JP2018126091A - 保存対象物の保存方法、ゾルゲル転移体およびこれを含む保存剤 - Google Patents
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Description
さらに上記ゼラチンは、豚腱コラーゲン由来であることが好ましい。
本発明に係る保存剤は、上記ゾルゲル転移体と、血清とを含む。
上記保存剤は、pH6.5〜7.5で等張作用を示すことが好ましい。
本発明に係る保存対象物の保存方法は、ゾルゲル転移体と保存対象物とを含むゾル状態の第1保存液を得る第1工程と、この第1工程の後、上記第1保存液を23℃以上42℃以下の条件下に載置することにより、ゾル状態から1時間で貯蔵弾性率(以下、単に「G’」とも記す)が100Pa以上のゲル状態に上記第1保存液をゲル化し、保存対象物の一部または全部をゾルゲル転移体で包囲する第2工程と、この第2工程の後、上記第1保存液のゲル状態を温度制御により、貯蔵弾性率が200Pa以上のゲル状態として維持し、上記保存対象物を保存する第3工程とを含む。保存対象物の保存方法は、上記第3工程の後、上記第1保存液を温度制御により、ゲル状態から貯蔵弾性率が50Pa未満のゾル状態にゾル化する第4工程を含むことができる。
第1工程では、ゾルゲル転移体と保存対象物とを含むゾル状態の第1保存液を得る。この第1保存液を得る方法は、特に限定されるべきではない。第1保存液は、所定の容器中に存する保存対象物へゾルゲル転移体を添加することにより得ることができ、所定の容器中に存するゾルゲル転移体へ保存対象物を添加することによって得ることができる。所定の容器へ、保存対象物およびゾルゲル転移体を同時に添加することによっても得ることができる。ゾルゲル転移体と保存対象物とを含むゾル状態の第1保存液を得た後は、これを撹拌混合することなく静置することが好ましい。本明細書において「静置」とは、物体を載置するときに、特に静止した状態に載置することをいう。
第2工程では、第1工程の後、第1保存液を23℃以上42℃以下の条件下に載置することにより、ゾル状態から1時間で貯蔵弾性率(G’)が100Pa以上のゲル状態に第1保存液をゲル化し、保存対象物の一部または全部をゾルゲル転移体で包囲する。したがって第2工程では、第1保存液が静的な環境下でゲル形状を維持する硬さを短時間で有することができる。これにより、保存対象物がたとえば細胞である場合、ゲル状態の第1保存液の内部に細胞を迅速に包埋することができ、細胞の形態を高く維持することができる。ここで、ゾル状態の第1保存液をG’が100Pa以上のゲル状態にゲル化する時間の開始点は、第1工程が終了した時点である。第1工程が終了した時点とは、ゾルゲル転移体と保存対象物とを添加し終わり、第2工程における温度制御を開始する時点をいう。さらに、本明細書において「包埋する」とは、保存対象物の一部または全部をゲル状態の第1保存液の内部に包んで埋め込んだ状態にすることをいう。
第3工程では、第2工程の後、第1保存液のゲル状態を温度制御により、貯蔵弾性率(G’)が200Pa以上のゲル状態として維持し、保存対象物を保存する。すなわち第3工程では、G’が100Paに達したゲル状態の第1保存液を、温度制御によりG’を200Pa以上に上昇させ、その状態で維持する。第1保存液のG’は、200Pa以上に上昇した後、温度を一定としても時間の経過とともに僅かずつ増加するが、200Pa以上であること自体は維持される。これにより、保存対象物がたとえば細胞である場合、ゲル状態の第1保存液の内部において細胞の損傷が抑制された状態で保存することが可能となって細胞の形態を高く維持することができる。
第4工程では、第3工程の後、第1保存液を温度制御により、ゲル状態から貯蔵弾性率(G’)が50Pa未満のゾル状態にゾル化する。すなわち、上記第3工程においてG’を200Pa以上に上昇させたゲル状態の第1保存液を温度制御により、G’が50Pa未満のゾル状態にゾル化する。これによりゲル状態の第1保存液の内部に保存されていた保存対象物を、外部へ脱して使用に供することが可能となる。
本発明に係る保存対象物の保存方法は、短時間で保存対象物をゲル状態の第1保存液の内部に包埋し、かつ包埋後もゲル状態の第1保存液の内部で保存対象物を損傷させることなく安定的に保存することができる。近年の細胞再生工学の分野では、自己または他者由来の細胞を公知の細胞培養技術により培養して形成した薄膜状の細胞塊である細胞シートを自己または他者へ移植する試みが行われている。このとき細胞シートは、これが作製された施設から移植の行為が行われる施設まで、損傷することなく安定的に保存されて輸送される必要がある。したがって、本発明に係る保存対象物の保存方法により、細胞シートを保存対象物として用いた場合、短時間で細胞シートをゲル状態の第1保存液の内部に包埋し、かつ包埋後もゲル状態の第1保存液の内部で細胞シートを損傷させることなく安定的に保存し、これが移植される施設まで輸送することができる。第1保存液のうち保存対象物を除いた部分の材質は、細胞に影響を与えない生体適合性のある材料であることが好ましい。
以上より、本発明に係る保存対象物の保存方法は、短時間でゲルの内部に細胞を包埋することができ、かつ包埋後もゲルの内部で細胞を安定的に保存することができる。さらにゾルゲル転移体のゲルの内部に保存していた細胞を、その状態から脱して使用に供することもできる。
本発明に係るゾルゲル転移体は、上述した保存対象物の保存に用いられる。ゾルゲル転移体は、上述した保存対象物とともに第1保存液を形成する。この第1保存液は、23℃以上42℃以下の条件下に載置することによって、ゾル状態から1時間で貯蔵弾性率が100Pa以上のゲル状態にゲル化され、かつゲル状態で貯蔵弾性率が200Pa以上を示し得る。これにより、ゾルゲル転移体は、短時間でゲルの内部に保存対象物を包埋することができ、かつ包埋後もゲルの内部で保存対象物を安定的に保存することができる。ゾルゲル転移体は、上記構成を満たす限り、その材質が特に限定されるべきではないが、保存対象物が細胞である場合、細胞に対して毒性を呈しない生体適合性材料であることが好ましい。そのような材質としてゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチンの合成物などが挙げられる。ゾルゲル転移体は、ゼラチンであることが最も好ましい。本発明では、たとえばゾルゲル転移体が後述するゼラチンであって、保存対象物が細胞である場合、20℃以上42℃未満においてゲルの内部に3日間(72時間)以上にわたり、80%以上の生存率で当該細胞を保存することができる。細胞の生存率の測定方法は後述する方法を用いることができる。
本発明に係るゾルゲル転移体は、上述のとおり好ましくはゼラチンである。このゼラチンは、たとえば牛、豚、鶏、ダチョウ、魚などの動物に由来するコラーゲンを原料とすることができる。好ましくは牛、豚、鶏、ダチョウに由来するコラーゲンを原料とし、より好ましくは豚に由来するコラーゲンを原料とする。最も好ましくはゼラチンは、豚腱コラーゲン由来である。
本発明に係る保存剤は、上述したゾルゲル転移体と、Ca2+イオンとを含む。あるいは保存剤は、上述したゾルゲル転移体と、血清とを含む。保存剤は、上述したゾルゲル転移体およびCa2+イオンに加え、Mg2+イオンを含むことが好ましい。さらに、保存剤は、上述したゾルゲル転移体および血清に加え、Ca2+イオンおよびMg2+イオンを含むことがより好ましい。加えて保存剤は、pH6.5〜7.5で等張作用を示すことが好ましい。等張作用の「等張」とは、半透膜を介した2つの液体の浸透圧が等しいことをいい、本明細書では、細胞シートにおける細胞質と保存剤および第1保存液との浸透圧が等しいことを指す。
上述のとおり本発明では、ゾルゲル転移体がゼラチンであって、保存対象物が細胞である場合、20℃以上42℃未満においてゲルの内部に、たとえば3日(72時間)以上にわたり、80%以上の生存率で保存することができる。本発明において、たとえば3日(72時間)静置後の細胞の生存率評価は、次のようにして行なうことができる。なお、次の説明では、マウス線維芽細胞(NIH3T3)を対象とする。すなわち、ゼラチンを所定の緩衝液と混合し、ゼラチンの濃度が3〜6質量%となる上記保存剤を調製するとともに、37℃に保温したこの保存剤1.5mLを、マウス線維芽細胞が30〜100%コンフルエントな状態で培養された培養皿に投入することによりゾル状態の第1保存液を得る。この培養皿を、第1保存液の実用的なゲル化温度に保温したサーモプレート上に40分間静置し、その後室温で20分間静置することにより第1保存液をゲル状態にゲル化し、第1保存液の内部に細胞シートを包埋する。その後、23℃の環境に3日間(72時間)静置する。3日(72時間経過)後、上記培養皿に対してCell Counting Kit 8(セルカウンティングキット(登録商標)、株式会社同仁化学研究所製)を用いて水溶性テトラゾリウム塩(WST−8)を添加し、37℃、5%CO2下で4時間静置する。これにより、ゲル状態の第1保存液に包埋されている細胞中の脱水酵素によって産生されるNADHが、1−Methoxy PMSを介してWST−8を橙色のホルマザンに還元するため、第1保存液が染色される。続いて、染色された第1保存液(以下、「3日静置後の試料」とも記す)を96wellマイクロプレート(コーニング社製)に移し、マイクロプレートリーダー(商品名:「サンライズ」、テカン社製)で450nmの吸光度測定を行なう。さらに、無細胞の試料、および上述したマウス線維芽細胞と同数の細胞を包埋した直後の試料(以下、「包埋した直後の試料」とも記す)に対しても、同じ吸光度測定を行なう。
細胞生存率(%)={(3日静置後の吸光度)−(無細胞の吸光度)}/{(無細胞の吸光度)+(包埋直後の吸光度)}×100。
細胞生存率(%)={(任意時間静置後の吸光度)−(無細胞の吸光度)}/{(無細胞の吸光度)+(包埋直後の吸光度)}×100。
以上より本発明に係るゾルゲル転移体は、短時間でゲルの内部に細胞を包埋することができ、かつ包埋後もゲルの内部で細胞を、その損傷(たとえば、形態変化)を抑制して安定的に保存することができる。
<ゾルゲル転移体を含む溶液の調製>
(ゼラチンのマスター溶液の調製)
まず、豚腱由来アテロコラーゲンを0.3質量%含むpH3.0の水溶液(新田ゼラチン株式会社製)を準備した。この水溶液に対して非分解型ゼラチンの調製法を用いることによりコラーゲンを熱変性し、さらに水溶液を乾燥させてゾルゲル転移体としてのゼラチンを調製した。このゼラチンから、後述する各種の試験に用いる実施例および比較例を調製するため、超純水を溶媒とした8質量%のゼラチン溶液(マスター溶液)を準備した。
実施例1〜2および比較例1の保存剤は、次のとおりに準備した。すなわち、上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、3質量%のゼラチン溶液を調製し、これを実施例1の保存剤として準備した。上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、6質量%のゼラチン溶液を調製し、これを実施例2の保存剤として準備した。上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、1.5質量%のゼラチン溶液を調製し、これを比較例1の保存剤として準備した。
まず、37℃に保温した実施例1〜2の保存剤(各3mL)を、上述した動的粘弾性測定装置に付帯するフタ付センサー(DC60/1Ti、内径60mm、コーン角度1°)に設置した。次に、37℃からそれぞれの実用的なゲル化温度に−1.2℃/分の速度で冷却し、この実用的なゲル化温度で40分間静置することによりゲル化した。その後、それぞれを実用的なゲル化温度から23℃に冷却し、23℃で20分間静置した。このとき(静置後1時間)の実施例1〜2のG’を、上記フタ付センサーを用いて測定した。37℃に保温した比較例1の保存剤(3mL)については、実用的なゲル化温度が室温未満であったため、上述した動的粘弾性測定装置のフタ付センサーに設置した後、37℃から23℃に−1.2℃/分の速度で冷却し、この23℃で60分間静置した。このとき(静置後1時間)のG’を、実施例1〜2と同じ方法により測定した。なお、実用的なゲル化温度の用語の意味については、上述したとおりである。
ここで実施例1〜2の保存剤を用いて細胞輸送を行う場合、各保存剤のG’は、次の4段階(1)〜(4)で測定することにより、その変化を把握することが好ましい。なお、各段階でのG’は、上述した動的粘弾性測定装置を用い、上記装置に付帯するフタ付センサー(DC60/1Ti、内径60mm、コーン角度1°)により測定することが好ましい。
(2)37℃から各保存液の実用的なゲル化温度に冷却(−1.2℃/分)し、40分静置した後のG’
(3)各保存剤の実用的なゲル化温度から23℃に冷却(−1.2℃/分)もしくは加温(1.2℃/分)し、20分静置した後のG’
(4)23℃から37℃に加温(1.2℃/分)し、60分静置した後のG’。
さらに、マスター溶液から調製される他のゼラチン濃度からなる保存剤のG’については、実施例1〜2および比較例1の各保存剤のG’の測定値に基づいて、線形近似により算出することができる。したがって、マスター溶液から調製される他のゼラチン濃度からなる保存剤において、上述した4段階(1)〜(4)のG’は、実施例1〜2および比較例1の各保存剤の各段階でのG’の測定値に基づいて求めることができる。
以下、各種の試験(試験1〜6)を行なったので、その試験の内容および結果について説明する。
試験1では、D-PBS(+)に浸漬した細胞を23℃で静置し、時間経過とともに変化する細胞形態および細胞骨格を観察することにより、保存剤、およびこの保存剤と保存対象物とを含む第1保存液のゲル化に費やすことが可能な時間を評価した。
(実施例1〜4および比較例1〜3の保存剤の調製)
試験2〜5に用いる実施例1〜2および比較例1の保存剤は、上述のとおりに調整して準備した。実施例3の保存剤は、上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、4質量%のゼラチン溶液を調製して準備した。実施例4の保存剤は、上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、5質量%のゼラチン溶液を調製して準備した。比較例2の保存剤は、上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、2質量%のゼラチン溶液を調製して準備した。比較例3の保存剤は、上記マスター溶液をD-PBS(+)を用いて希釈することにより、1質量%のゼラチン溶液を調製して準備した。
実施例1〜2および比較例1の保存剤における静置後1時間のG’は上述したとおりである。実施例3、4および比較例2の保存剤における静置後1時間のG’については、実施例1〜2および比較例1の保存剤における静置後1時間のG’の測定値に基づいて、線形近似により算出した。その結果を表2に示す。ただし、比較例1の保存剤における静置後1時間のG’については、表2への記載を省略した。
試験2では、37℃に保温した実施例1、2および比較例2の保存剤(各1.5mL)を、マウス線維芽細胞(NIH3T3)が50%コンフルエントになるまで培養されているφ35mmの培養皿(コーニング社製)へ添加した(第1工程)。さらに、上記培養皿を実用的なゲル化温度に保温したサーモプレート上に40分間静置し、その後20分間、サーモプレートを室温(23℃)として維持した。これにより実施例1、3および比較例2の保存剤をゲル化し、そのゲルの内部に上記細胞を包埋した(第2工程)。その後、上記培養皿を23℃の環境で3日間静置した(第3工程)。その上で、3日間保存後における各培養皿での細胞形態の変化とともに、培養皿から細胞が剥離するか否かを試験1と同じ方法により倒立顕微鏡で観察した。その結果を表2に示す。
試験6では、保存剤が血清、Ca2+イオン、Mg2+イオンなどを含有するか否かによって、細胞形態に影響を及ぼすかどうかについて評価した。具体的には、まず上記マスター溶液をD-PBS(-)を用いて希釈することにより3質量%のゼラチン溶液を実施例5の保存剤として調製した。なお実施例5の保存剤は、上記マスター溶液をD-PBS(-)を用いて希釈して調製した点において実施例1の保存剤と異なる。この実施例5の保存剤に対し、下記表3に示す条件1〜10の下、血清、Ca2+イオン、Mg2+イオンをそれぞれ添加することにより、10種類の保存剤を調製した。
Claims (9)
- ゾルゲル転移体と保存対象物とを含むゾル状態の第1保存液を得る第1工程と、
前記第1工程の後、前記第1保存液を23℃以上42℃以下の条件下で載置することにより、ゾル状態から1時間で貯蔵弾性率が100Pa以上のゲル状態に前記第1保存液をゲル化し、前記保存対象物の一部または全部を前記ゾルゲル転移体で包囲する第2工程と、
前記第2工程の後、前記第1保存液のゲル状態を温度制御により、貯蔵弾性率が200Pa以上のゲル状態として維持し、前記保存対象物を保存する第3工程とを含む、保存対象物の保存方法。 - 前記第3工程の後、前記第1保存液を温度制御により、ゲル状態から貯蔵弾性率が50Pa未満のゾル状態にゾル化する第4工程を含む、請求項1に記載の保存対象物の保存方法。
- 保存対象物の保存に用いられるゾルゲル転移体であって、
前記ゾルゲル転移体は、前記保存対象物とともに第1保存液を形成し、
前記第1保存液は、23℃以上42℃以下の条件下で載置することによってゾル状態から1時間で貯蔵弾性率が100Pa以上のゲル状態にゲル化され、かつゲル状態で貯蔵弾性率が200Pa以上を示し得る、ゾルゲル転移体。 - 前記ゾルゲル転移体は、ゼラチンである、請求項3に記載のゾルゲル転移体。
- 前記ゼラチンは、豚腱コラーゲン由来である、請求項4に記載のゾルゲル転移体。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のゾルゲル転移体と、
Ca2+イオンとを含む、保存剤。 - 請求項3〜5のいずれかに記載のゾルゲル転移体と、
血清とを含む、保存剤。 - 請求項3〜5のいずれかに記載のゾルゲル転移体と、
Ca2+イオンと、
血清とを含む、保存剤。 - 前記保存剤は、pH6.5〜7.5で等張作用を示す、請求項6〜8のいずれかに記載の保存剤。
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