JP6953894B2 - 立体的肝臓組織構造体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 少なくとも肝細胞を含み、2以上の細胞層が厚み方向に積層されている立体的肝臓組織構造体の製造方法であって、
構造体を構成する全細胞の40%以上が肝細胞であり、かつ厚みが150μm以上である立体的肝臓組織構造体を製造することを特徴とする、立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[2] (a)カチオン性緩衝液中で、少なくとも肝細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に、少なくとも肝細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を立体的肝臓組織構造体として得る工程と、
を含むことを特徴とする、前記[1]の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[3] 前記強電解質高分子が、ヘパリン、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群から選択される1種以上である、前記[2]の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[4] 前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカンからなる群から選択される1種以上である、前記[2]又は[3]の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[5] 前記カチオン性緩衝液がトリス−塩酸緩衝液、トリス−マレイン酸緩衝液、ビス−トリス−緩衝液、又はHEPESである、前記[2]〜[4]のいずれかの立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[6] 前記肝細胞が、非がん性細胞である、前記[1]〜[5]のいずれかの立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[7] 得られた立体的肝臓組織構造体の厚みが500μm以下である、前記[1]〜[6]のいずれかの立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[8] 前記工程(a)における前記細胞が、更に、間葉系幹細胞を含む、前記[1]〜[7]のいずれかの立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[9] 前記工程(a)における前記細胞が、更に、間質を構成する細胞を含む、前記[1]〜[8]のいずれかの立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[10] 前記工程(a)における前記細胞が、前記間質を構成する細胞として、更に、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含む、前記[9]の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
[11] 少なくとも肝細胞を含み、2以上の細胞層が厚み方向に積層されており、厚みが150〜500μmである細胞構造体であることを特徴とする、立体的肝臓組織構造体。
[12] 前記立体的肝臓組織構造体を構成する全細胞の40%以上が肝細胞である、前記[11]の立体的肝臓組織構造体。
[13] 前記立体的肝臓組織構造体を構成する細胞として、更に、間葉系幹細胞を含む、前記[11]又は[12]の立体的肝臓組織構造体。
[14] 前記細胞構造体を構成する細胞として、更に、間質を構成する細胞を含む、前記[11]〜[13]のいずれかの立体的肝臓組織構造体。
[15] 前記立体的肝臓組織構造体が、前記間質を構成する細胞として、更に、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含む、前記[14]の立体的肝臓組織構造体。
[16] 前記立体的肝臓組織構造体を構成する全細胞数が、1.2×105個以上である、前記[11]〜[15]のいずれかの立体的肝臓組織構造体。
[17] 前記立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生量が、培養9日目の時点で500ng/mL以上である、前記[11]〜[16]のいずれかの立体的肝臓組織構造体。
[18] 前記立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生量が、構造体構築後から培養11日目の時点で500ng/mL以上ある、前記[11]〜[17]のいずれかの立体的肝臓組織構造体。
[19] 前記[11]〜[18]のいずれかの立体的肝臓組織構造体を、被検化合物を接触させた状態で培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記立体的肝臓組織構造体中の肝細胞の生存率又はアルブミン産生能を指標として、前記被検化合物の肝毒性の有無を評価することを特徴とする、化合物の肝毒性評価方法。
[20] 前記立体的肝臓組織構造体に含まれている全肝細胞が、少なくとも1種類以上の薬物代謝酵素の遺伝子型が共通している、前記[19]の化合物の肝毒性評価方法。
本発明に係る立体的肝臓組織構造体は、少なくとも肝細胞を含み、2以上の細胞層が厚み方向に積層されていることを特徴とする。なお、本発明及び本明細書において、「立体的肝臓組織構造体」とは、少なくとも肝細胞を含む立体的な細胞集合体を意味し、「立体的肝臓組織構造体の厚み」とは、当該構造体の自重方向の長さを意味する。自重方向とは、重力のかかる方向であり、厚み方向ともいう。
(a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程。
また、工程(a)において、血管内皮細胞層5層分の血管内皮細胞と間葉系幹細胞層2層分の間葉系幹細胞を全て混合した混合物を調製し、工程(b)及び(c)を行い、形成された多層の構造体の上に、同様にして調製した肝細胞層5層分の肝細胞を積層することによって、12層分の厚みを有し、血管網構造が構造体内部に散在している構造体の上に肝細胞層が積層された細胞構造体が構築できる。さらに、工程(a)において、血管内皮細胞層5層分の血管内皮細胞と間葉系幹細胞層2層分の間葉系幹細胞と肝細胞層5層分の肝細胞とを全て混合した混合物を調製し、工程(b)及び(c)を行うことにより、12層分の厚みを有し、肝細胞と間葉系幹細胞と血管網構造の両方が構造体内部にそれぞれ独立して散在している細胞構造体が構築できる。
(b’−1)工程(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程と、
(b’−2)細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
(c’)播種した混合物から液体成分を除去し、基材上に細胞の層を形成する工程。
本発明に係る立体的肝臓組織構造体は、良好な肝機能が比較的長期間維持可能であるため、化合物の肝毒性の有無や強度を評価するツールとして好適である。本発明に係る立体的肝臓組織構造体を用いることにより、化合物の肝毒性についてより信頼性の高い評価をすることができる。また、この立体的肝臓組織構造体を用いた化合物の肝毒性評価方法を利用して、肝毒性を有する化合物のスクリーニングを行うこともできる。
肝細胞をヘパリンとコラーゲンで被覆した後に積層して構築された立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生能を調べた。
具体的には、細胞とヘパリン/50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.4)溶液と等量のコラーゲン/50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.4)溶液との混合液に懸濁した。実験を行った細胞の構成を表1に示す。ヒト肝細胞は、フェニックスバイオ社のPXB cellを用い、血管内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC−2517A)を用いた。また、ヒト間葉系幹細胞は、Lonza社から入手したものを(製品型番:PT-2501)、MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium) BulletKit(登録商標)(製品型番:PT-3001)を用いて培養して用いた。
Claims (20)
- 少なくとも肝細胞を含み、2以上の細胞層が厚み方向に積層されている立体的肝臓組織構造体の製造方法であって、
(a)カチオン性緩衝液中で、少なくとも肝細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に、少なくとも肝細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を立体的肝臓組織構造体として得る工程と、
を含み、
構造体を構成する全細胞の40%以上が肝細胞であり、かつ厚みが150μm以上である立体的肝臓組織構造体を製造することを特徴とする、立体的肝臓組織構造体の製造方法。 - 前記工程(b)に代えて、
(b’−1)前記(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程と、
(b’−2)前記(b’−1)の後、細胞培養容器内に前記細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程と
を含む、請求項1に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。 - 前記強電解質高分子が、ヘパリン、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸からなる群から選択される1種以上である、請求項2に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカンからなる群から選択される1種以上である、請求項2又は3に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記カチオン性緩衝液がトリス−塩酸緩衝液、トリス−マレイン酸緩衝液、ビス−トリス緩衝液、又はHEPESである、請求項2〜4のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記肝細胞が、非がん性細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 得られた立体的肝臓組織構造体の厚みが500μm以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記工程(a)における前記細胞が、更に、間葉系幹細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記工程(a)における前記細胞が、更に、間質を構成する細胞を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記工程(a)における前記細胞が、前記間質を構成する細胞として、更に、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含む、請求項9に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 前記工程(a)の後、前記工程(b)の前に、
(a’−1)得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程、及び
(a’−2)前記細胞集合体を溶液に懸濁する工程
を行う、請求項1〜10のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。 - 製造された立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生量が、細胞構造体構築後から培養を開始して培養9日目の時点において、100ng/mL以上である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体の製造方法。
- 少なくとも肝細胞を含み、2以上の細胞層が厚み方向に積層されており、厚みが150〜500μmである細胞構造体であり、
前記立体的肝臓組織構造体を構成する細胞として、更に、間葉系幹細胞と間質を構成する細胞を含み、
アルブミン産生量が、培養9日目の時点で100ng/mL以上であることを特徴とする、立体的肝臓組織構造体。 - 前記立体的肝臓組織構造体を構成する全細胞の40%以上が肝細胞である、請求項13に記載の立体的肝臓組織構造体。
- 前記立体的肝臓組織構造体が、前記間質を構成する細胞として、更に、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含む、請求項13又は14に記載の立体的肝臓組織構造体。
- 前記立体的肝臓組織構造体を構成する全細胞数が、1.2×105個以上である、請求項13〜15のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体。
- 前記立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生量が、培養9日目の時点で500ng/mL以上である、請求項13〜16のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体。
- 前記立体的肝臓組織構造体のアルブミン産生量が、構造体構築後から培養11日目の時点で500ng/mL以上ある、請求項13〜17のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体。
- 請求項13〜18のいずれか一項に記載の立体的肝臓組織構造体を、被検化合物を接触させた状態で培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記立体的肝臓組織構造体中の肝細胞の生存率又はアルブミン産生能を指標として、前記被検化合物の肝毒性の有無を評価することを特徴とする、化合物の肝毒性評価方法。 - 前記立体的肝臓組織構造体に含まれている全肝細胞が、少なくとも1種類以上の薬物代謝酵素の遺伝子型が共通している、請求項19に記載の化合物の肝毒性評価方法。
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