JP2023156998A

JP2023156998A - 立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織

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Publication number: JP2023156998A
Application number: JP2023061158A
Authority: JP
Inventors: 史朗北野; Shiro Kitano; 智行高屋; Tomoyuki Takaya
Original assignee: Toppan Holdings Inc
Current assignee: Toppan Holdings Inc
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2023-04-05
Publication date: 2023-10-25

Abstract

【課題】経時的に培養しても、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制して、立体的細胞組織の厚さを維持できる立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織の提供。【解決手段】第１の細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を混合して第１の混合物を得る工程と、前記第１の混合物から第１の細胞集合体を形成する工程と、前記第１の細胞集合体を培地中で８時間～５２時間培養して第１の細胞組織を得る工程と、第２の細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第２の混合物を得る工程と、前記第１の細胞組織上に前記第２の混合物を積層し第２の細胞集合体を形成する工程と、前記第２の細胞集合体を前記培地中で培養する工程を含む、立体的細胞組織の製造方法。【選択図】図２

Description

本発明は、立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織に関する。

近年、再生医療、及び生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系等の分野において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞組織を使用することの優位性が示されている。このため、生体外で立体的細胞組織を構築するための様々な技術が開発されている。

特許文献１には、細胞が、カチオン性緩衝液、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得る工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法が開示されている。立体的細胞組織は、例えば、生体組織モデル又は固形癌モデル等に使用して、薬物スクリーニング等の様々なアッセイに利用することができる。

特許第６６３９６３４号公報

特許文献１に記載の方法で立体的細胞組織を製造すると、経時的に立体的細胞組織の厚みが減少してしまう場合がある。立体的細胞組織の厚みが経時的に減少してしまうと、例えば、がん細胞等を立体的細胞組織内に配置しても、立体的細胞組織が薄くなり、がん組織が露出してしまう場合がある。また、立体的細胞組織の厚みが経時的に減少すると、免疫細胞の遊走性に関連した評価の再現性が低下する場合がある。

そこで、本発明は、経時的に培養しても、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制して、立体的細胞組織の厚さを維持できる、立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織を提供することを目的とする。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］第１の細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を混合して第１の混合物を得る工程と、前記第１の混合物から第１の細胞集合体を形成する工程と、前記第１の細胞集合体を培地中で８時間～５２時間培養して第１の細胞組織を得る工程と、第２の細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第２の混合物を得る工程と、前記第１の細胞組織上に前記第２の混合物を積層し第２の細胞集合体を形成する工程と、前記第２の細胞集合体を前記培地中で培養する工程を含む、立体的細胞組織の製造方法。
［２］前記第１の混合物を得る工程は、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第１の混合液を得る工程と、前記第１の細胞と前記第１の混合液とを混合して前記第１の混合物を得る工程を含み、前記第２の混合物を得る工程は、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第２の混合液を得る工程と、前記第２の細胞と前記第２の混合液とを混合して前記第２の混合物を得る工程を含む、［１］に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［３］前記第１の細胞集合体は、理論層数が５層以上２０層以下となる数の前記第１の細胞を含み、前記第２の細胞集合体は、理論層数が５層以上２０層以下となる数の前記第２の細胞を含む、［１］又は［２］に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［４］前記第１及び第２の細胞は、少なくとも間質細胞を含む、［１］～［３］のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［５］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［４］のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［６］前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［５］のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［７］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む立体的細胞組織であって、培養開始日の前記立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の前記立体的細胞組織の厚さの減少率が３５％以下である立体的細胞組織。
［８］前記細胞は少なくとも間質細胞を含む、［７］に記載の立体的細胞組織。

本発明によれば、経時的に培養しても、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制して、立体的細胞組織の厚さを維持できる立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織を提供できる。

実験例１～３において測定した、立体的細胞組織の厚さの経時変化のグラフである。実験例１の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。実験例２の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。実験例３の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。実験例４～６において測定した、立体的細胞組織の厚さの経時変化のグラフである。

本明細書において、数値範囲を例えば「１～１０ｍｍ」と記載した場合、１ｍｍから１０ｍｍまでの範囲を意味し、下限値である１ｍｍと上限値である１０ｍｍを含む数値範囲を意味する。

（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、第１の混合物を得る工程と、第１の細胞集合体を形成する工程と、第１の細胞組織を得る工程と、第２の混合物を得る工程と、第２の細胞集合体を形成する工程と、前記第２の細胞集合体を前記培地中で培養する工程と、を含む立体的細胞組織の製造方法を提供する。第１の混合物を得る工程では、第１の細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質とを混合する。第１の細胞集合体を得る工程では、第１の混合物から第１の細胞集合体を形成する。第１の細胞組織を得る工程では、第１の細胞集合体を培地中で８時間～５２時間培養する。第２の混合物を得る工程では、第２の細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合する。第２の細胞集合体を得る工程では、前記第１の細胞組織上に前記第２の混合物を積層し、前記第２の細胞集合体を形成する。立体的細胞組織を得る工程では、前記第２の細胞集合体を前記培地中で培養する。

本実施形態の製造方法によれば、経時的に培養しても、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制して、立体的細胞組織の厚さを維持することができる。具体的には、細胞と、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む立体的細胞組織は、培養開始日の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の立体的細胞組織の厚さの減少率が３５％以下である。本明細書において、培養開始日、つまり培養０日目は、立体細胞組織を構成する全ての細胞の積層が完了した日と定義する。

本明細書において、立体的細胞組織の厚さとは、立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さであり、立体的細胞組織のほぼ中央部における切片の厚さである。立体的細胞組織の形状は、立体的細胞組織の製造に使用した容器によって異なるが、例えば、円柱形状のセルカルチャーインサートを用いて立体的細胞組織を製造した場合には、円柱形状となる。この場合、立体的細胞組織を上面から見たときの形状は円であり、上面から見たときの重心は、円の中心となる。立体的細胞組織の形状は、円柱形状に限定されず、目的に応じて任意の形状であることができる。具体的には、例えば、三角柱形状、四角柱形状等の多角柱形状等が例示できる。

培養開始日の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の立体的細胞組織の厚さの減少率は、３５％以下であり、３０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。

培養開始日の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から１０日目の立体的細胞組織の厚さの減少率は、３０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましく、２０％以下であることがより好ましい。

本実施形態の製造方法において、培養開始日から４日目の立体的細胞組織の厚さは、８０μｍ以上であることが好ましく、例えば８５μｍ以上、例えば９０μｍ以上、例えば９５μｍ以上、例えば１００μｍ以上、例えば１１０μｍ以上、例えば１２０μｍ超、例えば１３０μｍ以上、例えば１４０μｍ以上、例えば１５０μｍ以上、例えば１６０μｍ以上、例えば１７０μｍ以上、例えば１８０μｍ以上、例えば１９０μｍ以上、例えば２００μｍ以上であってもよい。最終積層日から４日目の立体的細胞組織の厚さの上限値は特に限定されないが、一例として１０００μｍが挙げられる。

また、立体的細胞組織の厚さが８０μｍ以上となる培養期間は、培養開始日から少なくとも３日間であることが好ましく、例えば４日間、例えば５日間、例えば６日間、例えば７日間、例えば８日間、例えば９日間、例えば１０日間、例えば１１日間、例えば１２日間、例えば１３日間、例えば１４日間、例えば１５日間、例えば１６日間、例えば１７日間、例えば１８日間、例えば１９日間、例えば２０日間であってもよい。

立体的細胞組織の形態に特に制限は無く、例えば、セルカルチャーインサート等の容器の内部で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、コラーゲン等の天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォールド内で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、細胞凝集体（スフェロイドともいう）であってもよいし、シート状の細胞構造体であってもよい。

本明細書において、「立体的細胞組織」とは、立体的な細胞の集合体を意味する。立体的細胞組織の用途としては、生体組織モデル、固形癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。生体組織モデルとしては、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経及び食道等のモデルが挙げられる。固形癌モデルとしては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌及び肝癌等のモデルが挙げられる。

＜立体的細胞組織の製造方法＞
本発明の一実施形態に係る立体的細胞組織の製造方法は、細胞集合体を得る工程と、細胞集合体を培養する工程とを繰り返して細胞を積層し、立体的細胞組織を得る。このようにして得た立体的細胞組織は、培養開始日の前記立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の前記立体的細胞組織の厚さの減少率が３５％以下である。

立体的細胞組織は、工程（Ａ）～工程（Ｃ）をこの順で少なくとも２回繰り返すことによって製造する。
（Ａ）細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質とを混合して混合物を得る工程
（Ｂ）得られた混合物から細胞集合体を形成する工程
（Ｃ）細胞集合体の細胞を８～５２時間培養する工程

工程（Ａ）は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質とを混合して混合物を得る工程である。工程（Ａ）は、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質とを混合して混合液を得る工程と、細胞と混合液とを混合して混合物を得る工程とを含んでいてもよい。

（カチオン性物質）
カチオン性物質としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸、トリス－マレイン酸、ビス－トリス及びＨＥＰＥＳ等のカチオン性緩衝剤、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン及びポリアルギニン等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもカチオン性緩衝剤が好ましく、トリス－塩酸がより好ましい。

カチオン性物質としてカチオン性緩衝剤を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０であってよい。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．２～７．６であることがより好ましく、約７．４であることが更に好ましい。

（細胞外マトリックス成分）
細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成する任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン、及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、上述したものの改変体又はバリアント等であってもよい。細胞外マトリックス成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

プロテオグリカンとしては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられる。細胞外マトリックス成分としては、なかでも、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンが好ましく、コラーゲンが特に好ましい。

工程（Ａ）における混合液中の細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されず、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。細胞外マトリックス成分は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒としては、水、緩衝液及び酢酸等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、緩衝液又は酢酸が好ましい。

（高分子電解質）
本明細書において、高分子電解質とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質としては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。高分子電解質は、上述したものの誘導体であってもよい。これらの高分子電解質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

高分子電解質は、グリコサミノグリカンであることが好ましい。なかでも、ヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸が好ましく、ヘパリンが特に好ましい。

工程（Ａ）における混合物中の高分子電解質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。細胞外マトリックス成分と異なり、高分子電解質は溶解の限界以下であれば、どのような濃度であっても効果があり、また、細胞外マトリックス成分による効果を阻害しない。高分子電解質の濃度は０．００５ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

高分子電解質は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒の例としては、水及び緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、高分子電解質をカチオン性緩衝液に溶解して用いてもよい。

工程（Ａ）における混合物中の高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比（終濃度比）は、１：２～２：１であることが好ましく、１：１．５～１．５：１であってもよく、１：１であってもよい。

細胞は、少なくとも間質細胞を含むことが好ましい。間質細胞とは、上皮細胞の支持組織を構成する細胞を意味する。本実施形態で用いられる間質細胞としては、線維芽細胞、免疫細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等が挙げられる。免疫細胞としては、リンパ球、好中球、及びマクロファージ等が挙げられる。間質細胞は、組織の維持に必須であるとともに、炎症反応や創傷治癒反応等に重要な役割を担っている。本発明において、間質細胞は、制御対象細胞の維持をすることができる。

間質細胞の由来としては特に限定はされず、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス及びラット等の哺乳動物に由来する細胞を使用することができる。

工程（Ａ）において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質との混合、又は細胞と混合液との混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート及びセルカルチャーインサート等の適当な容器中で行うことができる。これらの混合は、工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）で使用する容器中で行ってもよい。

工程（Ｂ）は、上記混合物から細胞集合体を得る工程である。工程（Ｂ）において、上記混合物から液体部分を除去して細胞集合体を得てもよい。本明細書において、「細胞集合体」とは、細胞の集団を意味する。細胞集合体には、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, 2015.に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。

液体部分を除去する手段としては、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離やろ過によって、液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物の入ったマイクロチューブを、室温、４００～１，０００×ｇで１～２分間の遠心分離に供して液体部分と細胞集合体とを分離することによって、液体部分を除去してもよい。あるいは、自然沈降によって細胞を集めた後、液体部分を除去してもよい。この結果、細胞集合体を得ることができる。

工程（Ｃ）は、上記の細胞集合体を培地中で培養し、細胞組織を得る工程である。なお、工程（Ｂ）と工程（Ｃ）の間に、細胞集合体を溶液に懸濁する工程を行ってもよい。溶液は、細胞の生育及び立体的細胞組織の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞集合体を構成する細胞に適した細胞培養培地又は緩衝液等を用いることができる。細胞集合体の懸濁は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル及びプレート等の適当な容器中で行うことができる。

細胞集合体を溶液に懸濁した場合、培養の前に細胞を沈殿させて基材上に細胞の沈殿体を形成してもよい。基材としては、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材及び形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス及びプラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、プレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。基材は、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料である。基材は、透過膜であることが好ましい。かかる透過膜を有する容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌインサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサートなどのセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞の沈殿は、例えば、遠心分離、磁性分離又はろ過等により行うことができる。遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞集合体の懸濁液をセルカルチャーインサートに播種し、室温、４００～１，０００×ｇで１～２分間の遠心分離に供して沈殿させてもよい。あるいは、自然沈降によって細胞を沈殿させてもよい。また、集めた細胞は層構造を形成していてもよい。

細胞集合体、又は、細胞集合体を懸濁した場合には懸濁液は、培養容器において理論層数が５層以上２０層以下となる数の細胞を含むことが好ましい。理論層数は、５層以上１５層以下であることがより好ましく、５層以上１０層以下であることがさらに好ましい。「理論層数」は、使用する培養容器及び細胞種に基づいて、以下の方法で算出することができる。使用する培養容器と使用する細胞の組合せを用いて細胞数を複数の水準（例えば０．２×１０^５個～１．０×１０^５個の間で１～１０段階の水準）でそれぞれ培養を行う。培養開始から１日目（２４時間後）の細胞断面の顕微鏡写真から得られる層数と細胞数との比を求めることにより１層あたりの細胞数を算出する。細胞集合体に含まれる細胞数における理論層数は、得られた１層あたりの細胞数で、細胞集合体に含まれる細胞数を除することで得られる。

細胞が間質細胞である場合、細胞集合体又は懸濁液に含まれる細胞の数は、培養容器の底面積１ｍｍ^２あたり１．５７×１０^２～６．２９×１０^２個であることが好ましく、１．５７×１０^２～４．７２×１０^２個であることがより好ましく、１．５７×１０^２～３．１５×１０^２個であることがさらに好ましい。例えば、培養容器の底面積１ｍｍ^２あたりの細胞数が１．５７×１０^２～３．１５×１０^２個となるように細胞集合体又は懸濁液を調製することで理論層数を５～１０層とすることができる。細胞集合体を溶液に懸濁する工程、及び、細胞を沈殿させる工程を実施することにより、より均質な立体的細胞組織を得ることができる。

工程（Ｃ）は、上述の細胞集合体を培地中で８～５２時間培養して細胞組織を得る工程である。細胞集合体の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。細胞培養培地としては特に限定されないが、ＤＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｍｃｃｏｙ’５ａ及びＨａｍ’ｓＦ－１２等の基本培地や、これらの基本培地にＣＳ（ウシ血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）及びＨＢＳ（ウマ胎児血清）等の血清を１～２０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件もまた、当業者であれば容易に決定することができる。

細胞の培養時に、構築された立体的細胞組織の変形（例えば、組織の収縮及び組織末端の剥離等）を抑制するための物質を培地に添加してもよい。このような物質としては、選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｆｏｒｍｉｎｇｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＹ－２７６３２が挙げられるが、これに限定されない。

工程（Ｃ）における培養時間は、８時間～５２時間であり、１２時間～４８時間であることが好ましく、２０～２８時間であることがより好ましい。工程（Ｃ）において上記培養時間で培養を行った後に工程（Ａ）～工程（Ｃ）を繰り返すことで、経時的に培養しても厚さの減少が抑制される立体的細胞組織を作製することができる。

本実施形態において、工程（Ａ）～工程（Ｃ）を少なくとも２回繰り返す。即ち、工程（Ｃ）の後に少なくとも下記工程（Ａ－２）～工程（Ｃ－２）を行う。
（Ａ－２）第２の細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を混合して混合液を得る工程
（Ｂ－２）工程（Ｃ）で得られた細胞組織上に第２の混合物を積層し、第２の混合物から液体部分を除去して第２の細胞集合体を形成する工程
（Ｃ－２）第２の細胞集合体の細胞を８～５２時間培養する工程

工程（Ａ－２）～（Ｃ－２）は、上述の工程（Ａ）～工程（Ｃ）と同じ条件で行うことができるが、以下のように条件を設定してもよい。

工程（Ａ－２）のカチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質は、１回目の工程（Ａ）で用いたものと同じであってもよいし、異なっていてもよい。

工程（Ａ－２）の第２の細胞は、１回目の工程（Ａ）の細胞と同じ細胞種であってもよく、異なる細胞種であってもよい。また、第２の細胞及び１回目の工程（Ａ）の細胞が複数種の細胞を含む場合、第２の細胞は、１回目の工程（Ａ）の細胞種と異なる細胞種のみを含んでもよいし、１回目の工程（Ａ）の少なくとも一部の細胞種と同一の細胞種を含んでいてもよい。

工程（Ａ－２）の細胞集合体に含まれる第２の細胞数は、１回目の工程（Ａ）に含まれる細胞数と同じであってもよいし、異なってもよい。

工程（Ｂ－２）は、１回目の工程（Ｃ）で形成された細胞組織上に第２の混合物を積層する点が１回目の工程（Ｂ）と異なる。工程（Ｂ－２）で形成される第２の細胞集合体は、工程（Ｃ）で形成された細胞組織と工程（Ａ－２）で得られた細胞集合体とを含んでいる。また、工程（Ｂ－２）における液体部分を除去する方法は、１回目の工程（Ｃ）と同じでもよく、異なっていてもよい。

工程（Ｃ－２）の培養時間は、１回目の工程（Ｃ）と同じでもよく、異なっていてもよい。工程（Ａ）～工程（Ｃ）の繰り返し回数が２回である場合、つまり、工程（Ｃ－２）が最後の培養工程であり、これにより立体的細胞組織が作成される場合、培養期間は、５２時間超であってもよく、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間又は１４日間でもよい。

工程（Ａ）～工程（Ｃ）は、所望の立体的細胞組織の厚さが得られるよう３回以上繰り返してもよいし、４回、６回又は８回以上繰り返してもよい。工程（Ａ）～工程（Ｃ）の繰り返し回数の上限値は、特に限定されないが例として２０回が挙げられる。工程（Ａ）～工程（Ｃ）の繰り返し回数が３回以上である場合、つまり、工程（Ａ）～工程（Ｃ）の繰り返し回数がｎ回（ｎ≧３）の場合、工程（Ａ－ｎ）～工程（Ｃ－ｎ）は、上記工程（Ａ－２）～工程（Ｃ－２）に記載の条件で行うことができる。また、培養開始日は、工程（Ａ）～（Ｃ）の繰り返しにおいて最後の工程（Ｃ－ｎ）を開始した日である。

以上の工程（Ａ）～工程（Ｃ）を繰り返すことにより、経時的に培養しても厚さの減少が抑制される立体的細胞組織を作製することができる。

（第２実施形態）
本発明のもう一つの態様は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む立体的細胞組織であって、培養開始日の前記立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の前記立体的細胞組織の厚さの減少率が３５％以下である、立体的細胞組織である。

本実施形態の立体的細胞組織は、上述の第１実施形態により作製することができる。従って、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質は、第１実施形態に記載の通りである。

本実施形態においても、培養開始日は、工程（Ａ）～（Ｃ）の繰り返しにおいて最後の工程（Ｃ）を開始した日である。

培養開始日から４日目の立体的細胞組織の厚さは、８０μｍ以上であることが好ましく、例えば８５μｍ以上、例えば９０μｍ以上、例えば９５μｍ以上、例えば１００μｍ超、例えば１１０μｍ以上、例えば１２０μｍ以上、例えば１３０μｍ以上、例えば１４０μｍ以上、例えば１５０μｍ以上、例えば１６０μｍ以上、例えば１７０μｍ以上、例えば１８０μｍ以上、例えば１９０μｍ以上、例えば２００μｍ以上であってもよい。最終積層日から４日目の立体的細胞組織の厚さの上限値は特に限定されないが、一例として１０００μｍが挙げられる。

本実施形態の立体的細胞組織によれば、経時的に培養しても厚さの減少が抑制されているため、立体的細胞組織内に他の細胞（例えばがん細胞）を配置し、培養を継続しても他の細胞が露出しにくい。また、立体的細胞組織を用いた免疫細胞の遊走性に関連した評価の再現性が低下しにくい。

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

［実験例１］
間質細胞として、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（型番：ＣＣ－２５０９、Ｌｏｎｚａ社製）を用い、立体的細胞組織を作成した。立体的細胞組織を作成するにあたり、高分子電解質として、ヘパリン（ＨｅｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍｓａｌｔｆｒｏｍｐｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＧｒａｄｅＩ－Ａ）（型番：Ｈ３３９３－１００ＫＵ、Ｓｉｇｍａ社製）を用い、細胞外マトリックス成分として、コラーゲン（ＣｏｌｌａｇｅｎＴｙｐｅＩ，ＢｏｖｉｎｅＳｋｉｎ，ＡｃｉｄＳｏｌｕｂｌｅ）（型番：ＡＳＣ－１－１００－１００、ＮＩＰ社製）を用いた。

まず、ヘパリン／コラーゲン混合溶液として、０．１ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液と、０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン／酢酸溶液（ｐＨ３．７）とを等量ずつ混合した溶液（すなわち、コラーゲン及びヘパリンの終濃度はそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬであった）を調製した。次いで、ヘパリン／コラーゲン混合溶液にヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を加えて懸濁し、室温下、４００×ｇ、５分間遠心した後、上清を除き培養用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。培養用培地は、ペニシリンストレプトマイシン溶液（×１００）（型番：１６８－２３１９１、富士フィルム和光純薬社製）と５６℃、３０分間の非働化処理をしたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（型番：１０４３７０２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加した１０％ＦＢＳ含有高グルコースＤ－ＭＥＭ（型番：０４３－３００８５、富士フィルム和光純薬社製）を用いた。

次いで、トランズウェルインサート一体型９６ウェルプレート（０．４μｍ孔サイズポリエステルメンブレン、型番：７３６９、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、当該細胞懸濁液を１ウェル当たり１３５μＬ（ＮＨＤＦが２．２５×１０^５個含まれるように調製した細胞濃度、理論細胞層数が５となる量）播種した後、当該細胞懸濁液を分注したプレートを、室温下、４００×ｇ、１分間遠心分離し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。細胞懸濁液をウェルに播種した日を積層開始０日目とし、積層開始１日目（２４時間後）にウェル内の上清を除いた後、上述の方法で調製した細胞懸濁液を１ウェル当たり１３５μＬを播種した後、室温下、４００×ｇ、１分間遠心分離し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。次いで、積層開始２日目（４８時間後）と積層開始３日目（７２時間後）に積層開始１日目（２４時間後）と同様の操作を行い、積層開始０日目から３日目までの合計で２０層の間質細胞を積層した。
積層開始３日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で４日間培養した。

［実験例２］
［実験例１］の積層開始０日目の手順と同様に積層開始０日目の積層（理論細胞層数５）を行った。次いで、積層開始１日目（２４時間後）にウェル内の上清を除いた後、細胞が入っていない新しい培養用培地を１３５μＬ加え、室温下、４００×ｇ、１分間遠心分離し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。次いで、積層開始２日目（４８時間後）に［実験例１］に記載した方法と同様にして調製した細胞懸濁液を１ウェル当たり１３５μＬ（ＮＨＤＦが４．５×１０^５個含まれるように調製した細胞濃度、理論細胞層数が１０となる量）を播種した後、室温下、４００×ｇ、１分間遠心分離し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。次いで、積層開始３日目（７２時間後）に積層開始０日目と同様の操作を行い、積層開始０日目から３日目までの合計で２０層の間質細胞を積層した。
積層開始３日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で４日間培養した。

［実験例３］
［実験例１］に記載した方法と同様にして調製した細胞懸濁液を１ウェル当たり１３５μＬ（ＮＨＤＦが９×１０^５個含まれるように調製した細胞濃度、理論細胞層数が２０となる量）を播種した後、室温下、４００×ｇ、１分間遠心し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。積層開始０日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で７日間培養した。

［厚さの測定方法］
実験例１と２については積層０日目と培養０日目と培養４日目に、実験例３については培養０日目、４日目及び７日目に得られた立体的細胞組織を、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン緩衝液（型番「０６２－０１６６１」、富士フィルム和光純薬社製）１００μＬを、セルカルチャーインサート内に添加し、１０分間静置した後に、ＰＢＳで３回洗浄し、立体的細胞組織の固定を行った。

続いて、立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、ＨＥ染色した薄切切片を光学顕微鏡（ＭＸ５１、オリンパス社）で撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製）を用いて、立体的細胞組織の自重と垂直方向（つまり横方向）における中央付近の厚さを測定した。

実験例１～３の立体的細胞組織の厚さの経時変化のグラフを図１に示す。なお、図１中、誤差範囲のバーは標準偏差を示す。図２は、実験例１の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。図３は、実験例２の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。図４は、実験例３の培養４日目の立体的細胞組織の顕微鏡写真である。

実験例３（積層０日目に２０層積層した場合）では、積層０日目の立体的細胞組織の厚さは平均１２０．４μｍであった。しかしながら、培養４日目には６６．８μｍであり、培養０日目の厚さに対し４５％減少した。培養７日目には厚みが４２．０μｍまで減少し、培養０日目の厚さに対し６５％減少した。

実験例１（積層０日目から積層３日目まで理論細胞層数で５層ずつ、計２０層積層した場合）では、培養０日目（つまり、積層３日目）に立体的細胞組織の厚さが１１７．０μｍとなった。また、培養４日目の立体的細胞組織の厚さは１２３．６μｍであり、培養０日目の厚さに対し６％増加した。実験例２（積層０日目に５層、積層２日目に１０層、積層３日目に５層積層し、計２０層積層した場合）では、培養０日目（つまり、積層３日目）に立体的細胞組織の厚さが１１９．３μｍとなった。また、培養４日目の立体的細胞組織の厚さは９６．２μｍであった。培養４日目の厚さは、培養０日目の厚さに対し２０％減少したが、１００μｍ程度の厚さを維持することができた。

実験例１～３より培養期間を長くした場合の立体的細胞組織の厚みの変化を調べるため、実験例４～６を行った。

［実験例４］
実験例１とは異なるロット番号のＮＨＤＦ（型番：ＣＣ－２５０９、Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、実験例１と同じ手順で積層開始０日目から３日目までの合計で２０層の間質細胞を積層し、立体的細胞組織を作成した。その後、積層開始３日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で１０日間培養した。

［実験例５］
実験例４と同じロット番号のＮＨＤＦを用いて、実験例２と同じ手順で積層開始０日目から３日目までの合計で２０層の間質細胞を積層し、立体的細胞組織を作成した。その後、積層開始３日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で１４日間培養した。その後、積層開始３日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で１０日間培養した。

［実験例６］
実験例４と同じロット番号のＮＨＤＦを用いて、実験例３に記載した方法と同様に培養した。積層開始０日目を培養開始日とし、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で１４日間培養した。

実験例４～６の立体的細胞組織の厚さの経時変化のグラフを図５に示す。なお、図５中、誤差範囲のバーは標準偏差を示す。

実験例６（積層０日目に２０層積層した場合）では、積層０日目の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養７日目の厚さの減少率は、４７％であった。また、培養０日目の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養１０日目の厚さの減少率は、３９％であった。

実験例４（積層０日目から積層３日目まで理論細胞層数で５層ずつ、計２０層積層した場合）では、培養０日目（つまり、積層３日目）の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養７日目（つまり、積層１０日目）の厚さの減少率は、２２％であった。また、培養０日目の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養１０日目の厚さの減少率は、２０％であった。実験例５（積層０日目に５層、積層２日目に１０層、積層３日目に５層積層し、計２０層積層した場合）では、培養０日目の立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養７日目の厚さの減少率は、３４％であった。

Claims

第１の細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を混合して第１の混合物を得る工程と、
前記第１の混合物から第１の細胞集合体を形成する工程と、
前記第１の細胞集合体を培地中で８時間～５２時間培養して第１の細胞組織を得る工程と、
第２の細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第２の混合物を得る工程と、
前記第１の細胞組織上に前記第２の混合物を積層し第２の細胞集合体を形成する工程と、
前記第２の細胞集合体を前記培地中で培養する工程を含む、立体的細胞組織の製造方法。
前記第１の混合物を得る工程は、
前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第１の混合液を得る工程と、
前記第１の細胞と前記第１の混合液とを混合して前記第１の混合物を得る工程を含み、
前記第２の混合物を得る工程は、
前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質とを混合して第２の混合液を得る工程と、
前記第２の細胞と前記第２の混合液とを混合して前記第２の混合物を得る工程を含む、請求項１に記載の立体的細胞組織の製造方法。
前記第１の細胞集合体は、理論層数が５層以上２０層以下となる数の前記第１の細胞を含み、
前記第２の細胞集合体は、理論層数が５層以上２０層以下となる数の前記第２の細胞を含む、請求項１又は２に記載の立体的細胞組織の製造方法。
前記第１及び第２の細胞は、少なくとも間質細胞を含む、請求項１又は２に記載の立体的細胞組織の製造方法。
前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の立体的細胞組織の製造方法。
前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の立体的細胞組織の製造方法。
細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む立体的細胞組織であって、培養開始日の前記立体的細胞組織の厚さを１００％としたときの培養開始日から７日目の前記立体的細胞組織の厚さの減少率が３５％以下である、立体的細胞組織。
前記細胞は、少なくとも間質細胞を含む、請求項７に記載の立体的細胞組織。