JP7480476B2 - 立体的細胞組織の培養方法及びキット - Google Patents
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Description
[2]前記立体的細胞組織が、細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物中の前記細胞を培養して前記立体的細胞組織を得る工程と、含む方法により製造されたものである、[1]に記載の立体的細胞組織の培養方法。
[3]前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、[2]に記載の立体的細胞組織の培養方法。
[4]前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分の濃度が、0.01mg/mL以上1.0mg/mL未満であり、前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が、0.01mg/mL以上1.0mg/mL未満である、[2]又は[3]に記載の立体的細胞組織の培養方法。
[5]前記細胞を培養して前記立体的細胞組織を得る工程が、前記細胞を、Fibroblast growth factorを含まない培地で培養することにより行われる、[2]~[4]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[6]前記Fibroblast growth factorを含む培地を72時間に1回以上交換する、[1]~[5]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[7]前記Fibroblast growth factorがFGF2である、[1]~[6]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[8]前記Fibroblast growth factorを含む培地中の前記Fibroblast growth factorの濃度が、100pg/mL以上である、[1]~[7]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[9]前記立体的細胞組織中の生細胞の数が、1.5×106個以上である、[1]~[8]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[10]前記立体的細胞組織中の前記生細胞の密度が、4.0×106個/cm2以上である、請求項[1]~[9]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[11]前記立体的細胞組織の厚みが60μm以上である、[1]~[10]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法。
[12][1]~[9]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法により製造される、シート状の立体的細胞組織。
[13][1]~[11]のいずれかに記載の立体的細胞組織の培養方法に用いられ、Fibroblast growth factorを含む、立体的細胞組織の培養用キット。
1実施形態において、本発明は、立体的細胞組織をFibroblast growth factorを含む培地中で培養する工程を含む、前記立体的細胞組織の培養方法を提供する。
(A)細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、
(B)得られた混合物から細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程と、
(C)細胞を培養して立体的細胞組織を得る工程と、
を含む方法によって製造されたものであってもよい。
本実施形態の立体的細胞組織は、生体内の組織の機能を模倣する組織であるため、前記立体的細胞組織の製造方法に用いられる細胞は、不死化された細胞以外の細胞であることが好ましい。
本実施形態においては、組織の厚み方向の断面からなる切片を用いて、細胞数を以下のように測定することができる。当該切片において、所定の大きさ以上の空隙がない領域のうち、立体的細胞組織の厚みが最大になる位置(最大地点)を決定する。厚みの最大値付近を含む幅50μmの短冊状(組織の天面から底面までを含む)の領域を測定領域として、当該測定領域中に含まれる細胞核の数を計数する。当該測定領域には空隙を含まないようにする。なお、空隙の所定の大きさとは、最大径50μm以上をいう。空隙の最大径とは空隙が矩形の場合は長辺、球形の場合は直径、楕円形の場合は長径、不定形の場合は略楕円に近似した場合の長径をいう。なお、HE染色した切片上で空隙は染色されない。但し、厚みの最大値を含む領域の天面が凸形状の場合、組織が基材から剥離している場合もある。このような場合はその最大値近傍でかつ天面が比較的平坦な領域を測定領域とする。この場合、厚みの最大値付近を含む幅方向100μm~650μmの領域を測定領域とする。
計数した当該測定領域に少なくとも一部分が含まれている細胞核は、測定領域に含まれ
る細胞核として計数する。計数した細胞数から、厚み方向100μm、幅方向50μmの
面積あたりの前記細胞数を算出する。
1実施形態において、本発明は、上述した立体的細胞組織の培養方法により製造される、立体的細胞組織を提供する。立体的細胞組織の形状は特に限定されず、シート状であってもよく、塊状であってもよく、球状であってもよい。
1実施形態において、本発明は、上述した立体的細胞組織の培養方法に用いられ、Fibroblast growth factorを含む、立体的細胞組織の培養用キットを提供する。
囲を限定するものではない。以下の実施例において、特に説明がない限り、コラーゲンとしてコラーゲンIを用いた。
<立体的細胞組織の構築および培養>
(サンプルA)
2.0×106細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)および1.0×104細胞のRFP導入ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、150μLの0.2mg/mL ヘパリン/50mM トリス-塩酸緩衝液(pH7.4)と、150μLの0.2mg/mL コラーゲン/5mM 酢酸溶液(pH3.7)溶液との等量混合液に懸濁した。得られた混合物を室温、1000×gで1分間、遠心し、粘稠体を得た。得られた粘稠体を10%FBS含有DMEMに懸濁した。得られた懸濁液の全量を24well セルカルチャーインサート(底面積0.33cm2)内に播種し、室温、400×g(重力加速度)で1分間、遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞集合体を形成した。次いで、10%FBS含有DMEMをセルカルチャーインサートの内側および外側の合計液量が2mL超となる様に添加し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて培養した(この培養を開始した時点を培養開始時点とする)。培養開始時点から24時間培養後、5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から、48時間後、120時間後、144時間後、168時間後に、同様にして5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
培養開始時点から192時間後の時点での立体的細胞組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋切片を作製した。パラフィン包埋切片の作製は公知の方法に従った。作製した切片について、抗CD31抗体による組織免疫染色を行った。組織免疫染色は公知の方法に従った。
培養開始時点から192時間後の時点での立体的細胞組織について、当該セルカルチャーインサート内の培地を除いた後、PBSを適量添加し、その後、液体成分を十分に除去した。この洗浄操作を繰り返し3回実施した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を200μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で15分間インキュベートした。その後、溶液全量を回収用1.5mLチューブに移した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を200μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートし、その後同様にして溶液全量を回収用1.5mLチューブに移した。更に、トランズウェルセルカルチャーインサートにPBSを200μL添加し、攪拌した後、その溶液全量を回収した。回収溶液全量に対し、DMEM400μLを加え、合計1mLの分散液を得た。
得られた立体的細胞組織の分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、RFPの蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)を使用して行った。
サンプルAと同様にして作成した立体的細胞組織について、サンプルAと同様に10%FBS含有DMEMで24時間培養した後、15ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、48時間後、120時間後、144時間後、168時間後に、同様にして15ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養した立体的細胞組織について、サンプルAと同様にして、免疫組織染色および生細胞数測定を実施した。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
(サンプルC)
サンプルAと同様にして作成した立体的細胞組織について、サンプルAと同様に10%FBS含有DMEMで24時間培養した後、FGFを加えない10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、48時間後、120時間後、144時間後、168時間後に、同様にしてFGFを加えない10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養した立体的細胞組織について、サンプルAと同様にして、免疫組織染色および生細胞数測定を実施した。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
<立体的細胞組織の構築および培養>
(サンプルA)
2.0×106細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)および1.0×104細胞のRFP導入ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、150μLの0.2mg/mL ヘパリン/50mM トリス-塩酸緩衝液(pH7.4)と、150μLの0.2mg/mL コラーゲン/5mM 酢酸溶液(pH3.7)溶液との等量混合液に懸濁した。得られた混合物を室温、1000×gで1分間、遠心し、粘稠体を得た。得られた粘稠体を10%FBS含有DMEMに懸濁した。得られた懸濁液の全量を24well セルカルチャーインサート内に播種し、室温、400×g(重力加速度)で1分間、遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞層を形成した。次いで、10%FBS含有DMEMをセルカルチャーインサートの内側および外側の合計液量が2mL超となる様に添加し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて培養した(この培養を開始した時点を培養開始時点とする)。培養開始時点から24時間培養後、5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、48時間後、72時間後、96時間後、120時間後、144時間後、168時間後に、同様にして5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
培養開始時点から192時間後の時点での立体的細胞組織について、実施例1と同様にして、合計1mLの分散液を得て、当該分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、RFPの蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)を使用して行った。
サンプルAと同様にして作成した立体的細胞組織について、サンプルAと同様に10%FBS含有DMEMで24時間培養した後、5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、72時間後、120時間後、168時間後に、同様にして5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養した立体的細胞組織について、サンプルAと同様にして、生細胞数測定を実施した。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
サンプルAと同様にして作成した立体的細胞組織について、サンプルAと同様に10%FBS含有DMEMで24時間培養した後、5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、96時間後、168時間後に、同様にして5ng/mLのFGF2を含む10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養した立体的細胞組織について、サンプルAと同様にして、生細胞数測定を実施した。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
サンプルAと同様にして作成した立体的細胞組織について、サンプルAと同様に10%FBS含有DMEMで24時間培養した後、FGFを加えない10%FBS含有DMEMに培地交換した。以降、培養開始時点から換算して、48時間後、72時間後、96時間後、120時間後、144時間後、168時間後に、同様にしてFGFを加えない10%FBS含有DMEMによる培地交換を行った。培養した立体的細胞組織について、サンプルAと同様にして、生細胞数測定を実施した。培養終了後、立体的細胞組織の底面積が変化するような外観上の変化(ウェルカルチャーインサートからの剥がれ等)は観察されなかった。
Claims (12)
- 細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程とを含む方法によって製造された立体的細胞組織を、Fibroblast growth factorを含む培地中で培養する工程を含み、前記細胞は少なくとも血管内皮細胞及び線維芽細胞を含む、前記立体的細胞組織の培養方法。
- 前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、 前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分の濃度が、0.01mg/mL以上1.0mg/mL未満であり、
前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が、0.01mg/mL以上1.0mg/mL未満である、請求項1又は2に記載の立体的細胞組織の培養方法。 - 前記細胞を培養して前記立体的細胞組織を得る工程が、前記細胞を、Fibroblast growth factorを含まない培地で培養することにより行われる、請求項1~3のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記Fibroblast growth factorを含む培地を72時間に1回以上交換する、請求項1~4のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記Fibroblast growth factorがFGF2である、請求項1~5のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記Fibroblast growth factorを含む培地中の前記Fibroblast growth factorの濃度が、100pg/mL以上である、請求項1~6のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記立体的細胞組織中の生細胞の数が、1.5×106個以上である、請求項1~7のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記立体的細胞組織中の前記生細胞の密度が、4.0×106個/cm2以上である、請求項8に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 前記立体的細胞組織の厚みが60μm以上である、請求項1~9のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法により製造される、立体的細胞組織。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法に用いられ、Fibroblast growth factorを含む、立体的細胞組織の培養用キット。
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Acta. Biomater.,2017年05月,Vol.54,pp.333-344 |
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