CN109072277A - 癌化可能性的评价方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及评价癌化可能性的方法,其具有下述工序:将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序;和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标,评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序;所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液,在所述评价工序中,当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比,构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时,评价为所述受检者发生癌化的可能性高。
Description
技术领域
本发明涉及用于使用由正常细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体评价受检者的癌化可能性的方法及试剂盒。
本申请主张基于2016年4月19日在日本申请的日本特愿2016-083949号的优先权,其内容援引至本申请。
背景技术
近年来,正在积极地以液体活检为对象研究癌的早期发现、恶化及转移的预测等的生物标记物。
作为液体活检中的代表性的生物标志物,可以举出例如蛋白、核酸(例如ccfDNA、microRNA等)、循环肿瘤细胞(CTCs)、细胞外分泌物囊泡(Exosome,外泌体)等。其中,外泌体作为与以癌为代表的疾病的发病、恶化、发展以及转移等各种情况密切相关的生物标志物,近年来得到广泛研究。
外泌体是指在大部分细胞中分泌的直径为40nm~150nm左右的膜囊泡。
生物体中,可在唾液、血液、尿、羊水、恶性腹水等体液中观察到,也可从培养细胞分泌。近年来,外泌体被指出有承担向分离的细胞或组织传递信息作用的可能性。外泌体中包括各种蛋白、脂质、核酸,认为通过被搬运到其他细胞而引起功能变化或生理变化。作为其具体例,启示具有介导针对感染性病原体或肿瘤的适应性免疫应答、组织修复、神经传递、病原性蛋白搬运等作用。
在最新的研究中,清楚了外泌体中内含的microRNA的亚群根据分泌它们的肿瘤细胞种类的不同而不同。另外,发现了特异性地内包于来自癌患者(胰腺癌)的外泌体内的被称为Glypican1(GPC 1)的蛋白,显示外泌体所内含的核酸、蛋白在癌的早期发现、预后诊断及疾病状态监测中传递有益的信息(例如参照非专利文献1)。
另外,还报告了外泌体与癌的转移、恶化(血管新生、增殖效率提高)密切相关(例如参照非专利文献2、3、4)。
现有技术文献
专利文献
非专利文献1:Sonia A.m.,et al.,“Glypican-1identifies cancer exosomesand detects early pancreatic cancer”,NATURE,vol.523,p177-182,2015.
非专利文献2:Ayuko H.,et al.,“Tumour exosome integrins determineorganotropic metastasis”,NATURE,vol.527,p329-335,2015.
非专利文献3:Hillary E.m.,et al.,“Extracellular vesicle-mediatedphenotype switching in malignant and non-malignant colon cells”,BMC Cancer,15:571,p1-14,2015.
非专利文献4:Mara F.R.,et al.,“Exosomes Function in Pro-and Anti-Angiogenesis”,NIH-PA,2(1),p54-59,2013.
发明内容
发明所要解决的课题
目前作为诊断方法得到应用化研究的方法大部分是对体液中的外泌体所内含的特定的核酸、蛋白的量等进行测量的方法,从外泌体实际地在体内发挥怎样的作用和效果的观点出发,还没有能够进行检查及诊断的技术或方法的报告。
本发明是鉴于上述情况而完成的,其提供一种用于迅速、简便且更低侵袭性地评价受检者的癌化可能性的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们发现了,从癌症患者采集的体液试样等生物试样中含有从癌细胞分泌的有助于癌化的因子,通过研究来自癌症患者或怀疑有癌的患者的生物试样对由正常细胞形成的细胞结构体中的脉管网结构的影响,来评价该患者的癌化可能性的方法,从而完成了本发明。
本发明的第一方式的评价癌化可能性的方法具有下述工序:将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序;和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标,评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序;所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液,在所述评价工序中,当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比,构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时,评价为所述受检者发生癌化的可能性高。
所述体液试样可以是血液、血清、血浆、尿、白膜、唾液、精液、胸部渗液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱灌洗液或支气管肺泡灌洗液。
所述生物试样可以含有外泌体。
所述细胞结构体可以含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的一种以上。
所述细胞结构体可以进一步含有选自由成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的1种以上。
所述细胞结构体可以进一步含有成纤维细胞,所述细胞结构体中的所述血管内皮细胞和所述淋巴细胞的总细胞数可以为所述成纤维细胞的细胞数的0.1%以上。
所述细胞结构体的厚度可以为5μm~500μm。
构成所述细胞结构体的细胞层的数量可以为2层~60层。
在所述培养工序中,可以进行3天~14天的培养。
在所述培养工序中,相对于所述正常细胞2×106个的所述外泌体的数量可以为1×103个以上。
本发明的第二方式的用于评价癌化可能性的试剂盒包含细胞培养容器和在所述细胞培养容器上构建的由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体。
发明效果
根据本发明的上述方式,由于能够使用血液等体液试样进行怀疑癌化的受检者发生癌化的可能性的评价,因此能够更低侵袭性地对受检者的癌化进行评价。
附图说明
图1是表示实施例1中的外泌体添加个数为0个、1×107个、1×108个、1×109个的来自血管网的荧光发光区域及来自外泌体的荧光发光区域的图像。
图2(左图)是表示实施例1中的外泌体添加个数为1×109个的细胞结构体的右图所示的荧光发光区域的荧光强度分布的曲线图。(右图)是表示对实施例1中的外泌体添加个数为1×109个的细胞结构体的来自血管网的荧光发光区域和来自外泌体的荧光发光区域的图像。
具体实施方式
<<用于评价被检者的癌化可能性的方法>>
本发明的一个实施方式的评价癌化可能性的方法提供具有以下工序的癌化可能性的评价方法:将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序;和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标,评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序。在受检者发生癌症的情况下,来自该受检者的生物试样中含有由癌细胞分泌的microRNA等癌因子。本实施方式的方法中,通过研究生物试样中含有癌因子与否对由正常细胞形成的脉管网结构的影响来进行评价,根据该评价来评价受检者的癌化可能性。
通过本实施方式的方法,不一定需要癌组织本身的活检,即使使用可更低侵袭性地采集的体液试样,也能够评价癌化的可能性。另外,由于在癌化可能性的评价中不需要基因分析,因此能够更简便地进行癌化评价。特别是外泌体也被用于癌的早期发现,通过使用本实施方式的方法,能够期待应用于原发性癌或复发性癌的早期发现等诊断技术。
通常,“外泌体”是指各种细胞所分泌的直径为40nm~150nm的膜囊泡。已知在该膜囊泡中含有miRNA、mRNA等核酸、蛋白、脂质等。由于从癌细胞分泌的外泌体中含有与癌化相关的microRNA、蛋白,因此当将由正常细胞形成的细胞结构体在由癌细胞分泌的外泌体存在下进行培养时,会引起构成该细胞结构体的细胞的癌化。
以下对本实施方式的方法详细地进行说明。
[细胞结构体]
本实施方式和本申请说明书中,“细胞结构体”是指层叠有多个细胞层的三维结构体。本实施方式中使用的细胞结构体(以下有时称为“本实施方式的细胞结构体”)具备脉管网结构,由构成脉管的内皮细胞和未构成脉管的细胞(除内皮细胞以外的细胞)构成。即,本实施方式的细胞结构体是在未形成脉管的细胞的层叠体的内部三维构建淋巴管和/或血管等的脉管网结构,构建了更接近于生物体内的组织的结构体。脉管网结构可以仅形成在细胞结构体的内部,也可以形成为至少其一部分露出到细胞结构体的表面或底面。
作为本实施方式的细胞结构体中所含的内皮细胞,可以是血管内皮细胞,也可以是淋巴管内皮细胞。另外,也可以含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者。
作为本实施方式的细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞的细胞种类,只要是不阻碍内皮细胞形成脉管网的细胞种类则没有特别限定,可以考虑体液试样的种类、生物体内的环境等来适当选择。作为本实施方式的细胞结构体中的除内皮细胞以外的细胞,由于内皮细胞容易形成保持本来的功能和形状的脉管网,因此优选是在生物体内构成脉管的周边组织的细胞。作为这样的细胞,可以举出例如成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞、平滑肌细胞等。细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞可以为1种,也可以为2种以上。作为本实施方式的细胞结构体,优选作为除内皮细胞以外的细胞至少包含成纤维细胞的细胞,更优选包含血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、包含淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、或包含血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞。另外,作为细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞,可以是来自与内皮细胞同种的生物种的细胞,也可以是来自异种的生物种的细胞。
本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞的数量只要是足以形成脉管网结构的数量则没有特别限定,可以考虑细胞结构体的大小、内皮细胞、除内皮细胞以外的细胞的细胞种类等来适当确定。例如,通过使内皮细胞相对于构成本实施方式的细胞结构体的全部细胞的存在比(细胞数比)为0.1%以上,能够制备形成有脉管网结构的细胞结构体。在使用成纤维细胞作为除内皮细胞以外的细胞的情况下,本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞数优选为成纤维细胞数的0.1%以上,更优选为0.1~10.0%,进一步优选为0.1~5.0%。在作为内皮细胞含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者的情况下,血管内皮细胞和淋巴管表皮细胞的总细胞数优选为成纤维细胞数的0.1%以上,更优选为0.1~10.0%,进一步优选为0.1~5.0%。
构成本实施方式的细胞结构体的细胞的种类没有特别限定,可以是从动物采集的细胞,也可以是对从动物采集的细胞进行培养而得到的细胞,也可以是对从动物采集的细胞实施各种处理而得到的细胞,也可以是培养细胞株。为从动物采集的细胞的情况下,采集部位没有特别限定,可以是来自骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等的体细胞,也可以是生殖细胞,也可以是胚胎性干细胞(ES细胞)。另外,构成本实施方式的细胞结构体的细胞所来源的生物种没有特别限定,例如可以使用来自人、猴子、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等动物的细胞。作为对从动物采集的细胞进行培养而得到的细胞,可以是初代培养细胞,也可以是传代培养细胞。另外,作为实施各种处理而得到的细胞,可以举出诱导多能性干细胞(iPS细胞)、分化诱导后的细胞。另外,本实施方式的细胞结构体可以仅由来自同种生物种的细胞构成,也可以由来自多种生物种的细胞构成。
构成本实施方式的细胞结构体的细胞全部为正常细胞。通常,正常细胞是指未发生癌化的细胞,是根据身体或周围的状况而具有增殖或停止增殖的能力的细胞。
作为构成本实施方式的细胞结构体的正常细胞,可以是从未发生癌化的动物采集的细胞、或从未发生癌化的动物分离且获得永生能力的、在体外稳定维持的细胞(细胞株)、在从未发生癌化的动物分离后人为地进行了基因改变的未发生癌化的细胞。另外,也可以是未发生癌化的培养细胞株。
本实施方式的细胞结构体的大小和形状只要能够形成脉管网结构则没有特别限定。从能够形成更接近于形成在生物体内的组织内的脉管的状态的脉管网结构的角度出发,该细胞结构体的厚度优选为5μm以上,更优选为10μm以上,进一步优选为50μm以上,更进一步优选为100μm以上。作为该细胞结构体的厚度,还优选为500μm以下,更优选为400μm以下,进一步优选为300μm以下。作为本实施方式的细胞结构体的细胞层的数量,优选2~60层左右,更优选5~60层左右,进一步优选为10~60层左右。
需要说明的是,构成细胞结构体的细胞层数通过将构成三维结构的细胞的总数除以每1层的细胞数(构成1层所需的细胞数)来测定。每1层的细胞数可以通过在使细胞结构体构成时所使用的细胞培养容器中,预先平面地培养细胞使其达到满铺来研究。具体而言,在某个细胞培养容器中形成的细胞结构体的细胞层数可以通过测量构成该细胞结构体的总细胞数,然后除以该细胞培养容器的每1层的细胞数来计算。
通常,本实施方式的细胞结构体构建在细胞培养容器中。作为该细胞培养容器,只要是能够构建细胞结构体并且能够培养所构建的细胞结构体的容器则没有特别限定。作为该细胞培养容器,具体而言,可以举出培养皿、插入式细胞培养器(例如Transwell(注册商标)inserts、Netwell(注册商标)inserts、Falcon(注册商标)插入式细胞培养器、Millicell(注册商标)插入式细胞培养器等)、试管、烧瓶、培养瓶和培养平板等。本实施方式的细胞结构体的构建中,由于能够更适当地进行使用了该细胞结构体的癌化预测,因此优选培养皿或各种插入式细胞培养器。
本实施方式的细胞结构体只要是由形成有脉管网结构的多层细胞形成的结构体即可,其构建方法没有特别限定。例如,可以是一层一层地构建并依次层叠进行构建的方法,也可以是一次构建2层以上的细胞层的方法,也可以是适当组合两种构建方法来构建多层的细胞层的方法。另外,本实施方式的细胞结构体可以是构成各细胞层的细胞种类在每层不同的多层结构体,也可以是构成各细胞层的细胞种类在结构体的全部层中相同的细胞结构体。例如,可以是通过每一种细胞地形成层、使该细胞层依次层叠来进行构建的方法,也可以是预先制备混合了多种细胞的细胞混合液、由该细胞混合液一次构建多层结构的细胞结构体的方法。
作为一层一层地构建并依次层叠进行构建的方法,可以举出例如日本专利第4919464号公报中记载的方法,即通过交替地重复形成细胞层的工序和使所形成的细胞层与含有ECM(细胞外基质)的成分的溶液接触的工序,由此连续地层叠细胞层的方法。例如,在进行该方法时,通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物,利用该细胞混合物形成各细胞层,由此能够构建在结构体整体上形成有脉管网结构的细胞结构体。另外,通过每一种细胞地形成各细胞层,能够构建仅在由内皮细胞形成的层中形成有脉管网结构的细胞结构体。
作为一次构建2层以上的细胞层的方法,可以举出例如日本专利第5850419号公报中记载的方法。即可以举出如下方法:预先将细胞的整个表面用含有与整合素结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的高分子、和与含有所述RGD序列的高分子发生相互作用的高分子被覆,在将被该粘接膜被覆的被覆细胞收纳到细胞培养容器中后,通过离心处理等使被覆细胞彼此聚集,由此构建由多层细胞层形成的细胞结构体。例如,在进行该方法时,使用通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物、在该细胞混合物中添加粘接性成分而制备的被覆细胞。由此,通过一次离心处理,能够构建在结构体整体形成有脉管网结构的细胞结构体。另外,例如分别单独地制备被覆了内皮细胞的被覆细胞和被覆了成纤维细胞的被覆细胞,形成由成纤维细胞的被覆细胞形成的多层,然后在其上层叠由内皮细胞的被覆细胞形成的一层,再在其上层叠由成纤维细胞的被覆细胞形成的多层。由此,能够构建具备被具有厚度的成纤维细胞层夹持的脉管网结构的细胞结构体。
本实施方式的细胞结构体也可以通过具有下述(a)~(c)工序的方法构建。
(a)在阳离子性缓冲液中将细胞和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序,
(b)将通过所述工序(a)得到的混合物接种到细胞培养容器中的工序,和
(c)在所述工序(b)之后,从所述细胞培养容器中的细胞混合物中除去液体成分,得到在该细胞培养容器中多层层叠细胞而成的细胞结构体的工序。
本实施方式中,在工序(a)中,通过将细胞与含有阳离子性物质的缓冲液(阳离子性缓冲液)和细胞外基质成分混合,由该细胞混合物形成细胞集合体,从而可以得到内部大的空隙少的立体细胞组织。另外,得到的立体细胞组织比较稳定,因此能够进行至少数天的培养,并且在培养基更换时组织也不易崩解。
另外,本实施方式中,在工序(b)中,可以包含使接种于细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的工序。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等主动地使细胞沉降,也可以使其自然沉降。
在工序(a)中,优选将细胞进一步与强电解质高分子混合。通过将细胞与阳离子性物质、强质解质高分子以及细胞外基质成分混合,即使在工序(b)中不需要离心分离等主动地使细胞集合的处理而使其自然沉降的情况下,也能够得到空隙少、具有厚度的立体性细胞组织。
作为上述阳离子性缓冲液,可以举出例如Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、双-Tris-缓冲液或HEPES等。该阳离子性缓冲液中的阳离子性物质(例如Tris-盐酸缓冲液中的Tris)的浓度和pH只要不对细胞的生长和细胞结构体的构建带来不良影响,则没有特别限定。例如,阳离子性缓冲液中的阳离子性物质的浓度可以设为10~100mM,优选为40~70mM,更优选为50mM。另外,该阳离子性缓冲液的pH可以设为6.0~8.0,优选为6.8~7.8,更优选为7.2~7.6。
作为上述强电解质高分子,可以举出例如肝素、硫酸软骨素(例如4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素)、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸等糖胺聚糖;硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、褐藻糖胶、卡拉胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、及聚丙烯酸、或它们的衍生物等,但并不限定于这些。工序(a)中制备的混合物中,可以仅混合1种强电解质高分子,也可以组合使用2种以上。本实施方式的细胞结构体的构建中,高分子电解质优选为糖胺聚糖。另外,更优选使用肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的至少一种。本实施方式中使用的强电解质高分子进一步优选为肝素。
与上述阳离子性缓冲液混合的强电解质高分子的量只要不对细胞的生长及细胞结构体的构建带来不良影响,则没有特别限定。例如,阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的浓度可以设为大于0mg/mL且小于1.0mg/mL,优选为0.025~0.1mg/mL,更优选为0.05~0.1mg/mL。另外,本实施方式中,也可以不混合上述强电解质地制备上述混合物,进行细胞结构体的构建。
作为上述细胞外基质成分,可以举出例如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖或它们的修饰体或变体等。在蛋白聚糖中,可以举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖等。在工序(a)中制备的混合物中,可以仅混合1种细胞外基质成分,也可以组合混合2种以上。本实施方式的细胞结构体的构建中,优选使用胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白,更优选使用胶原。只要不对细胞的生长和细胞结构体的形成产生不良影响,也可以使用上述的细胞外基质成分的修饰体或变体。与上述阳离子性缓冲液混合的细胞外基质成分的量只要不对细胞的生长及细胞结构体的构建带来不良影响,则没有特别限定。例如,阳离子性缓冲液中的细胞外基质成分的浓度可以设为大于0mg/mL且小于1.0mg/mL,优选为0.025~0.1mg/mL,更优选为0.05~0.1mg/mL。
与上述阳离子性缓冲液混合的强电解质高分子与细胞外基质成分的配合比为1:2~2:1。本实施方式的细胞结构体的构建中,强电解质高分子与细胞外基质成分的配合比优选为1:1.5~1.5:1,更优选为1:1。
重复工序(a)~(c),具体而言,在工序(c)中得到的细胞结构体上,作为工序(b),接种工序(a)中制备的混合物,然后进行工序(c),重复上述工序,由此可以构建充分厚度的细胞结构体。在工序(c)中得到的细胞结构体上新接种的混合物的细胞组成可以与构成已构建的细胞结构体的细胞组成相同,也可以不同。
例如,首先,在工序(a)中制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物,进行工序(b)及(c),得到在细胞培养容器中由10层成纤维细胞层形成的细胞结构体。接着,作为工序(a),制备作为细胞仅含有血管内皮细胞的混合物,进行工序(b)和(c),在细胞培养容器内的10层成纤维细胞层上层叠1层血管内皮细胞层。进而,作为工序(a),制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物,进行工序(b)及(c),在细胞培养容器内的血管内皮细胞层上层叠10层成纤维细胞层。由此,能够构建成纤维细胞层10层-血管内皮细胞层1层-成纤维细胞层10层这样每一种细胞依次层叠成层状的细胞结构体。通过调节在工序(b)中接种的细胞数,可以调整工序(c)中层叠的细胞层的厚度。工序(b)中接种的细胞数越多,工序(c)中层叠的细胞层的数量就越多。另外,在工序(a)中,制备将成纤维细胞层20层量的成纤维细胞和血管内皮细胞层1层量的血管内皮细胞全部混合而成的混合物,进行工序(b)及(c),由此能够构建具有21层量的厚度、血管网结构分散在结构体内部的细胞结构体。
重复工序(a)~(c)时,可以在进行工序(c)之后、工序(b)之前,对得到的细胞结构体进行培养。培养中使用的培养基的组成、培养温度、培养时间、培养时的大气组成等培养条件以适于构成该细胞结构体的细胞的培养的条件进行。作为培养基,可以举出例如D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
工序(a)之后,进行(a’-1)从得到的混合物中除去液体部分、得到细胞集合体的工序,和(a’-2)将细胞集合体悬浮在溶液中的工序,也可以进入到工序(b)。
另外,工序(a)之后,代替所述工序(b),也可以进行下述工序(b’-1)和(b’-2)。本实施方式和本申请说明书中,“细胞粘稠体”是指如非专利文献2中记载那样的凝胶样的细胞集合体。
(b’-1)将工序(a)中得到的混合物接种到细胞培养容器内后,从混合物中除去液体成分,得到细胞粘稠体的工序,
(b’-2)在细胞培养容器内将细胞粘稠体悬浮于溶剂中的工序。通过实施上述工序(a)~(c),可以得到所期望的组织体,但通过在工序(a)之后实施(a’-1)和(a’-2)、实施工序(b),能够得到更均匀的组织体。
作为用于制备细胞悬浮液的溶剂,只要对细胞没有毒性、不损害增殖性和功能则没有特别限定,可以使用水、缓冲液、细胞的培养基等。作为该缓冲液,可以举出例如磷酸生理盐水(PBS)、HEPES、Hanks缓冲液等。作为培养基,可以举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
代替上述工序(c),也可以进行下述工序(c’)。
(c’)从所接种的混合物中除去液体成分,在基材上形成细胞层的工序。
工序(c)和(c’)中的液体成分的除去处理的方法只要不对细胞的生长和细胞结构体的构建带来不良影响,则没有特别限定,作为从液体成分和固体成分的悬浮液中除去液体成分的方法,可以通过本领域技术人员公知的方法适当进行。作为该方法,可以举出例如离心分离处理、磁性分离处理、或过滤处理等。例如,在使用插入式细胞培养器作为细胞培养容器的情况下,通过将接种有混合物的插入式细胞培养器以10℃、400×g供于1分钟的离心分离处理,由此能够除去液体成分。
[培养工序]
将本实施方式的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养。本实施方式中的受检者是指癌症患者或者怀疑有癌的患者。具体而言,在混合有来自受检者的生物试样的培养基中培养细胞结构体。与培养基混合的生物试样的量可以考虑生物试样的种类、构成细胞结构体的细胞的种类、数量、培养基的种类、培养温度、培养时间等培养条件来实验确定。
本实施方式的方法中,作为成为应用对象的癌,没有特别的限定,可以举出例如乳腺癌(例如浸润式导管癌、非浸润性导管癌、炎症性乳腺癌等)、前列腺癌(例如激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌等)、胰腺癌(例如胰管癌等)、胃癌(例如乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌等)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤等)、结肠癌(例如消化道间质肿瘤等)、直肠癌(例如消化道间质肿瘤等)、大肠癌(例如家族性大肠癌、遗传性非息肉性大肠癌、消化道间质肿瘤等)、小肠癌(例如非何杰金氏淋巴瘤、消化道间质肿瘤等)、食道癌、十二指肠癌、舌癌、咽癌(例如上咽癌、中咽癌、下咽癌等)、头颈部癌、唾液腺癌、脑肿瘤(例如松果体星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤等)、神经鞘瘤、肝脏癌(liver cancer)(例如原发性肝癌、肝外胆管癌等)、肾癌(例如肾细胞癌、肾盂和输尿管的转移上皮癌等)、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌(hepatoma)、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢性生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性度肿瘤等)、膀胱癌、尿道癌、皮肤癌(例如眼内(眼)黑色素瘤、Merkel细胞癌等)、血管瘤、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、何杰金氏病等)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌等)、甲状旁腺癌、鼻窦癌、副鼻窦癌、骨肿瘤(例如骨肉瘤、尤文氏瘤、子宫肉瘤、软组织肉瘤等)、转移性髓母细胞瘤、血管纤维瘤、隆起性皮肤纤维肉瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、睾丸肿瘤、儿童实体癌(例如肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤等)、kaposi肉瘤、AIDS引起kaposi肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性骨髓增殖性疾病、白血病(例如急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病等)等,并不限定于这些。
作为本实施方式中使用的来自受检者的生物试样,可以举出从受检者采集的体液试样、从受检者采集的细胞的细胞提取液、或从受检者采集的细胞的培养上清液。细胞提取液、培养上清液中也含有从细胞分泌的外泌体,因此与从受检者采集的体液试样同样地,可以使用细胞提取液或培养上清液。
作为本实施方式中使用的从受检者采集的体液试样,只要是含有来自癌细胞、参与癌化的核酸、蛋白等的试样即可,没有特别限定。本实施方式中,优选含有外泌体的体液试样。外泌体包含在大部分体液中。因此,作为本实施方式中使用的从受检者采集的体液试样,没有特别限定,可以使用血液、血清、血浆、尿、白膜、唾液、精液、胸部渗液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱灌洗液、支气管肺泡灌洗液等通常在液体活检中采集的体液。
在培养工序中,作为向细胞结构体的培养基中添加的体液试样,可以是从受检者直接采集的体液,也可以是利用缓冲液等对所采集的体液进行稀释、或进行提取特定成分等的前处理后的试样。例如,可以从体液试样将外泌体回收、浓缩、精制、分离。关于回收、浓缩、精制、分离方法,可以根据上述例示的体液试样的种类、状态等任意选择。
在培养工序中,作为所使用的培养基,只要是含有细胞的生存增殖所需的成分(无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素)等的基础培养基即可,可以根据细胞的种类适当选择。例如,可以举出DMEM、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI-1640、Basal Medium Eagle(BME)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:NutrientMixture F-12(DMEM/F-12)、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)等,并不限定于这些。
在培养工序中,作为培养温度,优选25℃~40℃,更优选30℃~39℃,进一步优选35℃~39℃。培养环境只要是不直接影响药剂、细胞及组织的维持且能够在任意期间保持适于所使用的细胞培养的环境的环境,则可以任意设定。另外,根据需要,只要不显著改变培养环境,则还可以加入回流等流体力学的载荷。另外,培养环境例如可以是约5%的CO2条件下。
在培养工序中,作为培养时间,可以根据液性物质的来源、量等任意设定。作为培养时间,例如优选3天~14天,更优选4天~10天,进一步优选4天~8天。
在培养工序中,作为上述外泌体的数量,可以根据上述正常细胞的种类、数量等任意设定。作为上述外泌体的数量,例如,相对于上述正常细胞2×106个,优选为1×103个以上,更优选为1×107个以上,进一步优选为1×107个~1×1012个。
[评价工序]
接着,将培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标,评价所述受检者发生癌化的可能性。具体而言,与在生物试样未存在下进行培养的情况相比,构成细胞结构体中的脉管的细胞数多时、或者细胞结构体中的脉管网结构伸长时,评价为该受检者发生癌化的可能性高。另一方面,与在生物试样未存在下进行培养的情况相比,构成细胞结构体中的脉管的细胞数少时、或者细胞结构体中的脉管网结构未伸长时,评价为该受检者发生癌化的可能性低。
脉管有无伸展例如可以通过对构成脉管的细胞进行标记以与其他细胞区别,将来自该标记的信号作为指标进行研究。例如,通过对构成脉管的细胞进行荧光标记,能够直接观察细胞结构体中的脉管。另外,使用图像分析技术,对在生物试样存在下培养得到的细胞结构体的荧光图像与在生物试样未存在下培养得到的细胞结构体的荧光图像进行比较,能够研究利用生物试样是否加速了脉管网结构的伸展。另外,构成脉管的细胞的荧光标记例如可以通过将针对特异性表达在构成脉管的细胞的细胞表面上的物质的抗体作为一次抗体、使用与该一次抗体特异性结合的荧光标记二次抗体的免疫染色法等公知的方法进行。
构成脉管的细胞数也可以同样地,通过对构成脉管的细胞(内皮细胞)进行标记、将来自该标记的信号作为指标进行研究。例如,在对构成脉管的细胞进行荧光标记的情况下,细胞结构体的荧光图像中的总荧光强度或荧光发光区域面积依赖于构成脉管的细胞数。当构成脉管的细胞数多时,总荧光强度变大,荧光发光区域面积变多。因此,对于在生物试样存在下培养得到的细胞结构体的荧光图像和在生物试样未存在下培养得到的细胞结构体的荧光图像,通过比较荧光强度或荧光发光区域面积,能够比较构成脉管的细胞数。此外,也可以在破坏对构成脉管的细胞进行标记后的细胞结构体的立体结构后,仅对利用FACS(荧光激活细胞分选术,fluorescence activated cell sorting)等标记的细胞进行直接计数。
作为标记内皮细胞的标记物,可以举出例如荧光色素、荧光微珠、量子点、生物素、抗体、抗原、能量吸收性物质、放射性同位素、化学发光体、酶等,并不限定于这些。其中,优选使用荧光色素,作为荧光色素,更具体而言,可以举出例如FAM(羧基荧光素)、JOE(6-羧基-4’,5’-二氯2’,7’-二甲氧基荧光素)、FITC(异硫氰酸荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(5'-六氯-荧光素-CE亚磷酰胺)、Cy3、Cy5、Alexa568、Alexa647、PKH26、PKH67GL等。
<<用于评价癌化可能性的试剂盒>>
本发明的一个实施方式的用于评价受检者的癌化可能性的试剂盒提供一种包含细胞培养容器和由构建在所述细胞培养容器上的正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体的试剂盒。
根据本实施方式的试剂盒,能够更迅速且简便地评价受检者的癌化可能性。
本实施方式中,作为细胞培养容器及细胞结构体,可以举出与在上述的<<用于评价受检者的癌化可能性的方法>>中例示的细胞结构体同样的细胞结构体。
本实施方式的试剂盒还可以包含细胞结构体的培养基、用于标记由内皮细胞形成的脉管细胞的标记物质、构建细胞结构体时使用的物质(例如阳离子性缓冲液、强电解质高分子、细胞外基质成分等)、用于计数细胞结构体的细胞数的检测装置等。
作为培养基等,可以举出与上述的<<用于评价受检者的癌化可能性的方法>>中例示的培养基同样的培养基。另外,作为检测装置,可以举出酶标仪、荧光扫描仪、双光子激发扫描仪、荧光显微镜等。
实施例
以下,通过实施例说明本发明,但本发明并不限于以下的实施例。
[实施例1]使用了来自大肠癌细胞株的外泌体的癌化评价(1)
作为由正常细胞构成的血管网结构形成体的构成细胞,使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制,CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)这2种,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(System Biosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记与利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于外泌体,使用通过超离心处理从人结肠直肠腺癌细胞株HCT116(ATCC(注册商标)、CCL-247)的培养上清液回收的外泌体,对0个、1×107个、1×108个、1×109个这4个条件实施评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟,除去液体成分。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]外泌体的添加和共培养
(1)将适量的培养基与外泌体混合,制备含有0个、1×107个、1×108个、1×109个的外泌体溶液。
(2)将各外泌体溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养96~192小时。
[3]血管网形成的评价
将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记与利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于图1和表1。
[表1]
从图1和表1可以确认,相对于外泌体添加个数为0个时,1×107个、1×108个、1×109个时更为优势地促进了血管网形成,即发生了癌化。另外,对于荧光发光区域,外泌体添加个数为0个时为190×105μm2,而1×107个时为211×105μm2、1×108个时为298×105μm2,1×109个时为311×105μm2,也表示与外泌体的添加个数成比例地促进了血管网形成,即癌化进展。
另外,图2中示出了外泌体添加个数为1×109个的细胞结构体的左图所示部位的荧光强度分布。图中,实线部是来自构成血管网的细胞的荧光强度,虚线部是来自外泌体的荧光强度。在来自外泌体的荧光强度强的部位,来自构成血管网的细胞的荧光强度较强,确认了血管网形成在外泌体作用下得到促进。
[实施例2]使用了来自大肠癌细胞株的外泌体的癌化评价(2)
将HUVEC数相对于NHDF数的比例(HUVEC含有率)变更为0.05、0.25、0.5或1.5%,除此以外,与实施例1同样地构建细胞结构体。其结果,在将HUVEC含有率设为0.25、0.5或1.5%时构建的细胞结构体中形成有血管网结构,与此相对,在将HUVEC含有率设为0.05%时构建的细胞结构体中未形成血管网结构。
按照外泌体添加个数为0或1×108个的方式添加,除此以外,与实施例1同样地在外泌体存在下培养细胞结构体,评价血管网形成。将结果示于表2。
[表2]
由表2可以确认,在HUVEC的细胞数相对于NHDF的细胞数的比例为0.05、0.25、0.5、1.0、1.5%的全部条件下,相对于外泌体添加个数为0个时,外泌体为1×108个时促进了血管网的形成,即发生了癌化。
[实施例3]使用了来自大肠癌细胞株的外泌体的癌化评价(3)
按照外泌体添加个数为0或1×108个的方式添加,并将培养天数设为4天、6天、8天这3个条件,除此以外,与实施例1同样地在外泌体存在下培养细胞结构体,评价血管网的形成。将结果示于表3。
[表3]
从表3可以确认,在培养天数为4天、6天、8天的全部条件下,相对于外泌体添加个数为0个的情况,外泌体为1×108个时促进了血管网的形成,即发生了癌化。
[实施例4]使用了由来自肺的间质细胞构成的细胞结构体的癌化可能性评价
实施例4中,对使用由来自肺的间质细胞构成的细胞结构体代替上述实施例1~3的由NHDF和HUVEC构成的细胞结构体的情况也进行了研究。
作为由正常细胞构成的血管网结构形成体的构成细胞,使用人肺成纤维细胞(Normal Human Pulomonary Fibroblasts:NHPF)(Promocell公司制,产品编号:C-12360)、人肺微小血管内皮细胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell:HMVEC-L)(Lonza公司制,产品编号:CC-2527)这2种,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(SystemBiosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于血清,使用来自阶段IV大肠癌患者的血清V1。关于外泌体,使用通过超离心处理从来自阶段IV大肠癌患者的血清V1回收、在与原来的血清量相同容量的培养基中进行再悬浮而得到的外泌体。对于血清、外泌体,分别对添加量为0μL、10μL、50μL这3个条件实施评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHPF和1×105个HMVEC-L悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]血清、外泌体的添加和共培养
(1)将适量的培养基和血清0μL、10μL、50μL混合,制备血清培养基溶液。另外,将适量的培养基与外泌体0μL、10μL、50μL混合,制备外泌体培养基溶液。
(2)将血清培养基溶液、外泌体培养基溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养144小时。
[3]血管网形成的评价
将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于表4及表5。
[表4]
[表5]
由表4可知,相对于血清添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网的形成。另外,对于荧光发光区域,血清添加量为0μL时为252×105μm2,而10μL时为359×105μm2、50μL时为481×105μm2,也是与血清添加量成比例地促进了血管网形成。
另外,如表5所示,相对于外泌体添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网形成。另外,对于荧光发光区域,外泌体添加量为0μL时为252×105μm2,而10μL时为351×105μm2、50μL时为438×105μm2,也是与外泌体添加量成比例地促进了血管网形成。
在使用由来自肺的间质细胞NHPF和HMVEC-L构成的细胞结构体代替实施例1~3中使用的由NHDF和HUVEC构成的细胞结构体的情况下也确认了,通过将来自癌症患者的血清、或来自癌症患者的外泌体添加到细胞结构体中,促进了血管网的形成,即发生了癌化。
[实施例5]使用了市售的来自临床大肠癌患者的血清(阶段III/IV)的癌化可能性评价
作为由正常细胞构成的血管网结构形成体的构成细胞,使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制,CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)这2种,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(System Biosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,通过将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于血清,使用来自阶段III大肠癌患者的血清024301S(Proteogenex公司,006-20000)、来自阶段IV大肠癌患者的血清024249S(Proteogenex公司,006-20000),分别对添加量为0μL、10μL、50μL这3个条件实施评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]血清的添加和共培养
(1)将适量的培养基和血清0μL、10μL、50μL混合,制备血清培养基溶液。
(2)将血清培养基溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养144小时。
[3]血管网形成的评价
将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于表6及表7。
[表6]
[表7]
由表6可知,相对于来自阶段III大肠癌患者的024301S血清添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网形成。另外,对于荧光发光区域,血清添加量为0μL时为133×105μm2,而10μL时为619×105μm2、50μL时为628×105μm2,也是与血清添加量成比例地促进了血管网形成。
由表7可知,相对于来自阶段IV大肠癌患者的血清24249S添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网的形成。另外,对于荧光发光区域,血清添加量为0μL时为133×105μm2,而10μL时为310×105μm2、50μL时为269×105μm2。
由该结果可以确认,通过本发明的上述实施方式的评价方法,至少能够判别阶段III以后的大肠癌患者。
[实施例6]使用了市售的来自临床肺癌患者的血清(阶段IV)的癌化可能性评价
作为由正常细胞构成的血管网结构形成体的构成细胞,使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制,CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC),作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(System Biosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于血清,使用来自阶段IV肺癌患者的血清024427S、024435S(Proteogenex公司,006-20000),分别对添加量为0μL、2μL这2个条件实施评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]血清的添加和共培养
(1)将适量的培养基和血清0μL、2μL混合,制备血清培养基溶液。
(2)将血清培养基溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养144小时。
[3]血管网形成的评价
将利用anti-CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)的荧光标记和利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于表8及表9。
[表8]
[表9]
由表8和表9可知,使用了任一来自阶段IV肺癌患者的血清时,相对于血清添加量为0μL的情况,2μL时更为优势地促进了血管网形成。另外,对于荧光发光区域,血清添加量为0μL时为383×105μm2,而血清024427S为2μL时为668×105μm2、血清024435S为2μL时为533×105μm2,也是通过添加血清,促进了血管网的形成。
根据该结果,确认了通过本发明的上述实施方式的评价方法,即使在肺癌中也能够判别至少阶段IV的癌症患者。
[实施例7]使用了临床大肠癌患者血清(阶段IV)的癌化可能性评价
使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制、CC-2509、Normal HumanDermal Fibroblasts:NHDF)、GFP蛋白表达人脐带静脉内皮细胞(Funakoshi公司制,cAP-0001GFP,GFP Expression Human Umbilical Vein Endothelial Cell:GFP-HUVEC)这2种,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(System Biosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,将GFP蛋白和利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于血清,使用实际从临床大肠癌患者得到的来自阶段IV大肠癌患者的血清V1、V2(实际从临床大肠癌患者得到的来自阶段IV大肠癌患者的2个血清试样),分别对添加量为0μL、10μL、50μL这3个条件实施评价。另外,作为参考,对健康人血清也同样地进行评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700,BZ-9000)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHDF和3×104个GFP-HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]血清的添加和共培养
(1)将适量的培养基和血清0μL、10μL、50μL混合,制备血清培养基溶液。
(2)将血清培养基溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养144小时。
[3]血管网形成的评价
将GFP蛋白和利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于表10~表12。
[表10]
[表11]
[表12]
由表10和表11可知,使用了任一来自阶段IV大肠癌患者的血清时,相对于血清添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网形成。另外,关于荧光发光区域,也如表10所示,V1血清添加量为0μL时为341×105μm2,而10μL时为403×105μm2、50μL时为622×105μm2,如表11所示,V2血清添加量为0μL时为341×105μm2,而10μL时为773×105μm2、50μL时为705×105μm2,与血清添加量成比例地促进了血管网的形成。
与此相对,如表12所示,使用了健康人血清时,相对于血清添加量为0μL的情况,在10μL、50μL的任一条件下,血管网形成均为大致相同的程度。另外,对于荧光发光区域,如表12所示,健康人血清添加量为0μL时为341×105μm2,而10μL时为331×105μm2、50μL时为360×105μm2,也是无论血清添加量如何,血管网形成为大致相同的程度。
确认了通过本发明的上述实施方式的评价方法,即使使用实际的从临床大肠癌患者得到的血清,也能够判别癌化可能性。
[实施例8]使用了来自临床大肠癌患者血清的外泌体(阶段IV)的癌化可能性评价
使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制、CC-2509、NormalHumanDermal Fibroblasts:NHDF)、GFP蛋白表达人脐带静脉内皮细胞(Funakoshi公司制,cAP-0001GFP,GFP Expression Human Umbilical Vein Endothelial Cell:GFP-HUVEC)这2种,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,#3470),作为培养基,使用含10vol/vol%牛血清(System Biosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)、1vol/vol%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,043-30085)。
关于评价,将GFP蛋白和利用直接观察法的图像分析组合,评价血管网形成。
关于外泌体,使用通过超离心处理从实际由临床大肠癌患者得到的来自阶段IV大肠癌患者的血清V1回收、在与原来的血清量相同容量的培养基中进行再悬浮而得到的外泌体,分别对添加量为0μL、10μL、50μL这3个条件实施评价。另外,作为参考,对来自健康人血清的外泌体和从来自阶段IV大肠癌患者的血清V1中除去外泌体级分而得到的液体成分(以下有时也称为血清上清液)也同样地进行评价。
对于图像分析,用KEYENCE公司制的BOX型显微镜(BZ-X700,BZ-9000)测量荧光发光区域面积进行评价。
详细的步骤如下所示。
[1]由正常细胞构成的血管网结构形成体的构建
(1)将2×106个NHDF和3×104个GFP-HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中(工序(a))。
(2)将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。
(3)将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b)),在室温、400×g下离心处理1分钟。
(4)将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养24小时(工序(c))。
[2]外泌体、血清上清的添加和共培养
(1)将适量的培养基和外泌体0μL、10μL、50μL混合,制备外泌体培养基溶液。将适量的培养基和血清上清0μL、10μL、50μL混合,制备血清上清液培养基溶液。
(2)将外泌体培养基溶液、血清上清液培养基溶液培养基溶液分别添加到Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养144小时。
[3]血管网形成的评价
将GFP蛋白和利用直接观察法的图像分析组合,测量荧光发光区域面积。将结果示于表13~表15。
[表13]
[表14]
[表15]
由表13可知,相对于来自阶段IV大肠癌患者血清V1的外泌体添加量为0μL的情况,10μL、50μL时更为优势地促进了血管网的形成。另外,对于荧光发光区域,外泌体添加量为0μL时为344×105μm2,而10μL时为423×105μm2、50μL时为617×105μm2,也是与外泌体添加量成比例地促进了血管网形成。
与此相对,如表14所示,使用来自阶段IV大肠癌患者血清V1的血清上清液时,相对于血清上清液添加量为0μL的情况,10μL、50μL时稍微促进了血管网形成。另外,对于荧光发光区域,血清上清液添加量为0时为344×105μm2,而10μL时为354×105μm2、50μL时为387×105μm2,也是与外泌体添加量成比例地稍微促进了血管网形成。但是,与添加外泌体时相比,添加通过离心分离除去外泌体而得到的试样即血清上清液时,血管网形成的促进效果明显小。
这样,通过外泌体得到血管网形成这样的本发明的上述实施方式的主要效果。
另外,如表15所示,使用来自健康人血清的外泌体时,相对于外泌体添加量为0μL的情况,10μL、50μL的任一条件下血管网形成均为大致相同的程度。另外,对于荧光发光区域,如表15所示,外泌体添加量为0时为344×105μm2,而10μL时为334×105μm2、50μL时为343×105μm2,也是无论外泌体添加量如何,血管网形成为大致相同的程度。
由这些结果考虑,外泌体是具有血管网形成这样的本发明的上述实施方式的主要效果的成分。
确认了通过在本发明的上述实施方式的评价方法中使用外泌体,能够判别癌化可能性。
[实施例9]具有脉管结构的细胞结构体的制作
制作由成纤维细胞和血管内皮细胞构成且具备血管网结构的细胞结构体,观察血管网结构。
另外,实施例9中,在具有脉管结构的细胞结构体的制作中,通过改变血管内皮细胞相对于成纤维细胞的添加量,进行了着眼于能够形成具备血管网结构的细胞结构体的血管内皮细胞与成纤维细胞的比率的研究。
作为包含血管网结构的细胞结构体,使用来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制、CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)这2种的2种类的细胞构成的细胞结构体。另外,作为细胞培养容器,使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制,产品编号:#3470),作为培养基,使用含10容量%牛血清(SystemBiosciences公司制,EXO-FBS-50A-1)和1容量%青霉素/链霉素(和光纯药公司制,168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制,产品编号:043-30085)。作为评价对象的血管生成抑制剂使用贝伐单抗(R&D Systems公司制,产品编号:MAB293)。
<细胞结构体的构建>
首先,将2×106个NHDF和NHDF细胞数为0.05、0.1、0.25、0.5,1.0、1.5、5.0%的HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mMTris、pH为7.4)中,制备细胞悬浮液(HUVEC数与NHDF数的比例:5%)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟,除去上清液后(工序(a’-1)),在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-2))。接着,将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b)),将该Transwell插入式细胞培养器在室温、400×g下离心处理1分钟。然后,将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后,用CO2培养箱(37℃、5%CO2)培养96小时(工序(c))。
<构成血管的细胞的荧光标记及评价>
对培养后的细胞结构体进行使用了anti-CD31抗体(DAKO公司制,产品编号:JC70AM082329)和二次抗体(Invitrogen公司制,产品编号:A-11001)的荧光免疫染色,将该结构体中的血管进行绿色荧光标记。直接观察该经荧光标记的细胞结构体,确认有无血管网形成。将结果如表16所示。
[表16]
HUVEC含有率(%) | 有无血管网形成 |
0.05 | 无 |
0.1 | 有 |
0.25 | 有 |
0.5 | 有 |
1.0 | 有 |
1.5 | 有 |
5.0 | 有 |
通过表16确认了,含有相当于NHDF数的0.1%以上的HUVEC时,形成了血管网结构。
即,通过表16确认了,在除了含有NHDF数的0.05%的HUVEC的情况以外的全部条件下形成了血管网结构。
Claims (11)
1.一种评价癌化可能性的方法,其具有下述工序:
将由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体在来自受检者的生物试样存在下进行培养的培养工序,和
将所述培养工序后的所述细胞结构体中的脉管的状态作为指标,评价所述受检者发生癌化的可能性的评价工序;
所述生物试样为从所述受检者采集的体液试样、从所述受检者采集的细胞的细胞提取液、或从所述受检者采集的细胞的培养上清液,
在所述评价工序中,当与在所述体液试样未存在下进行培养的情况相比,构成所述细胞结构体中的所述脉管的细胞数多时、或者所述细胞结构体中的所述脉管网结构伸长时,评价为所述受检者发生癌化的可能性高。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,
所述体液试样是血液、血清、血浆、尿、白膜、唾液、精液、胸部渗液、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸水、羊水、膀胱灌洗液或支气管肺泡灌洗液。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,
所述生物试样含有外泌体。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,
所述细胞结构体含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,
所述细胞结构体还含有选自由成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的1种以上。
6.根据权利要求4所述的方法,其中,
所述细胞结构体还含有成纤维细胞,
所述细胞结构体中的所述血管内皮细胞和所述淋巴细胞的总细胞数为所述成纤维细胞的细胞数的0.1%以上。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中,
所述细胞结构体的厚度为5μm~500μm。
8.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中,
构成所述细胞结构体的细胞层的数量为2层~60层。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的方法,其中,
在所述培养工序中,进行3天~14天的培养。
10.根据权利要求3所述的方法,其中,
在所述培养工序中,相对于所述正常细胞2×106个的所述外泌体的数量为1×103个以上。
11.一种用于评价癌化可能性的试剂盒,其包含:
细胞培养容器、和
在所述细胞培养容器上构建的由正常细胞形成且具备脉管网结构的细胞结构体。
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