WO2021149661A1 - 立体的細胞構造体の製造方法 - Google Patents

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cells
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靖之 平岡
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凸版印刷株式会社
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
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    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional cell structure.
  • the present application claims priority with respect to Japanese Patent Application No. 2020-006587 filed in Japan on January 20, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • ECM extracellular matrix such as collagen produced by the living body itself
  • Patent Document 1 cells isolated by enzyme treatment or the like are brought into contact with collagen or the like, which is a typical ECM and a water-soluble polymer having a cytoprotective effect, and then as a three-dimensional aggregate.
  • a method of culturing is disclosed. According to this method, a water-soluble polymer gel is formed around the cells during culturing.
  • Patent Document 2 a cell sheet is prepared using a culture dish in which poly (N-isotropylacrylamide) (also referred to as PIPAAm), which is a temperature-responsive resin, is immobilized on the surface, and the prepared cell sheet is laminated.
  • poly (N-isotropylacrylamide) also referred to as PIPAAm
  • PIPAAm poly(N-isotropylacrylamide)
  • Patent Document 3 the step of forming the cell layer and the step of alternately contacting the formed cell layer with the first substance-containing liquid and the second substance-containing liquid are repeated to obtain a nanometer-sized thickness.
  • a method for constructing a three-dimensional cell structure by continuously laminating cell layers via ECM is disclosed. It is said that this method does not require peeling of a single-layer cell sheet or stacking of peeled cell sheets, so that a three-dimensional cell structure can be produced with excellent reproducibility and efficiency.
  • Patent Document 4 discloses a method for constructing a three-dimensional cell structure by preparing coated cells in which the entire surface of each cell is coated with an adhesive membrane and adhering the cells via the adhesive membrane. Has been done.
  • vascular endothelial cells are added to a cell population that constitutes a three-dimensional cell structure.
  • the vascular network (vascular network) is not necessarily formed simply by the three-dimensional cell structure containing vascular endothelial cells, and the environment around the vascular endothelial cells is important for the formation of the vascular network. Is.
  • vascular endothelial growth factor also called VEGF
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the inventors of the present application have previously collected the cells from step A to obtain a mixture in which the cells are suspended in a solution containing at least a cationic buffer, ECM, and a polymer electrolyte, and the resulting mixture.
  • a technique for producing a three-dimensional cell structure which includes a step B of forming a cell aggregate on a substrate and a step C of culturing the cells to obtain a three-dimensional cell structure (patented). See Document 5).
  • Patent No. 2824081 International Publication No. 2002/008387 Japanese Patent No. 4919464 Japanese Patent No. 5850419 Patent No. 6427836
  • Patent Document 5 is applicable without being largely limited to the cell type, is excellent in the ability to form a vascular network when the cell contains endothelial cells, and is also effective in forming a layer structure. It is a method.
  • an object of the present invention is to provide a technique for producing a three-dimensional cell structure having a sufficient thickness and a vascular network.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the extracellular matrix component is collagen or a collagen analog, comprising the step of culturing the cell aggregate in a medium to obtain a three-dimensional cell structure having a thickness of more than 150 ⁇ m and having a vasculature.
  • a method for producing a steric cell structure wherein the polymer electrolyte is a heparin or a heparin analog having a final concentration of 0.001 mg / mL or more in the mixture.
  • the cell aggregate is arranged at a cell density of 1,000 cells / mm 2 to 1,000,000 cells / mm 2 with respect to the area of the culture vessel.
  • the production method according to [1], wherein the seeding and culturing are performed.
  • the production method according to [1] or [2], wherein the total length of the vessels constituting the vessel network is 5,000 ⁇ m / mm 2 or more.
  • [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the endothelial cells are vascular endothelial cells.
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the cell population further contains fibroblasts.
  • [6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein the pH of the mixture is 7.2 to 7.6.
  • [7] The production method according to any one of [1] to [6], wherein the mixture has fluidity.
  • the present invention comprises a step of mixing a cell population containing at least endothelial cells, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte to obtain a mixture, and removing a liquid portion from the mixture to obtain a cell aggregate.
  • the extracellular matrix component is collagen, which comprises a step of culturing the cell aggregate in a medium to obtain a three-dimensional cell structure having a thickness of more than 150 ⁇ m and having a vasculature.
  • a method for producing a three-dimensional cell structure which is a collagen analog and the polymer electrolyte is a heparin or a heparin analog having a final concentration of 0.001 mg / mL or more in the mixture.
  • the manufacturing method of the present embodiment it is possible to provide a technique for manufacturing a three-dimensional cell structure having a sufficient thickness and a vascular network.
  • sufficient thickness means, for example, more than 150 ⁇ m, for example 160 ⁇ m or more, for example 170 ⁇ m or more, for example 180 ⁇ m or more, for example 190 ⁇ m or more, for example more than 200 ⁇ m, for example 210 ⁇ m or more, for example 220 ⁇ m or more, for example 230 ⁇ m or more, for example 240 ⁇ m or more, for example. It may be 250 ⁇ m or more, for example 260 ⁇ m or more, for example 270 ⁇ m or more, for example 280 ⁇ m or more, for example 290 ⁇ m or more, for example 300 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the thickness is not particularly limited, and examples thereof include 3000 ⁇ m, 1000 ⁇ m, and 500 ⁇ m.
  • the upper limit value and the lower limit value of the thickness of the three-dimensional cell structure can be arbitrarily combined, and are preferably more than 150 ⁇ m and 3000 ⁇ m or less, and more preferably 150 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the total length of the vessels constituting the vessel network is 5,000 ⁇ m / mm 2 or more, for example, 5,200 ⁇ m. It may be / mm 2 or more, for example 5,400 ⁇ m / mm 2 or more.
  • the total length of the vessels is not particularly limited, and examples thereof include 5,500 ⁇ m / mm 2 , 8,000 ⁇ m / mm 2 , and 14,000 ⁇ m / mm 2 .
  • Upper and lower limits of the total length of the vessel can be arbitrarily combined, it is preferably 5,000 .mu.m / mm 2 or more 20,000 / mm 2 or less, 5,000 .mu.m / mm 2 or more 10 More preferably, it is 000 ⁇ m / mm 2 or less.
  • the total length of the vessels is measured as the total length of the vessels per unit area of the three-dimensional cell structure when the three-dimensional cell structure is observed from above.
  • the total length of the vessels that make up the vasculature is the number of fluorescent pixels that indicate that it is a vasculature from the image analysis of fluorescence micrographs of the three-dimensional cell structure observed from above. Can be measured by.
  • the morphology of the three-dimensional cell structure is not particularly limited, and for example, even a three-dimensional cell structure formed by culturing cells in a scaffold composed of a natural biopolymer such as collagen or a synthetic polymer. It may be a cell aggregate (also referred to as a spheroid), or it may be a sheet-like cell structure.
  • the "three-dimensional cell structure” means an aggregate of three-dimensional cells including at least one type of cell.
  • the morphology of the three-dimensional cell structure includes biological tissue models such as skin, hair, bone, cartilage, teeth, cornea, blood vessels, lymph vessels, heart, liver, pancreas, nerves, and esophagus, and gastric cancer, esophageal cancer, and colon. Examples include, but are not limited to, solid cancer models such as cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cell cancer, and liver cancer.
  • the production method of the present embodiment includes a step (A) of mixing a cell population containing at least endothelial cells, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte to obtain a mixture, and removing a liquid portion from the mixture to obtain cells.
  • the step (B) of obtaining an aggregate and the step (C) of culturing the cell aggregate in a medium to obtain a three-dimensional cell structure are included.
  • the cell population contains at least endothelial cells.
  • the endothelial cells vascular endothelial cells are preferable.
  • the origin of the cells is not particularly limited, and examples thereof include humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the cells other than the endothelial cells are not particularly limited, and may be, for example, somatic cells derived from bone, muscle, internal organs, nerve, brain, bone, skin, blood, etc., or germ cells.
  • the cell may be an induced pluripotent stem cell (iPS cell) or an embryonic stem cell (ES cell).
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • ES cell embryonic stem cell
  • it may be a cultured cell such as a primary cultured cell, a subcultured cell, and a cell line cell.
  • the cell population may contain one type of cell or may contain a plurality of types of cells.
  • cells include cancer cells such as nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, and hepatoma cells, epithelial cells, myocardial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, and tissue stem cells. And smooth muscle cells and the like, but are not limited thereto.
  • cancer cells such as nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, and hepatoma cells, epithelial cells, myocardial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, and tissue stem cells.
  • smooth muscle cells and the like but are not limited thereto.
  • step (A) a cell population containing at least endothelial cells, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte are mixed to obtain a mixture. Since the mixture contains extracellular matrix components, it tends to be easy to obtain a thick cell structure.
  • the mixture may further contain a cationic substance.
  • extracellular matrix components include collagen or collagen analogs.
  • collagen include, but are not limited to, type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, type VI collagen, type VII collagen, and type VIII collagen. Of these, type I collagen is preferable.
  • collagen analogs include proteins having "collagen-like regions" that partially have the characteristics of collagen proteins, or partial peptides thereof. More specifically, C1q, collectin, ficholine, adiponectin, macrophage scavenger receptor or a partial peptide thereof and the like can be mentioned.
  • the collagen analog may be an artificial synthetic peptide as long as it partially possesses the characteristics of a collagen protein.
  • heparin or heparin analogs examples include heparin, heparan sulfate, and hirudoid (registered trademark) which is a heparinoid.
  • hirudoid registered trademark
  • the inclusion of heparin or heparin analogs in the mixture tends to improve the inhibition of vascular network formation by the extracellular matrix.
  • step (A) a cell population containing at least endothelial cells, collagen or collagen analogs, and heparin or heparin analogs are mixed to obtain a mixture.
  • the final concentration of collagen or collagen relatives in the mixture is, for example, 0.01 mg / mL or more, for example 0.025 mg / mL or more, for example 0.05 mg / mL or more, for example 0.1 mg / mL or more, for example 0.15 mg / mL.
  • the above for example, 0.3 mg / mL or more.
  • the upper limit of the final concentration of collagen or collagen analog is not particularly limited, but is, for example, 1.5 mg / mL, 2.0 mg / mL, 3.0 mg / mL, 5.0 mg / mL, 10.0 mg / mL and 20. It is 0.0 mg / mL.
  • the upper and lower limits of the final concentration of collagen or collagen analogs in the mixture can be arbitrarily combined.
  • the final concentration of collagen or collagen relatives in the mixture is 0.01 mg / mL or more and 20.0 mg / mL or less, 0.01 mg / mL or more and 10.0 mg / mL or less, 0.01 mg / mL or more and 5.0 mg / mL or less.
  • mL or less 0.01 mg / mL or more and 3.0 mg / mL or less, 0.01 mg / mL or more and 2.0 mg or less, 0.025 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less, 0.05 mg / mL or more and 1.5 mg / It may be mL or less, 0.05 mg / mL or more and 3.0 mg / mL or less.
  • the final concentration of heparin or heparin relatives in the mixture is greater than or equal to 0.001 mg / mL, such as greater than 0.001 mg / mL, such as greater than or equal to 0.01 mg / mL, such as greater than or equal to 0.025 mg / mL, such as greater than or equal to 0.05 mg / mL.
  • 0.1 mg / mL or more for example 0.15 mg / mL or more, for example 0.3 mg / mL or more, for example 1.0 mg / mL or more, for example 5.0 mg / mL or more.
  • the final concentration of heparin or heparin analog is 0.001 mg / mL or more, gelation of collagen can be prevented.
  • the upper limit of the final concentration of heparin or heparin analog in the mixture is not particularly limited, but is, for example, 10.0 mg / mL and 50.0 mg / mL.
  • the upper and lower limits of the final concentration of heparin or heparin analogs in the mixture can be arbitrarily combined.
  • the final concentration of heparin or heparin relatives in the mixture is 0.001 mg / mL or more and 50 mg / mL or less, 0.001 mg / mL or more and 10 mg / mL or less, 0.01 mg / mL or more and 10 mg / mL or less, 0.025 mg. / ML or more and 10.0 mg / mL or less, 0.05 mg / mL or more and 10.0 mg / mL or less, 0.001 mg / mL or more and 0.1 mg / mL or less, 0.001 mg / mL or more and less than 0.025 mg / mL.
  • the final concentration of heparin or heparin analog in the mixture is less than 0.025 mg / mL, collagen gelation can be prevented and collagen can be prevented from becoming too soft.
  • the final concentrations of collagen or collagen analogs and heparin or heparin analogs in the mixture can be arbitrarily combined.
  • the final concentration of collagen or collagen relatives in the mixture is 0.01 mg / mL or more and 10.0 mg / mL or less and the final concentration of heparin or heparin relatives is 0.001 mg / mL or more and 50.0 mg / mL or less.
  • the final concentration of collagen or collagen relatives may be 0.05 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less, and the final concentration of heparin or heparin relatives is 0.001 mg / mL or more and 10.0 mg / mL or less.
  • the final concentration of collagen or collagen relatives may be 0.01 mg / mL or more and 3.0 mg / mL or less, and the final concentration of heparin or heparin relatives is 0.001 mg / mL or more and 10.0 mg / mL. It may be as follows.
  • Cationic substances include tris-hydrochloride buffer, tris-maleic acid buffer, bis-tris-buffer, cationic buffers such as HEPES, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine, polylysine. , Polyhistidine, polyarginine and the like, but are not limited thereto. Of these, a cationic buffer solution is preferable, and a Tris-hydrochloric acid buffer solution is more preferable.
  • the final concentration of the cationic substance in the mixture in the step (A) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the final concentration of the cationic substance used in the present embodiment is preferably 10 to 100 mM, for example, 20 to 90 mM, 30 to 80 mM, 40 to 70 mM, for example. It may be, for example, 45-60 mM.
  • the pH of the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is preferably 6.0 to 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7. It may be 8, 7.9, 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is more preferably 7.2 to 7.6, and more preferably 7.35 to 7.45. , 7.4, more preferably.
  • the pH of the mixture in step (A) can be adjusted to the above range.
  • the pH is a value measured at room temperature (20 to 25 ° C.).
  • collagen is soluble in water under acidic conditions, but is insoluble in water under neutral to alkaline conditions and gels. Therefore, collagen gels when the pH of the mixture in step (A) is 7.0 to 8.0, but when the mixture contains heparin at a rate of at least 0.001 mg / mL, collagen gelation is prevented. be able to. That is, the mixture in step (A) has fluidity. As a result, the movement of endothelial cells is facilitated in the cell culture described later, and the endothelial cells are easily aggregated with each other. Therefore, a vascular network is likely to be formed in the three-dimensional cell structure.
  • the presence or absence of fluidity of the mixture is determined by the following method. First, a cell population containing at least endothelial cells, extracellular matrix components, and a polymer electrolyte are mixed in a 1.5 mL tube to prepare a mixture. Allow to stand overnight at 4 ° C. and incubate the tube at 37 ° C. for 30 minutes. Visually check the mixture in the tube. The tube is turned upside down, and the mixture in the tube that has flowed after 1 second is judged to be "fluid", and the one that has not flowed is judged to be "non-fluid". Further, the presence or absence of fluidity may be determined by dynamic viscoelasticity measurement.
  • the storage elastic modulus X and the loss elastic modulus Y of the mixture at a temperature of room temperature or higher are measured, and if X is larger than Y, the mixture is gelled and “no fluidity”, and X is Y. If it is smaller than, the mixture is not gelled and may be judged to be "fluid". Since the proportion of the cell population contained in the mixture is extremely small, it is assumed that the determination of fluidity is not affected even when the mixture does not contain the cell population.
  • heparin when heparin is contained in the mixture in the step (A) at a ratio of at least 0.001 mg / mL, collagen is uniformly distributed in the mixture. As a result, the uniformity of cell distribution in the mixture can also be enhanced.
  • collagen or collagen analog, and heparin or heparin analog can be used by dissolving in an appropriate solvent.
  • the solvent include, but are not limited to, water, an acidic aqueous solution, a buffer solution and the like.
  • Collagen or collagen analogs may be dissolved in an acidic aqueous solution, for example an acetic acid aqueous solution.
  • a cationic buffer solution is used as the above-mentioned cationic substance
  • collagen or a collagen analog and heparin or a heparin analog may be dissolved in the cationic buffer solution and used.
  • step (A) the cell population is mixed with collagen or collagen analogs, heparin or heparin analogs, and optionally cationic substances in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle, or plate. It can be carried out.
  • step (B) the liquid portion is removed from the above mixture to obtain a cell aggregate.
  • the term "cell aggregate” means a population of cells.
  • the cell aggregate also includes a cell precipitate obtained by centrifugation, filtration, or the like.
  • the cell aggregate is a slurry-like viscous body.
  • "Slurry viscous body” means Akihiro Nishiguchi et al., Cell--cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317 , Refers to gel-like cell aggregates as described in 2015.
  • the liquid portion may be removed by centrifugation or filtration.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the liquid portion may be removed by centrifuging the microtube containing the mixture at room temperature at 400 to 1,000 ⁇ g for 1 minute to separate the liquid portion and the cell aggregate.
  • the liquid portion may be removed after the cells have been collected by natural sedimentation. As a result, a cell aggregate can be obtained.
  • step (C) the above cell aggregate is cultured in a medium to obtain a three-dimensional cell structure.
  • Cell aggregates may be suspended in solution prior to culturing.
  • the solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of three-dimensional cell structures.
  • a cell culture medium, a buffer solution, or the like suitable for the cells constituting the cell aggregate can be used.
  • Suspension of cell aggregates can be done in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle, or plate.
  • the cells When the cell aggregate is suspended in a solution, the cells may be precipitated before culturing to form a cell precipitate on the substrate.
  • the base material include a culture vessel for use in culturing cells.
  • the culture container may be a container having a material and shape usually used for culturing cells and microorganisms. Examples of the material of the culture container include, but are not limited to, glass, stainless steel, plastic, and the like. Culture vessels include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles, plates and the like.
  • the base material is, for example, a material that does not allow cells in the liquid to pass through but allows the liquid to pass through.
  • the base material is preferably a permeable membrane. Containers having such a permeable membrane include, but are limited to, cell culture inserts such as Transwell® inserts, Netwell inserts, Falcon® cell culture inserts, and Millicell® cell culture inserts. Not done.
  • cells may be collected by centrifugation, magnetic separation, filtration, or the like.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells.
  • cells may be collected by seeding the mixture or suspension into cell culture inserts and subjecting them to centrifugation at 400-1,000 xg at 10 ° C. or room temperature for 1 minute.
  • cells may be collected by spontaneous sedimentation.
  • the collected cells may form a layered structure.
  • the number of cell aggregates, or cells suspended when the cell aggregates are suspended is 1,000 cells / mm 2 or more, for example 10,000 cells / mm 2 or more, for example, with respect to the area of the culture vessel. It is preferable to seed at a cell density of 20,000 cells / mm 2 or more, for example, 25,000 cells / mm 2 or more.
  • the number of cells is 1,000 cells / mm 2 or more with respect to the area of the culture vessel, the cells are appropriately dispersed, the thickness of the three-dimensional cell structure tends to exceed 150 ⁇ m, and the endothelial cells move. Because it is easy, endothelial cells are easy to gather together.
  • the number of cells is 1,000,000 cells / mm 2 or less, for example 500,000 cells / mm 2 or less, for example 200,000 cells / mm 2 or less, for example 100,000 cells / mm 2 or less with respect to the area of the culture vessel. It can be seeded at a cell density of mm 2 or less. When the number of cells is 1,000,000 cells / mm 2 or less with respect to the area of the culture vessel, it is possible to prevent the three-dimensional cell structure from becoming thin.
  • the upper and lower limits of the cell density can be arbitrarily combined.
  • the cell density is 1,000 cells / mm 2 or more and 100,000 cells / mm 2 or less, for example, 10,000 cells / mm 2 or more and 200,000 cells / mm 2 or less with respect to the area of the culture vessel. May be good.
  • a more homogeneous three-dimensional cell structure can be obtained by carrying out a step of suspending the cell aggregate in a solution and a step of precipitating the cells.
  • the cells can be cultured under culture conditions suitable for the cells to be cultured.
  • the cell culture medium is not particularly limited, but basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, or Ham's F-12, and CS (also referred to as bovine serum) in these basal media. ), FBS (also referred to as fetal bovine serum), or HBS (also referred to as fetal bovine serum) is added to a medium in an amount of about 1 to 20% by volume. Conditions such as the temperature of the culture environment and the atmospheric composition can also be easily determined by those skilled in the art.
  • a substance for suppressing deformation of the constructed three-dimensional cell structure for example, tissue contraction, tissue terminal detachment, etc.
  • a substance for suppressing deformation of the constructed three-dimensional cell structure for example, tissue contraction, tissue terminal detachment, etc.
  • examples of such substances include, but are not limited to, Y-27632, which is a selective ROCK (also referred to as Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-associated kinase) inhibitor.
  • step (A) and step (B) can be repeated a plurality of times, and then step (C) can be performed.
  • step (C) can be performed.
  • a three-dimensional cell structure having a thickness of more than 150 ⁇ m, preferably more than 200 ⁇ m can be obtained without repeating the above steps.
  • step (A) is performed using a cell population containing a first cell and a second cell different from the first cell as a cell population (referred to as step (A1)), and step (B). conduct.
  • step (A1) and step (B) may be repeated, and then step (C) may be performed to construct a three-dimensional cell structure.
  • step (A) is performed (referred to as step (A2)) using a cell population containing the first cell as the cell population, and step (B) is performed.
  • step (A) is performed using a cell population containing a second cell different from the first cell as the cell population (referred to as step (A3)), and then step (B) is performed. Even if the combination with the step (A2) and the step (B) and the combination with the step (A3) and the step (B) are repeated a plurality of times and then the step (C) is performed to construct a three-dimensional cell structure. good.
  • the combination with the step (A2) and the step (B) may be continuously performed a plurality of times, and then the combination with the step (A3) and the step (B) may be performed. And the combination with the step (B) may be performed a plurality of times in succession, and then the combination with the process (A2) and the process (B) may be performed.
  • vascular network refers to a network-like tubular structure having a large number of bifurcation points, such as a vascular network or a lymphatic network in a living tissue.
  • the production method of the present embodiment is a method of imparting a vascular network to a thick three-dimensional cell structure.
  • heparin or a heparin analog can be said to be a vascular network forming agent for forming a vascular network in a cell structure. It can also be said that heparin or a heparin analog is an improving agent for improving the density of the vasculature formed in the three-dimensional cell structure.
  • the present invention includes the following aspects as another aspect.
  • the extracellular matrix component is collagen or a collagen analog, comprising the step of culturing the cell aggregate in a medium to obtain a three-dimensional cell structure having a thickness of more than 150 ⁇ m and having a vasculature.
  • the polymer electrolyte is a heparin or heparin analog having a final concentration of 0.001 mg / mL or more and 0.05 mg / mL or less or 0.001 mg / mL or more and less than 0.025 mg / mL in the mixture.
  • Method of manufacturing the structure [9] In the step of culturing the cell aggregate in the medium, the cell aggregate is seeded at a cell density of 20,000 cells / mm 2 to 100,000 cells / mm 2 with respect to the area of the culture vessel. The production method according to [8].
  • the total length of vessels constituting the vessel network is 5,000 .mu.m / mm 2 or more 10,000 / mm 2 or less, the production method according to [8] or [9].
  • the production method according to any one of [8] to [12], wherein the pH of the mixture is 7.35 to 7.45.
  • the final concentration of the extracellular matrix component in the mixture is 0.01 mg / mL or more and 3.0 mg / mL or less (preferably 0.01 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less) [8].
  • the production method according to any one of [14].
  • Example 1 (Formation of three-dimensional cell structure 1) 4.25 ⁇ 10 5 cells of normal human skin fibroblasts (NHDF) and 7.0 ⁇ 10 3 cells of GFP-introduced human umbilical vein endothelial cells (GFP-HUVEC) at 0 mg / mL, 0.2 mg / mL, Or 2.0 mg / mL heparin / 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 7.4) and 0 mg / mL, 0.2 mg / mL, or 0.6 mg / mL collagen / 5 mM acetic acid solution (pH 3.7). Suspended in an equal volume mixture of.
  • NHDF normal human skin fibroblasts
  • GFP-HUVEC GFP-introduced human umbilical vein endothelial cells
  • the final concentrations of collagen in the mixture were 0 mg / mL, 0.1 mg / mL, or 0.3 mg / mL, respectively, and the final concentrations of heparin were 0 mg / mL, 0.1 mg / mL, or 0.3 mg / mL, respectively. It was 1.0 mg / mL.
  • the obtained mixture was centrifuged at 1,000 ⁇ g (gravitational acceleration) for 1 minute at room temperature to obtain a viscous body.
  • the obtained viscous body was suspended in DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the entire amount of the obtained suspension was seeded in a 96-well cell culture insert (bottom area per well was 0.143 cm 2 ) and centrifuged at room temperature, 400 ⁇ g for 1 minute. This formed a cell layer on the cell culture insert.
  • the density of cells seeded in the cell culture insert was 29,720 cells / mm 2 .
  • DMEM containing 10% FBS was added so that the total liquid volume inside and outside the cell culture insert was more than 2 mL, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% O 2 ) (this culture was carried out).
  • the time when the culture is started is the time when the culture is started).
  • the medium was replaced with DMEM containing 10% FBS. After that, the medium was exchanged 48 hours and 96 hours after the start of the culture.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of fluorescence microscope observation.
  • the formation of the vascular network was inhibited as compared with the other samples.
  • the inhibition of vascular network formation was significantly alleviated in the sample in which the final concentration of heparin was 0.1 mg / mL or more.
  • Table 1 below shows the measurement results of the thickness of the three-dimensional cell structure.
  • ND indicates that the three-dimensional cell structure contracted and the thickness of the three-dimensional cell structure could not be measured.
  • the thickness resolution is 50 ⁇ m because the focal length of the confocal microscope lens used was about 25 ⁇ m, so if the two points in the height direction are separated by 50 ⁇ m, they will not be in focus at both points. ..
  • the thickness of the three-dimensional cell structure could be more than 150 ⁇ m. Became clear.
  • FIG. 2 is a graph showing the total length of the measured vessels.
  • "col” indicates collagen and "hep” indicates heparin.
  • "col 0 / hep 0" indicates that the final concentration of collagen was 0 mg / mL and the final concentration of heparin was 0 mg / mL, indicating that "col 0 / hep 0.1" was obtained.
  • the total length of the vessels was 5,000 ⁇ m / mm 2 or more. It became clear that it could be done.
  • the final concentrations of collagen in the mixture were 0 mg / mL or 0.15 mg / mL, respectively, and the final concentrations of heparin were 0 mg / mL, 0.001 mg / mL, 0.1 mg / mL, or 0.1 mg / mL, respectively. It was 5.0 mg / mL.
  • the experimental example in which the final concentration of collagen was 0 mg / mL was performed only when the final concentration of heparin was 0 mg / mL.
  • the obtained mixture was centrifuged at 1,000 ⁇ g for 1 minute at room temperature to obtain a viscous body.
  • the obtained viscous material was suspended in DMEM containing 10% FBS.
  • the entire volume of the obtained suspension was seeded in a 96-well cell culture insert and centrifuged at room temperature, 400 xg for 1 minute. This formed a cell layer on the cell culture insert.
  • the density of cells seeded in the cell culture insert was 29,550 cells / mm 2 .
  • DMEM containing 10% FBS was added so that the total liquid volume inside and outside the cell culture insert was more than 2 mL, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% O 2 ) (this culture was carried out).
  • the time when the culture is started is the time when the culture is started).
  • the medium was replaced with DMEM containing 10% FBS. After that, the medium was exchanged 48 hours, 96 hours, and 144 hours after the start of the culture.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of fluorescence microscope observation. “No data” in FIG. 3 indicates that the micrograph was not taken.
  • Example 3 (Formation of three-dimensional cell structure 3) A three-dimensional cell structure similar to Experimental Example 1 except that collagen having a final concentration of 0.1 mg / mL was used as an extracellular matrix component and hyaluronic acid having a final concentration of 0.1 mg / mL was used as a polymer electrolyte. Was produced.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of fluorescence microscope observation. As a result, it was clarified that when hyaluronic acid was used as the polymer electrolyte, the inhibition of the formation of the vascular network by collagen was not alleviated.
  • the final concentration of collagen in the mixture was 0.1 mg / mL or 0.15 mg / mL, respectively, and the final concentration of heparin was 0 mg, respectively. It was / mL, 0.001 mg / mL, 0.025 mg / mL, 0.1 mg / mL, or 1.0 mg / mL.
  • the pH of a 1 mL mixture of conditions 1-8 was measured. The tube containing the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. After incubating the tube at 37 ° C. for 30 minutes, the tube was turned upside down, and after 1 second, it was visually confirmed whether the mixture in the tube flowed. The fluid mixture was judged to be "fluid", and the non-fluid mixture was judged to be "non-fluid”. Table 2 shows the pH and fluidity of the mixture under each condition.

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Abstract

この立体的細胞構造体の製造方法は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を培地中で培養し、厚さが１５０μｍ超であり、脈管網を有する立体的細胞構造体を得る工程と、を含み、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン又はコラーゲン類縁体であり、前記高分子電解質が、前記混合物における終濃度０．００１ｍｇ／ｍＬ以上のヘパリン又はヘパリン類縁体である。

Description

立体的細胞構造体の製造方法
　本発明は、立体的細胞構造体の製造方法に関する。
　本願は、２０２０年１月２０日に日本に出願された特願２０２０－００６５８７号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、再生医療はもとより、生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞構造体を使用することの優位性が示されており、生体外で立体的細胞構造体を構築するための様々な技術が開発されている。例えば、細胞が付着できない表面基板上で細胞塊を形成させる方法、液滴中で細胞塊を形成させる方法、及び透過性膜上に細胞を集積させる方法等が開発されている。
　このような細胞の組織化を維持するためには、細胞間の結合や足場形成のために、生体自身が産生するコラーゲン等の細胞外マトリックス（以下、ＥＣＭと記載することがある）が必要である。そのため、人為的に細胞組織を構築する際にＥＣＭを外部から添加することが検討されてきた。
　例えば、特許文献１には、酵素処理等により単離した細胞を、代表的なＥＣＭであり、細胞保護作用を有する水溶性高分子である、コラーゲン等と接触させた後、三次元集合体として培養する方法が開示されている。この方法によれば、培養中に細胞周辺で水溶性高分子のゲルが形成される。
　また、特許文献２には、温度応答性の樹脂であるｐｏｌｙ（Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＰＩＰＡＡｍともいう）を表面に固定化した培養皿を用いて細胞シートを作製し、作製した細胞シートを積層することで立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。
　また、特許文献３には、細胞層の形成する工程と、形成した細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行い、ナノメートルサイズの厚みのＥＣＭを介して連続的に細胞層を積層することで、立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。この方法では、単層の細胞シートの剥離や剥離した細胞シートの重ね合わせ等が不要であるため、優れた再現性及び効率で立体的細胞構造体を製造できるとされている。
　また、特許文献４には、個々の細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を作製し、接着膜を介して細胞を接着させることにより、立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。
　以上の通り、立体的細胞構造体の製造技術としていくつもの手法が提案されている。しかしながら、いずれかの手法によって立体的細胞構造体を一時的に形成できたとしても、立体的細胞構造体の内部に脈管網を再現できなければ、真に生体に近い構造を模倣できたとはいえない。特に立体的細胞構造体の場合、立体的細胞構造体の内部の細胞にまで必要な栄養を供給するためにも脈管網がよく形成されていることが求められる。
　一般的に、脈管網を形成させるためには、立体的細胞構造体を構成する細胞集団に血管内皮細胞を加える。しかしながら、立体的細胞構造体が単に血管内皮細胞を含有しているだけでは必ずしも脈管網（血管網）は形成されず、血管網の形成には、血管内皮細胞の存在する周辺の環境が重要である。
　立体的細胞構造体の内部の血管網の形成に影響を与える因子としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦともいう）等の各種成長因子等様々な因子が知られているが、その一つとして、ＥＣＭの機械的性質が血管網の形成に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１を参照。）。
　本願発明者らは、以前に、細胞が、カチオン性緩衝液、ＥＣＭ、及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得るＡ工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成するＢ工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞構造体を得るＣ工程と、を含む、立体的細胞構造体の製造技術を開発している（特許文献５を参照）。
特許第２８２４０８１号明細書 国際公開第２００２／００８３８７号 特許第４９１９４６４号明細書 特許第５８５０４１９号明細書 特許第６４２７８３６号明細書
Rouwkema J. and Khademhosseini A., Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks, Trends Biotechnol, 34 (9), 733-745, 2016.
　特許文献５に記載の方法は、細胞種に大きく限定されず適用可能であり、細胞が内皮細胞を含む場合の脈管網の形成能に優れ、且つ層構成を形成することも可能な有効な手法である。
　しかしながら、ＥＣＭがコラーゲンを含む場合に、厚い立体的細胞構造体をより得やすくするためには，更なる改善の余地がある。
　そこで、本発明は、十分な厚さを有し、脈管網を有する、立体的細胞構造体の製造技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を培地中で培養し、厚さが１５０μｍ超であり、脈管網を有する立体的細胞構造体を得る工程と、を含み、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン又はコラーゲン類縁体であり、前記高分子電解質が、前記混合物における終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上のヘパリン又はヘパリン類縁体である、立体的細胞構造体の製造方法。
［２］前記細胞集合体を培地中で培養する工程において、前記細胞集合体を、培養容器の面積に対して１，０００個／ｍｍ２～１，０００，０００個／ｍｍ２の細胞密度で播種して培養する、［１］に記載の製造方法。
［３］前記脈管網を構成する脈管の合計の長さが、５，０００μｍ／ｍｍ２以上である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記内皮細胞が血管内皮細胞である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記細胞集団が線維芽細胞を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記混合物のｐＨが、７．２～７．６である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記混合物が流動性を有する、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、十分な厚さを有し、脈管網を有する、立体的細胞構造体の製造技術を提供することができる。
実験例１において撮影した蛍光顕微鏡写真である。 実験例１において測定した、立体的細胞構造体の内部の脈管の合計の長さを示すグラフである。 実験例２において撮影した蛍光顕微鏡写真である。 実験例３において撮影した蛍光顕微鏡写真である。
　１実施形態において、本発明は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を培地中で培養し、厚さが１５０μｍ超であり、脈管網を有する立体的細胞構造体を得る工程と、を含み、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン又はコラーゲン類縁体であり、前記高分子電解質が、前記混合物における終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上のヘパリン又はヘパリン類縁体である、立体的細胞構造体の製造方法を提供する。
　本実施形態の製造方法によれば、十分な厚さを有し、脈管網を有する、立体的細胞構造体の製造技術を提供することができる。
　ここで、十分な厚さとは、例えば１５０μｍ超、例えば１６０μｍ以上、例えば１７０μｍ以上、例えば１８０μｍ以上、例えば１９０μｍ以上、例えば２００μｍ超、例えば２１０μｍ以上、例えば２２０μｍ以上、例えば２３０μｍ以上、例えば２４０μｍ以上、例えば２５０μｍ以上、例えば２６０μｍ以上、例えば２７０μｍ以上、例えば２８０μｍ以上、例えば２９０μｍ以上、例えば３００μｍ以上であってもよい。厚さの上限に特に制限はないが、例えば、３０００μm、１０００μm、及び５００μm等が挙げられる。立体細胞構造体の厚さの上限値と下限値は、任意に組み合わせることができ、１５０μｍ超３０００μm以下であることが好ましく、１５０μm以上５００μm以下であることがより好ましい。
　また、本実施形態の製造方法により製造される立体的細胞構造体の脈管網は、脈管網を構成する脈管の合計の長さが、５，０００μｍ／ｍｍ２以上、例えば５，２００μｍ／ｍｍ２以上、例えば５，４００μｍ／ｍｍ２以上であってよい。脈管の合計の長さに特に制限はないが、例えば、５，５００μm／ｍｍ２、８，０００μm／ｍｍ２、及び１４，０００μm／ｍｍ２等が挙げられる。脈管の合計の長さの上限値と下限値は、任意に組み合わせることができ、５，０００μｍ／ｍｍ２以上２０，０００μm／ｍｍ２以下であることが好ましく、５，０００μm／ｍｍ２以上１０，０００μm／ｍｍ２以下であることがより好ましい。
　脈管の合計の長さは、立体的細胞構造体を上面から観察した際の立体的細胞構造体の単位面積あたりの脈管の合計長さとして測定する。脈管網を構成する脈管の合計の長さは、立体的細胞構造体を上面から観察した蛍光顕微鏡写真の画像解析から、脈管網であることを示す蛍光を発している画素を数えることにより、測定することができる。
　立体的細胞構造体の形態に特に制限は無く、例えば、コラーゲン等の天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォールド内で細胞を培養して形成した立体的細胞構造体であってもよいし、細胞凝集体（スフェロイドともいう）であってもよいし、シート状の細胞構造体であってもよい。
　本明細書において、「立体的細胞構造体」とは、少なくとも１種類の細胞を含む立体的な細胞の集合体を意味する。立体的細胞構造体の形態としては、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経、食道等の生体組織モデル、及び、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、及び肝癌等の固形癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態の製造方法は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程（Ａ）と、前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程（Ｂ）と、前記細胞集合体を培地中で培養し、立体的細胞構造体を得る工程（Ｃ）と、を含む。
　工程（Ａ）において、細胞集団は少なくとも内皮細胞を含む。内皮細胞としては血管内皮細胞が好ましい。細胞の由来は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、及びラット等が挙げられる。
　内皮細胞以外の細胞は特に限定されず、例えば、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、又は血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。また、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。あるいは、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。細胞集団は１種類の細胞を含んでいてもよいし、複数種類の細胞を含んでいてもよい。
　細胞としては、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞及び平滑筋細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
　工程（Ａ）において、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る。混合物が細胞外マトリックス成分を含むことにより、厚い細胞構造体が得られやすい傾向にある。混合物は、更にカチオン性物質を含んでいてもよい。
　細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン又はコラーゲン類縁体が挙げられる。コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、及びＶＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられるがこれらに限定されない。なかでもＩ型コラーゲンが好ましい。
　コラーゲン類縁体としては、コラーゲンタンパク質の特徴を部分的に備えた「コラーゲン様領域」を有するタンパク質又はその部分ペプチド等が挙げられる。より具体的には、Ｃ１ｑ、コレクチン、フィコリン、アディポネクチン、マクロファージスカベンジャー受容体又はその部分ペプチド等が挙げられる。コラーゲン類縁体は、コラーゲンタンパク質の特徴を部分的に備えていれば、人工的な合成ペプチドであってもよい。
　ヘパリン又はヘパリン類縁体としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヘパリン類似物質であるヒルドイド（登録商標）等が挙げられる。混合物がヘパリン又はヘパリン類縁体を含むことにより、細胞外マトリックスによる脈管網の形成の阻害が改善される傾向にある。
　工程（Ａ）において、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、コラーゲン又はコラーゲン類縁体と、ヘパリン又はヘパリン類縁体とを混合して混合物を得る。
混合物におけるコラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度は、例えば０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．３ｍｇ／ｍＬ以上である。コラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度の上限値は特に限定されないが、例えば、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ及び２０．０ｍｇ／ｍＬである。混合物におけるコラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、混合物におけるコラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上２０．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上２．０ｍｇ以下、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　混合物におけるヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度は、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ超、例えば０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば０．３ｍｇ／ｍＬ以上、例えば１．０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば５．０ｍｇ／ｍＬ以上である。ヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度は、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上であると、コラーゲンのゲル化を防止することができる。混合物におけるヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度の上限値は特に限定されないが、例えば、１０．０ｍｇ／ｍＬ及び５０．０ｍｇ／ｍＬである。混合物におけるヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、混合物におけるヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度は、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上０．０２５ｍｇ／ｍＬ未満であってもよい。混合物におけるヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度が０．０２５ｍｇ／ｍＬ未満であると、コラーゲンのゲル化を防止すると共に、コラーゲンが柔らかくなりすぎることを防ぐことができる。
　混合物におけるコラーゲン又はコラーゲン類縁体と、ヘパリン又はヘパリン類縁体のそれぞれの終濃度は、任意に組み合わせることができる。例えば、混合物におけるコラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下であり且つヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上５０．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、コラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であり且つヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、コラーゲン又はコラーゲン類縁体の終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下であり且つヘパリン又はヘパリン類縁体の終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　カチオン性物質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、ＨＥＰＥＳ等のカチオン性緩衝液、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、及びポリアルギニン等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもカチオン性緩衝液が好ましく、トリス－塩酸緩衝液がより好ましい。
　工程（Ａ）における混合物におけるカチオン性物質の終濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性物質の終濃度は１０～１００ｍＭであることが好ましく、例えば２０～９０ｍＭであってもよく、例えば３０～８０ｍＭであってもよく、例えば４０～７０ｍＭであってもよく、例えば４５～６０ｍＭであってもよい。
　カチオン性物質としてカチオン性緩衝液を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０であってよい。細胞へのダメージが小さいという観点から、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．２～７．６であることがより好ましく、７．３５～７．４５であることがより好ましく、７．４であることが更に好ましい。カチオン性緩衝液を用いることにより、工程（Ａ）における混合物のｐＨを上記範囲に調整することができる。なお、本明細書において、ｐＨは室温（２０～２５℃）で測定したときの値である。
　一般的にコラーゲンは、酸性条件下では水に可溶であるが、中性からアルカリ性条件下では水に不溶でありゲル化する。従って、工程（Ａ）における混合物のｐＨが７．０～８．０ではコラーゲンはゲル化するが、混合物にヘパリンが少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬの割合で含まれると、コラーゲンのゲル化を防止することができる。つまり、工程（Ａ）における混合物は、流動性を有している。その結果、後に説明する細胞の培養において内皮細胞の移動を容易にし、内皮細胞同士が集合しやすくなる。そのため、立体的細胞構造体に脈管網が形成されやすくなる。
　本明細書において混合物の流動性の有無は、以下の方法で判断する。まず、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを１．５ｍＬチューブ内で混合して混合物を調製する。４℃で一晩静置し、前記チューブを３７℃で３０分間インキュベーションする。前記チューブ内の混合物を目視で確認する。チューブを上下反転させ、１秒間後にチューブ内の混合物が流動したものを「流動性あり」、流動しなかったものを「流動性なし」と判断する。また、流動性の有無は、動的粘弾性測定によって判断してもよい。具体的には、室温以上の温度下での混合物の貯蔵弾性率Xと損失弾性率Yとを測定し、ＸがＹよりも大きければ混合物はゲル化しており「流動性なし」、ＸがＹよりも小さければ混合物はゲル化しておらず「流動性あり」と判断してもよい。なお、混合物に含まれる細胞集団の割合は極めて小さいため、混合物に細胞集団が含まれていない場合であっても、流動性の判断に影響はないものとする。
　また、工程（Ａ）における混合物にヘパリンが少なくとも０．００１ｍｇ／ｍＬの割合で含まれると、混合物中においてコラーゲンが均一に分布する。その結果、混合物における細胞の分布の均一性も高めることができる。
　工程（Ａ）において、コラーゲン又はコラーゲン類縁体、及びヘパリン又はヘパリン類縁体は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒の例としては、水、酸性水溶液及び緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン又はコラーゲン類縁体は、酸性水溶液、例えば酢酸水溶液に溶解してもよい。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、コラーゲン又はコラーゲン類縁体、及びヘパリン又はヘパリン類縁体を、カチオン性緩衝液に溶解して用いてもよい。
　工程（Ａ）において、細胞集団と、コラーゲン又はコラーゲン類縁体、ヘパリン又はヘパリン類縁体、及び、場合によりカチオン性物質の混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、又はプレート等の適当な容器中で行うことができる。
　続いて、工程（Ｂ）において、上記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る。本明細書において、「細胞集合体」とは、細胞の集団を意味する。細胞集合体には、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、Akihiro Nishiguchi et al., Cell--cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, 2015. に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
　液体部分を除去する手段としては、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離やろ過によって、液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物の入ったマイクロチューブを、室温、４００～１，０００×ｇで１分間の遠心分離に供して液体部分と細胞集合体とを分離することによって、液体部分を除去してもよい。あるいは、自然沈降によって細胞を集めた後、液体部分を除去してもよい。この結果、細胞集合体を得ることができる。
　続いて、工程（Ｃ）において、上記の細胞集合体を培地中で培養し、立体的細胞構造体を得る。培養の前に細胞集合体を溶液に懸濁してもよい。溶液は、細胞の生育及び立体的細胞構造体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞集合体を構成する細胞に適した細胞培養培地、緩衝液等を用いることができる。細胞集合体の懸濁は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、又はプレート等の適当な容器中で行うことができる。
　細胞集合体を溶液に懸濁した場合、培養の前に細胞を沈殿させて基材上に細胞の沈殿体を形成してもよい。基材としては、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材及び形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス、及びプラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、及びプレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。基材は、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料である。基材は透過膜であることが好ましい。かかる透過膜を有する容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌインサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサートなどのセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞の沈殿は、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離、又はろ過等によって、細胞を集めてもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物又は懸濁液をセルカルチャーインサートに播種し、１０℃又は室温、４００～１，０００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集めてもよい。あるいは、自然沈降によって細胞を集めてもよい。また、集めた細胞は層構造を形成していてもよい。
　細胞集合体、又は、細胞集合体を懸濁した場合には懸濁された細胞は、培養容器の面積に対して１，０００個／ｍｍ２以上、例えば１０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２５，０００個／ｍｍ２以上の細胞密度で播種することが好ましい。細胞が培養容器の面積に対して１，０００個／ｍｍ２以上であると、適度に細胞が分散した状態となり、立体的細胞構造体の厚さが１５０μm超となりやすく、また内皮細胞が移動しやすいため内皮細胞同士が集合しやすい。また、細胞は、例えば培養容器の面積に対して１，０００，０００個／ｍｍ２以下、例えば５００，０００個／ｍｍ２以下、例えば２００，０００個／ｍｍ２以下、例えば１００，０００個／ｍｍ２以下の細胞密度で播種することができる。細胞が培養容器の面積に対して１，０００，０００個／ｍｍ２以下であると、立体的細胞構造体が薄くなることを防ぐことができる。細胞密度の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、細胞密度は、培養容器の面積に対して１，０００個／ｍｍ２以上１００，０００個／ｍｍ２以下、例えば１０，０００個／ｍｍ２以上２００，０００個／ｍｍ２以下であってもよい。細胞集合体を溶液に懸濁する工程、及び、細胞を沈殿させる工程を実施することにより、より均質な立体的細胞構造体を得ることができる。
　工程（Ｃ）において、細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。細胞培養培地としては特に限定されないが、ＤＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｍｃｃｏｙ’５ａ、又はＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２等の基本培地や、これらの基本培地にＣＳ（ウシ血清ともいう）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清ともいう）、又はＨＢＳ（ウマ胎児血清ともいう）等の血清を１～２０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件もまた、当業者であれば容易に決定することができる。
　細胞の培養時に、構築された立体的細胞構造体の変形（例えば、組織の収縮、組織末端の剥離等）を抑制するための物質を培地に添加してもよい。このような物質としては、選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼともいう）阻害剤であるＹ－２７６３２が挙げられるが、これに限定されない。
　上記の工程を繰り返すことにより、細胞集合体又は細胞の沈殿体を積層することもできる。言い換えれば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を複数回繰り返し、その後工程（Ｃ）を行うことができる。これにより、複数の層を有する立体的細胞構造体を構築することができる。しかしながら、本実施形態の製造方法によれば、上記の工程を繰り返さなくても、１５０μｍ超、好ましくは２００μｍ超の厚さを有する立体的細胞構造体を得ることができる。
　上記の工程を繰り返して、細胞集合体又は細胞の沈殿体を積層する場合、複数種類の細胞を用いて、異なる種類の細胞によって構成される立体的細胞構造体を構築してもよい。具体的には、細胞集団として第１の細胞と第１の細胞とは異なる第２の細胞を含む細胞集団を用いて工程(Ａ)を行い（工程（Ａ１）とする）、工程（Ｂ）行う。この工程（Ａ１）と工程（Ｂ）を繰り返し、その後工程（Ｃ）を行って、立体的細胞構造体を構築してもよい。また別の側面として、細胞集団として第１の細胞を含む細胞集団を用いて工程(Ａ)を行い（工程（Ａ２）とする）、工程（Ｂ）行う。その後、細胞集団として第１の細胞とは異なる第２の細胞を含む細胞集団を用いて工程（Ａ）を行い（工程（Ａ３）とする）、次いで工程（Ｂ）を行う。工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）との組み合わせと、工程（Ａ３）及び工程（Ｂ）との組み合わせを複数回繰り返し、その後工程（Ｃ）を行って、立体的細胞構造体を構築してもよい。なお、上述の製造方法において工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）との組み合わせを複数回連続して行ってから工程（Ａ３）及び工程（Ｂ）との組み合わせを行ってもよく、工程（Ａ３）及び工程（Ｂ）との組み合わせを複数回連続して行ってから工程（Ａ２）及び工程（Ｂ）との組み合わせを行ってもよい。
　本実施形態の製造方法により製造される立体的細胞構造体は、脈管網を有しているため、生体に近い構造を模倣したモデルとして有用である。本明細書において、「脈管網」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、多数の分岐点を有するネットワーク状の管構造を指す。
　本実施形態の製造方法は、厚い立体細胞構造体に脈管網を付与する方法であるということができる。また、本実施形態の製造方法において、ヘパリン又はヘパリン類縁体は、脈管網を細胞構造体に形成させるための脈管網形成剤であるということができる。また、ヘパリン又はヘパリン類縁体は、立体細胞構造体に形成される脈管網の密度を向上させるための改善剤であるということもできる。
　本発明は、もう一つの側面として以下の態様を包含する。
［８］少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程と、前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を培地中で培養し、厚さが１５０μｍ超であり、脈管網を有する立体的細胞構造体を得る工程と、を含み、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン又はコラーゲン類縁体であり、前記高分子電解質が、前記混合物における終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上０．０５ｍｇ／ｍＬ以下あるいは０．００１ｍｇ／ｍＬ以上０．０２５ｍｇ／ｍＬ未満のヘパリン又はヘパリン類縁体である、立体的細胞構造体の製造方法。
［９］前記細胞集合体を培地中で培養する工程において、前記細胞集合体は、培養容器の面積に対して２０，０００個／ｍｍ２～１００，０００個／ｍｍ２の細胞密度で播種して培養する、［８］に記載の製造方法。
［１０］前記脈管網を構成する脈管の合計の長さが、５，０００μｍ／ｍｍ２以上１０，０００μｍ／ｍｍ２以下である、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］前記内皮細胞が血管内皮細胞である、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記細胞集団が線維芽細胞を更に含む、［８］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］前記混合物のｐＨが、７．３５～７．４５である、［８］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］前記混合物が流動性を有する、［８］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記細胞外マトリックス成分の前記混合物における終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下（好ましくは、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下）である、［８］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　以下の各実験例において、特に説明がない限り、コラーゲンとしてコラーゲンＩを用いた。
［実験例１］
（立体的細胞構造体の形成１）
　４．２５×１０５細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及び７．０×１０３細胞のＧＦＰ導入ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を、０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、又は２．０ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と、０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、又は０．６ｍｇ／ｍＬコラーゲン／５ｍＭ酢酸溶液（ｐＨ３．７）溶液との等量混合液に懸濁した。この結果、混合物におけるコラーゲンの終濃度は、それぞれ、０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、又は０．３ｍｇ／ｍＬとなり、ヘパリンの終濃度は、それぞれ、０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、又は１．０ｍｇ／ｍＬとなった。
　続いて、得られた混合物を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で１分間遠心し、粘稠体を得た。続いて、得られた粘稠体を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭに懸濁した。続いて、得られた懸濁液の全量を９６ウェルセルカルチャーインサート（１ウェルあたりの底面積は０．１４３ｃｍ２であった。）内に播種し、室温、４００×ｇで１分間遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞層が形成された。セルカルチャーインサートに播種された細胞の密度は２９，７２０個／ｍｍ２であった。
　続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭをセルカルチャーインサートの内側及び外側の合計液量が２ｍＬ超となるように添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％Ｏ２）中で培養した（この培養を開始した時点を培養開始時とする）。培養開始時から２４時間培養後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地交換した。以降、培養開始時から、４８時間後、及び９６時間後に培地交換を行った。
《立体的細胞構造体の観察》
　培養開始時から１２０時間後に、立体的細胞構造体を上面から生きた状態で蛍光顕微鏡観察し、ＧＦＰの蛍光を検出した。図１は、蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。その結果、コラーゲンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上であり、ヘパリンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬであったサンプルでは、その他のサンプルと比較して血管網の形成が阻害された。これに対し、コラーゲンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上である場合であっても、ヘパリンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上であったサンプルでは、血管網の形成の阻害が有意に緩和された。
《立体的細胞構造体の厚さの測定》
　続いて、各立体的細胞構造体の厚さを測定した。高さの測定は、共焦点顕微鏡の焦点が合った高さから、９６ウェルセルカルチャーインサートの底面の高さを差し引いて算出した。
　下記表１に、立体的細胞構造体の厚さの測定結果を示す。表１中、「Ｎ．Ｄ．」は立体的細胞構造体が収縮し、立体的細胞構造体の厚さを測定できなかったことを示す。厚さの解像度が５０μｍなのは、使用した共焦点顕微鏡のレンズの焦点距離が約２５μｍであったため、高さ方向の２つの点が５０μｍ離れていれば、両方で焦点が合うことがなくなるためである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、コラーゲンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上であり、ヘパリンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ超であったサンプルでは、立体的細胞構造体の厚さを１５０μｍ超とすることができることが明らかとなった。
《脈管の合計の長さの測定》
　続いて、図１に示す蛍光顕微鏡写真の画像解析により、各立体的細胞構造体の内部の脈管網を構成する脈管の合計の長さを測定した。図２は、測定した脈管の合計の長さを示すグラフである。図２中「ｃｏｌ」はコラーゲンを示し、「ｈｅｐ」はヘパリンを示す。また、「ｃｏｌ　０／ｈｅｐ　０」はコラーゲンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬであり、ヘパリンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬであったサンプルの結果であることを示し、「ｃｏｌ　０／ｈｅｐ　０．１」はコラーゲンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬであり、ヘパリンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬであったサンプルの結果であることを示し、以下同様である。
　その結果、コラーゲンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ以上であり、ヘパリンの終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ超であったサンプルでは、脈管の合計の長さを５，０００μｍ／ｍｍ２以上とすることができることが明らかとなった。
［実験例２］
（立体的細胞構造体の形成２）
　本実験例は、実験例１と比較して、コラーゲンの終濃度、ヘパリンの終濃度、細胞の培養時間が主に異なっていた。まず、４．２５×１０５細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及び４．５×１０３細胞のＧＦＰ導入ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を、０ｍｇ／ｍＬ、０．００２ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、又は１０．０ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と、０ｍｇ／ｍＬ、又は０．３ｍｇ／ｍＬコラーゲン／５ｍＭ酢酸溶液（ｐＨ３．７）溶液との等量混合液に懸濁した。この結果、混合物におけるコラーゲンの終濃度は、それぞれ、０ｍｇ／ｍＬ、又は０．１５ｍｇ／ｍＬとなり、ヘパリンの終濃度は、それぞれ、０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、又は５．０ｍｇ／ｍＬとなった。なお、コラーゲンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬである実験例は、ヘパリンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬの場合のみ行った。
　続いて、得られた混合物を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、粘稠体を得た。続いて、得られた粘稠体を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに懸濁した。続いて、得られた懸濁液の全量を９６ウェルセルカルチャーインサート内に播種し、室温、４００×ｇで１分間遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞層が形成された。セルカルチャーインサートに播種された細胞の密度は２９，５５０個／ｍｍ２であった。
　続いて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭをセルカルチャーインサートの内側及び外側の合計液量が２ｍＬ超となる様に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％Ｏ２）中で培養した（この培養を開始した時点を培養開始時とする）。培養開始時から２４時間培養後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地交換した。以降、培養開始時から、４８時間後、９６時間後、及び１４４時間後に培地交換を行った。
《立体的細胞構造体の観察》
　培養開始時から１６８時間後に、立体的細胞構造体を上面から生きた状態で蛍光顕微鏡観察し、ＧＦＰの蛍光を検出した。図３は、蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。図３中「Ｎｏ　ｄａｔａ」は顕微鏡写真を撮影しなかったことを示す。
　その結果、コラーゲンの終濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬであり、ヘパリンの終濃度が０ｍｇ／ｍＬであったサンプルでは、その他のサンプルと比較して血管網の形成が阻害された。これに対し、コラーゲンの終濃度が０．１５ｍｇ／ｍＬ以上である場合であっても、ヘパリンの終濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬ以上であったサンプルでは、血管網の形成の阻害が有意に緩和された。
［実験例３］
（立体的細胞構造体の形成３）
　細胞外マトリックス成分として終濃度０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを使用し、高分子電解質として終濃度０．１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を使用した点以外は実験例１と同様にして立体的細胞構造体を作製した。
《立体的細胞構造体の観察》
　培養開始時から１２０時間後に、立体的細胞構造体を上面から生きた状態で蛍光顕微鏡観察し、ＧＦＰの蛍光を検出した。図４は、蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。その結果、高分子電解質としてヒアルロン酸を使用した場合には、コラーゲンによる血管網の形成の阻害が緩和されないことが明らかとなった。
［実験例４］
（混合物の流動性の確認）
　０ｍｇ／ｍＬ、０．００２ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ又は２．０ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭ又は２００ｍＭのトリス－塩酸緩衝液と、０．２ｍｇ／ｍＬ、又は０．３ｍｇ／ｍＬのコラーゲン／５ｍＭの酢酸溶液との等量混合物を１．５ｍＬチューブ内で調製した。この結果、表２に記載される条件１～８に記載の通り、混合物におけるコラーゲンの終濃度は、それぞれ、０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．１５ｍｇ／ｍＬとなり、ヘパリンの終濃度は、それぞれ、０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、又は１．０ｍｇ／ｍＬとなった。
　条件１～８の１ｍＬの混合物のｐＨを測定した。混合物を含むチューブを４℃で一晩静置した。チューブを３７℃で３０分間インキュベーションした後、チューブを上下反転させ、１秒間後にチューブ内の混合物が流動するか目視で確認した。混合物が流動したものを「流動性あり」、流動しなかったものを「流動性なし」と判断した。各条件における混合物のｐＨと流動性を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　条件１ではｐＨ６．９６であり、混合物がヘパリンを含んでいなくても流動性を有していた。条件３、５～８の結果より、混合物がヘパリンを含有すると混合物のｐＨが７．３８以上である場合でも流動性を有し、脈管網を有する立体細胞構造体の作製に適していることが見出された。また、条件５の結果から、ヘパリン濃度が０．００１ｍｇ／ｍＬであっても混合物の流動性を向上させることが確認された。さらに条件３、５～８の結果より、混合物中のコラーゲン濃度に対するヘパリン濃度が変動しても混合物の流動性を向上させることが分かった。
　一方で、ヘパリンを含まずｐＨが７．３８である条件２と条件４では、混合物がゲル化し、流動性がなかった。
　本発明によれば、十分な厚さを有し、脈管網を有する、立体的細胞構造体の製造技術を提供することができる。

Claims (7)

  1. 　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質とを混合して混合物を得る工程と、
    　前記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得る工程と、
    　前記細胞集合体を培地中で培養し、厚さが１５０μｍ超であり、脈管網を有する立体的細胞構造体を得る工程と、を含み、
    　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン又はコラーゲン類縁体であり、
    　前記高分子電解質が、前記混合物における終濃度０．００１ｍｇ／ｍＬ以上のヘパリン又はヘパリン類縁体である、立体的細胞構造体の製造方法。
  2. 　前記細胞集合体を培地中で培養する工程において、前記細胞集合体を、培養容器の面積に対して１，０００個／ｍｍ２～１，０００，０００個／ｍｍ２の細胞密度で播種して培養する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記脈管網を構成する脈管の合計の長さが、５，０００μｍ／ｍｍ２以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記細胞集団が線維芽細胞を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記混合物のｐＨが、７．２～７．６である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記混合物が流動性を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
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