JP7331979B2 - 抗がん剤の評価方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年4月19日に日本に出願された特願2016-083948、2016年4月19日に日本に出願された特願2016-083950号、及び2016年4月19日に日本に出願された特願2016-083951号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本発明は、血管新生阻害剤と抗がん剤との併用治療における薬効を、in vitroの系を用いて精度良く評価する方法を提供することを目的とする。
上記第一態様において、前記がん細胞が、前記細胞構造体内部に散在していてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、がん細胞のみを含む細胞層を含んでいてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、がん細胞を含む層と間質を構成する細胞を含む層とが半透膜により仕切られていてもよい。
上記第一態様において、前記半透膜のポアサイズが0.4μm~8μmであってもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含んでいてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、さらに、繊維芽細胞、神経細胞、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞からなる群より選択される1種以上を含んでいてもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上と、繊維芽細胞とを含み、前記細胞構造体中の血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、繊維芽細胞の細胞数の0.1%以上であってもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体の厚さが5μm以上であってもよい。
上記第一態様において、前記細胞構造体が、脈管網構造を備えていてもよい。
上記第一態様において、前記培養工程において、前記細胞構造体を、細胞障害性を有する抗がん剤及び脈管新生阻害剤の存在下で培養し、前記脈管新生阻害剤と前記抗がん剤とを併用した場合の抗がん効果を評価してもよい。
上記第一態様において、前記がん細胞が、がん患者から採取されたがん細胞であってもよい。
上記第一態様において、前記培養工程における培養時間が、24~96時間であってもよい。
本発明の第二態様に係る抗がん剤評価用キットは、上記第一態様に係る抗がん剤の評価方法を行うためのキットであって、少なくも間質を構成する細胞を含む細胞構造体と、前記細胞構造体を収容する細胞培養容器とを備える。
上記第二態様において、前記細胞構造体が、天面に半透膜を備えていてもよい。
上記第二態様において、前記細胞構造体が、脈管網構造を備えていてもよい。
上記第二態様において、前記細胞構造体の厚さが5μm以上であってもよい。
また、本発明の上記第二態様に係る抗がん剤評価用キットを用いることにより、前記評価方法をより簡便に実施することができる。
本発明の第一実施形態に係る抗がん剤の評価方法(以下、「本実施形態に係る評価方法」ということがある。)は、がん細胞、及び間質を構成する細胞(間質細胞)を含む細胞構造体を、1種又は2種以上の抗がん剤の存在下で培養する培養工程と、前記培養工程後の前記細胞構造体中のがん細胞の生細胞数を指標として、前記抗がん剤の抗がん効果を評価する評価工程と、を有する。本実施形態に係る評価方法は、間質を構成する細胞から形成される三次元構造内にがん細胞を含む細胞構造体を用いて抗がん効果を評価する。間質は生体内のがん微小環境において重要な構成である。つまり、間質を構成する細胞が形成する三次元構造を有する細胞構造体内に、がん細胞を含ませることによって、生体内のがん細胞の環境を再現し、生体内における抗がん作用を適切に評価できるようになる。このため、当該細胞構造体を用いることによって、in vitroの評価系であっても、ヒトの臨床結果をより反映した抗がん剤の評価が可能となり、信頼性の高い評価が得られる。
本発明及び本願明細書において、「細胞構造体」とは、複数の細胞層が積層された3次元構造体である。本実施形態において用いられる細胞構造体(以下、「本実施形態に係る細胞構造体」ということがある。)は、がん細胞及び間質細胞によって構築されている。本実施形態に係る細胞構造体としては、がん細胞が構造体全体に散在している細胞構造体であってもよく、がん細胞が特定の層にのみ存在している細胞構造体であってもよい。
(a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、前記細胞培養容器中の細胞混合物から液体成分を除去し、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程。
また、本発明においては、工程(b)において、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよいし、自然沈降させてもよい。
また、工程(a)の後に、前記工程(b)に代えて、下記工程(b’-1)及び(b’-2)を行ってもよい。本発明及び本願明細書において、「細胞粘稠体」とは、非特許文献5に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
(b’-1)工程(a)で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し細胞粘稠体を得る工程と、
(b’-2)細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。上述の工程(a)~(c)を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程(a)の後に(a’-1)及び(a’-2)を実施し、工程(b)を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
(c’)播種した混合物から液体成分を除去し、基材上に細胞の層を形成する工程。
例えば、細胞培養容器としてセルカルチャーインサートを用いた場合には、混合物を播種したセルカルチャーインサートを、10℃、400×gで1分間の遠心分離処理に供することによって、液体成分を除去することができる。
本実施形態に係る評価方法に用いられる抗がん剤には、がん治療に用いられる薬剤であればよく、細胞障害性を有する薬剤のようにがん細胞に直接的に作用する薬剤のみならず、細胞障害性を有さないが、がん細胞の増殖等を抑制する薬剤も含まれる。細胞障害性を有さない抗がん剤としては、がん細胞を直接的に攻撃することはせず、生体内の免疫細胞やその他の薬剤との協働的な作用によって、がん細胞の増殖を抑制したり、がん細胞の活動を鈍らせたり、がん細胞を死滅させたりする機能を発揮する薬剤や、がん細胞以外の細胞や組織を障害することによってがん細胞の増殖を抑制する薬剤が挙げられる。本実施形態において用いられる抗がん剤は、抗がん作用を有することが既知である薬剤であってもよく、新規な抗がん剤の候補化合物であってもよい。
当該方法により、生体内の状態により近い三次元構造内に脈管網構造を含む細胞構造体を用いるため、動物モデルを用いることなく、脈管新生阻害剤と抗がん剤とを併用使用することにより得られる薬効を精度良く評価することができる。
細胞障害性を有する抗がん剤としては、細胞障害性を有することが期待される化合物であればよく、既知の抗がん剤であってもよく、新規な抗がん剤の候補化合物であってもよい。
当該細胞構造体は、脈管網構造を備えており、脈管を構成する内皮細胞と、脈管を構成していない細胞(内皮細胞以外の細胞)と、により構成される。
当該細胞構造体に含まれる内皮細胞以外の細胞の細胞種としては、内皮細胞が脈管網を形成することを阻害しないものであれば特に限定されるものではなく、含有させるがん細胞の由来や種類、評価に使用される脈管新生阻害剤や抗がん剤の種類、目的の抗がん活性が奏される生体内の環境等を考慮して、適宜選択することができる。
本実施形態に係る評価方法では、まず、培養工程として、がん細胞及び間質細胞を含む細胞構造体を、抗がん剤の存在下で培養する。具体的には、1種又は2種以上の抗がん剤を混合した培養培地中で、細胞構造体を培養する。細胞障害性を有する抗がん剤と脈管新生阻害剤との併用効果を評価する場合には、培養工程として、脈管網構造を備える細胞構造体を、脈管新生阻害剤及び抗がん剤の存在下で培養する。具体的には、脈管新生阻害剤と抗がん剤とを混合した培養培地中で、細胞構造体を培養する。
前記培養工程後の細胞構造体中のがん細胞の生細胞数を指標として、抗がん剤の抗がん効果を評価する。具体的には、抗がん剤非存在下で培養した場合と比較して、がん細胞の生細胞数が多い場合に、当該抗がん剤は、当該細胞構造体に含まれるがん細胞に対して抗がん効果を有すると評価する。一方で、抗がん剤非存在下で培養した場合と比較して、がん細胞の生細胞数が同程度又は有意に多い場合には、当該抗がん剤は、当該細胞構造体に含まれるがん細胞に対して抗がん作用はないと評価する。
また、抗がん剤として、細胞障害性を有する抗がん剤と血管新生阻害剤とを組み合わせることにより、細胞障害性を有する抗がん剤と脈管新生阻害剤との併用効果の評価をより簡便に実施することができる。
繊維芽細胞と血管内皮細胞から形成され、血管網構造を備える細胞構造体を作製し、血管網構造を観察した。
血管網構造を含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Lonza社製、CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Lonza社製、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)の2種の2種類の細胞から形成された細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(System Biosciences社製、EXO-FBS-50A-1)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用いた。
まず、2×106個のNHDFとNHDF細胞数の0.05、0.1、0.25、0.5.1.0、1.5、5.0%のHUVECを、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC 数の割合:5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて96時間培養した(工程(c))。
培養後の細胞構造体に対して、anti-CD31抗体(DAKO社製、製品番号:JC70A M082329)と二次抗体(Invitrogen社製、製品番号:A-11001)を用いた蛍光免疫染色を行い、当該構造体中の血管を緑色蛍光標識した。この蛍光標識された細胞構造体を直接観察して血管網形成有無を確認した。
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、抗がん剤ドキソルビシンの抗がん効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)及び、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、ヒト結腸直腸腺がん細胞株であるHT29(ATCC番号:HTB-38TM)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる抗がん剤はドキソルビシン(和光純薬社製、製品番号:046-21523)を用いた。
まず、NHDFのみ、又はNHDF及びHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理し、液体成分を除去した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、ドキソルビシンの最終濃度が10μMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ドキソルビシンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
次に、当該トランズウェルセルカルチャーインサートにトリス緩衝溶液(50mM,pH7.4)を適量添加し、その後、液体成分を除去した。この一連の工程を繰り返し3回実施した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で15分間インキュベートした。その後、溶液全量を回収し、あらかじめ0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)が300μL添加された回収用1.5mLチューブに移した。次いで、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を100μL添加し、回収用1.5mLチューブと共にCO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートした。その後、溶液全量を回収し、回収用1.5mLチューブに移し、更に0.25%トリプシン‐EDTA溶液(Invitrogen社製、)を300μL添加し、CO2インキュベータ(37℃,5%CO2)で5分間インキュベートし、細胞構造体分散液を得た。
得られた細胞構造体の分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
また、2D培養物に対しても同様にトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞として計数した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の生細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の生細胞数]×100
血管網構造が層状に形成されている細胞構造体と、同じく血管網構造が構造体全体に散在している細胞構造体とを用い、抗がん剤ドキソルビシンの抗がん効果を評価した。
細胞培養容器、培養培地、及びドキソルビシンは実施例2で使用した物と同じものを用いた。
2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液に懸濁させたこと以外は実施例2と同様にして、細胞構造体を構築した。得られた細胞構造体は、血管網構造が構造体全体に散在している層にがん細胞層が積層された細胞構造体(NHDF(20層分)及びHUVEC(1層分)の混合層(21層)-HT29(1層))が得られた。
まず、1×106個のNHDFを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(工程(a))。これらの細胞懸濁液を、それぞれ、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。また、3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(工程(a))。これらの細胞懸濁液を、それぞれ、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。
得られた細胞構造体を、ドキソルビシンの最終濃度が10μMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ドキソルビシンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。結果を表3に示す。
繊維芽細胞(NHDF)と血管内皮細胞(HUVEC)とがん細胞(HT29)とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、抗がん剤のうち、血管新生阻害剤ベバシズマブと細胞障害性を有する分子標的薬セツキシマブとの併用効果を評価した。
細胞培養容器及び培養培地は実施例2で使用した物と同じものを用いた。評価対象となる抗がん剤は、ベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)とセツキシマブ(メルクセローノ社製、型番なし)とを用いた。
細胞構造体は、実施例3における「血管網構造が構造体全体に散在している細胞構造体」と同様にして構築した。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、セツキシマブの最終濃度が0又は1mg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブ及びセツキシマブのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。結果を表4に示す。
表中、「2D」の欄は2D培養物の結果を、「Spheroid」の欄はスフェロイドの結果を、「3D」の欄は構築した細胞構造体の結果を、それぞれ示す。
繊維芽細胞(NHDF)と血管内皮細胞(HUVEC)とがん細胞(HT29又はHCT116)とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブ及び抗がん剤5-FUの併用効果を評価した。
がん細胞及び血管網構造を含む細胞構造体としては、NHDF及びHUVECの2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、HT29又はHCT116(ATCC番号:CCL-247)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。細胞培養容器及び培養培地は、実施例2で使用した物と同じものを用いた。
評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用い、一般的な細胞障害性抗がん剤は5-FU(和光純薬社製、製品番号:064-01403)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理し、液体成分を除去した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、5-FUの最終濃度が100μM又は1mMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブ及び5-FUのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。
また、2D培養物及びスフェロイドに対しても同様にトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞として計数した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブ及び抗がん剤オキサリプラチンの併用効果を評価した。
がん細胞及び血管網構造を含む細胞構造体としては、実施例5で構築した細胞構造体を用い、細胞培養容器、培養培地、及びベバシズマブも実施例5で使用した物と同じものを用いた。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、オキサリプラチン(ファイザー社製)の最終濃度が10又は100μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブ及びオキサリプラチンのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。
また、比較のために、実施例5と同様にして、2D培養物及びスフェロイドについても同様にして、ベバシズマブ及びオキサリプラチン存在下で培養し、CNT(%)を算出した。
血管網構造の形成条件を振って構築した細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブと抗がん剤オキサリプラチンとの併用効果を評価した。
細胞培養容器、培養培地、及びベバシズマブは実施例5で使用した物と同じものを、オキサリプラチンは実施例6で使用した物と同じものを、それぞれ用いた。また、がん細胞としては、HT29細胞を用いた。
NHDF数に対するHUVEC数の割合(HUVEC含有率)を、0.05、0.25、0.5、又は1.5%とふった以外は実施例5と同様にして、細胞構造体を構築した。
この結果、HUVEC含有率を0.25、0.5、又は1.5%として構築した細胞構造体では血管網構造が形成されていたのに対して、HUVEC含有率を0.05%として構築した細胞構造体では血管網構造が形成されていなかった。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、オキサリプラチンの最終濃度が100μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブ及びオキサリプラチンのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
表中、「単剤」はオキサリプラチン単剤存在下で培養した場合の結果を、「併用」はオキサリプラチン及びベバシズマブの両存在下で培養した場合の結果を、それぞれ示す。また、「血管網形成有無」の欄中、「×」は血管網構造が形成されなかったことを、「○」は血管網構造が形成されたことを、それぞれ示す。
血管網構造の形成条件を振って構築した細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブと抗がん剤オキサリプラチンの併用効果を評価した。
細胞培養容器、培養培地、及びベバシズマブは実施例5で使用した物と同じものを、オキサリプラチンは実施例6で使用した物と同じものを、それぞれ用いた。また、がん細胞としては、HT29細胞を用いた。
NHDF及びHUVECから形成された構造体が形成されたトランズウェルセルカルチャーインサート内に、HT29細胞を播種し、遠心処理し、液体成分を除去した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて培養する培養時間を24、48、72、又は96時間とふったこと以外は実施例5と同様にして、細胞構造体を構築した。この結果、全ての培養時間において、血管網構造を備える細胞構造体が構築された。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、オキサリプラチンの最終濃度が100μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブ及びオキサリプラチンのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様にして、細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー染色した後、生きているがん細胞を計数し、CNT(%)を算出した。各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
表中、「単剤」及び「併用」、並びに「血管網形成有無」の欄の「×」及び「○」は、表9と同様である。
がん細胞を含む細胞層と、繊維芽細胞と血管内皮細胞から形成され、血管網構造を備える細胞層とを含む細胞構造体を用い、抗がん剤ドキソルビシンの抗がん効果を評価した。
がん細胞を含む細胞層と血管網構造を含む細胞層とを備える細胞構造体としては、NHDF及びHUVECの2種類の細胞が多層を構成する細胞層と、HT29から形成されたがん細胞層とを備える細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器、培養培地、評価対象となる抗がん剤ドキソルビシンは、実施例2で使用した物と同じものを用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁し、間質細胞懸濁液を調製した(工程(a’-1)(a’-2))。
間質細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理し、液体成分を除去した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
次いで、間質細胞を含む構造体が形成されたトランズウェルセルカルチャーインサート内に、がん細胞懸濁液を播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理し、液体成分を除去した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて96時間培養した(工程(c))。培養終了後、血管網構造を備えた間質細胞層にがん細胞層が積層された細胞構造体1(NHDF(20層分)及びHUVEC(1層分)の混合層(21層)-HT29(1層))が得られた。
間質細胞を含む構造体の上に、ポアサイズ0.4μmの半透膜を載せた後、この半透膜の上にがん細胞懸濁液を播種してがん細胞層を形成させたこと以外は、細胞構造体1と同様にして、細胞構造体2を得た。つまり、血管網構造を備えた間質細胞層の上にポアサイズ0.4μmの半透膜を介してがん細胞層が積層された細胞構造体2(NHDF(20層分)及びHUVEC(1層分)の混合層(21層)-半透膜-HT29(1層))が得られた。細胞構造体2では、がん細胞層を構成する細胞と間質細胞層を構成する細胞とは、完全に分離していた。
トランズウェルセルカルチャーインサート内に、まず、がん細胞懸濁液を播種してがん細胞層を形成させ、このがん細胞層の上にポアサイズ0.4μmの半透膜を載せた後、この半透膜の上に間質細胞懸濁液を播種して間質細胞層を形成させたこと以外は、細胞構造体1と同様にして、細胞構造体3を得た。つまり、がん細胞層の上にポアサイズ0.4μmの半透膜を介して血管網構造を備えた間質細胞層が積層された細胞構造体3(HT29(1層)-半透膜-NHDF(20層分)及びHUVEC(1層分)の混合層(21層))が得られた。細胞構造体3では、がん細胞層を構成する細胞と間質細胞層を構成する細胞とは、完全に分離していた。
ポアサイズ8μmの半透膜を用いたこと以外は、細胞構造体2と同様にして、細胞構造体4を得た。つまり、血管網構造を備えた間質細胞層の上にポアサイズ8μmの半透膜を介してがん細胞層が積層された細胞構造体4(NHDF(20層分)とHUVEC(1層分)の混合層(21層)-半透膜-HT29(1層))が得られた。細胞構造体4では、がん細胞層を構成する細胞と間質細胞層を構成する細胞とは、半透膜中の貫通部分において互いに伸展して接触していた。
ポアサイズ8μmの半透膜を用いたこと以外は、細胞構造体3と同様にして、細胞構造体5を得た。つまり、がん細胞層の上にポアサイズ8μmの半透膜を介して血管網構造を備えた間質細胞層が積層された細胞構造体5(HT29(1層)-半透膜-NHDF(20層分)とHUVEC(1層分)の混合層(21層))が得られた。細胞構造体5では、がん細胞層を構成する細胞と間質細胞層を構成する細胞は、半透膜中の貫通部分において互いに伸展して接触していた。
得られた細胞構造体を、ドキソルビシンの最終濃度が10μMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ドキソルビシンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
CNT(%)=[がん細胞の生細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の生細胞数]×100
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブと抗がん剤5-FUの併用効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト肺線維芽細胞(Normal Human Lung Fibroblasts:NHLF)(Lonza社製、製品番号:CC-2512)、ヒト肺微小血管内皮細胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell:HMVEC-L)(Lonza社製、製品番号:CC-2527)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、ヒト肺腺がん細胞株であるA549(ATCC番号:CCL-185)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用い、一般的な細胞障害性抗がん剤は5-FU(和光純薬社製、製品番号:064-01403)を用いた。
まず、2×106個のNHLF及び1×105個のHMVEC―Lを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHLF数に対するHMVEC―L数の割合:5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、5-FUの最終濃度が100μMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブと5-FUのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に、培養後の細胞構造体を分散し、分散した懸濁液を室温、1120×gで5分間、遠心処理した。その後、Fixation/Permilization solution(BD bioscience社製、554722)400 μLを加えて4℃で30分間固定し、液体成分を除去した。その後、キット付属のPerm/Wash buffer400μLを添加し、室温、1120×gで5分間遠心処理した。その後、5%FBS含有PBSで希釈した一次抗体Monoclonal Mouse Anti-human Cytokeratin7 (DAKO社製、M7018)を添加して4℃で30分間反応させた。その後、液体成分を除去し、キット付属のPerm/Wash bufferで2回洗浄し、5%FBS含有PBSで希釈した二次抗体 Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 (ThermoFischer Scientific社製、A-11030)を添加して4℃で30分間反応させた。その後、液体成分を除去し、キット付属のPerm/Wash bufferで2回洗浄し、5%FBS含有PBS350μLで再懸濁した。
固定及び染色後の懸濁液中で蛍光を発している細胞を、生きていたがん細胞として計数した。細胞の計数は、フローサイトメーター(ソニー社製)を使用して行った。
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブと抗がん剤5-FUの併用効果を評価した。
がん細胞及び血管網構造を含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、ヒト肺腺がん細胞株であるA549(ATCC番号:CCL-185)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用い、一般的な細胞障害性抗がん剤は5-FU(和光純薬社製、製品番号:064-01403)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した)。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、5-FUの最終濃度が100μM又は1mMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブと5-FUのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に、培養後の細胞構造体を分散し、分散した懸濁液を室温、1120×gで5分間、遠心処理した。その後、Fixation/Permilization solution(BD bioscience社製、554722)400 μLを加えて4℃で30分間固定し、液体成分を除去した。その後、キット付属のPerm/Wash buffer400μLを添加し、室温、1120×gで5分間遠心処理した。その後、5%FBS含有PBSで希釈した一次抗体Monoclonal Mouse Anti-human Cytokeratin7 (DAKO社製、M7018)を添加して4℃で30分間反応させた。その後、液体成分を除去し、キット付属のPerm/Wash bufferで2回洗浄し、5 %FBS含有PBSで希釈した二次抗体 Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 (ThermoFischer Scientific社製、A-11030)を添加して4℃で30分間反応させた。その後、液体成分を除去し、キット付属のPerm/Wash bufferで2回洗浄し、5%FBS含有PBS350μLで再懸濁した。
固定及び染色後の懸濁液中で蛍光を発している細胞を、生きていたがん細胞として計数した。細胞の計数は、フローサイトメーター(ソニー社製)を使用して行った。
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、抗がん剤オキサリプラチンの効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、市販肺がん細胞株NCI-H820(ATCC番号:HTB-181)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる一般的な細胞障害性抗がん剤はオキサリプラチン(ファイザー社製)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.05mg/mL ヘパリン、0.05mg/mL コラーゲン、25mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのオキサリプラチンの最終濃度が1μg/mL又は10μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、オキサリプラチンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
各培養条件について、1回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、抗がん剤オキサリプラチンの効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、市販胃がん細胞株NCI-N87(ATCC番号:CRL-5822)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる一般的な細胞障害性抗がん剤はオキサリプラチン(ファイザー社製)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.05mg/mL ヘパリン、0.05mg/mL コラーゲン、25mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのオキサリプラチンの最終濃度が10μg/mL又は100μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、オキサリプラチンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
各培養条件について、1回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、抗がん剤ドキソルビシンの効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、市販乳がん細胞株MCF-7(ATCC番号:HTB-22)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる一般的な細胞障害性抗がん剤はドキソルビシン(和光純薬社製、製品番号:046-21523)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのオキサリプラチンの最終濃度が1μM又は10μMである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ドキソルビシンを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、血管新生阻害剤ベバシズマブと抗がん剤5-FUの併用効果を評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、患者由来乳がん細胞CLTH/BC(celther社製、型番:CL04002-CLTH)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となる血管新生阻害剤はベバシズマブ(R&D Systems社製、製品番号:MAB293)を用い、一般的な細胞障害性抗がん剤はオキサリプラチン(ファイザー社製)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのベバシズマブ添加量が0又は2μgであり、オキサリプラチンの最終濃度が10μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、ベバシズマブとオキサリプラチンのいずれも添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
繊維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を用い、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬セツキシマブを評価した。
がん細胞と血管網構造とを含む細胞構造体としては、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts:NHDF)(Lonza社製、製品番号:CC-2509)、及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)(Lonza社製、製品番号:CC-2517A)の2種類の細胞から形成された多層構造体の天面に、KRASコドン13遺伝子変異型細胞株HCT116(ATCC番号:CCL-247)、KRASコドン12遺伝子変異型細胞株A549(ATCC番号:CCL-185)から形成されたがん細胞層を積層した細胞構造体を用いた。また、細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート(Corning社製、製品番号:#3470)を用い、培養培地としては、10容量%ウシ血清(Corning社製、製品番号:#35-010-CV)及び1容量%ペニシリン/ストレプトマイシン(和光純薬社製、製品番号:168-23191)含有D-MEM(和光純薬社製、製品番号:043-30085)を用いた。評価対象となるセツキシマブ(メルクセローノ社製、型番なし)を用いた。
まず、2×106個のNHDF及び3×104個のHUVECを、ヘパリン及びコラーゲンを含有するトリス-塩酸緩衝液(0.1mg/mL ヘパリン、0.1mg/mL コラーゲン、50mM トリス、pH7.4)に懸濁し、細胞懸濁液を調製した(NHDF数に対するHUVEC数の割合:1.5%)(工程(a))。この細胞懸濁液を、室温、400×gで1分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した(工程(a’-1)(a’-2))。次いで、この細胞懸濁液を、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後(工程(b))、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、400×gで1分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて24時間培養した(工程(c))。
得られた細胞構造体を、トランズウェルセルカルチャーインサートの1ウェル当たりのセツキシマブの最終濃度が100μg/mLである培養培地中で、37℃、5%CO2にて72時間培養した。対照として、セツキシマブを添加しなかったこと以外は同様にして培養した(薬剤非存在下での培養)。
実施例2と同様に細胞構造体を分散し、得られた分散液をトリパンブルー溶液に浸漬させてトリパンブルー染色した後、蛍光を発しておりかつトリパンブルー染色されていない細胞を、生きているがん細胞として計数した。細胞の計数は、セルカウンター「CountessII」(ライフテクノロジーズ社製)の蛍光モードを使用して行った。
各培養条件について、繰り返し3回ずつ測定した。
CNT(%)=[がん細胞の正細胞数]/[薬剤非存在下での培養におけるがん細胞の正細胞数]×100
Claims (15)
- (a)カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分と強電解質高分子とを混合して混合物を得る工程と、
(b)前記工程(a)により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
(c)前記工程(b)の後、当該細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程と、
により、がん細胞及び間質を構成する細胞を含む細胞構造体を製造した後、
前記細胞構造体を、1種又は2種以上の抗がん剤の存在下で培養する培養工程と、
前記培養工程後の前記細胞構造体中のがん細胞の生細胞数を指標として、前記抗がん剤の抗がん効果を評価する評価工程と、
を有する、抗がん剤の評価方法。 - 前記細胞培養容器が、セルカルチャーインサートである、請求項1に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記工程(a)の後、前記工程(b)の前に、(a’-1)得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程、及び(a’-2)細胞集合体を溶液に懸濁する工程を行い、
前記工程(c)において、遠心処理により、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る、
請求項1又は2に記載の抗がん剤の評価方法。 - 前記がん細胞が、前記細胞構造体内部に散在している、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、がん細胞のみを含む細胞層を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、がん細胞を含む層と間質を構成する細胞を含む層とが半透膜により仕切られている、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記半透膜のポアサイズが0.4μm~8μmである、請求項6のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、さらに、繊維芽細胞、神経細胞、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞からなる群より選択される1種以上を含む、請求項8に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される1種以上と、繊維芽細胞とを含み、
前記細胞構造体中の血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、繊維芽細胞の細胞数の0.1%以上である、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。 - 前記細胞構造体の厚さが5μm以上である、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記細胞構造体が、脈管網構造を備える、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記培養工程において、前記細胞構造体を、細胞障害性を有する抗がん剤及び脈管新生阻害剤の存在下で培養し、
前記脈管新生阻害剤と前記抗がん剤とを併用した場合の抗がん効果を評価する、請求項12に記載の抗がん剤の評価方法。 - 前記がん細胞が、がん患者から採取されたがん細胞である、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
- 前記培養工程における培養時間が、24~96時間である、請求項1~14のいずれか一項に記載の抗がん剤の評価方法。
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