JPWO2018043153A1 - 細胞培養担体、細胞培養担体作製キット、およびそれらを用いたゲル/細胞ハイブリッド組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
ヒドロキシアルキルキトサンを含む細胞培養担体において、温度応答性を維持しつつ力学的特性を向上させることを目的とし、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体を提供するものである。
Description
本発明は、細胞培養担体に関するものであり、より詳細には所定の温度応答性高分子と水溶性高分子とを含む温度応答性細胞培養担体に関する。
細胞培養担体は、所定の構造を有する細胞組織を培養するために用いられる。例えば、ポリ乳酸からなる多孔性の足場材料内で細胞を培養することにより、細胞が足場材料に接着し、足場材料と細胞からなる立体構造を有する細胞組織が得られる(例えば、非特許文献1)。
しかし、こうした足場材料は、組織形成後に取り除くことが難しく、細胞の含有率が高い、あるいは細胞のみからなる細胞組織を得ることが困難であった。
また、再生医療において、足場材料と細胞から成る組織を体内に移植する場合は、人工物である足場材料が残留すること、あるいは足場材料が消失するのに非常に長い期間を要することが課題となっていた。
そこで、刺激応答性材料を足場材料として用い、組織形成後に何らかの刺激を加えることにより足場材料を除去することが試みられている。このような目的のための刺激応答性材料としては、温度に応答して状態が変化する温度応答性高分子が注目されている。例えば、ある温度以上でゲル(固体状)、以下でゾル(液体状)になる温度応答性高分子を足場材料として使用すると、細胞組織形成後に温度を低下させてゾル化させることで足場材料を除去することができる。
このように注目される温度応答性高分子は、一般に水和状態にある高分子が、ある一定温度以上で脱水和して体積や形態、性質等が変化する下限臨界溶液温度(Lower Critical Solution Temperature; 以下、「LCST」と略す。)を示すものと、ある一定温度以上で水和して体積や形態、性質等が変化する上限臨界溶液温度(Upper Critical Solution Temperature; 以下「UCST」と略す。)を示すものが知られている。LCSTを示すものとして、例えば、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)のホモポリマーまたはコポリマーやポロキサマーが知られている。特に、ポリN−イソプロピルアクリルアミド(PNIPAM)系ゲルは、体温に近い32℃付近で膨潤、収縮の体積転移が起こることから、医療材料等として広く研究が行われている(例えば、特許文献1)。
しかし、PNIPAMは、ゲル形成に非可逆的な化学架橋を必要とするため、組織形成後に除去することが困難である。また、ポロキサマーは毒性を示すのに加えて、ゲル化に高濃度を必要とすることや培地の添加で溶解する問題があり使用されていない。
それに対して、ヒドロキシアルキルキトサンは25℃付近にLCSTを有し、ゾル−ゲル転移することから、組織形成後に除去が可能であり、更に低毒性でもあることから、細胞培養担体としての利用が期待されている(例えば、非特許文献2および特許文献2)。
Nature Biotechnology, vol.12, 1994, p689
Biomaterials, vol.27, 2006, p406
しかし、細胞の増殖には、細胞培養担体が一定以上の強度であることが必要である。従来のヒドロキシアルキルキトサンのゲルは力学的強度が弱いため、細胞培養担体として用いても細胞の増殖が起こらず、ゲル内での細胞組織形成が難しいのに加えて、形成した細胞組織の移植等の際のハンドリングも困難であった。例えば、再生医療用途で立体構造を有する細胞組織を製造する場合に、ヒドロキシブチルキトサンゲル中で細胞を培養すると、ゲルの立体構造を維持できないのに加えて、製造中の取り扱いが困難であった。また、三次元造形装置(3Dプリンタ)によりヒドロキシアルキルキトサンゲルを三次元に造形することも行われているが、極めて細い紐状の細胞含有ゲルを積層することで立体構造を構築するため、自重に耐えきれず、構造を維持することができなかった。
本発明は、ヒドロキシアルキルキトサンを含む細胞培養担体において、温度応答性を維持しつつ力学的特性を向上させることを課題とする。
すなわち、本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体を提供するものである。
本発明により、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成したゲルの力学的強度を向上、改良させることができ、温度応答性と優れた力学的特性とを両立させた細胞培養担体を提供することができる。
<細胞培養担体>
本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体に関する。
本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体に関する。
また、本発明は、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンに、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子を含ましめることを特徴とする、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成した細胞培養担体(ゲル)の力学的強度を改良する方法を提供する。
さらに、本発明は、ヒドロキシアルキルキトサン単体で構成した細胞培養担体(ゲル)の力学的強度に比べその強度が改良された温度応答性細胞培養担体を製造する方法であって、温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンとともに、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子を含ましめることを特徴とする、上記製造方法を提供する。
〔温度応答性ヒドロキシアルキルキトサン〕
本発明の細胞培養担体は、ヒドロキシアルキルキトサン(ヒドロキシアルキル基導入キトサン)を含む。ヒドロキシアルキルキトサンとしては、ヒドロキシエチルキトサン、ヒドロキシプロピルキトサン、ヒドロキシイソプロピルキトサン、ヒドロキシブチルキトサン、ヒドロキシペンチルキトサン、好ましくはヒドロキシブチルキトサンが挙げられる。
本発明の細胞培養担体は、ヒドロキシアルキルキトサン(ヒドロキシアルキル基導入キトサン)を含む。ヒドロキシアルキルキトサンとしては、ヒドロキシエチルキトサン、ヒドロキシプロピルキトサン、ヒドロキシイソプロピルキトサン、ヒドロキシブチルキトサン、ヒドロキシペンチルキトサン、好ましくはヒドロキシブチルキトサンが挙げられる。
ヒドロキシアルキルキトサンは、例えば、キトサンのアミノ基および/または水酸基を、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、プロピレンオキシドなどでヒドロキシアルキル化する方法などで製造することができる。また、キチンを出発物質とし、これをヒドロキシアルキル化した後、脱アセチル化してもよい。
ヒドロキシアルキルキトサンは、下限臨界溶液温度(LCST)以下では流動性のある状態(液体またはゾル)、LCST以上では固体(ゲル)状態となる温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンを用いる。温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンのLCSTは、用途に応じて調整することができる。例えば、単糖あたりのヒドロキシアルキル基の導入数を下げるとLCSTを上昇させることができ、導入数を上げると低下させることができる。キトサン分子の単糖単位あたりのヒドロキシアルキル基の導入数は、1.0〜3.0個が好ましく、1.5〜2.5個がより好ましい。ヒドロキシアルキル基の導入部位は、キトサンのアミノ基でもヒドロキシル基でも良いが、単糖単位あたりに少なくとも1個はアミノ基に導入されていることが望ましい。
また、ヒドロキシアルキルキトサンの脱アセチル化度は、特に制限されないが、LCST以下の温度で水溶性を維持するために、ピラノース環1モル当り好ましくは50〜100モル%の範囲が好ましい。
ヒドロキシアルキルキトサンの分子量は特に限定されないが、水溶性高分子との絡み合いによる相互貫入ネットワークを形成させる点では、数平均分子量が3,000以上であることが好ましく、10,000以上であることがより好ましく、100,000以上であることが更に好ましく、150,000以上であることがより更に好ましい。ヒドロキシアルキルキトサンの分子量の上限は、温度応答性が発現する限り特に限定されず、〜1,000,000程度まで、好ましくは〜900,000程度まで、より好ましくは〜800,0000程度までのものを使用できる。
なお、本明細書において、ヒドロキシアルキルキトサンの分子量は、還元末端をShales変法で定量し求めたものである。
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンの重量濃度は、温度応答前後の形状および/または性質等の変化がより顕著に発揮できる点で、50重量%以下であることが好ましく、30重量%以下であることがより好ましく、20重量%以下であることがさらに好ましく、10重量%以下であることがよりさらに好ましい。また、細胞培養担体が必要十分な力学的特性を保つ点で、0.10重量%以上が好ましく、0.50重量%以上がより好ましく、1.0重量%以上が更に好ましく、1.5重量%以上がより更に好ましい。
〔水溶性高分子〕
本発明の実施態様に係る細胞培養担体に用いる水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびこれらの塩から選択されるものが用いられる。
本発明の実施態様に係る細胞培養担体に用いる水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびこれらの塩から選択されるものが用いられる。
ポリエチレングリコールおよびその誘導体としては、ポリエチレングリコール活性誘導体、好ましくはマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体、より好ましくは、2から8、さらにより好ましくは4から8分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体が挙げられる。このようなマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体は、末端に相互に反応し得る官能基を有する2種類の活性誘導体を混合(反応)して得られるものが好ましい。相互に反応し得る2種類の官能基としては、アミノ基と活性エステルの組み合わせ、チオール基とマレイミド基の組み合わせが好ましい。活性エステルとしては、N-ヒドロキシコハク酸イミドとカルボン酸が縮合したものが好ましい。
ヒアルロン酸の由来は特に限定されず、鶏冠、靱帯由来のもの、乳酸菌や連鎖球菌により生産されたものを使用することができる。
アルギン酸の由来は特に限定されず、褐藻、紅藻由来のもの、細菌により生産されたものを使用することができる。
本発明で用いる水溶性高分子の分子量は、水に溶解する限り特に限定されないが、ヒドロキシアルキルキトサンとの絡み合いによる相互貫入ネットワークを形成させる点では、数平均分子量が10,000〜1,500,000、好ましくは15,000〜1200,000程度のものを使用できる。具体的には、ポリエチレングリコールおよびその誘導体は、数平均分子量が10,000以上、好ましくは15,000以上程度のものを使用でき、アルギン酸、ヒアルロン酸については、数平均分子量が10,000以上、好ましくは100,000以上、より好ましく200,000以上、さらに好ましくは300,000以上、さらにより好ましくは400,000以上、1,500,000以下、好ましくは1,300,000以下程度のものを使用できる。なお、本明細書における水溶性高分子の分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて求めた値である。
細胞培養担体中における水溶性高分子の重量濃度は、温度応答の前後での形状および/または性質等の変化がより顕著に発揮できる点で、10重量%以下であることが好ましく、5.0重量%以下であることがより好ましく、3.0重量%以下であることが更に好ましい。また、細胞培養担体の力学的特性の向上効果を十分に得るためには、0.01重量%以上が好ましく、0.05重量%以上が好ましく、0.1重量%以上がより好ましい。
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子は、LCST以下での流動性を保つために、非架橋状態にあることが望ましい。LCST以下で流動性が保たれることによって、3Dプリンタによる組織製造時に分注チップからの吐出が容易になる。
〔温度応答性〕
本明細書において「温度応答性」とは、外部温度変化に応答し、その温度変化が起こる前とその温度変化が起こる後で液体状と固体状間の変化、すなわちゾル−ゲル転移を起こす性質を言う。
本明細書において「温度応答性」とは、外部温度変化に応答し、その温度変化が起こる前とその温度変化が起こる後で液体状と固体状間の変化、すなわちゾル−ゲル転移を起こす性質を言う。
細胞培養担体が温度応答性を有することにより、LCST未満として流動性を保ったゾル状態で細胞を分散させることができる。また、三次元細胞組織を形成させる培養中にはLCST以上として立体構造を保つことができる。さらに、三次元細胞組織形成後には再びLCST未満としてゾル状態にすることで、ヒドロキシアルキルキトサンを取り除くことができる。本発明における細胞培養担体は、取り扱いや細胞培養の点から、室温以下でゾル状態、細胞培養温度および体温でゲル状態であることが望ましく、好ましくは4℃〜37℃にLCSTを有し、より好ましくは25℃〜37℃にLCSTを有する。
ここで、本明細書において、細胞培養担体が「温度応答性を有する」とは、4℃における貯蔵弾性率(G’(4℃))と37℃における貯蔵弾性率(G’(37℃))の比(G’(37℃)/G’(4℃))が、1.0を上回ることを意味するものとする。G’(37℃)/G’(4℃)は、1.5以上であることが好ましく、2.0以上であることがより好ましく、10以上であることがさらに好ましく、100以上であることが一層好ましい。
4℃における貯蔵弾性率は、50Pa未満であることが好ましく、10Pa未満であることがより好ましい。50Pa未満、より好ましくは10Pa未満であることによって、細胞の懸濁や3Dプリンタによる吐出、細胞組織形成後の除去が容易になる。
また、取り扱いのし易さや立体構造の維持等の効果を発揮する観点から、25〜40℃における最大貯蔵弾性率が100Pa以上であることが好ましく、300Pa以上であることがより好ましく、1000Pa以上であることが更に好ましい。25〜40℃における最大貯蔵弾性率の上限は特に限定されないが、一般に50000Pa以下となる。本発明でいう最大貯蔵弾性率とは、所定の温度範囲での貯蔵弾性率のうち、最大のものをいう。本発明における貯蔵弾性率(G’)は、パラレルプレートをプレート間隔0.5mmで取り付けた動的粘弾性測定装置に、測定するサンプル液を入れてから5分間静置後、ひずみ1%、周波数1Hz、昇温速度1.8℃/分で測定した値を用いる。なお、より具体的には、37℃における貯蔵弾性率が100Pa以上であることが好ましく、300Pa以上であることがより好ましく、1000Pa以上であることが更に好ましい。37℃における貯蔵弾性率の上限は特に限定されないが、一般に50000Pa以下となる。
細胞培養担体中におけるヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子の重量濃度比(ヒドロキシアルキルキトサン/水溶性高分子)は、1.0〜100であることが好ましく、1.0〜30がより好ましく、1.0〜25が更に好ましい。当該重量比を100以下、より好ましくは30以下、更に好ましくは25以下とすることにより、ヒドロキシアルキルキトサンに対して水溶性高分子が適度に分散して、力学的特性を向上させることができる。重量比が0.5以下である場合、水溶性高分子の絡まりやヒドロキシアルキルキトサンの寄与の減少等によってヒドロキシアルキルキトサンと水溶性高分子と水からなる材料が温度応答性を示さない場合がある。
特に、水溶性高分子がポリエチレングリコールである場合には、ヒドロキシアルキルキトサン/水溶性高分子が1.0以上3.5以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。また、特に、水溶性高分子がヒアルロン酸である場合には、ヒドロキシアルキルキトサン/水溶性高分子が10以上20以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。アルギン酸の場合、ヒドロキシアルキルキトサン/水溶性高分子が、5以上20以下の場合、力学的特性の向上効果が特に顕著に発揮される。
ヒドロキシアルキルキトサンおよび水溶性高分子は、水性液剤に分散および/または溶解、好ましくは溶解していることが好ましい。水性液剤としては、例えば、水、水性緩衝液(リン酸緩衝液、トリス一塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など)、生理食塩水、糖水溶液(5重量%グルコース水溶液、ブドウ糖水溶液など)、細胞培養液(例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地)が挙げられる。水溶液中の緩衝剤、塩、糖、その他培養液に添加されている溶質の濃度は、ヒドロキシアルキルキトサンのヒドロゲルが形成される濃度であれば良い。
<細胞培養担体作製キット>
本発明によれば、次のような細胞培養担体作製キットが提供される。すわなち、第1のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Aと前記第1のポリエチレングリコール活性誘導体と反応し得る第2のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Bとからなり、水溶液Aまたは水溶液Bの少なくとも一方はヒドロキシアルキルキトサンを含む。ポリエチレングリコール活性誘導体としては、上記したマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体が好ましく使用される。
本発明によれば、次のような細胞培養担体作製キットが提供される。すわなち、第1のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Aと前記第1のポリエチレングリコール活性誘導体と反応し得る第2のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液Bとからなり、水溶液Aまたは水溶液Bの少なくとも一方はヒドロキシアルキルキトサンを含む。ポリエチレングリコール活性誘導体としては、上記したマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体が好ましく使用される。
水溶液Aまたは水溶液Bの少なくとも一方に、細胞を分散させた後、両者を混合することで、第1および第2のポリエチレングリコール活性誘導体間に架橋結合が形成される。例えば、水溶液Aがアミノ基を有する活性誘導体を含む場合、活性エステルを有する活性誘導体を含む水溶液Bを用いることができる。また、例えば、水溶液Aがチオール基を有する活性誘導体を含む場合、マレイミド基を有する活性誘導体を含む水溶液Bを用いることができる。これらの例の場合、水溶液A中のポリエチレングリコール活性誘導体のモル濃度と水溶液B中のポリエチレングリコール活性誘導体のモル濃度との比率(水溶液A/水溶液B)は、より効率的に反応が進み、細胞培養担体の力学的特性向上効果を十分に得させるために、0.5〜2.0が好ましく、0.9〜1.1がより好ましい。水溶液AおよびBには、温度応答性を損なわない限り、細胞培養に適した緩衝剤、塩、糖などの添加剤を加えることができる。
<細胞組織の製造方法>
LCST未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散し、その細胞分散体を、その後LCST以上の温度に加温してゲル化させることで、ゲル/細胞ハイブリッド組織(以下、単に「ハイブリッド組織」ということがある)を製造することができる。
LCST未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散し、その細胞分散体を、その後LCST以上の温度に加温してゲル化させることで、ゲル/細胞ハイブリッド組織(以下、単に「ハイブリッド組織」ということがある)を製造することができる。
ハイブリッド組織を作製する際には、まず、LCST未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体中に細胞を分散させる。以下、細胞を分散させたゾル状態または液体状態の細胞培養担体を、「液状細胞組成物」と呼ぶ。このときの細胞濃度は、1.0×106〜 1.0×108個/mlとすることが好ましく、3.0×107〜 1.0×108個/mlとすることがより好ましい。
液状細胞組成物は、任意の形状をした細胞培養用基材を用い、任意の形状に加工することができる。例えば、平板上の細胞培養用基材上に液状細胞組成物を流延した後、LCST以上の温度に加温することで、液状細胞組成物をシート状にゲル化させることができる。また、立体的な鋳型となる細胞培養用基材に液状細胞組成物を流し込んだ後、LCST以上の温度に加温することで、液状細胞組成物を立体的にゲル化させることができる。
細胞培養用の基材は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリビニルアルコール、セルロース、ポリアクリレート、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポリイミドなどの成形性に優れたプラスチック、あるいはガラス、金、白金、銅、チタン、タンタル、ジルコニア、シリカ、アルミナ、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムおよびリン酸マグネシウム等の無機物により形成されたものを用いることができる。
液状細胞組成物を細胞培養用の基材の上に、ピペット、スポッターおよびアレイヤー等を使用してスポットすれば、ドット状のパターンを形成することができる。スタンプ法、ステンシル法およびスプレー法などを使用すると、さらに精密なパターンを形成することもできる。このようなパターンは、規則的なものであっても不規則なものであってもよい。
形状を固定する際の温度は、細胞培養担体のLCST以上であれば特に限定されないが、細胞へ障害を与えないためには40℃以下が好ましく、更に好ましくは37℃以下である。ゲル化する、すなわち形状を固定するための加温時間は特に限定されないが、例えば、10秒から30分であることが好ましく、更に好ましくは30秒から5分である。
ゲル化により形状を固定化した後、LCST以上の温度に保たれた培養液を添加し、LCST以上の細胞培養に適した温度で培養を行うことで、本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞組織とからなるハイブリッド組織が得られる。
<バイオインク>
三次元造形装置(例えば、3Dプリンタやバイオプリンタ)を用いて、細胞培養担体を立体的に造形することも可能である。すなわち、下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散させて得られた細胞分散体を、3Dプリンタを使用して、所定の立体構造を有する細胞培養担体に造形する工程を経て、ゲル/細胞ハイブリッド組織を製造できる。このような手法は、一般にバイオプリンティングと呼ばれている。バイオプリンティングにおいては、コンピュータープログラムに従い、任意の位置に正確に液状細胞組成物を配置できる。例えば、ディスペンサー型三次元造形装置を用いたバイオプリンティングでは、ゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体と細胞とを混合して液状細胞組成物(バイオインク)を調製し、貯蔵器に接続された分注チップ(例えば、注射器、キャピラリーチューブなど)を介して吐出する。そして、吐出されたバイオインクを瞬時にLCST以上の温度に加温することにより、細胞培養担体をゲル化さる。この操作をコンピュータープログラムに従って繰り返すことで、ハイブリッド組織を立体的に造形することができる。
三次元造形装置(例えば、3Dプリンタやバイオプリンタ)を用いて、細胞培養担体を立体的に造形することも可能である。すなわち、下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体に細胞を分散させて得られた細胞分散体を、3Dプリンタを使用して、所定の立体構造を有する細胞培養担体に造形する工程を経て、ゲル/細胞ハイブリッド組織を製造できる。このような手法は、一般にバイオプリンティングと呼ばれている。バイオプリンティングにおいては、コンピュータープログラムに従い、任意の位置に正確に液状細胞組成物を配置できる。例えば、ディスペンサー型三次元造形装置を用いたバイオプリンティングでは、ゾル状態または液体状態にある本発明の細胞培養担体と細胞とを混合して液状細胞組成物(バイオインク)を調製し、貯蔵器に接続された分注チップ(例えば、注射器、キャピラリーチューブなど)を介して吐出する。そして、吐出されたバイオインクを瞬時にLCST以上の温度に加温することにより、細胞培養担体をゲル化さる。この操作をコンピュータープログラムに従って繰り返すことで、ハイブリッド組織を立体的に造形することができる。
バイオプリンティングにおいては、繰り返しパターンでバイオインクを吐出することができる。繰り返しパターンは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的構造をとることができる。更に、繰り返しパターンは層状に積み重ねることができ、複数の層は隣接してプリントされ、ハイブリッド組織が形成される。
<細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織>
ハイブリッド組織が得られた後、さらにLCST未満に温度を下げ、細胞培養担体を再びゾル化させて除去することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得ることができる。ここで、細胞培養担体を実質的に含まない、とは、細胞培養担体が全く残存していないか、残存していたとしても細胞組織全体中の1重量%以下となっている状態を意味するものとする。細胞培養担体のゾル化のための温度は、LCST以下であれば特に限定されず、下限の温度は例えば4℃である。除去のための時間は特に限定されないが、30秒から10分とすることが好ましい。
ハイブリッド組織が得られた後、さらにLCST未満に温度を下げ、細胞培養担体を再びゾル化させて除去することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得ることができる。ここで、細胞培養担体を実質的に含まない、とは、細胞培養担体が全く残存していないか、残存していたとしても細胞組織全体中の1重量%以下となっている状態を意味するものとする。細胞培養担体のゾル化のための温度は、LCST以下であれば特に限定されず、下限の温度は例えば4℃である。除去のための時間は特に限定されないが、30秒から10分とすることが好ましい。
本発明の細胞培養担体は、神経、心臓、血管、軟骨、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、毛髪、心筋、筋肉および腱などの組織再生または移植用組織形成に使用する足場成型体の一部または全部に使用することができる。また、本発明の細胞培養担体を用いて、培養し得る細胞の具体例としては、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞等を例示でき、好ましいものとしては繊維芽細胞を例示できる。更に、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、ES細胞(胚性幹細胞)、多能性幹細胞、CD34陽性細胞、免疫系細胞、血球系細胞、神経細胞、膵β細胞、心筋細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、羊膜細胞および臍帯血細胞などの生体由来の細胞、NIH3T3(エヌアイエイチスリーティースリー)細胞、3T3−L1(スリーティースリーエルワン)細胞、3T3−E1(スリーティースリーイーワン)細胞、Hela(ヒーラ)細胞、PC12(ピーシーツェルブ)細胞、P19(ピーナインティーン)細胞、CHO(チャイニーズハムスター卵母)細胞、COS(シーオーエス)細胞、HEK(エッチイーケー)細胞、Hep−G2(ヘップジーツー)細胞、CaCo2(カコツー)細胞、L929(エルナインツーナイン)細胞、C2C12(シーツーシーツェルブ)細胞、Daudi(ダウディ)細胞、Jurkat(ジャーカット)細胞、KG−1a(ケージーワンエー)細胞、CTLL−2(シーティーエルエルツー)細胞、NS−1(エヌエスワン)細胞、MOLT−4(エムオーエルティーフォー)細胞、HUT78(エッチユーティーセブンティエイト)細胞およびMT−4(エムティーフォー)細胞などの株化細胞、あるいは抗体産生細胞である各種ハイブリドーマ細胞株、およびこれら細胞を遺伝子工学的に改変した細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細胞培養担体は、再生医療用途の細胞組織を再生するために使用することができる。再生される対象としては、血管、心臓弁、心膜、骨、軟骨、神経、皮膚、粘膜、靭帯、腱、筋肉、気管、食道、腸、硬膜などの全ての臓器、組織が含まれる。医療成型体や医療材料として目的を達した後、温度変化によりヒドロキシアルキルキトサンを除去することも可能である。本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞組織とを含むゲル/細胞ハイブリッド組織は、例えば、再生医療用途で生体内にそのまま移植してもよい。このような技術を応用すれば、再生医療、組織工学、細胞培養、バイオセンサー、バイオチップおよびドラッグスクリーニングを用途とした医療、研究および分析分野のデバイス開発が可能となる。
また、細胞として組織由来の細胞を使用することにより、例えば、筋芽細胞を使用すれば筋組織が、心筋細胞を使用すれば心筋が、また血管内皮細胞を使用すれば血管が細胞培養担体の形状に組織形成することができる。
以下、具体的に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらの実施例に限定的に解釈されるべきでなく、本発明の概念に接した当業者が想到し、実施可能であると観念するであろうあらゆる技術的思想、その具体的態様が本発明に含まれるものとして理解されるべきものである。
実施例中の貯蔵弾性率は以下の方法で測定した。
粘弾性測定はAnton Paar製レオメーター“Physica MCR302”(登録商標)を用いて行った。測定条件を以下に示す。
・プレート:パラレルプレート(φ25mm)
・プレート間隔:0.5mm
・ひずみ:1%
・周波数:1Hz
・温度変化範囲:4℃〜40℃
・温度変化速度:1.8℃/分
粘弾性測定はAnton Paar製レオメーター“Physica MCR302”(登録商標)を用いて行った。測定条件を以下に示す。
・プレート:パラレルプレート(φ25mm)
・プレート間隔:0.5mm
・ひずみ:1%
・周波数:1Hz
・温度変化範囲:4℃〜40℃
・温度変化速度:1.8℃/分
<試験例1:細胞を含まない細胞培養用担体>
[水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が2.1のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にアミノ基が導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃で水に溶解させて溶液Aを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0もしくは10重量%である。
[水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が2.1のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にアミノ基が導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃で水に溶解させて溶液Aを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0もしくは10重量%である。
別途、単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が2.1のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にN−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルが導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃で水に溶解させて溶液Bを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0もしくは10重量%である。
200μLの溶液Aと200μLの溶液Bを4℃で混合し、ヒドロキシブチルキトサン2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0もしくは10重量%の溶液を得た。一晩、37℃で静置することで、アミノ基と活性化エステルの反応を完了した。
[水溶性高分子としてヒアルロン酸またはアルギン酸を用いた場合のサンプル調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.9のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)と、ヒアルロン酸(分子量100万)またはアルギン酸(分子量50万)を4℃で水に溶解させて溶液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5または5.0重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.25または0.5重量%、アルギン酸の重量濃度は、0.25、0.5、0.75、1または2重量%である。
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.9のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)と、ヒアルロン酸(分子量100万)またはアルギン酸(分子量50万)を4℃で水に溶解させて溶液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5または5.0重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.25または0.5重量%、アルギン酸の重量濃度は、0.25、0.5、0.75、1または2重量%である。
<試験例2:細胞を含む細胞培養用担体>
[水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にチオール基が導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液Aを調製した。更に、溶液Aには、ヒト繊維芽細胞を分散させた。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0.75重量%である。
[水溶性高分子としてPEGを用いたサンプルの調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にチオール基が導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液Aを調製した。更に、溶液Aには、ヒト繊維芽細胞を分散させた。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0.75重量%である。
別途、単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)および末端にマレイミド基が導入された4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(日油製、分子量2万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液Bを調製した。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体の重量濃度は、0.75重量%である。
200μLの溶液Aと200μLの溶液Bを4℃で混合し、ヒドロキシブチルキトサン2.5重量%、4分岐マルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体(PEG)0、0.75重量%、細胞濃度5.0×107個/mLの細胞分散液を得た。一晩、37℃で培養液中で培養することで、チオール基とマレイミド基の反応を完了した。得られた組成物の弾性率を、4℃から40℃まで1.8℃/分で昇温しつつ測定した。表2に、4℃、37℃での貯蔵弾性率(G’)と、それらの比を示す。
[水溶性高分子としてヒアルロン酸またはアルギン酸を用いた場合のサンプル調製]
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)およびヒアルロン酸(分子量100万)、アルギン酸(分子量50万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0、0.125または0.25重量%、アルギン酸の濃度は0.25または0.5重量%、細胞濃度は5.0×107個/mLである。
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量20万)およびヒアルロン酸(分子量100万)、アルギン酸(分子量50万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0、0.125または0.25重量%、アルギン酸の濃度は0.25または0.5重量%、細胞濃度は5.0×107個/mLである。
<製造例1:ゲル/細胞ハイブリッド組織の作製>
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.125重量%、細胞濃度1.0×108個/mLである。分散液を直径35mmの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、37℃で5分間静置することで分散液をゲル化させた。37℃の細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培地))を添加した後、37℃で一晩培養することで、ゲル/細胞ハイブリッド組織を得た(図1)。
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.125重量%、細胞濃度1.0×108個/mLである。分散液を直径35mmの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、37℃で5分間静置することで分散液をゲル化させた。37℃の細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM培地))を添加した後、37℃で一晩培養することで、ゲル/細胞ハイブリッド組織を得た(図1)。
<製造例2:細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織の作製>
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.125重量%、細胞濃度1.0×108個/mLである。分散液を直径35mmの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、37℃で5分間静置することで分散液をゲル化させた。37℃の細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地、2mL)を添加した後、37℃で一晩培養した。培養後、4℃で10分間冷却し、細胞培養担体をゾル化させ、担体を含んだ培地を吸引除去した。新鮮な培地を添加した後に更に一晩培養することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得た(図2)。
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は、0.125重量%、細胞濃度1.0×108個/mLである。分散液を直径35mmの細胞培養用ポリスチレンディッシュ上に円形に成形し、37℃で5分間静置することで分散液をゲル化させた。37℃の細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地、2mL)を添加した後、37℃で一晩培養した。培養後、4℃で10分間冷却し、細胞培養担体をゾル化させ、担体を含んだ培地を吸引除去した。新鮮な培地を添加した後に更に一晩培養することで、細胞培養担体を実質的に含まない細胞組織を得た(図2)。
<製造例3:3Dプリンタを用いたゲル/細胞ハイブリッド組織の作製>
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は0.125重量%、細胞濃度は5.0×107個/mLである。10℃に冷却した分散液を3Dプリンタ(武蔵エンジニアリング社製;SHOTMASTER200DS)で、37℃に保った直径35mmの細胞培養用ガラスボトムディッシュ上に格子状にプリントした。細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地)を添加した後、37℃で一晩培養することで、ゲル/細胞ハイブリッド組織を得た(図3)。
単糖単位あたりヒドロキシブチル基の導入数が1.8のヒドロキシブチルキトサン(分子量80万)およびヒアルロン酸(分子量100万)を4℃でリン酸緩衝液に溶解させて溶液を得た。この溶液にヒト繊維芽細胞を分散させ細胞分散液を得た。ここで、ヒドロキシブチルキトサンの重量濃度は2.5重量%、ヒアルロン酸の重量濃度は0.125重量%、細胞濃度は5.0×107個/mLである。10℃に冷却した分散液を3Dプリンタ(武蔵エンジニアリング社製;SHOTMASTER200DS)で、37℃に保った直径35mmの細胞培養用ガラスボトムディッシュ上に格子状にプリントした。細胞培養用の培地(10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地)を添加した後、37℃で一晩培養することで、ゲル/細胞ハイブリッド組織を得た(図3)。
本発明は、温度応答性と力学的特性を両立することができる細胞培養担体およびそれを用いた医療材料として利用可能である。
Claims (10)
- 温度応答性ヒドロキシアルキルキトサンと、ポリエチレングリコール、その誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸およびそれらの塩から選択される水溶性高分子とを含む、温度応答性を有することを特徴とする細胞培養担体。
- 前記水溶性高分子の数平均分子量が20,000以上である、請求項1に記載の細胞培養担体。
- 前記水溶性高分子の含有量が0.01重量%以上10重量%以下である、請求項1または2に記載の細胞培養担体。
- 4℃〜37℃に下限臨界溶液温度を有する、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養担体。
- 4℃における貯蔵弾性率G’が50(Pa)未満であり、25〜40℃における最大貯蔵弾性率が100Pa以上である、請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養担体。
- 前記ヒドロキシアルキルキトサンと前記水溶性高分子が非架橋状態にある、請求項1〜5のいずれかに記載の細胞培養担体。
- 前記ポリエチレングリコールが、2種類のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体を含む、請求項1〜6の何れかに記載の細胞培養担体。
- 下記溶液Aおよび水溶液B、
水溶液A:第1のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液;
水溶液B:前記第1のマルチアーム型ポリエチレングリコール活性誘導体と反応し得る第2のポリエチレングリコール活性誘導体を含む水溶液
を含み、水溶液Aまたは水溶液Bの少なくとも一方はヒドロキシアルキルキトサンを含む、細胞培養担体作製キット。 - 下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある請求項1〜7のいずれかに記載の細胞培養担体に細胞を分散させる工程、および得られた細胞分散体を、下限臨界溶液温度以上の温度に加温してゲル化させる工程を含む、ゲル/細胞ハイブリッド組織の製造方法。
- 下限臨界溶液温度未満の温度でゾル状態または液体状態にある請求項1〜7のいずれかに記載の細胞培養担体に細胞を分散させて得られた細胞分散体を、3Dプリンタを使用して、所定の立体構造を有する細胞培養担体に造形する工程を含む、ゲル/細胞ハイブリッド組織の製造方法。
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