WO2021167049A1 - 生体材料の保存用組成物 - Google Patents

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WO2021167049A1
WO2021167049A1 PCT/JP2021/006281 JP2021006281W WO2021167049A1 WO 2021167049 A1 WO2021167049 A1 WO 2021167049A1 JP 2021006281 W JP2021006281 W JP 2021006281W WO 2021167049 A1 WO2021167049 A1 WO 2021167049A1
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WO
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tissue
cells
tgp
sample
temperature
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PCT/JP2021/006281
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English (en)
French (fr)
Inventor
正二郎 加藤
サミュエル ジェイケー アブラハム
Original Assignee
株式会社Ｊｂｍ
有限会社ジーエヌコーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US17/801,102 priority patent/US20230089316A1/en
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preserving biomaterials, which comprises a thermoreversible polymer.
  • Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Document 1
  • An object of the present invention is to provide a composition for preserving biomaterials.
  • the present invention relates to the following composition for preserving biomaterials.
  • a composition for preserving biomaterials which comprises a thermoreversible polymer.
  • the storage composition according to (1) above which is for storage at a constant or fluctuating temperature.
  • the storage composition according to (2) above wherein the constant or fluctuating temperature is a temperature at which cells do not substantially proliferate.
  • the biological material is selected from the group consisting of cartilage tissue, oral mucosal tissue, corneal tissue, ring tissue, dental pulp tissue, vascular tissue, gastrointestinal mucosal tissue, omental tissue, skin tissue, and liver tissue.
  • the biological material is a tissue selected from the group consisting of cartilage tissue, oral mucosal tissue, corneal tissue, ring tissue, dental pulp tissue, vascular tissue, gastrointestinal mucosal tissue, omental tissue, skin tissue, and liver tissue.
  • the thermoreversible polymer is polypropylene oxide, a copolymer of propylene oxide and another alkylene oxide, a poly N-substituted acrylamide derivative, a poly N-substituted metaacrylamide derivative, an N-substituted acrylamide derivative and an N-substituted meta.
  • a plurality of blocks having a cloud point and hydrophilic blocks selected from the group consisting of a copolymer with an acrylamide derivative, polyvinyl methyl ether, and polyvinyl alcohol partially vinegared are bonded.
  • the storage composition according to any one of the above.
  • the preservation composition of the present invention can maintain the survival and / or function of cells contained in the biomaterial as compared with the conventional preservation solution. Further, since the storage does not necessarily have to be performed under constant low temperature conditions or the like, the biomaterial can be stored under a wide range of temperature conditions. Further, the preservation with the preservative of the present invention can be widely used for cell therapy, organ transplantation, etc. because the labor and cost are small.
  • FIG. 1 shows samples A and B for transporting cartilage tissue prepared from a thermoreversible polymer (Sample A) and PBS (Sample B), respectively.
  • FIG. 2 shows the expression level of COL2a1 expressed when cultured with a thermoreversible polymer (Sample A) and ECS (Sample B).
  • FIG. 3 shows the proliferation of buccal mucosa cultured in planar cultures (DMEM and Cnt-PR) and thermoreversible polymers (TGP) after being transported in thermoreversible polymer (Sample A) and ECS (Sample B).
  • DMEM and Cnt-PR planar cultures
  • TGP thermoreversible polymers
  • FIG. 4 shows the endothelial cells in the cornea when the cornea was transported by the thermoreversible polymer (Sample A) and the MK solution (Sample B), respectively.
  • FIG. 5 shows the endothelial cells in the cornea when the cornea was transported by the thermoreversible polymer (Sample A) and the Optisol GS solution (Sample B), respectively.
  • FIG. 6 shows the proliferative nature of the corneal ring portion cultured after being transported with the thermoreversible polymer (Sample A) and the MK solution (Sample B).
  • FIG. 7 shows the proliferative potential of intestinal tissue cultured after transport with thermoreversible polymer (Sample A) and DMEM (Sample B).
  • FIG. 8 shows the proliferative potential of vascular tissue cultured after transport with a thermoreversible polymer (Sample A) and M199 (Sample B).
  • FIG. 9 shows the proliferative potential of dental pulp tissue cultured after transport with thermoreversible polymer (Sample A) and DMEM (Sample B).
  • FIG. 10 shows an HE-stained image of dental pulp tissue cultured after being transported with a thermoreversible polymer.
  • FIG. 11 shows the proliferative potential of cultured skin tissue after transport with a thermoreversible polymer (Sample A) and HBSS (Sample B).
  • FIG. 12 shows the proliferative potential of liver tissue cultured after transport with thermoreversible polymer (Sample A) and DMEM (Sample B).
  • composition for preserving biomaterials of the present invention is characterized by containing a thermoreversible polymer.
  • the "biological material” means a cell or a cell population containing the cell, a cell culture, a structure, a tissue, an organ, etc., and the cell is preferably from a living body-derived cell, more preferably from a living individual.
  • the obtained primary cells may be a cell obtained by culturing a primary cell for one generation or multiple generations and proliferating it.
  • the cells may be cells that have been cultured for multiple generations and proliferated, and the cells have stopped growing due to biological or physical conditions.
  • the cell is not limited to, for example, a somatic cell (eg, the "cell” may be a primary cell or a cell line.
  • the cell is, but is not limited to, a liver (eg, hepatocyte).
  • Central or peripheral nervous system such as sinus endothelial cells), pancreas (eg pancreatic islet ⁇ cells), lungs, brain (eg nerves, glial or coat cells) or spinal cord, kidneys, eyes (eg retinal cells, corneal endothelial cells) , Spleen, skin, thoracic gland, testicles, lung, diaphragm, heart (heart cells), muscle or lumbar muscle, or intestine (eg endocrine cells), adipose tissue (white, brown or beige fat cells), muscle (eg fibroblasts) ), Synthetic cells, cartilage cells, osteoclasty cells, epithelial cells, endothelial cells, salivary gland cells, nerve cells in the inner ear, or hematopoietic cells (eg, blood cells or lymphocytes) or their precursors and stem cells (epithelial stem cells) , Satellite
  • the cell also includes a cell population isolated from a tissue or organ collected from a living body.
  • the cells that can be used in the aspect of the cell population are not limited to this, but are limited to epithelial tissue-derived cell populations (for example, oral mucosal epithelial cells, epithelial stem cells, etc.) and adipose tissue-derived cell populations (fat cells, interstitial cells).
  • epithelial tissue-derived cell populations for example, oral mucosal epithelial cells, epithelial stem cells, etc.
  • adipose tissue-derived cell populations fat cells, interstitial cells.
  • foliar stem cells, etc. and cell populations derived from cartilage tissue (epithelial cells, cartilage cells, chondrogenic precursor cells, mesenchymal stem cells, etc.)
  • cell populations in which cultured cells are cultured are also included.
  • biomaterials may also include cell cultures or cell structures.
  • the cell culture or cell structure is not limited, for example, a cell polymer mixture, a cell sheet, a cell mass, etc., and the cell structure is not limited, such as a cell polymer structure, a cell sheet and a tissue. Structures in which and are combined are included.
  • Bio material is not limited as long as it contains cells, and is not limited to biological fluid including blood, bone marrow fluid, lymph fluid, etc., thoracic gland tissue, thyroid tissue, skeletal muscle tissue, tracheal tissue, vascular tissue, lung tissue, liver tissue, Biliary tissue, kidney tissue, urinary tract tissue, worm tissue, bladder tissue, urinary tract tissue, testicle tissue, uterine tissue, ovarian tissue, digestive tissue (such as gastric tissue, small intestine tissue or colon tissue), heart tissue, esophageal tissue, diaphragm Tissue, spleen tissue, pancreatic tissue, brain tissue (cerebral tissue, cerebral tissue, etc.), spinal tissue, cartilage tissue, limb peripheral tissue, retinal tissue, skin tissue, oral mucosal tissue, corneal tissue, ring tissue, dental pulp tissue, blood vessels It may be a tissue such as a tissue, a gastrointestinal tissue, a omental tissue, a skin tissue, a liver tissue, or a sheep membrane.
  • Bio materials include salivary glands, palate, palate, inferior, teeth, pharynx, laryngeal, esophagus, liver, gallbladder, total bile duct, stomach, pancreas, pancreatic duct, small intestine (duodenal, caecum, ileum), colon (transverse colon).
  • the biomaterial can be derived from any organism.
  • Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included.
  • “preservation” means maintaining the survival and / or function of cells contained in the biomaterial to be preserved (hereinafter, "biomaterial to be preserved” is referred to as “target biomaterial”).
  • Maintaining cell viability is not limited and is commonly used in the art to measure the degree of cell viability, such as measuring the number of viable cells contained in a biomaterial of interest, respiratory activity of viable cells, etc. Can be confirmed by the method.
  • the number of viable cells or respiratory activity contained in the target biomaterial is not limited to 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%. It is preferably maintained at 10%, 5%, 1%, 0.1% or 0.05%.
  • Maintenance of function is not limited, and biomaterials in the art such as proliferative ability of cells contained in the target biomaterial, maintenance of morphology of the biomaterial, secretion ability of a predetermined component, and measurement of an expression level of a predetermined protein or gene. It can be confirmed by the method usually used as a method for measuring the function of. Before and after storage using the storage composition of the present invention, it is preferable that the function of the same quality as that of the target biomaterial is maintained.
  • the "preservation composition” means a composition to be preserved, that is, a composition having the above-mentioned preservation effect when a biomaterial is immersed in the preservation composition.
  • the "preservation composition” includes both an embodiment containing the target biomaterial and an embodiment not containing the target biomaterial. As long as the survival and / or function of the cells contained in the target biomaterial is maintained, the preservation is not limited to standing, and includes any aspect that can give vibration such as transportation. Therefore, in one aspect, the storage composition of the present invention is a transport composition.
  • thermoreversible polymer The thermoreversible polymer contained in the preservation composition of the present invention (Thermoreversible Gelation Polymer: also referred to as "TGP" in the present specification) thermally reversibly forms a crosslinked structure or a network structure, and is based on the structure.
  • TGP Thermally reversible Gelation Polymer
  • Hydrogel refers to a gel containing a crosslinked or network structure made of a polymer and water supported or retained in the structure.
  • the temperature is changed (1 ° C./1 minute) to measure, and the temperature at the point where the storage elastic coefficient (G', elastic term) of the sample exceeds the loss elastic coefficient (G', viscous term) is the sol-gel transition.
  • the temperature is changed (1 ° C./1 minute) to measure, and the temperature at the point where the storage elastic coefficient (G', elastic term) of the sample exceeds the loss elastic coefficient (G', viscous term) is the sol-gel transition.
  • the temperature is changed (1 ° C./1 minute) to measure, and the temperature at the point where the storage elastic coefficient (G', elastic term) of the sample exceeds the loss elastic coefficient (G', viscous term) is the sol-gel transition.
  • the G ">G'state is defined as a sol
  • the G" ⁇ G'state is defined as a gel.
  • the following measurement conditions can be preferably used.
  • Measuring equipment (trade name): Stress-controlled rheometer AR500, concentration of sample solution (or separation solution) manufactured by TA Instruments (however, as the concentration of "hydrogel-forming polymer with sol-gel transition temperature") : 10 (weight)%
  • Amount of sample solution Approximately 0.8 g Measurement cell shape / dimensions: Acrylic parallel disk (diameter 4.0 cm), gap 600 ⁇ m Measurement frequency: 1Hz Applied stress: Within the linear region.
  • the sol-gel transition temperature of the thermoreversible polymer is higher than 0 ° C., preferably 37 ° C. or lower, and further higher than 5 ° C. and 35 ° C. or lower (particularly 10 ° C. or higher and 33 ° C. or lower). ) Is preferable. Since the storage composition of the present invention can store the target biological material in either a sol state or a gel state, the sol-gel transition temperature is not limited, and is 10 to 35 ° C. and 15 to 30 ° C.
  • the temperature is 17 to 25 ° C., which can be gelled at a normal room temperature, from the viewpoint that the gelling can prevent the storage medium from being agitated against vibration during storage or transportation and suppress the stress caused by the agitation. It is more preferably 19 to 23 ° C, and particularly preferably 19 to 21 ° C.
  • a TGP having such a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from specific compounds as described later according to the above-mentioned screening method (sol-gel transition temperature measurement method).
  • the TGP of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits the thermoreversible sol-gel transition as described above (that is, has a sol-gel transition temperature).
  • a specific example of a polymer in which the aqueous solution has a sol-gel transition temperature and reversibly exhibits a sol state at a temperature lower than the transition temperature is represented by, for example, a block copolymer of polypropylene oxide and polyethylene oxide.
  • Polyalkylene oxide block copolymers; etherified cellulose such as methyl cellulose and hydroxypropyl cellulose; chitosan derivatives (KRHolme.et al. “Chitosan derivatives bearing C10-alkyl glycoside branches: a temperature-induced gelling polysaccharide”, Macromolecules, 24, 3828-3833 (1991) (Non-Patent Document 3)) and the like are known.
  • the hydrogel-forming polymer using a hydrophobic bond for cross-linking which can be suitably used as the TGP of the present invention, preferably consists of a plurality of blocks having cloud points and hydrophilic blocks bonded to each other.
  • the hydrophilic block is preferably present because the hydrogel becomes water soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the plurality of blocks having a cloud point are the hydrogel's sol-gel transition temperature. It changes to a gel state at a higher temperature.
  • a block with a cloud point dissolves in water at a temperature lower than the cloud point and becomes insoluble in water at a temperature higher than the cloud point, so that the block is gelled at a temperature higher than the cloud point.
  • It serves as a cross-linking point consisting of hydrophobic bonds for formation. That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond corresponds to the sol-gel transition temperature of the hydrogel.
  • the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily have to coincide with each other. This is because the cloud point of the above-mentioned "block having a cloud point" is generally affected by the binding between the block and the hydrophilic block.
  • the target biomaterial can be immersed in the thermoreversible polymer at a low temperature in the storage composition, so that a plurality of blocks having cloud points and hydrophilic blocks are combined from the viewpoint of preventing damage to the target biomaterial.
  • a thermoreversible polymer is preferred.
  • the hydrogel used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond not only becomes stronger as the temperature rises, but the change is reversible with respect to temperature.
  • the TGP has a plurality of "blocks having cloud points". It is preferable to have.
  • the hydrophilic block in the TGP has a function of changing the TGP to water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and has a hydrophobic binding force at a temperature higher than the transition temperature.
  • the TGP used in the present invention is decomposed and absorbed in a living body. That is, it is preferable that the TGP of the present invention is decomposed in a living body by a hydrolysis reaction or an enzymatic reaction to become a low molecular weight substance harmless to the living body, and is absorbed and excreted.
  • the TGP of the present invention is formed by combining a plurality of blocks having cloud points and hydrophilic blocks, at least one of the blocks having cloud points and the hydrophilic blocks, preferably both of them, is in vivo. It is preferable that it is decomposed and absorbed by.
  • the block having a cloud point is preferably a polymer block having a negative solubility in water-temperature coefficient, and more specifically, polypropylene oxide, propylene oxide, another alkylene oxa-converted acrylamide derivative, and N-. It is selected from the group consisting of a copolymer with a substituent, a poly N-substituted acrylamide derivative, a poly N-substituted metaacrylamide derivative, a copolymer with an N-substituted metaacrylamide derivative, a polyvinyl methyl ether, and a polyvinyl alcohol partially vinegared product.
  • a polymer can be preferably used.
  • Coweight with poly N-substituted acrylamide derivative, poly N-substituted meta acrylamide derivative, and N-substituted meta acrylamide derivative from the viewpoint of forming a gel with excellent stability and thereby increasing the storage stability of the target biomaterial. Coalescence is preferred.
  • a polyester-type biodegradable polymer such as polylactic acid or polyglycolic acid can be used as a block having a cloud point that is decomposed and absorbed in the living body.
  • the cloud point of the above polymer is higher than 4 ° C. and 40 ° C. or less, which is a compound in which a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block are bonded.
  • the sol-gel transition temperature is higher than 0 ° C. and 37 ° C. or lower.
  • the cloud point is measured, for example, by cooling an aqueous solution of about 1% by mass of the above polymer (block having a cloud point) to obtain a transparent uniform solution, and then gradually raising the temperature (heating rate of about 1). It can be carried out by setting the point at which the solution becomes cloudy for the first time as a cloud point at ° C./min).
  • poly-substituted acrylamide derivative and the poly N-substituted meta acrylamide derivative that can be used in the present invention are listed below.
  • Poly-N-acroylpiperidin poly-Nn-propylmethacrylamide; poly-N-isopropylacrylamide; poly-N, N-diethylacrylamide; poly-N-isopropylmethacrylamide; poly-N-cyclopropylacrylamide; Poly-N-acryloylpyrrolidin; poly-N, N-ethylmethylacrylamide; poly-N-cyclopropylmethacrylamide; poly-N-ethylacrylamide.
  • the polymer may be a homopolymer or a copolymer of a monomer constituting the polymer and another monomer.
  • a hydrophilic monomer or a hydrophobic monomer can be used as the other monomer constituting such a copolymer.
  • copolymerization with a hydrophilic monomer raises the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, by selecting these monomers to be copolymerized, it is possible to obtain a polymer having a desired cloud point (for example, a cloud point higher than 4 ° C and 40 ° C or lower).
  • hydrophilic monomer examples include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, metaacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, and acrylic having an acidic group. Acids, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid, etc., and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl having a basic group. Examples include, but are not limited to, acrylamide and salts thereof.
  • the hydrophobic monomers include acrylate derivatives and methacrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate and glycidyl methacrylate, N-substituted alkyl metaacrylamide derivatives such as Nn-butyl metaacrylamide, vinyl chloride, acrylonitrile and styrene. , Vinyl acetate and the like, but are not limited thereto.
  • hydrophilic block On the other hand, specific examples of the hydrophilic block to be bonded to the above-mentioned block having a cloud point include methyl cellulose, dextran, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, poly N-vinylpyrrolidone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, and polymethacrylamide.
  • hydrophilic block is decomposed, metabolized and excreted in the living body, and a hydrophilic biopolymer such as a protein such as albumin and gelatin and a polysaccharide such as hyaluronic acid, heparin, chitin and chitosan is preferably used. ..
  • the method for binding the block having a cloud point and the above hydrophilic block is not particularly limited, but for example, a polymerizable functional group (for example, an acryloyl group) is introduced into any of the above blocks to give the other block. This can be done by copolymerizing the monomers. Further, the conjugate of the block having a cloud point and the above-mentioned hydrophilic block can also be obtained by block copolymerization of a monomer giving a block having a cloud point and a monomer giving a hydrophilic block. It is possible.
  • a polymerizable functional group for example, an acryloyl group
  • a functional group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.
  • a functional group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.
  • the bond between the polypropylene oxide having a cloud point and the hydrophilic block is, for example, anionic polymerization or cationic polymerization, in which the propylene oxide and the monomer constituting the "other hydrophilic block" (for example, ethylene oxide) are repeatedly and sequentially obtained.
  • a block copolymer in which polypropylene oxide and a "hydrophilic block" (for example, polyethylene oxide) are bonded can be obtained.
  • a block copolymer can also be obtained by introducing a polymerizable group (for example, an acryloyl group) at the end of polypropylene oxide and then copolymerizing the monomers constituting the hydrophilic block.
  • the polymer used in the present invention can also be obtained by introducing a functional group capable of binding reaction with a functional group (for example, a hydroxyl group) at the terminal of polypropylene oxide into a hydrophilic block and reacting both of them. ..
  • the TGP used in the present invention can also be obtained by connecting a material such as Pluronic (registered trademark) F-127 (trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) in which polyethylene glycol is bonded to both ends of polypropylene glycol. be able to.
  • Pluronic registered trademark
  • F-127 trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.
  • the above-mentioned "block having a cloud point” existing in the molecule is water-soluble together with the hydrophilic block at a temperature lower than the cloud point. It dissolves completely in water and shows a sol state.
  • the temperature of the aqueous solution of this polymer is heated to a temperature higher than the cloud point, the "block having a cloud point” existing in the molecule becomes hydrophobic, and the "blocks having a cloud point” become hydrophobic and associate between separate molecules by hydrophobic interaction. do.
  • the polymer of the present invention is a hydrophobic association between blocks having a cloud point in water.
  • a hydrogel having a three-dimensional network structure with the above as a cross-linking point is produced.
  • the temperature of this hydrogel is cooled again to a temperature lower than the cloud point of the "block having a cloud point" existing in the molecule, the block having the cloud point becomes water-soluble, and the cross-linking point due to the hydrophobic association is released.
  • the hydrogel structure disappears and the TGP of the present invention becomes a complete aqueous solution again.
  • the sol-gel transition of the polymer of the present invention in a preferred embodiment is based on a reversible change in hydrophilicity and hydrophobicity at the cloud point of the block having a cloud point existing in the molecule. Therefore, it has complete reversibility in response to temperature changes.
  • a hydrophobic interaction keeps the environment of the target biomaterial constant without dissolving the gel by tissue fluid or the like from the target biomaterial because it associates between separate molecules. Can be done.
  • the delicate hydrophilic-hydrophobic balance of TGP in water as described above can contribute to the stability of the target biomaterial during storage.
  • the hydrogel-forming polymer of the present invention containing at least a polymer having a sol-gel transition temperature in an aqueous solution is substantially water-insoluble at a temperature (d ° C.) higher than the sol-gel transition temperature. Is reversibly water-soluble at a temperature (e ° C.) lower than the sol-gel transition temperature.
  • the high temperature (d ° C.) described above is preferably a temperature 1 ° C. or higher than the sol-gel transition temperature, and more preferably 2 ° C. or higher (particularly 5 ° C. or higher).
  • the above-mentioned "substantially water-insoluble” means that the amount of the above-mentioned polymer dissolved in 100 ml (liter) of water at the above-mentioned temperature (d ° C.) is 5.0 g or less (further, 0.5 g or less, particularly 0). .1 g or less) is preferable.
  • the above-mentioned low temperature (e ° C.) is preferably 1 ° C. or higher (absolute value) lower than the sol-gel transition temperature, and further preferably 2 ° C. or higher (particularly 5 ° C. or higher) lower. preferable.
  • water-soluble means that the amount of the polymer dissolved in 100 ml (liter) of water at the temperature (e ° C.) is preferably 0.5 g or more (further 1.0 g or more). ..
  • reversibly water-soluble means that even after the aqueous solution of TGP is once gelled (at a temperature higher than the sol-gel transition temperature), at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, It means to show the above-mentioned water solubility.
  • the 10% aqueous solution of the polymer exhibits a viscosity of 10 to 3,000 cmpoise (further, 50 to 1,000 cmpoise) at 5 ° C.
  • Viscosity is preferably measured under the following measurement conditions, for example.
  • Viscometer Stress-controlled rheometer (model name: AR500, manufactured by TA Instruments) Rotor diameter: 60 mm Rotor shape: Parallel flat plate
  • the aqueous solution of TGP of the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature and then immersed in a large amount of water, the gel does not substantially dissolve.
  • the above-mentioned characteristics of the hydrogel formed by the above-mentioned TGP can be confirmed, for example, as follows. That is, 0.15 g of TGP is dissolved in 1.35 g of distilled water at a temperature lower than the sol-gel transition temperature (for example, under ice cooling) to prepare a 10 wt% aqueous solution, and the aqueous solution is used as a plastic petri dish having a diameter of 35 mm.
  • a gel having a thickness of about 1.5 mm is formed in the petri dish by injecting it into the dish and heating it to 37 ° C., and then the weight (fgram) of the entire petri dish containing the gel is measured. Then, the entire petri dish containing the gel was allowed to stand in water in 250 ml (liter) at 37 ° C. for 10 hours, and then the weight (ggram) of the entire petri dish containing the gel was measured to measure the gel from the gel surface. Evaluate the presence or absence of dissolution.
  • the weight loss rate of the gel that is, (fg) / f is preferably 5.0% or less, and further 1.0%. It is preferably less than or equal to (particularly 0.1% or less).
  • the aqueous solution of TGP of the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then immersed in a large amount of water (about 0.1 to 100 times the gel in terms of volume) for a long period of time.
  • the gel does not dissolve over time.
  • Such properties of the polymer used in the present invention are achieved, for example, by the presence of two or more (plurality) blocks having cloud points in the polymer.
  • Pluronic registered trademark
  • F-127 registered trademark
  • the concentration with respect to water that is, ⁇ (polymer) / (polymer + water) ⁇ ⁇ 100 (%), is 20% or less (further 15). It is preferable to use TGP capable of gelation at a concentration of% or less, particularly 10% or less).
  • the molecular weight of the TGP used in the present invention is preferably 30,000 or more and 30 million or less, more preferably 100,000 or more and 10 million or less, and further preferably 500,000 or more and 5 million or less.
  • the TGP in the preservation composition of the present invention may be dissolved in any medium.
  • the concentration of TGP in the preservation composition may be any concentration as long as the viability of the cells contained in the target biomaterial is maintained, and the concentration is not limited as a mass percent concentration, and is 1 to 40%, 3 to. It may be 30%, 5 to 20%, 7 to 15%, 8 to 12%, 9 to 11%, and has a viscosity such that the target biomaterial can float without contacting the bottom surface of the storage container in the sol state.
  • the TGP contained in the preservation composition of the present invention may be dissolved in any medium.
  • the medium is not particularly limited as long as it can maintain the survival of cells, but typically, physiological saline, various physiological buffers (for example, PBS, HBSS, etc.), various basal media for cell culture, and the like.
  • a storage solution, a solution based on a transport solution, or the like can be used.
  • the composition of the physiological saline solution and various physiological buffer solutions may be appropriately changed depending on the target biomaterial and other storage conditions.
  • the basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 105 (M199), 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80. -7, CnT-PR and the like are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used as it has a standard composition (for example, as it is on the market), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions.
  • the storage solution is not limited to, for example, EPII solution, MK solution, Optisol GS solution, and the tissue or organ transport solution is not limited to choline solution, eurocholine solution, UW solution, HTK solution, Celsior solution. , Polysol, Dsol and the like.
  • the physiological saline, basal medium, preservative solution, and transport solution used as the medium of the present invention are not limited to those having a known composition, and one or two or more components are added, removed, increased or decreased. include.
  • the medium may contain one or more additives such as serum, growth factors (for example, EGF, insulin, etc.), steroid component, selenium component, and the like.
  • the medium in which TGP is lysed does not contain serum.
  • the medium in which TGP is lysed may contain serum.
  • the serum may be a heterologous serum or an allogeneic serum. Allogeneic sera are preferred, and autologous sera are particularly preferred among allogeneic sera.
  • the concentration of serum is not limited, and the medium may contain 1% or more, 3% or more, 5% or more, 10% or more, or 20% or more. It is preferably 10%.
  • the preservation composition of the present invention may further contain any additional component as long as it does not interfere with the preservation effect of the preservation composition.
  • Additional ingredients may include, for example, an acceptable carrier, any ingredient (vitamins, amino acids, etc.) that enhances the viability of the cell culture, antibiotics, preservatives. Any known additional ingredient can be used as such additional ingredient, and those skilled in the art are familiar with these additional ingredients. Ingredients that can enhance the effects of the preservation composition of the present invention are preferred.
  • the state of TGP may be a sol state or a gel state as long as the target biomaterial can be preserved. From the viewpoint of suppressing agitation during transportation, it is preferably stored in a gel state.
  • the target biomaterial is immersed in the TGP sol at a low temperature, and then the temperature of the sol does not need to be raised.
  • the sol may be heated to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to bring it into a gel state.
  • cells or the like to be stored may be immersed in a TGP sol to gel, and then a medium may be further added on the TGP.
  • the medium added on top of the gelled TGP may be the same as or different from the medium in which it dissolves in the TGP.
  • the medium added on top of TGP is preferably the same as the medium that dissolves in TGP except that it does not contain serum.
  • the temperature at which the target biomaterial is stored is not limited as long as the viability of the cells in the target biomaterial can be maintained, for example, 1 ° C. to 42 ° C., 4 ° C. to 38 ° C., 6 to 35 ° C., 10 to 35 ° C., 12 It may be ⁇ 30 ° C., 15-30 ° C., 20-30 ° C., 22-28 ° C., 23-27 ° C., 24 ° C.-26 ° C., preferably 15-30 ° C., more preferably 20-30 ° C.
  • the storage temperature may be constant or variable.
  • the fluctuating temperature range is not limited as long as the viability of the cells in the target biomaterial can be maintained, and is typically 1 ° C. to 42 ° C., 4 ° C.
  • the fluctuation may be in the range of ⁇ 30 ° C., 15-30 ° C., 20-30 ° C., 22-28 ° C., 23-27 ° C., 24 ° C.-26 ° C., and the fluctuation of 15-30 ° C., 20-30 ° C.
  • variations in the range of 20-30 ° C are more preferred.
  • the fluctuating temperature may be the outside air temperature, and the fluctuating temperature range described above may fluctuate day by day.
  • the storage temperature may be a temperature at which cells or the like to be stored do not substantially proliferate.
  • the "temperature at which the target biological material does not substantially proliferate" may be a temperature at which cell growth slows or stops in the art, and is compared with the growth rate or respiration rate of the target biological material at 37 ° C. It is a temperature at which the growth rate or respiration rate is 3/4, 1/5, 1/10, 1/20 or 1/100 or less.
  • the temperature is not limited, and may be, for example, 30 ° C. or lower, 27 ° C. or lower, 25 ° C. or lower, 23 ° C. or lower, 20 ° C. or lower, 17 ° C. or lower, 15 ° C.
  • the storage temperature may be constant or fluctuate at a temperature at which cells or the like to be stored do not substantially proliferate.
  • the storage time is not limited as long as the target biomaterial can be stored, and the upper limit is, for example, 1 hour or more, 3 hours or more, 5 hours or more, 12 hours or more, 18 hours, 24 hours or more, 2 days or more, 4 days or more. , 8 days or more, 12 days or more, 16 days or more, 20 days or more, 30 days or more, 40 days or more, 50 days or more, 60 days or more, for example, 45 days or less, 35 days or less as the lower limit.
  • the storage time may be any combination of these upper limit values and lower limit values, and is not limited to 3 hours to 60 days, 6 hours to 50 days, 8 hours to 40 days, 10 hours to 25 days, and 12 days.
  • the range includes hours to 20 days, 18 hours to 15 days, 24 hours to 10 days, and 36 hours to 8 days. Since the target biomaterial is damaged by long-term storage, long-term storage is not very preferable.
  • the preservation composition of the present invention is excellent in the preservation of biomaterials
  • the preservation composition of biomaterials used in fields such as medical treatment and medical experiments, particularly cell therapy and organ transplantation is not limited. It can be suitably used as a composition for transportation.
  • Manufacturing example 1 42.0 g of N-isopropylacrylamide and 4.0 g of n-butyl methacrylate were dissolved in 592 g of ethanol.
  • PDE6000 polyethylene glycol dimethacrylate
  • APS 10% ammonium persulfate
  • hydrogel-forming polymer of the present invention having a molecular weight of 100,000 or more (“hydrogel-forming polymer”).
  • Polymer "-6) 40 g was obtained. 1 g of the hydrogel-forming polymer of the present invention (“hydrogel-forming polymer” -6) obtained as described above was dissolved in 9 g of distilled water under ice-cooling to obtain a 10 wt% aqueous solution.
  • the storage elastic modulus of this aqueous solution was measured at an application frequency of 1 Hz using a stress-controlled rheometer (AR500, manufactured by TA Instruments). As a result, it was 43 Pa at 10 ° C, 680 Pa at 25 ° C, and 1310 Pa at 37 ° C. .. This temperature-dependent change in storage modulus was reversibly and repeatedly observed.
  • the sol-gel transition temperature was about 20 ° C.
  • Example 1 Transport of cartilage tissue A part of cartilage tissue (about 10 ⁇ 5 mm, thickness 3 mm, age: 35 years old) excised by artificial joint replacement was collected, and an antibiotic (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin) was collected. It was immersed in PBS containing (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml)) for 30 minutes. The cartilage tissue was cut into pieces of about 3 mm 3 with a scalpel. Next, 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution.
  • an antibiotic gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin
  • Tissue pieces were added to the prepared TGP solution, and the tissue pieces were uniformly dispersed and immersed by pipetting. After allowing the flask to stand at room temperature for gelation, add 7 to 8 ml of DMEM medium containing 10% serum (Thermo Fisher Scientific, DMEM, high glucose, Cat NO: 11965-084) to a 5% carbon dioxide incubator (ESPEC). Tissue pieces were cultured in BNA-111). The medium was changed weekly and cultured for 42 days. After 42 days, 4 ° C. PBS was added to the TGP gel in which the tissue pieces were embedded, and the TGP gel was dissolved by pipetting. The tissue pieces were transferred to a 50 ml test tube. 20 ml of 4 ° C. PBS was added to the test tube, then centrifuged and washed, and this was repeated twice. The obtained tissue piece was divided into two, the weight of each was measured, and then the tissue pieces were added to two 10 ml test tubes (test tubes A and B).
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer (PLS, Cat No: 43-50100-03), the mixture was centrifuged (150 rpm, 5 minutes) and suspended in 2 ml PBS. 100 ⁇ l was taken from each test tube, 400 ⁇ L of 0.4% trypan blue solution was added, and the cells were counted on the cell counter. The results are shown in Table 1.
  • TGP is suitable for transporting cartilage tissue.
  • Example 1-2 Transport of cartilage tissue A cartilage tissue piece was prepared and added to test tubes A and B in the same procedure as in Example 1-1, except that the cartilage tissue of another sample was desired to be used.
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing tissue pieces, and gelation was performed at 30 ° C. for 1 hour. I let you. Using a biobox (Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.SBE-10W) and Thermo Storage 20 (Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.TP-20-350), the temperature was maintained at about 20 ° C. and transported for 3 hours. The weight of the tissue piece placed in sample A was 0.21 g.
  • Sample B Add 10 ml of Corning Glucose Solution (Euro-Collins), Cat No: 99-408-CM (hereinafter referred to as "ECS") to the test tube B containing the cheek tissue pieces. Then, it was transported at 4 ° C. for 3 hours. The weight of the tissue piece placed in sample B was 0.19 g.
  • ECS Corning Glucose Solution
  • Each piece of tissue was cut into 1 mm 2 or less with a scalpel.
  • the tissue pieces were treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes and then digested with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C ° for 12-16 hours.
  • the mixture was filtered through a filter (100 ⁇ m) and then centrifuged (1800 rpm, 10 minutes).
  • the precipitate was diluted with DMEM solution containing 10% serum, placed in a T25 flask, and cultured in a 5% carbon dioxide gas incubator.
  • the culture solution was changed every 3 days and the cells were cultured for 2 weeks. After 2 weeks, the culture supernatant was rejected and then dispersed in cells with Trypsin-EDTA (0.25%) solution.
  • the chondrocyte culture obtained by the culture was collected on the 42nd day.
  • the mRNA of the collected culture was isolated using the RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • cDNA was synthesized by reverse transcription using Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen).
  • Real-time PCR analysis was measured by Thermal Cycler Dice Real Time System II (Takara, Cat No. TP900) using TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Cat No. RR820S / A / B). The sequence of the primers used is shown below.
  • SOX9 Fwd 5'-ggagatgaaatctgttctgggaatg-3' (SEQ ID NO: 1)
  • SOX9 Rvs 5'-ttgaaggttaactgctggtgttctg-3' (SEQ ID NO: 2)
  • COL2A1 Fwd 5'-ccagttgggagtaatgcaagga-3' (SEQ ID NO: 3)
  • COL2A1 Rvs 5'-acaccaggttcaccaggttca-3'(SEQ ID NO: 4)
  • TGP When transported by TGP, it was found that SOX9 and COL2A1, which are known as markers of healthy cartilage tissue, were expressed even 42 days after culturing. Combined with the results of Example 1-1, it was found that when transported by TGP, it had a favorable effect not only on the number of living cells but also on the properties of the subsequent cultured tissue as compared with the case of transporting by PBS or ECS. .. From this result, it was found that TGP is suitable for tissue transport of cartilage tissue.
  • Example 2-1 Transportation of oral tissue Humans (age 54 years (# 1080), age 21 years (# 1081), age 17 years (# 1082), age 36 years (# 1083)) in the same procedure as in Example 1. ,) Oral mucosal tissue (3 mm 3 ) was collected from each human and washed. Each piece of tissue was cut evenly and added to two 10 ml test tubes (Samples A and B), respectively.
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing tissue pieces, and gelation was performed at 30 ° C. for 1 hour. I let you. Using a biobox (Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.SBE-10W) and Thermo Storage 20 (Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.TP-20-350), the temperature was maintained at about 20 ° C. and transported for 4 hours. Sample B: 10 ml of PBS was added to a test tube B containing a piece of buccal tissue, and the mixture was transported at 4 ° C. for 4 hours.
  • a biobox Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.SBE-10W
  • Thermo Storage 20 Sugiamagen Co., Ltd., CatNo.TP-20-350
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., weighed 0.05 mg each, treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then Collagenase II solution (1 mg / mg /). It was digested at 37 C ° for 2 hours in ml). After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the mixture was centrifuged (150 rpm, 5 minutes) and suspended in 2 ml PBS. 100 ⁇ l was taken from each sample, 400 ⁇ L of 0.4% trypan blue solution was added, and the cells were counted on the cell calculator. The results are shown in Table 2.
  • Example 2-2 Transportation of oral tissue A part of a healthy cheek tissue piece was collected from the oral cavity of a human (age 34 years old) (# 1084), and ECS (Eurocholine solution, Corning Glucose Solution (Euro)) was taken instead of PBS. -Collins), Product Number 99-408-CM) were collected and transported in the same procedure as in Example 2.
  • ECS Eurocholine solution, Corning Glucose Solution (Euro)
  • tissue piece of Samples A and B was washed with 4 ° C. PBS.
  • Each tissue piece of Samples A and B was seeded in 10% TGP in which 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of a culture solution. After gelling at 30 ° C. for 1 hour, a culture solution was added and the cells were cultured in a 5% carbon dioxide gas incubator (Sample A-TGP, Sample B-TGP). The proliferative nature of the tissue during culture was confirmed with an inverted microscope.
  • sample A-DMEM tissue piece of Samples A and B was added to a 25 cm 2 flask together with DMEM and cultured (Sample A-DMEM, Sample B-DMEM). Further, a part of the tissue piece of sample B was added to a 25 cm 2 flask containing 10 ml of Cnt-PR and cultured (Sample B-Cnt-PR).
  • Sample A-DMEM and Sample A-TGP cultured for 7 days and 17 days are shown on the left side of FIG.
  • Sample B-DMEM, sample B-CnT-PR, and sample B-TGP are shown on the right side of FIG.
  • the sample A-TGP has a magnification of 40 times, and the Day of the sample B-TGP. All have a magnification of 10 times, except that 17 has a magnification of 40 times.
  • sample A-DMEM DMEM
  • TGP cell proliferation was confirmed at a relatively early stage.
  • sample A-DMEM DMEM
  • -TGP cell proliferation was confirmed at a relatively early stage.
  • sample A-DMEM cell proliferation was confirmed at a relatively early stage.
  • FIG. 3 in sample A-DMEM, it was shown that many cells proliferated from the tissue pieces 17 days after culturing.
  • Sample A-TGP was the earliest confirmed cell proliferation among all samples.
  • sample A-TGP an extremely large number of cells proliferated from the tissue pieces 17 days after culturing.
  • sample B-DMEM When the tissue pieces of sample B were cultured in DMEM, Cnt-PR and TGP (Sample B-DMEM, -Cnt-PR, -TGP), the growth rates were all slow, but among them, those cultured in TGP. Was relatively fast.
  • sample B-DMEM although it was shown that cells grew slightly from the tissue piece, fibroblasts began to grow from the tissue piece 7 days after culturing, and a culture dish 17 days after culturing. The bottom surface was covered with fibroblasts.
  • sample B-Cnt-PR cells slightly proliferated from the tissue pieces 17 days after culturing.
  • sample B-TGP many cells proliferated from the tissue pieces 17 days after culturing. Since epithelial cell proliferation was excellent in sample A regardless of the culture medium, it was found that when TGP was used for transport, it caused less damage to tissues than ECS.
  • Tissue pieces of sample A-TGP, sample A-DMEM, sample B-TGP and sample B-DMEM were washed with PBS at 4 ° C. on the 21st culture.
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 ° C. Digested for 5 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the mixture was centrifuged (150 rpm, 5 minutes) and suspended in 2 ml PBS. 100 ⁇ l was taken from each sample, 400 ⁇ L of 0.4% trypan blue solution was added, and the cells were counted on the cell calculator. The results are shown in Table 3.
  • E N in the table indicates the ratio of epithelial cells to non-epithelial cells.
  • TGP The cells cultured in TGP after being transported by sample A (TGP) showed the highest number of cells. After transporting with sample B (ECS), the cells cultured in a plane had the lowest number of cells. Further, even in Sample B in which the number of viable cells after transport was low in Example 2, a sufficient number of viable cells was confirmed by TGP culture. From this, it was found that TGP enhances the proliferative ability of cells in epithelial tissue, and particularly restores the proliferative ability of epithelial tissue in which the number of viable cells has decreased.
  • the proportion of non-epithelial cells was high in all of the TGP cultures. While the epithelial cells had a polygonal tatami-like morphology, the non-epithelial cells had a round morphology characteristic of epithelial stem cells, and the proliferated non-epithelial cells were considered to be epithelial stem cells. Therefore, it was also found that culturing epithelial tissue with TGP proliferates epithelial stem cells in the epithelial tissue.
  • Example 3-1 Corneal transport (MK solution) Eyeballs are collected from human corpses, immersed in a sterilized I-PVP (iodine-polyvinylpyrrolidone) 0.5% solution for 2 minutes, two corneas are collected according to a conventional method, and antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml)) are collected. , Amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) containing PBS for 30 minutes. Next, 1 g of TGP prepared in the production example was added to 9 ml of MK solution (containing 5% dextran 40).
  • I-PVP iodine-polyvinylpyrrolidone
  • a 10% TGP solution was prepared by dissolving in M199 (Thermo Fisher cat no. 11150-067) at 4 ° C. Transfer one of the two corneas to a corneal storage container so that the entire cornea was immersed in the TGP solution. It was added and gelled at 30 ° C. for 1 hour, and 10 ml of MK solution was added. Transported at 5-42 ° C. for 96 hours (Sample A). Another piece of cornea was transferred to a corneal storage container, and the MK solution was transferred. 10 ml was added (Sample B) and transported at 4 ° C. for 96 hours.
  • sample A contained a large number of high-quality endothelial cells, which is a characteristic of corneal quality.
  • sample B no live endothelial cells were confirmed after 96 hours. Therefore, the cornea was better preserved in sample A than in sample B. Therefore, it became clear that TGP is suitable for corneal transport.
  • Example 3-2 Corneal transport (Optisol GS solution) Two corneas were collected from another sample by the same procedure as in Example 3-1. Samples A and B were prepared in the same procedure except that OptiSol-GS Corneal Storage Media (Box of 12) (Bausch & Lomb 50006-OPT) was used instead of the MK solution in Example 3-1. And transported. Samples A and B were observed with a microscope (Keratoanalyzer EKA-10, Conan Medical) and software (KSS-EB10, Conan Medical) before storage and after 96 hours of transport. The results are shown in FIG. The upper two photographs show the corneal tissue before storage (0 hours), and the lower two photographs show the corneal tissue after 96 hours of transportation.
  • Example 4-1 Transport of corneal ring Example 3-1 except that a tissue piece of the corneal ring was collected from another sample instead of the cornea and a 10 ml test tube was used instead of the corneal storage container.
  • Samples A and B were prepared by the same procedure and the corneal ring was transported.
  • the corneal rings of the transported samples A and B were washed with 4 ° C. PBS.
  • a 10% TGP solution in which DMEM was dissolved at 4 ° C. was prepared , 10 ml was added to a 25 cm 2 flask containing a part of the tissue pieces of Samples A and B, and pipetting was performed to uniformly disperse the tissue pieces.
  • sample B cell proliferation was confirmed from the graft on the 7th day, whereas in sample A, good cell proliferation was confirmed from the graft on the 2nd day. From this, it was found that transporting by TGP does not damage the corneal ring as compared with transporting by MK medium. Therefore, it was clarified that TGP is suitable for transporting the corneal ring portion.
  • Example 5 Transport of intestinal tissue 3 mm 3 of the intestinal tissue of the human large intestine that had undergone bowel resection due to Hirschsprung's disease was collected and cut into small pieces. Soaked in PBS containing antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) for 30 minutes. It was centrifuged and washed. Each piece of tissue was cut evenly and added to two 10 ml test tubes (test tubes A and B).
  • antibiotics gentamicin (50 ⁇ g / ml)
  • amphotericin (0.25 ⁇ g / ml)
  • penicillin 100 Units / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM / F12 at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing a tissue piece, and the temperature was 30 ° C. for 1 hour. After gelation, it was transported for 2 hours at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C.
  • Sample B 10 ml of PBS was added to a test tube B containing a piece of tissue, and the mixture was transported at 4 ° C. for 2 hours.
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the cells were centrifuged (150 rpm, 5 minutes), and TGP solution (Meviol 25 cm 2 flask) dissolved at 4 ° C. was added to 9 ml DMEM / F12 to uniformly disperse the cells. This was added to a 25 cm 2 flask and gelled at 30 ° C.
  • sample A-TGP Sample B-
  • TGP TGP
  • the proliferation of cells during culturing was confirmed with an inverted microscope (magnification: 10 times), and then the number of viable cells was measured with trypan blue. The observation results are shown in FIG. In the sample A, the intestinal neural stem cells proliferated well as Neurosphere-like bodies, but in the sample B, the proliferation was poor. The number of cells after culturing was about 20 to 30 times higher in sample A than in sample B. From this, it was clarified that TGP is suitable for transporting intestinal tissue.
  • Example 6 Transport of Vascular Tissue Saphenous venous tissue was collected from a human corpse and chopped into tissue pieces. Soaked in PBS containing antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) for 30 minutes. It was centrifuged and washed. Each piece of tissue was cut evenly and added to two 10 ml test tubes (test tubes A and B).
  • antibiotics gentamicin (50 ⁇ g / ml)
  • amphotericin (0.25 ⁇ g / ml)
  • penicillin 100 Units / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of M199 at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing a tissue piece, and gelation was performed at 30 ° C. for 1 hour. After the reaction, the mixture was transported at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C. for 24 hours.
  • Sample B 10 ml of HBSS was added to a test tube B containing a tissue piece, and the mixture was transported at 4 ° C. for 2 hours.
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the cells were centrifuged (150 rpm, 5 minutes), and a TGP solution (Meviol 25 cm 2 flask) dissolved in 9 ml of M199 at 4 ° C. was added to uniformly disperse the cells. This was added to a 25 cm 2 flask and gelled at 30 ° C.
  • TGP solution Meviol 25 cm 2 flask
  • sample A-TGP sample A-TGP
  • sample B-TGP sample B-TGP
  • the proliferation of cells during culturing was confirmed with an inverted microscope (magnification: 10 times), and then the number of viable cells was measured with trypan blue. The observation results are shown in FIG.
  • TGP is suitable for transporting vascular tissue.
  • Example 7 Transportation of pulp tissue Instead of collecting saphenous venous tissue from human carcasses, pulp tissue from 20 exfoliated deciduous incisors, molars and canines obtained from 15 healthy humans was collected. Except for the above, the samples were collected in the same procedure as in Example 6.
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing a tissue piece, and gelation was performed at 30 ° C. for 1 hour. After soaking, they were transported for 24, 48 and 96 hours at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C.
  • Sample B 10 ml of PBS was added to a test tube B containing a piece of tissue, and the mixture was transported at 4 ° C. for 2 hours.
  • Example 8 Preservation of Foreskin Tissue 1 cm 2 of circumcised human penile foreskin tissue was collected and chopped into tissue pieces. Soaked in PBS containing antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) for 30 minutes. It was centrifuged and washed. Each piece of tissue was cut evenly and added to two 10 ml test tubes (test tubes A and B).
  • antibiotics gentamicin (50 ⁇ g / ml)
  • amphotericin (0.25 ⁇ g / ml)
  • penicillin 100 Units / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • Sample A 1 g of TGP prepared in the production example was dissolved in 9 ml of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, 10 ml of this was added to test tube A containing a tissue piece, and gelation was performed at 30 ° C. for 1 hour. After being allowed to stand, it was allowed to stand for 24 hours at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C. and stored.
  • Sample B 10 ml of Hanks balanced salt solution (HBSS) was added to a test tube B containing a tissue piece, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours for storage.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the cells were centrifuged (150 rpm, 5 minutes), and TGP solution (Meviol 25 cm 2 flask) dissolved at 4 ° C. was added to 9 ml DMEM to uniformly disperse the cells. This was added to a 25 cm 2 flask and gelled at 30 ° C.
  • Example 9 Transport and culture of omental tissue Same as Example 8 except that 2-3 cm 2 of omental tissue collected from a human corpse was collected in place of the foreskin tissue and M199 was used in place of DMEM. Samples were prepared according to the procedure and transported under the following conditions. Sample A: Transported for 12 hours at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C. Sample B: Transported at 4 ° C. for 12 hours.
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtering with a 100 ⁇ m cell strainer, the mixture was centrifuged (150 rpm, 5 minutes). 9 ml of M199 was added to a TGP solution (Mebiol 25 cm 2 flask), and the dispersed cells of Sample A were added to a flask containing the TGP solution and uniformly dispersed. This was added to a 25 cm 2 flask and gelled at 30 ° C.
  • Example 10 Transport of human fetal hepatocytes
  • Six pieces of tissue 2-3 cm 2 from liver tissue collected from a human fetal are used instead of omental tissue, and DMEM / HAM F-12 is used instead of M199.
  • Samples A and B were prepared three by three in the same procedure as in Example 9, and transported under the following conditions.
  • Sample A Transported at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C. for 4 to 8 hours.
  • Sample B Transported at a temperature (outside air temperature) that could fluctuate in the range of 5 to 42 ° C. for 4 to 8 hours.
  • Tissue pieces of Samples A and B were washed with PBS at 4 ° C., each treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes, and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C °. , Digested for 19 hours. After filtration through a 100 ⁇ m cell strainer, the mixture was centrifuged (150 rpm, 5 minutes) and suspended in 2 ml PBS. 100 ⁇ l was taken from each test tube, 400 ⁇ L of 0.4% trypan blue solution was added, and the cells were counted on the cell counter. The results are shown in Table 4.
  • TGP is suitable for the storage and transportation of various biomaterials.

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Abstract

本発明は、従来の生体材料の保存液が、いずれも生体材料中の細胞の生存または機能の維持において十分ではないうえ、保存温度、保存処理などの保存条件に対する制約が多く、細胞治療の普及のボトルネックとなっているとの問題点を解決できる生体材料の保存用組成物の提供を目的とする。本目的は、保存用組成物が熱可逆性ポリマーを含むことにより解決された。

Description

生体材料の保存用組成物
　本発明は、熱可逆性ポリマー含む、生体材料の保存用組成物に関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために細胞治療が行われ始めている。細胞治療を行うには細胞、組織または細胞シートなどの生体材料に生細胞が一定数維持され、さらに移植先で所望の機能を果たす必要がある。したがって、生体材料が採取、加工等された後、移植等までの間は保存する必要がある。このような保存方法として、これまで生体材料を低温で保存液に浸漬する方法、保存液を持続的に灌流する方法、高圧ガス中で保存する方法、エアロゾル中で保存する方法等が知られている。しかしながら、これらの生体材料の保存方法は、いずれも生体材料中の細胞の生存または機能の維持において十分ではないうえ、保存温度、保存処理などの保存条件に対する制約が多く、細胞治療の普及のボトルネックとなっている（特許文献１、２、非特許文献１）。
特開２０１８－０１６６５４号公報 国際公開第２０１０／０４９９９６号
Jamart et al., "Efficiency and limitation of Euro-Collins solution in kidney preservation", J Surg Res. 1983 Mar;34(3):195-204 H. Yoshioka et al., "A Synthetic Hydrogel with Thermoreversible Gelation. I. Preparation and Rheological Properties", Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113-120 (1994) K.R.Holme.et al., "Chitosan derivatives bearing C10-alkyl glycoside branches: a temperature-induced gelling polysaccharide", Macromolecules, 24, 3828-3833(1991)
　本発明は、生体材料の保存用組成物の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、生体材料を熱可逆性ポリマーで保存することによって生体材料中の細胞の生存および／または機能を維持することができことを見出し、発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の生体材料の保存用組成物に関する。
（１）　熱可逆性ポリマー含む、生体材料の保存用組成物。
（２）　一定のまたは変動する温度での保存用である、前記（１）に記載の保存用組成物。
（３）　一定のまたは変動する温度が、実質的に細胞が増殖しない温度である、前記（２）に記載に記載の保存用組成物。
（４）　実質的に細胞が増殖しない温度が、４～３０℃である、前記（３）に記載に記載の保存用組成物。
（５）　生体材料が、軟骨組織、口腔粘膜組織、角膜組織、輪部組織、歯髄組織、血管組織、消化管粘膜組織、大網組織、皮膚組織、肝臓組織からなる群から選択される、前記（１）～（４）のいずれか一項に記載の保存用組成物。
（６）　生体材料が、軟骨組織、口腔粘膜組織、角膜組織、輪部組織、歯髄組織、血管組織、消化管粘膜組織、大網組織、皮膚組織、肝臓組織からなる群から選択される組織に含まれる体細胞、前駆細胞または幹細胞である、前記（１）～（４）のいずれか一項に記載の保存用組成物。
（７）　熱可逆性ポリマーが、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる、曇点を有する複数のブロックおよび親水性のブロックが結合してなる、前記（１）～（６）のいずれか一項に記載の保存用組成物。
（８）　輸送用にも使用可能である、前記（１）～（７）のいずれか一項に記載の保存用組成物。
　本発明の保存用組成物は、従来の保存液と比較して生体材料に含まれる細胞の生存および／または機能を維持することができる。さらに、当該保存は、必ずしも一定の低温条件等で行う必要がないため、生体材料を幅広い温度条件で保存することが可能となる。さらに、本発明の保存剤による保存は、手間やコストが軽微であるため細胞治療、臓器移植などに広く利用することができる。
図１は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）とＰＢＳ（サンプルＢ）でそれぞれ作成した軟骨組織の輸送用サンプルＡおよびＢを示す。 図２は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）とＥＣＳ（サンプルＢ）で輸送した後、培養した際に発現したＣＯＬ２ａ１の発現量を示す。 図３は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）とＥＣＳ（サンプルＢ）で輸送した後、平面培養（ＤＭＥＭおよびＣｎｔ－ＰＲ）および熱可逆性ポリマー（ＴＧＰ）で培養した頬粘膜の増殖性示す。 図４は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＭＫ液（サンプルＢ）でそれぞれ角膜を輸送した際に角膜中の内皮細胞を示す。 図５は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＯｐｔｉｓｏｌＧＳ液（サンプルＢ）でそれぞれ角膜を輸送した際に角膜中の内皮細胞を示す。 図６は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＭＫ液（サンプルＢ）で輸送した後、培養した角膜輪部の増殖性を示す。
図７は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＤＭＥＭ（サンプルＢ）で輸送した後、培養した腸管組織の増殖性を示す。 図８は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＭ１９９（サンプルＢ）で輸送した後、培養した血管組織の増殖性を示す。 図９は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＤＭＥＭ（サンプルＢ）で輸送した後、培養した歯髄組織の増殖性を示す。 図１０は、熱可逆性ポリマーで輸送した後、培養した歯髄組織のＨＥ染色像を示す。 図１１は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＨＢＳＳ（サンプルＢ）で輸送した後、培養した皮膚組織の増殖性を示す。 図１２は、熱可逆性ポリマー（サンプルＡ）およびＤＭＥＭ（サンプルＢ）で輸送した後、培養した肝臓組織の増殖性を示す。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
　本発明の生体材料の保存用組成物は、熱可逆性ポリマーを含むことを特徴とする。
（生体材料）
　本発明において、「生体材料」とは、細胞またはそれを含む細胞集団、細胞培養物、構造物、組織、臓器などを意味し、細胞は、好ましくは生体由来の細胞、より好ましくは生物個体から得られた初代細胞である。細胞は、初代細胞を一世代または複数世代培養して増殖させた細胞でもよい。細胞は複数世代培養して増殖させた細胞がある生物学的または物理学的条件により増殖を止めた細胞でもよい。細胞としては、限定されることなく、例えば体細胞（例えば、「細胞」としては初代細胞であっても株化細胞であってもよい。細胞は、これに限定されないが、肝臓（例えば肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（例えば膵島β細胞）、肺、脳（例えば神経、グリアまたは上衣細胞）または脊髄の様な中枢または末梢神経系、腎臓、眼（例えば網膜細胞、角膜内皮細胞）、脾臓、皮膚、胸腺、睾丸、肺、横隔膜、心臓（心臓細胞）、筋肉または腰筋、または腸（例えば内分泌細胞）、脂肪組織（白色、褐色またはベージュ脂肪細胞）、筋肉（例えば繊維芽細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳の神経細胞、または造血細胞（例えば、血液細胞またはリンパ球）または、これらの前駆細胞および幹細胞（上皮幹細胞、衛星細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、嗅粘膜幹細胞、毛包幹細胞、乳腺幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、間葉系幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、卵母細胞、卵割球、内細胞塊細胞、胚性生殖細胞、胚様体細胞、桑実胚由来細胞、奇形腫（奇形癌腫）細胞、および胚発生過程の後期由来の多分化能の部分的に分化した胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性細胞）のほか、精子、卵子、受精卵および胚なども包含される。
　細胞は、生体から採取された組織または臓器から分離された細胞集団なども包含する。細胞集団の態様で用い得る細胞としては、これに限定するものではないが、上皮組織由来の細胞集団（例えば、口腔粘膜上皮細胞、上皮幹細胞など）、脂肪組織由来の細胞集団（脂肪細胞、間葉系幹細胞など）、軟骨組織由来の細胞集団（滑膜細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞）のほか、培養細胞を培養した細胞集団なども包含される。
　さらに、「生体材料」には、細胞培養物または細胞構造物も含まれ得る。細胞培養物または細胞構造物としては、限定されることなく、例えば細胞ポリマー混合物、細胞シート、細胞塊などが、細胞構造物としては、限定されることなく、細胞ポリマー構造体、細胞シートと組織とを結合した構造物などが包含される。
　「生体材料」は、細胞を含んでいれば限定されず、血液、骨髄液、リンパ液などを含む生体液体、胸腺組織、甲状腺組織、骨格筋組織、気管組織、血管組織、肺組織、肝臓組織、胆のう組織、腎臓組織、尿管組織、虫垂組織、膀胱組織、尿道組織、睾丸組織、子宮組織、卵巣組織、消化器組織（胃組織、小腸組織または大腸組織など）、心臓組織、食道組織、横隔膜組織、脾臓組織、すい臓組織、脳組織（大脳組織、小脳組織など）、脊髄組織、軟骨組織、四肢末梢組織、網膜組織、皮膚組織、口腔粘膜組織、角膜組織、輪部組織、歯髄組織、血管組織、消化管組織、大網組織、皮膚組織、肝臓組織、羊膜などの組織であってよい。
　また、「生体材料」は、唾液腺、口蓋、口蓋垂、下、歯、咽頭、喉頭、食道、肝臓、胆嚢、総胆管、胃、膵臓、膵管、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（横行結腸、上行結腸、盲腸、下行結腸、盲腸、S状結腸、直腸）、虫垂、肛門、心臓、血管、リンパ管、リンパ節、脾臓、皮膚、胸腺、鼻腔、気管、気管支、肺、胸郭、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、子宮、卵巣、卵管、精管、陰茎、膣、眼球、耳、脳、脊髄、神経線維束、骨、軟骨、骨格筋、内臓筋、腱、靭帯を含む臓器であってもよい。
　生体材料は、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。
　本発明において、「保存」とは、その保存対象となる生体材料（以下に「保存対象となる生体材料」を「対象生体材料」という）に含まれる細胞の生存および／または機能を維持することを意味する。細胞の生存の維持は、限定されずに、対象生体材料に含まれる生細胞数の測定、生細胞の呼吸活性など当該技術分野で、細胞の生存の程度を測定する際に通常に使用される方法で確認し得る。本発明の保存用組成物を用いた保存の前後で、対象生体材料に含まれる生細胞数または呼吸活性が、限定されずに７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％または０．０５％維持されることが好ましい。機能の維持は、限定されずに、対象生体材料に含まれる細胞の増殖能、生体材料の形態の維持、所定成分の分泌能、所定タンパク質または遺伝子の発現レベルの測定といった当該技術分野で生体材料の機能を測定する方法として通常に使用される方法で確認できる。本発明の保存用組成物を用いる保存の前後で、対象生体材料の機能と同質の機能が維持されていることが好ましい。
　例えば、対象生体材料が、採取した直後の軟骨組織であれば、限定されずに、例えばSOX9、COL2A1、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL11A1、COL11A2、ACAN、HAPLN1、COMPまたはMATN3などの軟骨マーカータンパク質またはこれをコードする遺伝子の発現の維持として確認されてよい。したがって、本発明において「保存用組成物」とは、保存に供する組成物、すなわち生体材料を保存用組成物中に浸漬した場合に、上記の保存の効果を有する組成物を意味する。「保存用組成物」には、対象生体材料を含む態様も、対象生体材料を含まない態様も包含される。対象生体材料に含まれる細胞の生存および／または機能が維持されていれば、保存は、静置に限られず、輸送などの振動を与え得る任意の態様を含む。したがって一態様において本発明の保存用組成物は、輸送用組成物である。
（熱可逆性ポリマー）
　本発明の保存用組成物に含まれる熱可逆性ポリマーは、（Thermoreversible Gelation Polymer：本明細書において「ＴＧＰ」ともいう）は、架橋構造ないし網目構造を熱可逆的に生成し、該構造に基づき、その内部に水等の分離液体を保持するハイドロゲルを熱可逆的に形成可能な性質を有する高分子をいい、本発明の保存用組成物は当該ポリマーの性質を有する。ハイドロゲルとは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された水を含むゲルをいう。
（ゾル－ゲル転移温度）
　本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル－ゲル転移温度の定義および測定は、非特許文献２（H. Yoshioka et al., “A Synthetic Hydrogel with Thermoreversible Gelation. I. Preparation and Rheological Properties”, Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113-120 (1994)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ’、弾性項）が損失弾性率（Ｇ”、粘性項）を上回る点の温度をゾル－ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ”＞Ｇ’の状態がゾルであり、Ｇ”＜Ｇ’の状態がゲルであると定義される。このゾル－ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター　AR500、TAインスツルメント社製
試料溶液（ないし分離液）の濃度（ただし「ゾル－ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
測定周波数：１Ｈｚ
適用ストレス：線形領域内。
　本発明においては、熱可逆性ポリマーのゾル－ゲル転移温度は０℃より高く、３７℃以下であることが好ましく、更には、５℃より高く３５℃以下（特に１０℃以上３３℃以下である）ことが好ましい。本発明の保存用組成物は、ゾル状態であってもゲル状態であっても対象生体材料を保存し得るため、ゾル－ゲル転移温度は限定されずに、１０～３５℃、１５～３０℃であってよく、ゲル化することで保存時または輸送時の振動に対して保存媒体の攪拌を防ぎ、攪拌によるストレスを抑制できる観点から、通常の室温でゲル化し得る１７～２５℃が好ましく、より好ましくは１９～２３℃であり、特に好ましくは１９～２１℃である。このような好適なゾル－ゲル転移温度を有するＴＧＰは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル－ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
　上述したような熱可逆的なゾル－ゲル転移を示す（すなわち、ゾル－ゲル転移温度を有する）限り、本発明のＴＧＰは特に制限されない。その水溶液がゾル－ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（K.R.Holme.et al. “Chitosan derivatives bearing C10-alkyl glycoside branches: a temperature-induced gelling polysaccharide”, Macromolecules, 24, 3828-3833(1991)（非特許文献３））等が知られている。
（好適な熱可逆性ポリマー）
　本発明のＴＧＰとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。該親水性のブロックは、ゾル－ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化する。
　換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル－ゲル転移温度に対応する。ただし、該曇点とゾル－ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。このような性質により、対象生体材料を低温で熱可逆性ポリマーに保存用組成物中に浸漬できるため、対象生体材料の損傷を防ぐ観点から曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなる熱可逆性ポリマーが好ましい。
　本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成され、それにより対象生体材料の保存性が増加する観点からは、ＴＧＰが「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。一方、上記ＴＧＰ中の親水性ブロックは、前述したように、該ＴＧＰがゾル－ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。さらに本発明に用いるＴＧＰは、生体内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明のＴＧＰが生体内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、生体に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
　本発明のＴＧＰが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
（曇点を有する複数のブロック）
　曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度－温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサ換アクリルアミド誘導体とＮ－置イドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。安定性に優れたゲルが形成され、それにより対象生体材料の保存性が増加する観点からは、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体が好ましい。
　曇点を有するブロックを生体内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを生体内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
　上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル－ゲル転移温度を０℃より高く３７℃以下とする点から好ましい。ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
　本発明に使用可能なポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。
ポリ－Ｎ－アクロイルピペリジン；ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－アクリロイルピロリジン；ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－エチルアクリルアミド。
　上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。したがって、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
（親水性単量体）
　上記親水性単量体としては、Ｎ－ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（疎水性単量体）
　一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ－ｎ－ブチルメタアクリルアミド等のＮ－置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（親水性のブロック）
　一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ－ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ－メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。
　また親水性のブロックは生体内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性生体高分子が好ましく用いられる。
　曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるＴＧＰを得ることができる。
　この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明のＴＧＰは、再び完全な水溶液となる。このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル－ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。本発明の一態様において、このような疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合するため対象生体材料からの組織液などによりゲルが溶解されることなく、対象生体材料の環境を一定に保つことができる。上記したＴＧＰの水中における微妙な親水性－疎水性のバランスが、対象生体材料を保存する際の安定性に寄与し得る。
（ゲルの溶解性）
　上述したように水溶液中でゾル－ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル－ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル－ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
　上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
　一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記ＴＧＰの水溶液が、一旦（ゾル－ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル－ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
　上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０～３，０００センチポイズ（更には５０～１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
　　粘度計：ストレス制御式レオメーター（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
　　ローター直径：６０ｍｍ
　　ローター形状：平行平板
　本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記ＴＧＰが形成するハイドロゲルの上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
　すなわち、ＴＧＰ０．１５ｇを、上記ゾル－ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０ｗｔ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ（リットル）中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ－ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
　本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１～１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
　これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
　非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）｝×１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なＴＧＰを用いることが好ましい。
　本発明に用いられるＴＧＰの分子量は３万以上３，０００万以下が好ましく、より好ましくは１０万以上１，０００万以下、さらに好ましくは５０万以上５００万以下である。
（保存用組成物中のＴＧＰ濃度等）
　本発明の保存用組成物におけるＴＧＰは任意の媒体に溶解されていてよい。保存用組成物中のＴＧＰは、対象生体材料に含まれる細胞の生存が維持されれば、どのような濃度であってもよく、質量パーセント濃度として限定されずに、１～４０％、３～３０％、５～２０％、７～１５％、８～１２％、９～１１％であってよく、ゾル状態で対象生体材料が、保存容器底面に接触せず浮遊し得る程度の粘性を有する観点から、７～１５％、８～１２％、９～１１％が好ましく、ゲル化した際に対象生体材料が生体に存在していた程度の圧力を有する架橋または網目構造を形成できる観点から９～１１％のＴＧＰを含有することが好ましい。
　本発明の保存用組成物に含まれるＴＧＰは、任意の媒体に溶解されていてよい。媒体は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地、保存液、輸送液をベースにしたものなどを使用することができる。生理食塩水、種々の生理緩衝液は、対象生体材料その他の保存条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。
　基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０５（Ｍ１９９）、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＣｎＴ－ＰＲなどが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。保存液には、限定されずに、例えば、ＥＰＩＩ液、ＭＫ液、ＯｐｔｉｓｏｌＧＳ液が、組織または臓器輸送液には、限定されずに、コリン液、ユーロコリン液、ＵＷ液、ＨＴＫ液、Ｃｅｌｓｉｏｒ液、Ｐｏｌｙｓｏｌ，Ｄｓｏｌなどが含まれる。本発明の媒体として用いられる、生理食塩水、基礎培地、保存液、輸送液は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
　媒体は、上記のほか、血清、成長因子（例えばＥＧＦ、インシュリンなど）、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。本発明の一態様において、ＴＧＰを溶解する媒体は血清を含まない。本発明の一態様においてＴＧＰを溶解する媒体は血清を含んでいてよい。血清としては、異種血清でも同種血清でもよい。同種血清が好ましく、同種血清のなかでも自己血清が特に好ましい。血清の濃度は、限定されずに、媒体中に１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上または２０％以上含んでよい。好ましくは１０％である。
　本発明の保存用組成物は、保存用組成物の保存効果を阻害しない限り、さらに任意の追加成分を含んでよい。追加の成分としては、例えば、許容し得る担体や、細胞培養物の生存性を高める任意の成分（ビタミン、アミノ酸など）、抗生物質、防腐剤を含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。本発明の保存用組成物の効果を増強し得る成分が好ましい。
　本発明においてＴＧＰの状態は、対象生体材料が保存できれば、ゾル状態であってもゲル状態であってもよい。輸送時の攪拌を抑制できる観点から、好ましくはゲル状態での保存である。ゾル状態の保存としては、典型的には、低温で対象生体材料をＴＧＰゾルへ浸漬した後、当該ゾルを昇温しなければよい。ゲル状態での保存としては、典型的には、対象生体材料をＴＧＰゾルへ浸漬した後、当該ゾルをゾル-ゲル転移温度よりも昇温してゲル状態にすればよい。
　本発明の一態様において、ＴＧＰゾルへ保存対象となる細胞等を浸漬してゲル化した後、ＴＧＰの上にさらに媒体を添加してもよい。このようにすることで、媒体からＴＧＰ内に栄養を供給できるため、長期間の保存には好ましい。ゲル化したＴＧＰの上に添加する媒体は、ＴＧＰと溶解する媒体と同一であっても異なっていてもよい。ＴＧＰの上に添加する媒体としては、血清を含まない以外はＴＧＰに溶解する媒体と同一であることが好ましい。
（保存温度）
　対象生体材料を保存する温度は、対象生体材料中の細胞の生存が維持できれば、限定されずに、例えば１℃～４２℃、４℃～３８℃、６～３５℃、１０～３５℃、１２～３０℃、１５～３０℃、２０～３０℃、２２～２８℃、２３～２７℃、２４℃～２６℃であってよく、１５～３０℃が好ましく、２０～３０℃がより好ましい。温度変化による対象生体材料の損傷を防ぐ観点から一定温度での保存が好ましいが、変動する温度で対象生体材料を保存するための組成物としても使用することもできる。したがって、本発明の一態様において、保存温度は一定であっても変動してもよい。変動する温度範囲としては、対象生体材料中の細胞の生存が維持できれば限定されずに、典型的には１℃～４２℃、４℃～３８℃、６～３５℃、１０～３５℃、１２～３０℃、１５～３０℃、２０～３０℃、２２～２８℃、２３～２７℃、２４℃～２６℃の範囲の変動であってよく、１５～３０℃、２０～３０℃の変動が好ましく、２０～３０℃の範囲の変動がより好ましい。本発明の一態様において、変動する温度は、外気温であってよく、前述の変動する温度範囲を日周変動してよい。
　本発明の一態様において、保存温度は、保存対象となる細胞等が実質的に増殖しない温度であってよい。対象生体材料が、「実質的に増殖しない温度」とは当該技術分野において細胞の増殖が緩慢または停止する温度であればよく、対象生体材料の３７℃における増殖速度または呼吸速度と比較して１／３、１／５、１／１０、１／２０または１／１００以下の増殖速度または呼吸速度となる温度である。当該温度は、限定されずに、例えば３０℃以下であってよく、２７℃以下、２５℃以下、２３℃以下、２０℃以下、１７℃以下、１５℃以下、１２℃以下、１０℃以下、７℃以下、６℃以下または４℃以下であってよい。具体的には、例えば、４～３０℃、６～３０℃、８～３０℃、１０～３０℃、１２～３０℃、１４～３０℃、１６～３０℃、１８～３０℃または２０～３０℃であってよく、１６～３０℃が好ましく、２０～３０℃が特に好ましい。
　本発明の一態様において、保存温度は、保存対象となる細胞等が実質的に増殖しない温度において一定であっても変動してもよい。
（保存時間）
　保存時間は、対象生体材料が保存できれば、限定されずに、例えば上限値として１時間以上、３時間以上、５時間以上、１２時間以上、１８時間、２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１２日以上、１６日以上、２０日以上、３０日以上、４０日以上、５０日以上、６０日以上であってよく、例えば、下限値として４５日以下、３５日以下、２５日以下、１４日以下、１０日以下、６日以下、３日以下、２０時間以下、１６時間以下、１４時間以下、１０時間以下、８時間以下、６時間以下、５間以下、４以下、３時間以下、２時間以下、１時間以下などが挙げられる。保存時間としては、これら上限値および下限値の任意の組み合わせであってよく、限定されずに、３時間～６０日、６時間～５０日、８時間～４０日、１０時間～２５日、１２時間～２０日、１８時間～１５日、２４時間～１０日、３６時間～８日の範囲などが挙げられる。対象生体材料は、長時間の保存により損傷が進むため長時間の保存はあまり好ましくない。
　本発明の保存用組成物は、生体材料の保存性に優れるので、限定されずに、例えば、医療、医学実験等分野、特に細胞治療、臓器移植の用に用いる生体材料の保存用組成物、輸送用組成物として好適に利用可能である。
製造例１
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド４２．０ｇおよびｎ－ブチルメタクリレート４．０ｇをエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PDE6000、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。さらにＴＥＭＥＤ　０．４ｍＬと１０％ＡＰＳ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を５℃以下に冷却後、５℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて５℃で２Ｌまで濃縮した。
　該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（「ハイドロゲル形成性の高分子」－６）４０ｇを得た。上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（「ハイドロゲル形成性の高分子」－６）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解し１０ｗｔ％の水溶液を得た。この水溶液の貯蔵弾性率をストレス制御式レオメーター（AR500、TAインスツルメント社製）を用い、適用周波数１Ｈｚで測定したところ、１０℃で４３Ｐａ、２５℃で６８０Ｐａ、３７℃で１３１０Ｐａであった。この温度依存性貯蔵弾性率変化は、可逆的に繰り返し観測された。ゾルゲル転移温度は、約２０℃であった。
実施例１：軟骨組織の輸送
　人工関節置換術により切除した軟骨組織（約１０×５ｍｍ、厚さ３ｍｍ、年齢：３５歳）の一部を採取し、抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml)、penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)）を含有するＰＢＳに３０分間浸漬した。軟骨組織をメスにて約３ｍｍ３に細切して組織片にした。次いで、製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭにより４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成した。作成したＴＧＰ溶液に組織片を添加し、ピペッティングして組織片を均一に分散させて浸漬した。フラスコを室温で放置してゲル化させた後、１０％血清含有ＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific、DMEM、high glucose、Cat NO:11965-084）７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器（ESPEC BNA-111）にて組織片を培養した。培地は、１週間ごとに交換し４２日培養した。４２日後、組織片を包埋したＴＧＰゲルへ４℃ＰＢＳを添加し、ピペッティングによりＴＧＰゲルを溶解した。組織片を５０ｍｌ試験管へ移した。試験管へ４℃ＰＢＳを２０ｍｌ加え、その後遠心分離して洗浄し、これを２回繰り返した。得られた組織片を２つに分け、それぞれの重量を測定した後、１０ｍｌ試験管２本（試験管ＡおよびＢ）へ添加した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた後、５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で３時間輸送した。組織片の重量は、０．２３ｇであった（ｎ＝４）。
　サンプルＢ：ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で３時間輸送した。組織片の重量は０．１６ｇであった（ｎ＝４）。
　軟骨組織片が入ったサンプルＡおよびＢの写真を図１に示す。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナ（PLS、Cat No:43-50100-03）でろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、２ｍｌＰＢＳに浮遊させた。それぞれの試験管から１００μｌを分取し、０．４％トリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞算定盤で計数した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　ＴＧＰで輸送した場合、ＰＢＳで輸送した場合と比較して生細胞数および相対生細胞数が、高く維持されることが分かった。この結果から、軟骨組織の輸送にはＴＧＰが適していることが分かった。
実施例１－２：軟骨組織の輸送
　別の検体の軟骨組織を使用したい以外は、実施例１－１と同じ手順で軟骨組織片を用意し、試験管ＡおよびＢへ添加した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた。バイオボックス(株式会社スギヤマゲン、CatNo.SBE-10W)およびサーモストレージ２０（株式会社スギヤマゲン、CatNo.TP-20-350)を使用して約２０℃に保ち３時間輸送した。サンプルＡに入れた組織片の重量は０．２１ｇであった。
　サンプルＢ：ユーロコリンズ液（Corning Glucose Solution (Euro-Collins)、Cat No:99-408-CM）（以下、ユーロコリンズ液を「ＥＣＳ」という）を頬組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で３時間輸送した。サンプルＢに入れた組織片の重量は０．１９ｇであった。
　各組織片をメスにて１ｍｍ２以下に細切した。この組織片をＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°、１２～１６時間消化した。ＤＭＥＭ液にて洗浄後フィルター（１００μｍ）にてろ過した後、遠心分離（１８００ｒｐｍ、１０分間）した。沈殿物を１０％血清含有ＤＭＥＭ液にて希釈後、Ｔ２５フラスコに入れ５％炭酸ガス培養器にて培養した。３日ごとに培養液を交換し２週間培養した。２週間後培養上清を棄却後Ｔｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％）液にて細胞に分散した。
　製造例で作成したＴＧＰ１ｇを１０℃でＤＭＥＭに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、次いで軟骨組織片由来の細胞を分散し、６ｗｅｌｌプレートに分注した。室温に放置してゲル状にした後、１０％血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した培地７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器（ESPEC BNA-111）にて培養した。培養液は１週間ごとに交換して４～１６週間培養した。
　培養によって得られた軟骨細胞培養物を４２日目に回収した。RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて回収した培養物のmRNAを単離した。得られた全RNAのうち1μｇを鋳型として、Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen)を用いて逆転写によりcDNAを合成した。リアルタイムPCR解析は、TB Green Premix Ex Taq II（Takara,Cat No. RR820S/A/B）を用いて、Thermal Cycler Dice Real Time System II（Takara,Cat No.TP900）により測定した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
ＳＯＸ９：Ｆｗｄ　5’-ggagatgaaatctgttctgggaatg-3’（配列番号１）
ＳＯＸ９：Ｒｖｓ　5’-ttgaaggttaactgctggtgttctg-3’ （配列番号２）
ＣＯＬ２Ａ１：Ｆｗｄ　5’-ccagttgggagtaatgcaagga-3’ （配列番号３）
ＣＯＬ２Ａ１：Ｒｖｓ　5’-acaccaggttcaccaggttca-3’ （配列番号４）
　リアルタイムＰＣＲの結果、ＳＯＸ９はサンプルＡおよびＢにおいて同程度の発現をしていた。一方でサンプルＢ（ＥＣＳ輸送）は、４２日目においてＣＯＬ２Ａ１を発現していなかったが、サンプルＡ（ＴＧＰ輸送）は４２日目においてＣＯＬ２Ａ１を発現していた。ＣＯＬ２Ａ１の結果を図２に示す。
　ＴＧＰで輸送した場合、培養後４２日後でも健全な軟骨組織のマーカーとして知られるＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１が発現していることが分かった。実施例１－１の結果と合わせるとＴＧＰで輸送した場合、ＰＢＳまたはＥＣＳで輸送した場合と比較して生細胞数だけでなくその後の培養組織の性質にも良好な影響をあたえることが分かった。この結果から、軟骨組織の組織輸送にはＴＧＰが適していることが分かった。
実施例２－１：口腔組織の輸送
　実施例１と同じ手順でヒト（年齢５４歳（＃１０８０）、年齢２１歳（＃１０８１）、年齢１７歳（＃１０８２）、年齢３６歳（＃１０８３）、）口腔から口腔粘膜組織（３ｍｍ３）を、各ヒトから４つずつ採取し洗浄した。各組織片を均等に切断して、それぞれ１０ｍｌ試験管２本（サンプルＡおよびＢ）へ添加した。
[組織の輸送]
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた。バイオボックス(株式会社スギヤマゲン、CatNo.SBE-10W)およびサーモストレージ２０（株式会社スギヤマゲン、CatNo.TP-20-350)を使用して約２０℃に保ち４時間輸送した。
　サンプルＢ：ＰＢＳを頬組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で４時間輸送した。
[生細胞数の測定]
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれ０．０５ｍｇ秤量し、Ｔｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、２時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、２ｍｌＰＢＳに浮遊させた。それぞれのサンプルから１００μｌを分取し、０．４％トリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞算定盤で計数した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
［結果］
　ＴＧＰで輸送した上皮組織のいずれも、生細胞が多く確認されたことから、ＴＧＰでの保存は上皮組織の輸送に適していることが分かった。
実施例２－２：口腔組織の輸送
　ヒト（年齢３４歳）（＃１０８４）の口腔から健全な頬組織片の一部を採取し、ＰＢＳの代わりにＥＣＳ（ユーロコリン液、Corning Glucose Solution (Euro-Collins)、Product Number 99-408-CM）を使用した以外は実施例２と同じ手順で採取し輸送した。
［増殖性の確認］
　サンプルＡおよびＢの各組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した。製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌの培養液で溶解した１０％ＴＧＰ中にサンプルＡおよびＢの各組織片を播種した。３０℃で１時間ゲル化させた後、培養液を加えて５％炭酸ガス培養器で培養した（サンプルＡ－ＴＧＰ、サンプルＢ－ＴＧＰ）。培養時の組織の増殖性を倒立顕微鏡で確認した。
　サンプルＡおよびＢの一部の組織片を２５ｃｍ２フラスコへＤＭＥＭとともに添加し、培養した（サンプルＡ－ＤＭＥＭ、サンプルＢ―ＤＭＥＭ）。さらにサンプルＢの一部の組織片をＣｎｔ－ＰＲを１０ｍｌ含む２５ｃｍ２フラスコへ添加し培養した（サンプルＢ―Ｃｎｔ－ＰＲ）。サンプルＡ－ＤＭＥＭ、サンプルＡ―ＴＧＰを７日および１７日培養した際の倒立顕微鏡像を図３左側に示す。サンプルＢ－ＤＭＥＭ、サンプルＢ－ＣｎＴ－ＰＲ、サンプルＢ－ＴＧＰを図３の右側に示す。なお、サンプルＡ―ＴＧＰが倍率４０倍、サンプルＢ―ＴＧＰのＤａｙ．１７が倍率４０倍である以外は、全て倍率１０倍である。
　サンプルＡの組織片をＤＭＥＭおよびＴＧＰで培養した場合、比較的早い段階で細胞の増殖が確認された（サンプルＡ－ＤＭＥＭ、－ＴＧＰ）。図３のとおり、サンプルＡ―ＤＭＥＭでは、培養後１７日後に組織片から多くの細胞が増殖したことが示された。サンプルＡ―ＴＧＰは、全サンプルのなかで最も早く細胞の増殖が確認された。サンプルＡ―ＴＧＰでは、培養後１７日後に組織片から極めて多くの細胞が増殖した。
　サンプルＢの組織片をＤＭＥＭ、Ｃｎｔ－ＰＲおよびＴＧＰで培養した場合（サンプルＢ－ＤＭＥＭ、－Ｃｎｔ－ＰＲ、－ＴＧＰ）、増殖速度はいずれも緩慢であったが、なかでもＴＧＰで培養したものは比較的速かった。図３のとおり、サンプルＢ―ＤＭＥＭでは、組織片から、わずかに細胞が増殖したことが示されたものの培養後７日後に組織片から線維芽細胞が増殖し始め、培養後１７日後に培養皿底面が線維芽細胞に覆われた。またサンプルＢ―Ｃｎｔ－ＰＲでは、培養後１７日後に組織片から、わずかに細胞が増殖した。
　サンプルＢ―ＴＧＰでは、培養後１７日後に組織片から多くの細胞が増殖した。培養液にかかわらず、サンプルＡで上皮細胞の増殖が優れていたことから、ＴＧＰを輸送に使用した場合、ＥＣＳよりも組織に与える損傷が少ないことが分かった。
　培養２１目にサンプルＡ－ＴＧＰ、サンプルＡ－ＤＭＥＭ、サンプルＢ－ＴＧＰおよびサンプルＢ－ＤＭＥＭの組織片をそれぞれ４℃ＰＢＳで洗浄した。サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃、５時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、２ｍｌＰＢＳに浮遊させた。それぞれのサンプルから１００μｌを分取し、０．４％トリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞算定盤で計数した。結果を表３に示す。
表中のＥ：Ｎは上皮細胞：非上皮細胞の比率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　サンプルＡ（ＴＧＰ）で輸送した後にＴＧＰ培養したものが最も高い細胞数を示した。
　サンプルＢ（ＥＣＳ）で輸送した後に、平面培養したものが最も細胞数が低かった。また実施例２において輸送後の生細胞数が低かったサンプルＢでもＴＧＰ培養すると十分な生細胞数が確認された。このことからＴＧＰは上皮組織中の細胞の増殖能を高め、特に生細胞数が減少した上皮組織の増殖能をも回復させることが分かった。
　さらにＴＧＰ培養したものは、いずれも非上皮細胞の割合が高くなることが明らかとなった。上皮細胞は多角形の畳石のような形態を有しているところ、非上皮細胞は上皮幹細胞の特徴である丸い形態をしており、増殖した非上皮細胞は上皮幹細胞であると考えられた。したがって、ＴＧＰによる上皮組織の培養は、上皮組織中の上皮幹細胞を増殖させることも分かった。
実施例３－１：角膜の輸送（ＭＫ液）
　ヒトの死体から眼球を採取し、滅菌したＩ－ＰＶＰ（ヨウ素－ポリビニルピロリドン）０．５％溶液に２分間浸漬し、定法にしたがって角膜を２枚採取し、抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml)、penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)含有ＰＢＳに３０分間浸漬した。次いで、製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＭＫ液(５％デキストラン４０含有Ｍ１９９(Thermo Fisher cat no.11150-067)に４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成した。２枚の角膜のうち１枚を角膜保存容器へ移し、ＴＧＰ溶液を角膜全体が浸るように添加して３０℃で１時間ゲル化させ、１０ｍｌのＭＫ液を添加した。５～４２℃で９６時間輸送した（サンプルＡ）。角膜のうちもう一枚を角膜保存容器へ移し、ＭＫ液を１０ｍｌ添加し（サンプルＢ）４℃に維持して９６時間輸送した。サンプルＡおよびＢの角膜の保存前および９６時間の輸送後に鏡面顕微鏡（ケラトアナライザーＥＫＡ－１０、コーナン・メディカル）およびソフトウェア（ＫＳＳ－ＥＢ１０、コーナン・メディカル）を使用して観察した。結果を図４に示す。上段の２つの写真は、保存前（０時間）を示し、下段の２つの写真は９６時間の輸送後の角膜組織を示す。
９６時間の保存後にサンプルＡでは角膜の品質の特徴である良質の内皮細胞が多く存在することが明らかとなった。一方、サンプルＢでは９６時間後に生きた内皮細胞は確認されなかった。したがって、サンプルＢと比較して、サンプルＡでは角膜が良好に保存された。したがって、角膜の輸送にはＴＧＰが適していることが明らかとなった。
実施例３－２：角膜の輸送（ＯｐｔｉｓｏｌＧＳ液）
　別の検体から実施例３－１と同じ手順で角膜を２枚採取した。実施例３－１でＭＫ液を使用した代わりにＯｐｔｉｓｏｌＧＳ液（OptiSol-GS Corneal Storage Media (Box of 12) (Bausch & Lomb 50006-OPT)）を使用した以外は同じ手順でサンプルＡおよびＢを作成して輸送した。サンプルＡおよびＢの角膜の保存前および９６時間の輸送後に鏡面顕微鏡（ケラトアナライザーＥＫＡ－１０、コーナン・メディカル）およびソフトウェア（ＫＳＳ－ＥＢ１０、コーナン・メディカル）で観察した。結果を図５に示す。上段の２つの写真は、保存前（０時間）を示し、下段の２つの写真は９６時間の輸送後の角膜組織を示す。９６時間の保存後のンプルＡでは角膜の品質の特徴である良質の内皮細胞が多く存在することが明らかとなった。一方、サンプルＢでは４日目に生きた内皮細胞は確認できなかった。したがって、サンプルＢと比較して、サンプルＡでは角膜が良好に保存された。したがって、角膜の輸送にはＴＧＰが適していることが明らかとなった。
実施例４―１：角膜輪部の輸送
　角膜の代わりに別の検体から角膜輪部の組織片を採取し、角膜保存容器の代わりに１０ｍｌ試験管を使用した以外は、実施例３－１と同じ手順でサンプルＡおよびＢを作成し角膜輪部を輸送した。輸送したサンプルＡおよびＢの角膜輪部を４℃ＰＢＳで洗浄した。ＤＭＥＭを４℃で溶解した１０％ＴＧＰ溶液を作成し、サンプルＡおよびＢの一部の組織片をそれぞれ含む２５ｃｍ２フラスコへ１０ｍｌ添加し、ピペッティングして組織片を均一に分散させた。１０％血清含有ＤＭＥＭを７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で１４日培養した。培養時の組織の増殖性を倒立顕微鏡（倍率１０倍）で観察した。結果を図６に示す。
　サンプルＢでは、７日目で移植片から細胞の増殖が確認されたのに対して、サンプルＡでは２日日目で移植片から細胞の良好な増殖が確認された。このことからＴＧＰで輸送した場合、ＭＫ培地で輸送するよりも角膜輪部に損傷を与えないことが分かった。したがって、角膜輪部の輸送にはＴＧＰが適していることが明らかとなった。
実施例５：腸管組織の輸送
　ヒルシュスプルング病によって腸切除を受けたヒトの大腸の腸管組織を3ｍｍ３採取し、これを細切し組織片にした。抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml)、penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)含有ＰＢＳに３０分間浸漬した。各組織片を４℃ＰＢＳで２回遠心分離して洗浄した。各組織片を均等に切断して、１０ｍｌ試験管２本（試験管ＡおよびＢ）へ添加した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２に４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた後５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で２時間輸送した。サンプルＢ：ＰＢＳを組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で２時間輸送した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、９ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２に４℃で溶解したＴＧＰ溶液（メビオール２５ｃｍ２フラスコ）を添加して細胞を均一に分散した。これを２５ｃｍ２フラスコに添加して３０℃で１時間ゲル化させた後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で２週間培養した（サンプルＡ－ＴＧＰ、サンプルＢ－ＴＧＰ）。培養時の細胞の増殖性を倒立顕微鏡（倍率１０倍）で確認し、その後トリパンブルーで生細胞数を測定した。観察結果を図７に示す。サンプルＡでは腸管神経幹細胞がニューロスフェア様体（Neurosphere like bodies）として良好に増殖したが、サンプルＢでは増殖が乏しかった。培養後の細胞数はサンプルＡがサンプルＢと比較して約２０～３０倍高かった。このことからＴＧＰが腸管組織の輸送に適していることが明らかとなった。
実施例６：血管組織の輸送
　ヒトの死体から伏在静脈組織を採取し、これを細切し組織片にした。抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml)、penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)含有ＰＢＳに３０分間浸漬した。各組織片を４℃ＰＢＳで２回遠心分離して洗浄した。各組織片を均等に切断して、１０ｍｌ試験管２本（試験管ＡおよびＢ）へ添加した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＭ１９９に4℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた後５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で２４時間輸送した。
　サンプルＢ：ＨＢＳＳを組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で２時間輸送した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、９ｍｌのＭ１９９に４℃で溶解したＴＧＰ溶液（メビオール２５ｃｍ２フラスコ）を添加して細胞を均一に分散した。これを２５ｃｍ２フラスコに添加して３０℃で１時間ゲル化させた後、１０％血清含有Ｍ１９９を７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で１週間培養した（サンプルＡ－ＴＧＰ、サンプルＢ－ＴＧＰ）。培養時の細胞の増殖性を倒立顕微鏡（倍率１０倍）で確認し、その後トリパンブルーで生細胞数を測定した。観察結果を図８に示す。
　サンプルＡでは良好な増殖が観察され細胞の形状も比較的大きく良好であった。サンプルＢでは増殖が乏しく、細胞の形態も小さかった。このことからＴＧＰが血管組織の輸送に適していることが明らかとなった。
実施例７：歯髄組織の輸送
　ヒトの死体から伏在静脈組織を採取した代わりに、健常なヒト15人から得られた２０の剥離した落葉性切歯、臼歯および犬歯からの歯髄組織を採取した以外は実施例６と同じ手順で採取した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた後５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で２４、４８および９６時間輸送した。
　サンプルＢ：ＰＢＳを組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で２時間輸送した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解したＴＧＰ溶液（メビオール２５ｃｍ２フラスコ）を添加して歯髄組織を均一に分散した。これを２５ｃｍ２フラスコに添加して２０℃で１時間ゲル化させた後、１０％血清含有ＤＭＥＭ７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で２週間培養した。培養時の細胞の増殖性を倒立顕微鏡（倍率１０倍）で確認した。結果を図９に示す。
　また、サンプルＡおよびＢを２１日培養した後の歯髄組織のＨ＆Ｅ染色した。サンプルＡの歯髄組織のＨ＆Ｅ染色を図１０に示す。
　倒立顕微鏡の観察によりサンプルＢに比べてサンプルＡでは培養した組織から細胞の良好な増殖が観察された。また、２１日目のサンプルＡのＨ＆Ｅでは健全な歯髄組織が確認されたが、サンプルＢでは染色された歯髄組織が観察されなかった。このことからＴＧＰが歯髄組織の輸送に適していることが明らかとなった。
実施例８：包皮組織の保存
　割礼されたヒト陰茎の包皮組織１ｃｍ２を採取し、これを細切し組織片にした。抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml)、penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)含有ＰＢＳに３０分間浸漬した。各組織片を４℃ＰＢＳで２回遠心分離して洗浄した。各組織片を均等に切断して、１０ｍｌ試験管２本（試験管ＡおよびＢ）へ添加した。
　サンプルＡ：製造例で作成したＴＧＰ１ｇを９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、これを組織片が入った試験管Ａに１０ｍｌ添加し、３０℃で１時間ゲル化させた後５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で２４時間静置して保存した。
　サンプルＢ：ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を組織片が入った試験管Ｂに１０ｍｌ添加し、４℃で２４時間静置して保存した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、９ｍｌのＤＭＥＭに４℃で溶解したＴＧＰ溶液（メビオール２５ｃｍ２フラスコ）を添加して細胞を均一に分散した。これを２５ｃｍ２フラスコに添加して３０℃で1時間ゲル化させた後、１０％血清含有ＤＭＥＭ７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で２週間培養した。培養時の細胞の増殖性を倒立顕微鏡（倍率１０倍）で確認し、その後トリパンブルーで生細胞数を測定した。顕微鏡像を図１１に示す。
　サンプルＡでは、サンプルＢと比較して、細胞が組織から出て成長し始め、７日目にはサンプルＢよりも５～８倍多くの細胞を有していた。このことからＴＧＰが皮膚組織の保存に適していることが明らかとなった。
実施例９：大網組織の輸送および培養
　包皮組織の代わりにヒト死体から採取された大網組織を２－３ｃｍ２を採取し、ＤＭＥＭの代わりにＭ１９９を使用した以外は、実施例８と同じ手順でサンプルを作成し、次の条件で輸送した。
　サンプルＡ：５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で１２時間輸送した。
　サンプルＢ：４℃で１２時間輸送した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）した。９ｍｌのＭ１９９をＴＧＰ溶液（メビオール２５ｃｍ２フラスコ）へ添加して作成したＴＧＰ溶液入りのフラスコへサンプルＡの分散した細胞を添加して均一に分散した。これを２５ｃｍ２フラスコに添加して３０℃で１時間ゲル化させた後、１０％血清含有Ｍ１９９を７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器で１０日培養した。サンプルＢの分散した細胞は、１０ｍｌのＭ１９９を添加して５％炭酸ガス培養器で２週間培養した。培養時の細胞の増殖性を１０日目に倒立顕微鏡（倍率１０倍）で確認した。結果を図１２に示す。
　サンプルＡではサンプルＢと比較して細胞の成長が良好であり、細胞数として約１５～２０倍の細胞が観察された。このことからＴＧＰが大網組織の輸送に適していることが明らかとなった。
実施例１０：ヒト胎児肝細胞の輸送
　大網組織の代わりにヒト胎児から採取された肝臓組織から２～３ｃｍ２の６つの組織片を使用し、Ｍ１９９の代わりにＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ－１２を使用した以外は実施例９と同じ手順でサンプルＡおよびＢを３つずつ作成し、作成し、次の条件で輸送した。
　サンプルＡ：５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で４～８時間輸送した。
　サンプルＢ：５～４２℃の範囲で変動し得る温度（外気温）で４～８時間輸送した。
　サンプルＡおよびＢの組織片を４℃ＰＢＳで洗浄した後、それぞれをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＩ液（１ｍｇ／ｍｌ）で３７Ｃ°、１９時間消化した。１００μｍのセルストレイナでろ過した後、遠心分離（１５０ｒｐｍ、５分間）し、２ｍｌＰＢＳに浮遊させた。それぞれの試験管から１００μｌを分取し、０．４％トリパンブルー溶液４００μＬを添加して細胞算定盤で計数した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　ＰＢＳに比べてＴＧＰで輸送した場合、いずれも高い生細胞数が確認された。
このことからＴＧＰは肝臓組織に損傷を与えずに輸送することができる。したがってＴＧＰは肝臓組織の輸送に適していることが分かった。
　実施例１～１０の結果から、ＴＧＰは様々な生体材料の保存および輸送に適していることが分かった。

Claims (8)

  1. 　熱可逆性ポリマー含む、生体材料の保存用組成物。
  2. 　一定のまたは変動する温度での保存用である、請求項１に記載の保存用組成物。
  3. 　一定のまたは変動する温度が、実質的に細胞が増殖しない温度である、請求項２に記載に記載の保存用組成物。
  4. 　実質的に細胞が増殖しない温度が、４～３０℃である、請求項３に記載に記載の保存用組成物。
  5. 　生体材料が、軟骨組織、口腔粘膜組織、角膜組織、輪部組織、歯髄組織、血管組織、消化管粘膜組織、大網組織、皮膚組織、肝臓組織からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の保存用組成物。
  6. 　生体材料が、軟骨組織、口腔粘膜組織、角膜組織、輪部組織、歯髄組織、血管組織、消化管粘膜組織、大網組織、皮膚組織、肝臓組織からなる群から選択される組織に含まれる体細胞、前駆細胞または幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の保存用組成物。
  7. 　熱可逆性ポリマーが、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる、曇点を有する複数のブロックおよび親水性のブロックが結合してなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の保存用組成物。
  8. 　輸送用にも使用可能である、請求項１～７のいずれか一項に記載の保存用組成物。
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