JP7264814B2 - 初代培養方法 - Google Patents
初代培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7264814B2 JP7264814B2 JP2019537631A JP2019537631A JP7264814B2 JP 7264814 B2 JP7264814 B2 JP 7264814B2 JP 2019537631 A JP2019537631 A JP 2019537631A JP 2019537631 A JP2019537631 A JP 2019537631A JP 7264814 B2 JP7264814 B2 JP 7264814B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cell structure
- cancer
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 799
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 226
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 212
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 128
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 117
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 64
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 52
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 24
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 20
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 16
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 16
- 239000007785 strong electrolyte Substances 0.000 claims description 13
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 10
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 9
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 8
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 91
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 38
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 35
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 35
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 32
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 20
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 20
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 19
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 19
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 18
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 18
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 13
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 13
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 13
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 11
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 9
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 8
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 7
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- -1 dextran sulfate Chemical compound 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 3
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 3
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 3
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 2
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 2
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010068873 Adenosquamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000005598 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010059480 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000008334 Dermatofibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010057070 Dermatofibrosarcoma protuberans Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 208000021994 Diffuse astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017259 Extragonadal germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000855 Fucoidan Polymers 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710107035 Gamma-glutamyltranspeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101710173228 Glutathione hydrolase proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 208000008051 Hereditary Nonpolyposis Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000017095 Hereditary nonpolyposis colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010071119 Hormone-dependent prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010021042 Hypopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010056305 Hypopharyngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005726 Inflammatory Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010021980 Inflammatory carcinoma of the breast Diseases 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010073094 Intraductal proliferative breast lesion Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010052014 Liberase Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 201000005027 Lynch syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 208000005450 Maxillary Sinus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009018 Medullary thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010028729 Nasal cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010028767 Nasal sinus cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010031096 Oropharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010057444 Oropharyngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000007571 Ovarian Epithelial Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033268 Ovarian low malignant potential tumour Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000003937 Paranasal Sinus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000007286 Pilocytic astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 201000008395 adenosquamous carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 206010002224 anaplastic astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000001119 benign fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 208000012172 borderline epithelial tumor of ovary Diseases 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 201000006392 childhood kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013549 childhood kidney neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940094517 chondroitin 4-sulfate Drugs 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008819 extrahepatic bile duct carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020603 familial colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 201000001169 fibrillary astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 108060002895 fibrillin Proteins 0.000 description 1
- 102000013370 fibrillin Human genes 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 201000006866 hypopharynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 201000004653 inflammatory breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000007538 neurilemmoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 201000006958 oropharynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021284 ovarian germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000007052 paranasal sinus cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000172 poly(styrenesulfonic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229940005642 polystyrene sulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010639 renal pelvis urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 206010039667 schwannoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 208000035736 spondylodysplastic type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003537 structural cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N tris maleate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 201000000334 ureter transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/28—Vascular endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Description
本願は、2017年8月21日に日本に出願された特願2017-158901号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
前記細胞構造体の天面を構成する細胞層は、線維芽細胞を含み、
前記がん細胞が、大腸がん又は大腸がんからの転移巣に由来するがん細胞である。
[2] 前記生体から採取した前記組織の細片化物、前記生体から採取した前記組織の酵素処理物、又は前記生体から採取した前記組織から回収された細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養してもよい。
[3] 前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、周皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される1種以上を含んでいてもよい。
[4] 前記内皮細胞が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される1種以上であってもよい。
[5] 前記細胞構造体の厚みが5μm以上であってもよい。
[6] 前記細胞構造体の厚みが150μm以上であってもよい。
[7] 前記生体から採取した前記組織が腫瘍組織を含んでいてもよい。
[8] 前記生体から採取した前記組織を細片化した後、得られた細片化物からがん細胞を選別し、選別された前記がん細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養してもよい。
[9] 前記細片化物から前記がん細胞を選別する際に、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、及び密度勾配分画からなる群から選択される1種以上の手法によって前記がん細胞を選別してもよい。
[10] カチオン性緩衝液中で、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程(a)と、前記工程(a)により得られた前記混合物を、細胞培養容器中に播種する工程(b)と、前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中に、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程(c)と、により、前記細胞構造体を構築してもよい。
[11] 本発明の第二態様に係る初代培養細胞含有細胞構造体は、初代培養細胞含有細胞構造体であって、間質を構成する細胞(ただし、放射線照射処理されたものを除く)を含み、単層の又は2以上の細胞層が厚み方向に積層されている間質細胞層の天面に、生体から採取した組織に含まれている細胞から形成されている細胞層を備え、前記間質細胞層が、血管内皮細胞により構成された脈管網構造を備えており、前記間質細胞層の天面を構成する細胞層は、線維芽細胞を含んでおり、前記生体から採取した組織に含まれている細胞から形成されている細胞層が、少なくともがん細胞を含み、前記がん細胞が、大腸がん又は大腸がんからの転移巣に由来するがん細胞である。
本実施形態において使用される細胞構造体(以下、「本実施形態に係る細胞構造体」ということがある。)は、少なくとも間質細胞を含み、単層の又は2以上の細胞層が厚み方向に積層されている。間質細胞を立体的に構築することにより、間質組織を模した細胞構造体を構築できる。なお、本実施形態及び本明細書において、「細胞構造体」とは、少なくとも間質細胞を含む平面的又は立体的な細胞集合体を意味し、「細胞構造体の厚み」とは、当該構造体の自重方向の長さを意味する。自重方向とは、重力のかかる方向であり、厚み方向ともいう。「細胞層」とは、厚み方向と直交する方向に存在し、厚み方向に対して細胞核が重ならないで存在する一群の細胞および間質によって構成される層のことを意味する。
また、がん細胞をより多く得たいという需要に応えるためには、脈管網構造を有するのが好ましい。
また、本実施形態に係る細胞構造体は、各細胞層を構成する細胞種が層ごとに異なる多層構造体であってもよく、各細胞層を構成する細胞種が、構造体の全層で共通する細胞種であってもよい。例えば、細胞種毎に層を形成し、この細胞層を順次積層させることによって構築する方法であってもよく、複数種類の細胞を混合した細胞混合液を予め調製し、この細胞混合液から多層構造の細胞構造体を一度に構築する方法であってもよい。
工程(a):カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程(a)と、
工程(b):前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程(b)と、
工程(c):前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程(c)。
例えば、カチオン性緩衝液中の強電解質高分子の濃度は、0mg/mL超(0mg/mLより高く)1.0mg/mL未満とすることができ、0.025~0.1mg/mLであることが好ましく、0.05~0.1mg/mLであることがより好ましい。また、本実施形態においては、前記強電解質高分子を混合せずに前記混合物を調整し、細胞構造体の構築を行うこともできる。
工程(b’-1):工程(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程と、
工程(b’-2):細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
工程(c’):基材上に細胞の層を形成する工程。
本実施形態において培養される細胞は、生体組織に含まれる細胞である。本実施形態に係る初代培養方法においては、生体組織に含まれている複数種類の細胞を同時に初代培養してもよく、生体組織に含まれている細胞のうち特定の種類の細胞のみを単離して初代培養してもよい。
これらの組織は、例えば、手術や内視鏡検査等において、メスやレーザー等で摘出したり、注射器、スワブ等で採取することができる。ヒトの生体組織としては、例えば、臨床検査のために採取された組織を用いることができる。
本実施形態に係る初代培養方法では、本実施形態に係る細胞構造体の天面に、生体組織中の細胞を播種し培養する。具体的には、本実施形態に係る細胞構造体の培養溶液中に、生体組織中の細胞を添加する。これにより、生体組織中の細胞が細胞構造体の天面に接着し、生体組織中の細胞が細胞構造体の天面に接着された状態で培養される。
培養細胞株の培養に汎用されている一般的な培養培地としては、例えば、D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等や、これらにCS(ウシ血清)、FBS(ウシ胎児血清)、HBS(ウマ胎児血清)等の血清を1~10容量%程度になるように添加した培地が挙げられる。
間質細胞を含む細胞構造体の天面でがん患者から採取された腫瘍細胞から樹立された細胞株を培養し、通常培養培地と初代培養用培地で培養した場合とを比較した。
がん細胞株は、大腸がん患者由来細胞株(公益財団法人がん研究会にて手術検体より樹立)JC-004を用いた。当該患者由来がん細胞株は、以下の通りにして構築された。
まず、がん患者から採取された腫瘍組織を機械的に細片化した後、細片化物をコラゲナーゼ/ディスパーゼ(ロシュダイアグノスティックス社製)及びDnase I(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて処理した。次いで、得られた酵素処理物を、ROCK阻害剤であるY-27632を添加した幹細胞用の無血清培地であるStemPro培地(登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で培養することで樹立した。樹立後のがん細胞株は、本実験に用いるまで、当該培地を用いて培養した。
血管網構造を含む細胞構造体を、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞を用いて構築した。細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%FBS(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。
なお、本実施例においては、NHDFが2×106個/wellとなり、HUVECがNHDF総数に対して1.5%となるように細胞構造体を作成した。
まず、患者由来細胞株JC-004を、PKH67セルリンカーキットを用いて蛍光標識した。その後、PKH26標識JC-004を適量のD-MEM培地(10%FBS)又はY-27632含有StemPro培地で懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、適宜培地交換を行いながら2週間培養した。対照として、細胞構造体を構築していない24穴Transwellセルカルチャーインサート内に、適量のD-MEM培地(10%FBS)又はY-27632含有StemPro培地で懸濁したPKH26標識JC-004を播種し、培養した。
培養後のがん細胞を蛍光顕微鏡にて観察し、生育を確認した。各がん細胞の蛍光画像を図1に示す。
図1において、「間質なし」がカルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルである。
また、図1において、「3D組織上」が細胞構造体の天面に播種して培養したサンプルである。
また、「DMEM」はD-MEM培地(10%FBS)で培養したサンプルであり、「ES培地」はY-27632含有StemPro培地で培養したサンプルである。
その結果、カルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルでは、Y-27632含有StemPro培地では問題なく生育していたものの、D-MEM培地(10%FBS)ではカルチャーインサート上に細胞がほとんど残っていなかった。一方で、間質細胞を含む細胞構造体の天面へ播種して培養したサンプルでは、培地によって形態的な差異はみられたものの、どちらの培地でもがん細胞が生育していることが確認できた。
手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面で、通常培養培地で培養した。培養培地は、10%FBS含有D-MEM培地を用いた。
患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織(JC-115)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。次いで、得られた酵素処理物中のがん細胞(患者腫瘍組織由来JC-115細胞)を、PKH67セルリンカーキットを用いて蛍光標識した。
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体と、NHDFのみから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体と、1層のHUVECのみから形成された細胞構造体(二次元培養物)とを、それぞれ、培養基材上(細胞培養容器内)に構築した。細胞培養容器、NHDF、HUVEC、及びこれらの培養培地は、実施例1と同種のものを用いた。
NHDFのみから形成された20層の細胞構造体は、細胞懸濁液の調製を、NHDFをヘパリンとコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.05mg/mL ヘパリン、0.05mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁して行った以外は、実施例1で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
蛍光標識した患者腫瘍組織由来JC-115細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、適宜培地交換を行いながら2週間培養した。対照として、細胞構造体を構築していない24穴Transwellセルカルチャーインサート内に、適量のD-MEM培地(10%FBS)で懸濁した蛍光標識JC-115細胞を播種し、培養した。
培養後のがん細胞を、培養開始から5、7、10、及び13日目に、蛍光顕微鏡にて観察し、生育を確認した。同一サンプル中のがん細胞を経時的に観察した蛍光画像を図2に示す。
図2において、「間質なし」がカルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルである。
図2において、「Hのみ1層」が1層のHUVECのみから形成された細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
図2において、「Nのみ 20層(血管なし)」はNHDFのみから形成された20層の細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
図2において、「N+H20層(血管あり)」はNHDFとHUVECから形成された20層の細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
また、二次元培養HUVEC上に播種したサンプル(図2における「Hのみ1層」のサンプル)では、培養期間が長くなるにつれ、間質なしと同程度にまで蛍光標識細胞が減少していたが、培養5日の時点では間質なしよりも多くの蛍光標識細胞が確認できた。即ち、二次元培養HUVECは、初代培養がん細胞の増殖を亢進する効果には乏しいものの、培養初期の細胞接着を助ける効果はあると言える。
NHDFを含む20層の細胞構造体の天面に播種したサンプルでは、血管網構造が構築されている細胞構造体(図2における「N+H20層(血管あり)」のサンプル)と、血管網構造が構築されていない細胞構造体(図2における「Nのみ20層(血管なし)」のサンプル)と、の両方とも、培養5日の時点で間質なしよりも多くの蛍光標識細胞が確認できた。
さらに、血管網構造が構築されている細胞構造体と、血管網構造が構築されていない細胞構造体と、の間で、培養5日から2週間の間で蛍光標識細胞の顕著な増減は認められなかった。
即ち、間質細胞を含む立体的な細胞構造体の天面で培養することにより、初代培養がん細胞の生育に正の影響が及ぼされたこと、培養初期の細胞接着を助ける効果と初代培養がん細胞の増殖を亢進する効果の両方が得られることが示唆された。
手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面において培養した。培養培地は、10%FBS含有D-MEM培地又はY-27632含有StemPro培地を用いた。
患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織(JC-121)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体を、実施例1で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
患者腫瘍組織由来JC-121細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)又はY-27632含有StemPro培地にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)又はY-27632含有StemPro培地にて適宜培地交換を行いながら2.5週間培養した。
培養後の細胞構造体から培地を除去した後、PBSにて洗浄し、10%中性緩衝ホルマリンを用いて固定した。その後、サンプル中のがん細胞を、大腸がんのマーカーによって可視化し、評価した。具体的には、抗非リン酸化(活性化)β-カテニン抗体、抗CD31抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、さらにDAPIによる核染色を行った。非リン酸化β-カテニンは、がん細胞に特異的に蓄積するタンパク質であり、CD31は、血管内皮細胞の特異的に発現しているタンパク質である。染色後の細胞構造体を蛍光顕微鏡にて観察した。
図3にD-MEM培地(10%FBS)で培養した細胞構造体の染色像を示す。
また、図4にY-27632含有StemPro培地で培養した細胞構造体の染色像を示す。
手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、他の細胞と共に又はがん細胞のみ選別回収した後、細胞層数の異なる複数の細胞構造体の天面でそれぞれ培養した。培養培地は、10%FBS含有D-MEM培地を用いた。
患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん(大腸がんからの転移巣)患者から摘出された腫瘍組織(JC-052-3-liv)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体を、実施例1で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が1、5、又は10層となるようにした以外は同様にして、NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を構築した。
患者腫瘍組織由来JC-052-3-liv細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら5日間培養した。
対照として、細胞構造体を構築していない24穴Transwellセルカルチャーインサート内に、適量のD-MEM培地(10%FBS)又はY-27632含有StemPro培地で懸濁したJC-052-3-liv細胞を播種し、培養した。
培養後の細胞構造体から培地を除去した後、PBSにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit(ミルテニーバイオテク社製)に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗EpCAM抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、EpCAM陽性細胞の割合を計測した。
図5に細胞構造体を構築していない24穴Transwellセルカルチャーインサート内に播種したサンプルの算出結果を示す。
図6に、細胞構造体の天面に播種したサンプルの算出結果を示す。
図5において、「DMEM」はD-MEM培地(10%FBS)で培養したサンプルである。
図5において、「ES」はY-27632含有StemPro培地で培養したサンプルである。
また、図6において、「血管あり」は、血管網構造を備える細胞構造体の結果を示す。
図6において、「血管なし」は、血管網構造を備えていない細胞構造体の結果を示す。
さらに、細胞構造体の天面に播種したサンプルについて、総細胞数に対するEpCAM陽性細胞(抗EpCAM抗体で染色された細胞)の割合(%)を図7に示す。
更に、Tumor Cell Isolation Kit(ミルテニーバイオテク社製)を用いて、当該酵素処理物中のNHDF及びHUVECを磁気標識した後、磁気標識された細胞をネガティブセレクションによって除去し、NHDFとHUVEC以外の細胞を選別回収した。その後、前記自動セルカウンターを用いて、選別回収された細胞中のEpCAM陽性細胞の割合を計測した。細胞層数が10層及び20層の細胞構造体で培養したサンプルについて、選別回収後の全細胞数に対するEpCAM陽性細胞数の比率(%)の計測結果を図8に示す。
比較のため、選別回収前の結果も同時に示す。この結果、選別回収の前後でEpCAM陽性細胞の割合が上昇した。この結果から、初代培養がん細胞を濃縮して回収することが可能であることが示された。
細胞構造体を構築していない24穴Transwellセルカルチャーインサート内に播種し、D-MEM培地(10%FBS)で5日間培養したJC-052-3-liv細胞について、前記と同様にして抗EpCAM抗体による蛍光免疫染色を行った。染色結果を図9に示す。この結果、EpCAM陽性細胞が確認されたことから、患者腫瘍組織由来のがん細胞であるJC-052-3-liv細胞がEpCAM陽性細胞であることが明らかである。
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体について、前記と同様にして抗EpCAM抗体による蛍光免疫染色を行った。染色結果を図10に示す。この結果、NHDFとHUVECは、抗EpCAM抗体で染色されないことが確認された。
大腸がんからの転移巣(肝臓がん)由来の患者腫瘍組織由来細胞(PDC)を用いて、DMEM以外の種々の「一般的な培地」を用いた場合においても、初代培養がん細胞の生育が可能か検討を行った。
大腸がんからの転移巣(肝臓がん)由来の患者腫瘍組織由来細胞を、他の細胞と共に又はがん細胞のみ選別回収した後、細胞層数が20層の細胞構造体の天面で培養した。
患者腫瘍組織由来細胞(PDC)は次の通りにして調製した。
まず、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん(大腸がんからの転移巣)患者から摘出された腫瘍組織(JC039-2-Liv)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
同様に、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん(大腸がんからの転移巣)患者から摘出された腫瘍組織(JC047-2-Liv)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
実施例1で構築した細胞構造体と同様にして、NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体(NHDF:2×106個/well、HUVEC:NHDF総数に対して1.5%)を構築した。
患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間培養した。
D-MEM培地に代えて、以下の3つの培地をそれぞれ用いて、患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を14日間培養した。
なお、D-MEM培地に代えて、以下の3つの培地のいずれか一つの培地を用いた他は、上記D-MEM培地を用いた場合と同様に、患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を培養した。
・RPMI-1640培地(哺乳類細胞に広く使用できる高栄養培地として使用される培地である。)
・McCoy’s5A培地(リンパ球の培養用に開発され、がん細胞株でも良く用いられる培地である。)
・ES培地(本実施例では、Y-27632含有StemPro培地を用いた。がん臨床検体の初代培養によく用いられ、患者由来細胞株の樹立・維持に使用される培地である。)
なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は1×104個/wellとした。
なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は1×104個/wellとした。
なお、コラーゲンコート6穴プレートに播種した患者腫瘍組織由来細胞の細胞数は1×105個/wellとした。
実施例4と同様の手法により、培養後の細胞構造体、または、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート6穴プレートから培地を除去した後、PBSにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit(ミルテニーバイオテク社製)に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗EpCAM抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、EpCAM陽性細胞の割合を計測した。
図11には、間質細胞を含む細胞構造体の天面に患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を播種し、上記4種の培地を用いて、それぞれ14日間培養したサンプル(図11中3Dと示し、三次元構造を有する細胞構造体を用いた例である)の増殖率の算出結果を示す。
また、対照として、図11には、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート6穴プレート内に患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を播種し、上記4種の培地を用いて、それぞれ14日間培養したサンプル(図11において2Dと示し、間質なしに対応する)の増殖率の算出結果を示す。
換言すれば、図11は、実施例5において、(1)患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、4種の培地をそれぞれ用いて14日間培養したサンプルと、(2)患者腫瘍組織由来JC039-2-Liv細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート6穴プレート内に播種し、4種の培地をそれぞれ用いて14日間培養したサンプルと、における14日後増殖率(播種数比)の測定結果の比較を示した図である。
また、対照として、図12には、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート6穴プレート内に患者腫瘍組織由来JC047-2-Liv細胞を播種し、上記4種の培地を用いて、それぞれ14日間培養したサンプル(図12において2Dと示し、間質なしに対応する)の増殖率の算出結果を示す。
すなわち、図12は、実施例5において、(1)患者腫瘍組織由来JC047-2-Liv細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、4種の培地をそれぞれ用いて14日間培養したサンプルと、(2)患者腫瘍組織由来JC047-2-Liv細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート6穴プレート内に播種し、4種の培地を用いてそれぞれ14日間培養したサンプルと、における14日後増殖率(播種数比)の測定結果の比較を示した図である。
すなわち、三次元構造を有する細胞構造体を用いてがん細胞を培養した際には、D-MEM培地以外の一般的な培地を用いた場合にも、がん細胞の増殖が確認された。
一方、細胞構造体を構築していない2D(「間質なし」の場合)には、ES培地以外の培地を用いた場合には、播種した細胞数よりも回収細胞数が少なくなり、患者腫瘍組織由来のがん細胞が一般的な培地では増殖しない傾向にあることを確認した。
本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、患者腫瘍組織由来のがん細胞が、D―MEM培地以外の「一般的な培地」を用いた場合にも生育されることを確認できた。
換言すれば、本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、培地によらず、初代培養がん細胞を培養できる可能性が示された。
次に、初代培養の腫瘍細胞を用いて、細胞構造体における3D組織の厚さや血管網の有無と増殖率の関係、がん種による影響を検討した。
患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。
まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織(大腸がん原発巣、JC406-1-TT)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、ポアサイズ100μmのフィルタで分画した後に得られた通過画分を得て、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
また、公益財団法人がん研究会にて肺がん(大腸がんからの転移巣)患者から摘出された腫瘍組織(大腸がん肺転移巣、JC247-2-PUL)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、ポアサイズ100μmのフィルタで分画した後に得られた通過画分を得て、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
・血管網構造を備える細胞構造体
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体を、実施例1で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が1、5、又は10層となるようにした以外は同様にして、NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を構築した。
また、NHDFから形成され、血管網構造を備えていない20層の細胞構造体を、実施例2で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が1、5、又は10層となるようにした以外は同様にして、NHDFから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体を構築した。
・大腸がん患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞の播種
上記分画により得られた大腸がん患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した20層の細胞構造体(NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体)の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間培養した。
また、同様の方法により、大腸がん患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を、D-MEM培地に代えて、RPMI-1640培地を用いて、それぞれ14日間培養した。
さらに、同様の方法により、大腸がん患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を、D-MEM培地に代えて、McCoy’s5A培地を用いて、それぞれ14日間培養した。
同様に、層数が、1層、5層、10層の細胞構造体のいずれにおいても、3種の培地をそれぞれ用いて、JC406-1-TT細胞の培養を行った。
また、上記分画により得られた肺がん患者腫瘍組織由来JC247-2-PUL細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した20層の細胞構造体(NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体)の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間培養した。
同様に、層数が、1層、5層、10層の細胞構造体(NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体)のいずれにおいても、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間、肺がん患者腫瘍組織由来JC247-2-PUL細胞を培養した。
また、NHDFから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体(1層、5層、10層、20層)についても同様に、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間、肺がん患者腫瘍組織由来JC247-2-PUL細胞を培養した。
実施例4、実施例5と同様の手法により、培養後の細胞構造体から培地を除去した後、PBSにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit(ミルテニーバイオテク社製)に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗EpCAM抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、EpCAM陽性細胞の割合を計測した。
図13は、3種の培地(D-MEM培地、RPMI-1640培地、McCoy’s5A培地)をそれぞれ用いた場合において、NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える細胞構造体の層数(3D組織の層数)の変化に対する、JC406-1-TT細胞の2週間後増殖率(%)の変化を示す。
換言すれば、図13は、実施例6において、構成する細胞構造体の3D組織の層数を変化させた場合に、患者腫瘍組織(大腸がん原発巣)由来JC406-1-TT細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、3種の培地をそれぞれ用いて14日間培養したサンプルにおける14日後増殖率(播種数比)の測定結果を示した図である。
また、図14に示すように、本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、実施例1~5に示したような大腸がん(大腸がん原発巣)、肝臓がん(大腸がんからの転移巣、肝臓転移症例)に加えて、肺がん(大腸からの転移巣、肺転移症例)でも同様にがん細胞を培養可能であることが確認された。また、肺がん細胞においても、大腸がん細胞と同様に、細胞構造体における3D組織の層数の増加に従い、がん細胞の増殖率が向上する傾向にあった。
さらに、図14に示したように、NHDFから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体と、NHDFとHUVECから形成され血管網構造を備える細胞構造体と、の比較により、線維芽細胞のみで構成された細胞構造体よりも血管内皮細胞を含む組織上のほうが、細胞の増殖率が高い傾向を示すことが明らかになった。
なお、図14に示すように、NHDFから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体と、NHDFとHUVECから形成され血管網構造を備える細胞構造体と、の両者ともに、細胞構造体における3D組織の層数の増加に従い、細胞の増殖率が向上する傾向は同様であった。すなわち、細胞構造体における3D組織の層数の増加に従って細胞の増殖率が向上する傾向は、血管網の有無にかかわらず、同様であった。
本実施例では、初代培養の腫瘍細胞を用いて、3D組織中の血管内皮細胞の割合と、がん細胞の増殖率と、の関係を確認した。
患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。
まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん(大腸がん原発巣)患者から摘出された腫瘍組織(JC406-1-TT)を、機械的に細片化した後、実施例1と同様にしてコラゲナーゼ/ディスパーゼ及びDnase Iにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
NHDFとHUVECから形成され、血管網構造を備える20層の細胞構造体(NHDF:2×106個/well、HUVEC:NHDF総数に対して1.5%)を、実施例1で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
また、3D組織中の血管内皮細胞の割合を変化させるように、細胞構造体におけるHUVECのNHDF総数に対する含有率(以下、HUVEC含有率ということがある)を変化させて、HUVEC含有率が0%、0.5%、5.0%、15%とした細胞構造体(20層)を構築した。
換言すれば、本実施例では、HUVEC含有率が0%、0.5%、1.5%、5.0%、15%とした5種類の細胞構造体(20層)を構築した。
患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を、適量のD-MEM培地(10%FBS)にて懸濁し、24穴Transwellセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体(HUVEC含有率1.5%)の天面に播種した。その後、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間培養した。
また、同様に、患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を、HUVEC含有率を0%、0.5%、5.0%、15%とした細胞構造体の天面に播種し、D-MEM培地(10%FBS)にて適宜培地交換を行いながら14日間培養した。
なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は1×104個/wellとした。
実施例4~6と同様の手法により、培養後の細胞構造体から培地を除去した後、PBSにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit(ミルテニーバイオテク社製)に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗EpCAM抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、EpCAM陽性細胞の割合を計測した。
図15には、HUVEC含有率を0~15%の間で変化させた間質細胞を含む細胞構造体の天面に患者腫瘍組織由来JC406-1-TT細胞を播種し、D-MEM培地を用いて14日間培養したサンプルの増殖率の算出結果を示す。
換言すれば、図15は、実施例7において、構成する細胞構造体の血管内皮細胞の含有率を変化させた場合に、患者腫瘍組織(大腸がん原発巣)由来JC406-1-TT細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、14日間培養したサンプルにおける14日後増殖率(播種数比)の測定結果を示した図である。
すなわち、本実施例によれば、細胞構造体が血管内皮細胞を含む場合には、細胞構造体における血管内皮細胞(HUVEC)の割合にかかわらず、がん細胞の増殖の観点から好ましい結果が得られた。
また、本実施例によれば、線維芽細胞に対する血管内皮細胞の割合が0.5%~5.0%の範囲内にある際に、特にがん細胞の増殖率が高くなる傾向にあった。
本実施例によれば、がん細胞をより多く得たいという観点においては、血管内皮細胞を細胞構造体に含めて、脈管網構造を形成させるのが好ましい可能性が示された。
Claims (11)
- 生体から採取した組織に含まれている細胞をインビトロで初代培養する初代培養方法であって、
間質を構成する細胞(ただし、放射線照射処理されたものを除く)を含み、単層の又は2以上の細胞層が厚み方向に積層されており、血管内皮細胞により構成された脈管網構造を備えている細胞構造体の天面に、生体から採取した組織中の少なくともがん細胞を含む細胞を播種し、前記天面に接着させた状態で培養し、
前記細胞構造体の天面を構成する細胞層は、線維芽細胞を含み、
前記がん細胞が、大腸がん又は大腸がんからの転移巣に由来するがん細胞である、初代培養方法。 - 前記生体から採取した前記組織の細片化物、前記生体から採取した前記組織の酵素処理物、又は前記生体から採取した前記組織から回収された細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養する、請求項1に記載の初代培養方法。
- 前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、周皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される1種以上を含む、請求項1又は2に記載の初代培養方法。
- 前記内皮細胞が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される1種以上である、請求項3に記載の初代培養方法。
- 前記細胞構造体の厚みが5μm以上である、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代培養方法。
- 前記細胞構造体の厚みが150μm以上である、請求項1~4のいずれか一項に記載の初代培養方法。
- 前記生体から採取した前記組織が腫瘍組織を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の初代培養方法。
- 前記生体から採取した前記組織を細片化した後、得られた細片化物からがん細胞を選別し、
選別された前記がん細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養する、
請求項7に記載の初代培養方法。 - 前記細片化物から前記がん細胞を選別する際に、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、及び密度勾配分画からなる群から選択される1種以上の手法によって前記がん細胞を選別する、請求項8に記載の初代培養方法。
- カチオン性緩衝液中で、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程(a)と、
前記工程(a)により得られた前記混合物を、細胞培養容器中に播種する工程(b)と、
前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中に、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程(c)と、により、
前記細胞構造体を構築する、
請求項1~9のいずれか一項に記載の初代培養方法。 - 初代培養細胞含有細胞構造体であって、
間質を構成する細胞(ただし、放射線照射処理されたものを除く)を含み、単層の又は2以上の細胞層が厚み方向に積層されている間質細胞層の天面に、生体から採取した組織に含まれている細胞から形成されている細胞層を備え、
前記間質細胞層が、血管内皮細胞により構成された脈管網構造を備えており、
前記間質細胞層の天面を構成する細胞層は、線維芽細胞を含んでおり、
前記生体から採取した組織に含まれている細胞から形成されている細胞層が、少なくともがん細胞を含み、
前記がん細胞が、大腸がん又は大腸がんからの転移巣に由来するがん細胞である、
初代培養細胞含有細胞構造体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023065826A JP2023085557A (ja) | 2017-08-21 | 2023-04-13 | 初代培養方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017158901 | 2017-08-21 | ||
JP2017158901 | 2017-08-21 | ||
PCT/JP2018/030777 WO2019039457A1 (ja) | 2017-08-21 | 2018-08-21 | 初代培養方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023065826A Division JP2023085557A (ja) | 2017-08-21 | 2023-04-13 | 初代培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019039457A1 JPWO2019039457A1 (ja) | 2020-07-30 |
JP7264814B2 true JP7264814B2 (ja) | 2023-04-25 |
Family
ID=65438833
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019537631A Active JP7264814B2 (ja) | 2017-08-21 | 2018-08-21 | 初代培養方法 |
JP2023065826A Pending JP2023085557A (ja) | 2017-08-21 | 2023-04-13 | 初代培養方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023065826A Pending JP2023085557A (ja) | 2017-08-21 | 2023-04-13 | 初代培養方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11781115B2 (ja) |
EP (1) | EP3674394A4 (ja) |
JP (2) | JP7264814B2 (ja) |
CN (1) | CN111051495A (ja) |
WO (1) | WO2019039457A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112760282B (zh) * | 2019-11-04 | 2023-03-24 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法 |
WO2021149661A1 (ja) * | 2020-01-20 | 2021-07-29 | 凸版印刷株式会社 | 立体的細胞構造体の製造方法 |
CN111748519A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-10-09 | 深圳市人民医院 | 成纤维细胞的原代培养方法 |
WO2022039261A1 (ja) * | 2020-08-20 | 2022-02-24 | 凸版印刷株式会社 | 立体的細胞構造体の製造方法、及び立体的細胞構造体 |
WO2022039219A1 (ja) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | 凸版印刷株式会社 | 患者由来癌細胞培養用コンディションドメディウムの製造方法 |
WO2024034576A1 (ja) * | 2022-08-08 | 2024-02-15 | Toppanホールディングス株式会社 | がんオルガノイドの培養方法及び被験物質のスクリーニング方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000217570A (ja) | 2000-01-01 | 2000-08-08 | Yamato Kubota | 培養癌組織およびその製造方法 |
WO2003039611A1 (fr) | 2001-10-15 | 2003-05-15 | Japan Science And Technology Agency | Methode de formation de tissu regenere normal, tissu regenere normal, et methode d'echantillonnage de la sensibilite |
JP2007186492A (ja) | 2005-09-13 | 2007-07-26 | Japan Health Science Foundation | がんの診断、処置および/または予防、および/または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 |
JP2007222155A (ja) | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Shinshu Univ | ヒトリンパ管由来細胞株およびそれを用いた診断キット |
JP2012115254A (ja) | 2010-11-11 | 2012-06-21 | Osaka Univ | 細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法 |
WO2015079759A1 (ja) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 国立大学法人大阪大学 | 三次元組織体及びその製造方法 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4919464B1 (ja) | 1969-07-23 | 1974-05-17 | ||
JPS5652809B2 (ja) | 1974-01-14 | 1981-12-15 | ||
JPS5850419B2 (ja) | 1975-04-16 | 1983-11-10 | 松下電器産業株式会社 | 圧電性薄膜の製造方法 |
JPS5652809U (ja) | 1979-09-29 | 1981-05-09 | ||
CN101021508A (zh) * | 2006-02-13 | 2007-08-22 | 许洋 | 端切纤维蛋白肽a对胃癌细胞淋巴结转移检测的应用 |
JP5652809B2 (ja) | 2009-03-02 | 2015-01-14 | 株式会社ルネッサンス・エナジー・インベストメント | 癌組織由来細胞塊およびその調製法 |
CA3177480A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | Organovo, Inc. | Engineered three-dimensional breast tissue, adipose tissue, and tumor disease model |
CN105315369B (zh) * | 2014-07-25 | 2020-03-13 | 山东博安生物技术有限公司 | 利用阳离子交换层析纯化蛋白质 |
US10837002B2 (en) * | 2014-08-28 | 2020-11-17 | Hirosaki University | Artificial peritoneal tissue and method for producing same |
CN105200085A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-30 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途 |
CN106867959A (zh) * | 2015-12-10 | 2017-06-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种调控两种细胞间距离的方法 |
EP4349972A2 (en) * | 2016-02-22 | 2024-04-10 | Osaka University | Method for producing three-dimensional cell tissue |
JP2017158901A (ja) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | 株式会社高尾 | 弾球遊技機 |
WO2017183676A1 (ja) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | 凸版印刷株式会社 | 被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法 |
EP4190909A1 (en) * | 2016-04-19 | 2023-06-07 | Toppan Printing Co., Ltd. | Method for assessing possibility of cancerization |
-
2018
- 2018-08-21 CN CN201880053730.4A patent/CN111051495A/zh active Pending
- 2018-08-21 JP JP2019537631A patent/JP7264814B2/ja active Active
- 2018-08-21 EP EP18847307.8A patent/EP3674394A4/en active Pending
- 2018-08-21 WO PCT/JP2018/030777 patent/WO2019039457A1/ja unknown
-
2020
- 2020-02-05 US US16/782,579 patent/US11781115B2/en active Active
-
2023
- 2023-04-13 JP JP2023065826A patent/JP2023085557A/ja active Pending
- 2023-08-30 US US18/239,938 patent/US20230407266A1/en active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000217570A (ja) | 2000-01-01 | 2000-08-08 | Yamato Kubota | 培養癌組織およびその製造方法 |
WO2003039611A1 (fr) | 2001-10-15 | 2003-05-15 | Japan Science And Technology Agency | Methode de formation de tissu regenere normal, tissu regenere normal, et methode d'echantillonnage de la sensibilite |
JP2007186492A (ja) | 2005-09-13 | 2007-07-26 | Japan Health Science Foundation | がんの診断、処置および/または予防、および/または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 |
JP2007222155A (ja) | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Shinshu Univ | ヒトリンパ管由来細胞株およびそれを用いた診断キット |
JP2012115254A (ja) | 2010-11-11 | 2012-06-21 | Osaka Univ | 細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法 |
WO2015079759A1 (ja) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 国立大学法人大阪大学 | 三次元組織体及びその製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2023085557A (ja) | 2023-06-20 |
EP3674394A1 (en) | 2020-07-01 |
US11781115B2 (en) | 2023-10-10 |
JPWO2019039457A1 (ja) | 2020-07-30 |
EP3674394A4 (en) | 2021-05-26 |
US20230407266A1 (en) | 2023-12-21 |
CN111051495A (zh) | 2020-04-21 |
US20200172874A1 (en) | 2020-06-04 |
WO2019039457A1 (ja) | 2019-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7264814B2 (ja) | 初代培養方法 | |
JP7018635B2 (ja) | 立体的細胞組織の製造方法 | |
US11873514B2 (en) | Method of screening for a substance that acts on a cell mass | |
JP7331979B2 (ja) | 抗がん剤の評価方法 | |
JP6953894B2 (ja) | 立体的肝臓組織構造体及びその製造方法 | |
JP2022105712A (ja) | 被検化合物の脈管新生阻害活性の評価方法 | |
JP2023029353A (ja) | 抗がん効果の評価方法、及びがん免疫療法の奏効性予測方法 | |
JP7207508B2 (ja) | ガン化の可能性評価方法 | |
JP2021093927A (ja) | 細胞構造体及びその使用 | |
WO2023037940A1 (ja) | 遊走細胞の遊走能の評価方法 | |
WO2024034576A1 (ja) | がんオルガノイドの培養方法及び被験物質のスクリーニング方法 | |
JP7107450B1 (ja) | 立体的細胞構造体の製造方法 | |
WO2023120573A1 (ja) | 立体的細胞組織の培養方法 | |
JP7251595B2 (ja) | 薬剤耐性を有する細胞を作製する方法、及び抗ガン剤をスクリーニングするための方法 | |
JP2023036084A (ja) | 細胞構造体及びその製造方法 | |
JP2023118400A (ja) | 細胞構造体及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191030 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210702 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220621 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230127 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230314 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230413 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7264814 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |