることが好ましい。
　本発明の一実施形態に係るスフェロイド形成促進用キットは、前記促進剤を含むことを特徴とする。
　当該キットとしては、前記スフェロイド形成培養用容器を含む構成を有することが好ましい。その他、細胞懸濁液を調製するためのバッファー、細胞培養培地等を含んでいてもよい。このように、本発明の一実施形態に係るスフェロイド形成促進方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便かつ短時間でスフェロイド形成を行うことができる。
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　１種類の細胞から形成されるスフェロイドを形成した。
　細胞としては、スフェロイドを形成し易い細胞としてヒト結腸直腸腺がん細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）のＨＴＢ－３８（登録商標））、スフェロイドを形成しにくい細胞としてヒト乳腺がん細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣのＨＴＢ－２２（登録商標））の２種を用いた。培養容器としては、微小液中培養容器であるＰＥＲＦＥＣＴＡ　３Ｄ　Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ　Ｈａｎｇｉｎｇ　Ｄｒｏｐ　Ｐｌａｔｅ（３Ｄ　Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ社製、ＮＴ－ＨＤＰ１０９６）を用いた。培養培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（和光純薬社製　０４３－３００８５）に１０ｖｏｌ／ｖｏｌ％ウシ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製　＃３５－０１０－ＣＶ）と１ｖｏｌ／ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬社製　１６８－２３１９１）とを含有させた血清培養培地を用いた。促進剤としては、ヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ３１４９）を用いた。
　具体的には、まず、各細胞についてそれぞれ、細胞とヘパリンとを、ヘパリン濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬとなるように血清培養培地に添加して混合し、細胞懸濁液を調製した。
　次いで、調製した細胞懸濁液を、微小液中培養容器の３つのウェルにそれぞれ、１ウェル当たり５０μＬずつ（ウェル当たりの細胞数が１×１０４個となる。）添加し、３７℃、５％ＣＯ２ガス環境下で７２時間培養し、スフェロイド形成の有無を経時的に評価した。また、７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しの条件についても同様に実施した。
　スフェロイド形成の評価は、培養開始から２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、４８、７２時間後の１０点において、細胞懸濁液に対して、倒立型顕微鏡を用いた直接観察による画像解析を行い、３段階で評価した。評価値１は、スフェロイド形成無し（分散状態である。）、評価値２は、スフェロイド形成の兆候あり（アイランド形状等の不均一な凝集体ができている。）、評価値３は、スフェロイド形成有り（球状様形状で均一な形状のスフェロイドができている。）とした。評価方法は各実施例で共通である。
　細胞の生存率は、生細胞数解析により行った。具体的には、培養７２時間経過後の細胞懸濁液にトリパンブルー溶液を添加し、染色された細胞数を、ライフテクノロジーズ社製セルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓII）を用いてカウントして評価した。
　各細胞について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示す通り、ＭＣＦ７細胞の場合、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３に至らなかったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では、７２時間後には３つのウェルのうち２つのウェルでは評価値３に至っていた。また、ＨＴ２９細胞の場合は、評価値３に至るまでに、促進剤無しの細胞懸濁液では４８～７２時間要していたのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では６～８時間しか要しておらず、スフェロイド形成時間が約１／８に短縮できていた。一方で、表２に示す通り、いずれの細胞についても生存率は、促進剤無しの場合と促進剤有りの場合で同程度であり、促進剤が細胞の生存性を損なっていないことが確認された。
　また、図１に、ＨＴ２９細胞において、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図を示す。図中、左側２図が、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイド（上図：Ｎ１ウェル、下図：Ｎ２ウェル）であり、右側２図が、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイド（上図：Ｎ１ウェル、下図：Ｎ２ウェル）である。
　図１に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、形状がいびつなものが大半であったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、球形で大きさも大体同程度であり、形成されたスフェロイドは、形状と大きさが比較的均質であった。
［実施例２］
　３種類の細胞から形成されるスフェロイドを形成した。
　細胞としては、実施例１でも用いたＨＴ２９細胞と、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製、ＣＣ－２５０９　Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｌｏｎｚａ社製、ＣＣ－２５１７Ａ　Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）の３種を用いた。
　具体的には、細胞として、ＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを２００００：１２０００：８０００（細胞数）で混合した細胞混合物を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを微小液中培養容器で７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しの条件についても同様に実施した。
　ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表３に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では、２４時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表４に示す通り、促進剤無しの場合に比べて、促進剤有りの場合には、生細胞数は約１．５倍、生存率は約１．５倍であった。
　また、図２に、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図を示す。
　図中、左側２図が、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドであり、右側２図が、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドである。図２に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、形状がいびつなものが大半であったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、球形で大きさも大体同程度であり、形成されたスフェロイドは、形状と大きさが比較的均質であった。
［実施例３］
　促進剤添加後培養前に外力を与える条件で、１種類の細胞から形成されるスフェロイドを形成した。
　細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用いた。培養容器としては、細胞低吸着プレートＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰ（登録商標）　ＵＬＡ Ｐｌａｔｅ（Ｉｎｓｐｈｅｒｏ社製、ＩＳＰ－０９－００１）を用いた。培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
　具体的には、まず、実施例１と同様にして、ヘパリンと細胞とを血清培養培地に混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、調製した細胞懸濁液を、細胞低吸着プレートの３つのウェルにそれぞれ、１ウェル当たり５０μＬずつ（ウェル当たりの細胞数が１×１０４個となる。）添加した後、当該細胞低吸着プレートを４００×ｇで１分間遠心処理した。その後、当該細胞低吸着プレートを、３７℃、５％ＣＯ２ガス環境下で７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件と、促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件とについても同様に実施した。
　ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表５に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表６に示す。表５及び表６中、「促進剤無」は促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件の結果を、「促進剤有」は促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件の結果を、「促進剤・外力有」は促進剤有りであり、かつ遠心処理も行った条件の結果を、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らず、促進剤有りの細胞懸濁液では、７２時間培養後にようやく３つのウェルのうち２つのウェルで評価値３に至っていた。これに対して、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた細胞懸濁液では、１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。これらの結果から、細胞培養前の細胞懸濁液に外力をかけることにより、スフェロイド形成がさらに促進されることがわかった。一方で、表６に示す通り、細胞の生存率は、いずれの条件でも同程度であり、促進剤や外力の付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
［実施例４］
　促進剤添加後培養前に外力を与える条件で、３種類の細胞から形成されるスフェロイドを形成した。
　細胞としては、実施例２でも用いたＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用いた。培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
　具体的には、細胞として、ＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを２００００：１２０００：８０００（細胞数）で混合した細胞混合物を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件と、促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件とについても同様に実施した。
　ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表７に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数及び生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表８に示す。表７及び表８中、「促進剤無」、「促進剤有」、「促進剤・外力有」は表５と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表７に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らず、促進剤有りの細胞懸濁液では、２４時間培養後にようやく全てのウェルで評価値３に至っていた。これに対して、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた細胞懸濁液では、１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。これらの結果から、複数種類の細胞からスフェロイドを形成する場合でも、細胞培養前の細胞懸濁液に外力をかけることにより、スフェロイド形成がさらに促進されることがわかった。一方で、表８に示す通り、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた場合の生存率は、促進剤を添加し、培養前に外力をかけていない場合とほぼ同等であり、本実施例において行った外力付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
［実施例５］
　促進剤として３種類のグリコサミノグリカンを用いて、スフェロイドを形成させた。
　細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用いた。促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンと、コンドロイチン硫酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃ３７８８）と、ヒアルロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ１８７６）とを用いた。
　具体的には、まず、実施例１と同様にして、各促進剤をそれぞれ細胞に添加し、ヘパリン濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、コンドロイチン硫酸ナトリウム濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、ヒアルロン酸ナトリウム濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、をそれぞれ調製した。次いで、実施例３と同様にして、各細胞懸濁液をそれぞれ、細胞低吸着プレートのウェルに添加した後、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
　各促進剤を添加した細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表９に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１０に示す。表９及び表１０中、「コンドロイチン」はコンドロイチン硫酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液の結果を、「ヒアルロン」はヒアルロン酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液の結果を、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表９に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリンを添加した細胞懸濁液では１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。コンドロイチン硫酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液では７２時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、ヒアルロン酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液でも７２時間培養後には３つのウェルのうち２つのウェルで評価値３に至っていた。これらの結果から、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸でも、ヘパリンと同様にスフェロイド形成促進効果が得られることがわかった。また、表１０に示す通り、細胞の生存率は、いずれの細胞懸濁液でも同程度であり、促進剤の付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
［実施例６］
　細胞懸濁液中の促進剤の濃度によるスフェロイド形成に対する影響を調べた。
　細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
　具体的には、細胞懸濁液中の最終濃度が０．０１、０．１、１、１０ｍｇ／ｍＬとなるようにヘパリンを添加したこと以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
　各細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１１及び１２に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１３に示す。表１１～表１３中、「０．０１ｍｇ／ｍＬ」、「０．１ｍｇ／ｍＬ」、「１ｍｇ／ｍＬ」、「１０ｍｇ／ｍＬ」は、それぞれヘパリンを０．０１、０．１、１、１０ｍｇ／ｍＬとなるように含有する細胞懸濁液の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１１及び１２に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリン０．０１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液では２４時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。ヘパリン０．１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液とヘパリン１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液とでは１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。ヘパリン１０ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液では１８時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表１３に示す通り、細胞の生存率は、いずれの細胞懸濁液でも同程度であった。
［実施例７］
　細胞懸濁液中の細胞数によるスフェロイド形成に対する影響を調べた。
　細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
　具体的には、細胞数が１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個／５０μＬとなるように細胞懸濁液を調製したこと以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
　各細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１４及び１５に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１６及び１７に示す。表１４～表１６中、「１×１０３個」、「１×１０４個」、「１×１０５個」、「１×１０６個」は、それぞれ細胞数が１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個／５０μＬである細胞懸濁液の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１４及び１５に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリンを添加した細胞懸濁液ではいずれの細胞数でも４８時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。特に、細胞数が１×１０３個／５０μＬと１×１０４個／５０μＬの細胞懸濁液とでは、１０時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。細胞数が、１×１０５個／５０μＬの細胞懸濁液では１８時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表１６及び１７に示す通り、いずれの条件でも、促進剤有りの細胞懸濁液の細胞の生存率は、促進剤無しの細胞懸濁液の生存率以上であった。特に、細胞数が１×１０３個／５０μＬ、１×１０５個／５０μＬ、及び１×１０６個／５０μＬの細胞懸濁液では、促進剤有りの細胞懸濁液の細胞の生存率は、促進剤無しの細胞懸濁液の生存率よりも有意に高かった。
　本発明に係るスフェロイド形成促進法では、促進剤を用いることにより、簡便な工程で迅速かつ安定的にスフェロイドを形成することができる。このため、例えば臨床現場において、患者から採取した細胞からスフェロイドを迅速かつ安定して形成できるため、患者由来の細胞の薬剤感受性試験等における労力や時間を大幅に削減でき、また、これまでスフェロイド形成が上手くできず、分析困難であった症例についても分析を可能にすることができる。

Claims (12)

  1. 　スフェロイド形成を促進する方法であって、
    　細胞試料と促進剤とを混合した混合物を調製する調製工程と、
    　前記調整工程にて得られた前記混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する培養工程と、
    を有し、
    　前記促進剤が、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子であるスフェロイド形成促進方法。
  2. 　前記調製工程において前記細胞試料と前記促進剤との混合を複数回繰り返した後、前記培養工程を行う、請求項１に記載のスフェロイド形成促進方法。
  3. 　前記培養工程の前に、前記調製工程により得られた前記混合物中の前記細胞に外力を加える、請求項１又は２に記載のスフェロイド形成促進方法。
  4. 　前記外力が、遠心力である、請求項３に記載のスフェロイド形成促進方法。
  5. 　前記細胞試料に含まれている細胞数が、１×１０３～１×１０６個である、請求項１～４のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
  6. 　前記細胞試料が、動物から採取された細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
  7. 　前記細胞試料が、ヒトから採取された細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
  8. 　前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
  9. 　前記促進剤が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
  10. 　Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸、及びＤ－ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子を含む促進剤を有する、スフェロイド形成促進用キット。
  11. 　前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、又はデルマタン硫酸である、請求項１０に記載のスフェロイド形成促進用キット。
  12. 　さらに、スフェロイド形成培養用容器を含む、請求項１０又は１１に記載のスフェロイド形成促進用キット。
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