CN115244172A - 细胞的保存方法 - Google Patents

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柳田康友
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Exocrine Therapy Co ltd
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Abstract

取得冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。使用包括以下工序的细胞的保存方法。工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。或者可以使用包括以下工序的细胞悬液的生产方法工序。工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物；工序(c)：将所述冷冻物解冻，生成解冻物的工序；以及工序(d)：将所述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液。

Description

细胞的保存方法
【技术领域】
本发明涉及细胞、细胞悬液、容器、设备、或再生医疗用医药组合物等。
【背景技术】
作为以干细胞为主成分的再生医疗用产品，日本贩卖有Temcell HS注射液和STEMIRAC注射液。这些产品以冷冻状态保存送往医疗现场。然后在对患者施用前解冻使用。施用时的剂型为细胞悬液。
Temcell HS注射液在袋(总量10.8mL)中含有72×106个人间充质干细胞和1.08mL的二甲基亚砜(DMSO)等。STEMIRAC注射液在袋(总量20mL或40mL)中含有0.5～2.0×108个自体骨髓间充质干细胞和2mL或4mL的DMSO等。这里，DMSO为冷冻保护剂。
专利文献1中记载了含有人间充质干细胞的医药组合物及其制造方法。该专利已提交了Temcell HS注射液相关的专利权延长登录申请。专利文献2中记载了含有来源于骨髄或血液的细胞的再生用医药的制造方法。该专利已提交了STEMIRAC注射液相关的专利权延长登录申请。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】日本专利第5394932号说明书
【专利文献2】日本专利第4936341号说明书
【发明内容】
【发明要解决的课题】
上述再生医疗用产品和专利文献中记载的再生医疗用医药组合物经过冷冻、解冻后使用,因此细胞悬液中含有冷冻保护剂。但是,由于冷冻保护剂的浓度高,所以会引起有害的副作用。
【解决课题的手段】
本申请发明人等经过冷冻、解冻后也成功制造出了冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。即，根据本发明的一个实施方式，提供一种细胞的保存方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。若将含有采用该方法保存的细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则能够得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种细胞的冷冻解冻方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物；以及工序(c)：将上述冷冻物解冻，生成解冻物。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种含冷冻细胞的组合物的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种细胞悬液的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物；工序(c)：将上述冷冻物解冻，生成解冻物；以及工序(d)：将上述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种细胞悬液的生产方法，其包括：装有含细胞和冷冻保护液的细胞悬液的容器的冷冻物解冻的工序；将安装于注射器的注射针刺入上述容器的工序；以及从上述注射器向上述容器注入溶液的工序。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种容器，其装有含有作为单细胞群的2.0×107个/mL以上的细胞和冷冻保护剂的组合物的冷冻物。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种设备，其包括装有细胞和冷冻保护液的容器以及注射器，是上述容器与上述注射器一体化而成的。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种设备，其由装有颗粒状的含细胞组合物的容器与注射器一体化而成。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供一种再生医疗用医药组合物，其含有细胞和冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的含量为1％(v/v)以下。
【附图说明】
图1是实施例1中记载的颗粒法的一个例子的概念图。
图2是实施例1中测定冷冻保护液残留量的结果的图。
图3是实施例1中测定将细胞冷冻解冻后的活细胞率的结果的图。
图4是实施例1中测定解冻后的细胞数和培养3天后的细胞数的结果的图。
图5是实施例2中测定将细胞冷冻解冻后的活细胞率和细胞数的结果的图。
图6是实施例3中将袋设置于离心机的状态的照片。
图7是实施例3中测定冷冻保护液残留量的结果的图。
图8是实施例3中测定将细胞冷冻解冻后的活细胞率的结果的图。
图9是实施例3中测定解冻后的细胞数和培养3天之后的细胞数的结果的图。
【具体实施方式】
以下对本发明的实施方式进行详细说明。应予说明，为避免重复，对相同内容适当省略说明。
本发明的一个实施方式包括细胞的保存方法，该方法包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。若将含有采用该方法保存的细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则能够得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。另外，采用该方法保存中的细胞在用于目的用途(例如将细胞施用于需要再生医疗的患者)之前，可以放在容器(例如冷冻柜)中保存。例如用于再生医疗时，可以在施用于患者之前将采用该方法保存的细胞从冷冻柜取出，解冻并用溶液混悬后对患者施用。此时，可根据溶液量将悬液中的冷冻保护剂设定为低浓度，因此能够施用安全性优异的细胞悬液。另外，由于细胞被事先浓缩，所以能够将目的浓度的细胞留在悬液中。
本发明的一个实施方式包括细胞的保存方法，该方法包括：将装有细胞和冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；去除上述上清液，生成浓缩组分的工序；以及将上述浓缩组分冷冻的工序。若将含有采用该方法保存的细胞的组合物解冻，并用溶液混悬，则能够得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞的冷冻解冻方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物工序；以及工序(c)：将上述冷冻物解冻，生成解冻物。若将采用该方法冷冻解冻的细胞用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞的冷冻解冻方法，其包括如下工序：将单细胞在细胞冷冻保护液中混悬后，通过离心操作使细胞沉降成为颗粒状，去除冷冻保护液的上清液，在该状态下将剩余的细胞颗粒冷冻及解冻。若将采用该方法冷冻解冻的细胞用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括含冷冻细胞的组合物的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。若将采用该生产方法得到的含冷冻细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。此时，根据溶液量，可将悬液中的冷冻保护剂设定为低浓度，因此能够得到安全性优异的细胞悬液。另外，由于细胞被事先浓缩，所以能够将目的浓度的细胞留在悬液中。
本发明的一个实施方式包括含冷冻细胞的组合物的生产方法，其包括：将含有细胞和冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；去除上述上清液，生成浓缩组分的工序；以及将上述浓缩组分冷冻的工序。若将采用该生产方法得到的含冷冻细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞悬液的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物工序；工序(c)：将上述冷冻物解冻，生成解冻物；以及工序(d)：将上述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液。根据该生产方法，能够得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞悬液的生产方法，其包括：将含有细胞和冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；去除上述上清液，生成浓缩组分的工序；将上述浓缩组分冷冻的工序；以及将上述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液的工序。根据该生产方法，可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞悬液的生产方法，其包括：将细胞被浓缩的浓缩组分冷冻，生成冷冻物的工序；或者将细胞被浓缩的浓缩组分的冷冻物解冻，生成解冻物的工序。根据该生产方法，可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞悬液的生产方法，其包括：将装有含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液的容器的冷冻物解冻的工序；将安装于注射器的注射针刺入上述容器的工序；以及从上述注射器向上述容器注入溶液的工序。根据该生产方法，可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括装有含冷冻细胞的组合物的容器的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及工序(b)：将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。若将采用该生产方法得到的容器内的含冷冻细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括含冷冻细胞的组合物的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分。若将采用该生产方法得到的含冷冻细胞的组合物解冻并用溶液混悬，则可得到冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括细胞颗粒的生产方法，其包括：将装有细胞和上述冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；以及去除上述上清液，生成浓缩组分的工序。可将采用该生产方法得到的细胞颗粒冷冻、解冻，生产细胞颗粒。
本发明的一个实施方式包括一种设备，其具备装有上述细胞颗粒的带橡胶塞的小瓶和装有细胞悬液的注射器，具有安装于注射器的注射针刺入橡胶塞的形状，为注射器与小瓶结合的状态。
本发明的一个实施方式包括一种方法或含细胞组合物的生产方法，其包括工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；或者工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。
本发明的一个实施方式包括一种容器，其装有组合物的冷冻物，该组合物含有作为单细胞群的2.0×107个/mL以上的细胞(例如干细胞等)和冷冻保护剂。若将该容器中的冷冻物解冻后与溶液混合，则能够根据溶液的量稀释冷冻保护剂，制备细胞悬液。该容器可通过上述任意本发明的一个实施方式的生产方法来生产。这里，组合物中的细胞浓度可以为2.0×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、1×108、3×108、5×108、7×108、9×108、或1×109/mL以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。上述组合物可含有20％(v/v)以下的冷冻保护剂。该浓度例如可以为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20％(v/v)，也可以是其中2个数值之间的范围内。该冷冻保护剂例如可以为DMSO、甘油、丙三醇、葡聚糖、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇(Propylene glycol)、或丙二醇(Propanediol)。冷冻保护剂为海藻糖、山梨糖醇或聚乙烯吡咯烷酮时，可以含有浓度为20％(w/v)以下的冷冻保护剂。该浓度例如可以为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20％(w/v)，也可以是其中2个数值之间的范围内。上述组合物可以含有0.001～1mL的冷冻保护液。其量例如可以为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1mL，也可以是其中2个数值之间的范围内。
本发明的一个实施方式包括一种容器，其装有含有细胞和冷冻保护液的组合物的冷冻物，冷冻物的容量为容器容积的30％以下。若将该容器中的冷冻物解冻后与溶液混合，则能够根据溶液的量边稀释冷冻保护剂边制备细胞悬液。此时，由于能够对容器内冷冻物以外的部分注入溶液，因此细胞悬液的制备简单。
本发明的一个实施方式包括一种设备，其包括本发明的上述任意一个实施方式的容器和注射器，是容器与注射器一体化而成的。该设备可用来简单制备细胞悬液。另外，使用该设备能够生产冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。本发明的一个实施方式中，一体化包括连接的状态。本发明的一个实施方式中，连接包括直接或间接连接的方式。直接连接时，例如容器表面与注射器可以直接连接。间接连接时，例如容器与注射器可以介由连接部(例如管、连接器等)连接。此时，可以容器的表面与连接部连接，接着连接部与注射器连接。
本发明的一个实施方式包括一种组合物，其含有2.0×107个/mL以上的细胞(例如干细胞等)和冷冻保护剂。这里，细胞优选为单细胞群。此时，冷冻保护剂的浓度只要是对于细胞的冷冻保护有效的浓度就没有特别限定。该浓度例如可以为0.5～20％(v/v)或0.5～20％(w/v)。若将该组合物冷冻，将冷冻物解冻后与溶液混合，则能够根据溶液量边稀释冷冻保护剂边制备细胞悬液。该组合物中的细胞与冷冻保护剂的浓度可以是上述容器中的组合物的说明中列举的值的范围。该组合物可以采用本发明的上述任意一个实施方式的生产方法进行生产。本发明的一个实施方式包括装有上述组合物的容器。
本发明的一个实施方式包括一种设备，其包括装有上述组合物的容器和注射器，是容器与注射器一体化而成的。该设备可用于简单制备细胞悬液。另外，使用该设备能够生产冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括一种设备，其包括装有颗粒状的含细胞(例如干细胞等)组合物的容器和注射器，是上述容器与上述注射器一体化而成的。该设备可用于简单制备细胞悬液。本发明的一个实施方式包括一种设备，其包括装有含细胞(例如干细胞等)组合物的冷冻物的容器和注射器，是上述容器与上述注射器一体化而成的。另外，使用设备能够生产冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。
本发明的一个实施方式包括本发明的上述任意一个实施方式的组合物、容器、或设备的冷冻物。使用该冷冻物能够生产冷冻保护剂浓度低的细胞悬液。装有含冷冻细胞的组合物的容器、或该容器与注射器一体化而成的设备的冷冻物能够在维持冷冻状态的状态下流通。容器与注射器一体化而成的设备的冷冻物具有可省略在医疗现场连接容器与注射器的工序的优点。
本发明的一个实施方式包括一种含有细胞(例如人干细胞等)的组合物(例如再生医疗用医药组合物)，其含有低浓度的冷冻保护剂。该组合物中的冷冻保护剂浓度例如可以为1％(v/v)以下或1％(w/v)以下。该组合物的冷冻保护剂的浓度低，所以对受试者施用时的安全性优异。该冷冻保护剂的浓度例如可以是对患者施用时的浓度。在本发明的一个实施方式中，1％(v/v)以下或1％(w/v)以下例如可以为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、0.2、0.3、0.4、0.5或者1％(v/v)或％(w/v)，也可以是其中2个数值之间的范围内。本发明的一个实施方式包括用于生产再生医疗用组合物的细胞的使用，该再生医疗用组合物含有低浓度的冷冻保护剂。本发明的一个实施方式包括用于再生医疗的含有细胞的组合物，该组合物含有低浓度的冷冻保护剂。本发明的一个实施方式中，再生医疗可以将含有细胞和冷冻保护剂(例如1％(v/v)以下的浓度)的组合物施用于受试者。另外，再生医疗包括细胞疗法。细胞疗法包括具备将细胞施用于受试者的工序的治疗方法。
本发明的一个实施方式包括再生医疗方法，其包括将含有细胞(例如人干细胞等)的再生医疗用组合物施用于患者的工序，再生医疗用组合物中的冷冻保护剂的含量为低浓度。此时，冷冻保护剂的浓度例如可以为1％(v/v)以下或1％(w/v)以下。该再生医疗方法由于施用的冷冻保护剂的浓度低，所以安全性优异。施用例如可以是血管内(例如静脉内或动脉内)给药。施用也可以是静脉给药。
本发明的一个实施方式包括再生医疗方法，其包括：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分的工序；将上述浓缩组分冷冻，生成冷冻物的工序；将上述冷冻物解冻，生成解冻物的工序；将上述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液的工序；或者将上述细胞悬液施用于受试者的工序。
本发明的一个实施方式包括再生医疗方法，其包括：将本发明的上述任意一个实施方式的组合物的冷冻物在容器内解冻的工序；向上述容器中添加溶液使细胞混悬的工序；或者将上述细胞悬液施用于受试者的工序。
上述本发明的一个实施方式的细胞的保存方法、细胞的冷冻解冻方法、含冷冻细胞的组合物的生产方法、细胞悬液的生产方法、容器的生产方法、或细胞颗粒的生产方法可以包括：培养细胞的工序；将所得细胞集落(例如在含胰蛋白酶的溶液中)分散成单细胞的工序；将所得单细胞群离心，生成沉淀画分的工序、或者将沉淀组分与冷冻保护液混合的工序。
上述本发明的一个实施方式的细胞的保存方法、细胞的冷冻解冻方法、含冷冻细胞的组合物的生产方法、细胞悬液的生产方法、容器的生产方法、或细胞颗粒的生产方法可以包括如下工序：将细胞与冷冻保护液混合，生成细胞悬液。该工序后可以将细胞悬液静置。静置时间可以为1、2、3、4、5、10、20、30、或60分钟以上，也可以是这些数值中任意2个数值之间的范围内。从获得冷冻解冻后更高的细胞存活率的观点考虑，该静置时间优选为5分钟以上。此时的温度例如可以为3、4、5、6、10、20、30、或37℃，也可以是这些数值中任意2个数值之间的范围内。
上述本发明的一个实施方式的方法或生产方法(细胞的保存方法、细胞的冷冻解冻方法、含冷冻细胞的组合物的生产方法、细胞悬液的生产方法、容器的生产方法、或细胞颗粒的生产方法等)可以包括：将装有上述细胞和上述冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；以及去除上述上清液，生成浓缩组分的工序。根据这两个工序，可通过简单的操作生成细胞的浓缩组分。另外，可使浓缩组分中含有高浓度的细胞和冷冻保护有效量的冷冻保护剂。
上述本发明的一个实施方式的方法或生产方法(细胞的保存方法、细胞的冷冻解冻方法、含冷冻细胞的组合物的生产方法、细胞悬液的生产方法、容器的生产方法、或细胞颗粒的生产方法等)可包括如下工序：使用过滤器从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分。根据该工序，可使浓缩组分中含有高浓度的细胞和冷冻保护有效量的冷冻保护剂。
上述本发明的一个实施方式的方法或生产方法(细胞的保存方法、细胞的冷冻解冻方法、含冷冻细胞的组合物的生产方法、细胞悬液的生产方法、容器的生产方法、或细胞颗粒的生产方法等)可以包括如下工序：将装有上述浓缩组分的容器置于冰点以下的环境。这些方法或生产方法可以包括如下工序：将装有上述浓缩组分的容器与注射器连接(例如将安装于注射器的注射针刺入容器)，形成上述容器与注射器一体化而成的设备。这些方法或生产方法可以包括将上述设备冷冻的工序。这些方法或生产方法可以包括将上述设备置于冰点以下环境的工序。这些方法或生产方法可以包括将上述冷冻物保存于冷冻柜内的工序。这些方法或生产方法可以包括从上述注射器向上述容器注入溶液的工序。这些方法或生产方法可以包括重复用注射器注入和吸入的工序。这些方法或生产方法可以包括将容器内的上述细胞悬液用上述注射器吸入的工序。这些方法或生产方法可以包括将上述容器与上述注射器分离的工序。这些方法或生产方法可以在工序(a)与工序(b)之间包括：培养或清洗细胞的工序；向容器中添加冷冻保护剂的工序；或者向容器中添加培养液、缓冲液或生理盐水的工序。
以下详细说明以上实施方式中记载的各用语。
本发明的一个实施方式中，注射器可以装有药学上可接受的载体或其冷冻物。注射器例如可以装有生理盐水、缓冲液(例如PBS等)或它们的冷冻物。
本发明的一个实施方式中，浓缩组分可以含有细胞和冷冻保护液。浓缩组分可以收容在小瓶或袋内。
本发明的一个实施方式中，可以浓缩5倍以上。该倍数例如可以为5、10、20、30、40、50、60、70、100、120、150、200、300、或400倍以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。
本发明的一个实施方式中，细胞可以作为细胞群存在。另外，细胞可以是单细胞(单一细胞)群。单细胞群包括细胞彼此不粘连而处于分散的状态。单细胞群例如可以用细胞分散化剤(例如胰蛋白酶)处理细胞群来生成。单细胞群包括主要由单细胞构成的细胞群。含有单细胞群的组合物例如包括细胞分散液的形态。单细胞群例如可以用显微镜观察。另外，也可以用细胞分选仪分析。在上述本发明的一个实施方式的方法或生产方法中，单细胞群在解冻后的细胞存活率高。解冻后的细胞存活率例如为75、80、85、90、95、96、97、98、99、或100％，也可以是其中2个数值之间的范围内。
本发明的一个实施方式中，细胞例如可以为哺乳动物的细胞。哺乳动物例如包括人、猴、啮齿类动物(小鼠、仓鼠等)等。细胞包括干细胞或体细胞。干细胞例如包括具有自我复制能力和分化成其它种类细胞的能力的细胞。干细胞包括多能干细胞、多效干细胞、单能干细胞。多能干细胞例如包括ES细胞或iPS细胞等。多效干细胞例如包括间充质干细胞、脂肪干细胞、造血系干细胞、神经干细胞等。单能干细胞例如包括来源于肌肉干细胞、色素干细胞等。体细胞例如包括心脏、皮肤、肝脏、肺、胃、肠、肾脏、子宫、脑、血液、或间充质组织的细胞。另外，体细胞例如包括成纤维细胞或血细胞(例如白细胞(例如T细胞、樹状细胞、或NK细胞)、红细胞或血小板)。这些细胞可以为转基因细胞(例如CAR-T细胞等)。这些细胞可应用于具备上述工序(a)和工序(b)的方法，其结果能够得到安全性优异、冷冻保存效率良好的细胞悬液。
本发明的一个实施方式中，冷冻保护剂例如包括DMSO、甘油、葡聚糖、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、海藻糖、或山梨糖醇。冷冻保护剂可采用公知方法制造。冷冻保护剂可使用市售品，可从制造商(例如ZENOAQ RESOURCE(株)、富士胶片和光纯药(株)、東京化成工业(株)等)购入。海藻糖例如包括α,α-海藻糖、α,β-海藻糖、β,β-海藻糖、葡萄糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖、麦芽三醇基海藻糖。葡聚糖例如包括葡聚糖40或葡聚糖70等。
本发明的一个实施方式中，再生医疗包括通过对患有疾病的患者施用细胞进行疾病治疗的医疗行为。再生医疗例如包括对患有(例如造血干细胞移植后的)急性移植物抗宿主病的患者施用人间充质干细胞的处理。再生医疗例如包括对患有伴有脊髓损伤的神经系统症状或功能障碍的患者施用(例如自己的)骨髄间充质干细胞的处理。对患者的给药路径例如可以静脉注射。
本发明的一个实施方式中，组合物(例如细胞悬液、或再生医疗用医药组合物)可含有药学上可接受的载体。该组合物可含有1.0×105个/mL以上的细胞(例如干细胞)。该浓度例如可以为1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、或1.0×109个/mL以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。该组合物可含有1×10-6～0.5％(v/v)或1×10-6～0.5％(w/v)的冷冻保护剂。该浓度例如可以为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、0.2、0.3、0.4或者0.5％(v/v)或％(w/v)，也可以是其中2个数值之间的范围内。该组合物可以收容在注射器内或袋内。该组合物中的细胞浓度和冷冻保护剂浓度例如可以是将组合物施用于患者时的浓度。
本发明的一个实施方式中，冷冻可以是缓慢冷冻或快速冷冻。缓慢冷冻例如包括以缓慢的冷却速度历经长时间冷却将细胞冷冻的方法。缓慢冷冻例如可利用BICELL(Nihonfreezer(株))或者可以利用程序冷冻柜来控制冷冻，也可以施用绝热材料的发泡胶盒。缓慢冷冻例如可以以0.1～1℃/分钟的速冻冷冻。0.1～1℃/分钟例如可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1℃/分钟，也可以是其中2个数值之间的范围内。快速冷冻例如在液氮中快速冷冻并保存的方法。冷冻优选为缓慢冷冻。此时，在维持冷冻解冻后细胞的活细胞数的方面更优异。为了产生冷冻，可以将上述容器、悬液或组合物置于冰点以下，或者在冰点以下保管。冰点以下例如可以为-50、-60、-80、-100、-120、或-140℃以下，也可以是其中2个数值之间的范围内。冷冻时间例如可以为3、6、12、18、24、30、36、42、48、72、或96时间以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。
本发明的一个实施方式中，从容器内去除离心后的上清液的工序可以包括用移液管吸引容器内上清液的工序或用与容器连接的注射器吸引容器内上清液的工序。从容器内去除离心后上清液时，上清液可以被去除一部分。一部分可以为80、90、95、96、97、98、99、99.5％以上，也可以是其中2个数值之间的范围内，可以小于100％。
本发明的一个实施方式中，对装有细胞和冷冻保护液的混合液的容器进行离心处理的离心力例如可以为150、200、250、300、350、400、450、500、600、或700g，也可以是其中2个数值之间的范围内。离心处理时间例如可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15min以内，也可以是其中2个数值之间的范围内。袋的离心处理可以使用平板离心机。
本发明的一个实施方式中，容器包括小瓶、袋或瓶等。容器具有可将安装于注射器的针刺入的塞的容器。塞例如包括橡胶塞。橡胶塞在将注射针刺入时容易保持封闭系统。容器的材质例如包括玻璃或塑料等。塑料例如包括聚丙烯、聚乙烯或乙烯醋酸乙烯酯共聚物等。从注射器(例如从橡胶塞的端部)向容器注入溶液时，可以边抽出空气边注入。小瓶包括可收容溶液(例如细胞悬液)的瓶型容器。小瓶例如包括无菌小瓶(例如溶液收容部无菌的小瓶)、冷冻保存用小瓶。袋优选对于保持封闭系统优异的形态。使用袋时，可根据容器内的液量和气体量改变形状，因此能够简单地实施从注射器向容器注入溶液。使用袋时，可以在将袋内的含细胞组合物冷冻之前减少其中的气体量。袋包括无菌袋(例如溶液收容部无菌的袋)、冷冻保存用袋、点滴用袋、软袋、连接有管的袋。袋可以与注射器直接或间接连接。直接连接时，例如袋的开口部与注射器可以直接连接。间接连接时，例如袋与注射器可以介由连接部(例如管、连接器等)连接。此时，可以容器的开口部与连接部相连，然后连接部与注射器相连接。可填充于容器的溶液的容量例如可以为1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、100、500、1000、或1500mL以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。
本发明的一个实施方式中，容器与注射器一体化而成的设备可以安装于注射器的针贯穿容器表面。容器表面的针贯穿部可以为橡胶制。
本发明的一个实施方式中，注射针的粗细例如可以为18G以上。该粗细例如可以为18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27G，也可以是其中2个数值之间的范围内。从由注射器向容器注入溶液时的细胞悬浮的简单程度和对细胞的低压力的观点考虑优选为21～23G。本发明的一个实施方式中，注射器中可填充的溶液的容量例如可以为1、5、10、15、20、50、100、200、300、400、或500mL以上，也可以是其中2个数值之间的范围内。注射器可以具备柱塞。
本发明的一个实施方式中，细胞的解冻时间例如可以为1、2、3、4、或5分钟以上，也可以是这些数值中任意2个数值之间的范围内。解冻可包括溶解。
本说明书中引用的所有刊行物、公报类(专利或专利申请)其全部内容通过参照援引于此。
本说明书中，“或”可在采用文章中列举的事项中的“至少1个以上”时使用。“或”也同样。本说明书中，记为“2个值之间的范围内”时，该范围也包括2个值本身。本说明书中，“A～B”包括A和B。
以上描述了本发明的实施方式，但这些实施方式仅为本发明的例示，也可以采用上述以外的各种构成。另外，也可以将上述实施方式中记载的构成组合使用。
【实施例】
以下通过实施例进一步详细说明。但本发明并不限定于此。
＜实施例1＞
对脐带来源间充质干细胞(由脐带MSC、CET公司提供)、骨髄来源间充质干细胞(骨髄MSC、Lonza、PT-3001)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF、Chemicon International)、iPS细胞来源心肌细胞(iPS-CM、Myoridge、H-013506)这4种细胞实施现有的冷冻解冻法(以下称为现有方法)和使用了细胞浓缩物的冷冻解冻法(以下称为颗粒法)。另外，比较解冻后的活细胞率、解冻后的细胞数和培养3天后的细胞数。
1.1试验步骤
1.1.1现有方法
对装有利用胰蛋白酶溶液或TrypLETM Select溶液(赛默飞世尔)形成为单细胞的各种细胞(1×10e7cells)的离心管以400g×5min离心。通过倾析和吸取去除上清液的胰蛋白酶液，以4ml置换成ZENOAQ公司的Stem Cell Banker(用于脐带MSC、骨髄MSC)冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)或Cell Banker 1plus(用于MEF、iPS-CM)冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)。将所得细胞悬液全部转移到带橡胶塞的小瓶(Maruemu公司、5-111-02、容量5ml)后，在缓慢冷冻用容器BICELL(Nihonfreezer)中用-80℃冷冻柜缓慢冷冻一夜。接着，将小瓶在37℃加热解热数分钟。向小瓶中添加16ml的PBS进行稀释并回收。将细胞悬液转移至离心管，用细胞计数器测定活细胞率和细胞数。其后，为继续细胞培养评价，以400g×5min离心后，去除上清液的PBS后，添加适量各种细胞培养液，吹打混悬，接种于培养皿，培养3天。用胰蛋白酶溶液形成为单细胞，再次测定细胞数。
1.1.2颗粒法
将颗粒法的一个例子的概念图示于图1。对装有采用胰蛋白酶溶液或TrypLETMSelect溶液形成为单细胞的各种细胞(1×10e7cells)的离心管，在400g×5min离心。通过倾析和吸取去除上清液的胰蛋白酶液，以4ml置换成ZENOAQ公司的Stem Cell Banker(用于脐带MSC、骨髄MSC)冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)、或Cell Banker 1plus(用于MEF、iPS-CM)冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)。将所得细胞悬液全部转移至带橡胶塞的小瓶(Maruemu公司、5-111-02、容量5ml)，在4℃冰箱中静置5分钟后，以400g×5min离心，形成细胞颗粒。其后，使用1000ul的吸头和20ul的吸头尽可能去除上清液的冷冻保护液(共去除3.9～3.96ml)后，在缓慢冷冻用容器BICELL中用-80℃冷冻柜缓慢冷冻一夜。接着，将小瓶在37℃加热解冻数分钟。使用装有16ml的PBS的注射器和21G的注射针，将针刺入橡胶塞，添加PBS，轻轻敲打小瓶使颗粒漂浮后，用注射针缓慢吸取细胞悬液，回收细胞。将细胞悬液转移至离心管，用细胞计数器测定活细胞率和细胞数。其后，为继续细胞培养评价，以400g×5min离心后，去除上清液的PBS后，添加适量的各种细胞培养液，吹打混悬，接种于培养皿，培养3天。用胰蛋白酶溶液形成为单细胞，再次测定细胞数。
1.2实验结果
1.2.1冷冻保护液的残留量
在现有方法和颗粒法中，根据从小瓶中去除的冷冻保护液的量计算细胞冷冻时冷冻保护液的残留量，绘制成图(图2)。颗粒法与现有方法相比，冷冻保护液的残留量减少至1/40～1/100。
1.2.2活细胞率和细胞数
在现有方法和颗粒法中，用细胞计数器测定细胞解冻后的活细胞率(图3)。结果未观察到两者存在显著差异。
在现有方法和颗粒法中，用细胞计数器测定解冻后的细胞数和培养3天后的细胞数(图4)。结果未观察到两者存在显著差异。
＜实施例2＞
2.1实验步骤
作为冷冻保护液，使用含5％DMSO的胎牛血清(FBS)(5％DMSO/FBS.溶液)(DMSO(Sigma公司制)、FBS(Gibco公司制))、含10％甘油的胎牛血清(FBS)(10％甘油/FBS溶液)(甘油(Sigma公司制)、FBS(Gibco公司制))或者Stem Cell Banker GMP级无DMSO(DMSOfree GMP grade)(ZENOAQ公司)代替实施例1中ZENOAQ公司的Stem Cell Banker，进行脐带MSC的冷冻解冻。按照实施例1进行其它步骤。
2.2实验结果
与实施例1同样地，颗粒法与现有方法相比，细胞冷冻时的冷冻保护液的残留量非常少。对于各冷冻保护液，用细胞计数器测定现有方法与颗粒法中解冻后的活细胞率和生细胞数，结果未观察到显著差异(图5)。
＜实施例3＞
3.1实验步骤
3.1.1现有方法
使用冷冻袋F-050(Nipro公司、容量25ml)进行脐带MSC的冷冻解冻。对装有采用TrypLETM Select溶液形成为单细胞的脐带MSC(10x10e7cells)的离心管，以400gx5min离心后，去除上清液的胰蛋白酶液，以20ml取代为Stem Cell Banker冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)。将所得细胞悬液全部填充于冷冻袋，放入绝热材料的发泡胶盒，以0.1～1℃/分钟的速度用-80℃冷冻柜缓慢冷冻一夜。细胞解冻时，将袋在37℃加热解冻数分钟后，将注射器安装于连接器，从管中缓慢吸取细胞悬液回收细胞。将细胞悬液转移至离心管，用细胞计数器测定活细胞率和细胞数。其后，为了继续细胞培养评价，以400gx5min离心后，去除上清液的冷冻保护液后，添加适量的各种细胞培养液，吹打混悬，接种于培养皿，培养3天。用TrypLETM Select溶液形成为单细胞，再次测定细胞数。
3.1.2颗粒法
使用冷冻袋F-050(Nipro公司、容量25ml)进行脐带MSC的冷冻解冻。对装有采用TrypLETM Select溶液形成为单细胞的脐带MSC(10x10e7cells)的离心管，以400gx5min离心后，去除上清液的胰蛋白酶液，以20ml取代为Stem Cell Banker冷冻保护液(10％(v/v)DMSO)。将所得细胞悬液全部填充于冷冻袋，在4℃冰箱中静置20分钟后，将袋平放于TOMY离心机LCX-200的多孔板转子TS-41C中，在该状态下以400gx10min离心，在袋的较大面积的侧面形成细胞颗粒(图6)。其后，缓慢取出冷冻袋以防颗粒漂浮，将注射器与连接器连接，从管中尽可能去除上清液的冷冻保护液(共去除约19ml)后，装入绝热材料的发泡胶盒，以0.1～1℃/分钟的速度用-80℃冷冻柜缓慢冷冻一夜。细胞解冻时，将袋在37℃加热解冻数分钟后，将装有20ml的PBS的注射器安装于袋的管上，向袋中注入PBS，用手轻轻解开袋使颗粒漂浮。其后将袋内的细胞悬液用安装于连接器的注射器缓慢地从管吸取，回收细胞。将细胞悬液转移至离心管，用细胞计数器测定活细胞率和细胞数。其后，为了继续细胞培养评价，以400gx5min离心后，去除上清液的PBS后，添加适量的各种细胞培养液，吹打混悬，接种于培养皿，培养3天。用TrypLETM Select溶液形成为单细胞，再次测定细胞数。
3.2实验结果
3.2.1冷冻保护液的残留量
根据从袋中去除的冷冻保护液的量计算现有方法和颗粒法中冷冻时的冷冻保护液的残留量，绘制成图。颗粒法与通常法相比，残留量减少至约1/20(图7)。
3.2.2活细胞率和细胞数
用细胞计数器测定采用现有方法和颗粒法解冻后的活细胞率，结果未观察到显著差异(图8)。用细胞计数器测定采用现有方法和颗粒法解冻后的细胞数以及培养3天后的细胞数，结果未观察到显著差异(图9)。
如上所述，根据颗粒法，能够急剧减少冷冻保护液的残留量，同时细胞冷冻保存效率良好。另外，该方法中，能够以封闭系统或者一系列的操作进行从细胞的解冻到注射器充填的操作，能够简单地对患者施用细胞。另外，在医疗现场实施细胞解冻之后的步骤即可，因此即使在例如没有实验室设施医疗设施，也能够将采用该方法得到的细胞悬液施用于患者。
以上对实施例进行了说明。本领域技术人员能够理解的是这些实施例仅为例示，还存在各种变形例，这些变形例也包括在本发明的范围内。

Claims (46)

1.一种细胞的保存方法，其包括如下工序，
工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及
工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。
2.根据权利要求1所述的保存方法，其中，
所述浓缩组分含有所述细胞和所述冷冻保护液。
3.根据权利要求1或2所述的保存方法，其中，
所述工序(a)包括：将装有所述细胞和所述冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；以及
去除所述上清液，生成浓缩组分的工序。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的保存方法，其中，
所述浓缩组分收容在小瓶或袋内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的保存方法，其包括如下工序：
将装有所述浓缩组分的容器与注射器连接，形成所述容器与注射器一体化的设备。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的保存方法，其包括如下工序：
将安装于注射器的注射针刺入所述浓缩组分，形成所述容器与注射器一体化的设备。
7.根据权利要求5或6所述的保存方法，其包括将所述设备冷冻的工序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的保存方法，其中，
所述细胞为干细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的保存方法，其中，
所述细胞为间充质干细胞。
10.一种细胞的冷冻解冻方法，其包括如下工序，
工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；
工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物；以及
工序(c)：将所述冷冻物解冻，生成解冻物。
11.一种含冷冻细胞的组合物的生产方法，其包括如下工序，
工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；以及
工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物。
12.根据权利要求11所述的生产方法，其中，
所述工序(a)包括：将装有所述细胞和所述冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；以及
去除所述上清液，生成浓缩组分的工序。
13.根据权利要求11或12所述的生产方法，其中，
所述浓缩组分收容在小瓶或袋内。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的生产方法，其中，
所述细胞为单细胞群。
15.一种含冷冻细胞的组合物，其采用权利要求11至14中任一项所述的生产方法获得。
16.一种细胞悬液的生产方法，其包括如下工序，
工序(a)：从含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液浓缩细胞，生成浓缩组分；
工序(b)：将所述浓缩组分冷冻，生成冷冻物；
工序(c)：将所述冷冻物解冻，生成解冻物；以及
工序(d)：将所述解冻物与溶液混合，生成细胞悬液。
17.根据权利要求16所述的生产方法，其中，
所述工序(a)包括：将装有所述细胞和所述冷冻保护液的容器离心，使上清液与沉淀部分分离的工序；以及
去除所述上清液，生成浓缩组分的工序。
18.根据权利要求16或17所述的生产方法，其包括如下工序：
将安装于注射器的注射针刺入装有所述浓缩组分的容器，形成所述容器与注射器一体化的设备。
19.根据权利要求18所述的生产方法，其包括如下工序：
从所述注射器向所述容器注入溶液。
20.根据权利要求19所述的生产方法，其包括如下工序：
用所述注射器吸入所述细胞悬液。
21.根据权利要求20所述的生产方法，其包括如下工序：
将所述容器与所述注射器分离。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的生产方法，其中，
细胞悬液为再生医疗用医药组合物。
23.一种细胞悬液，其采用权利要求16至22中任一项所述的生产方法获得。
24.一种细胞悬液的生产方法，其包括：
将装有含有细胞和冷冻保护液的细胞悬液的容器的冷冻物解冻的工序；
将安装于注射器的注射针刺入所述容器的工序；以及
从所述注射器向所述容器注入溶液的工序。
25.一种细胞悬液，其采用权利要求24所述的生产方法获得。
26.一种容器，其装有冷冻物，所述冷冻物含有作为单细胞群的2.0×107个/mL以上的细胞和冷冻保护剂的组合物。
27.根据权利要求26所述的容器，其中，所述细胞为干细胞。
28.根据权利要求26或27所述的容器，其中，所述组合物含有0.5～20％(v/v)的冷冻保护剂。
29.根据权利要求26～28中任一项所述的容器，其中，所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。
30.根据权利要求26～29中任一项所述的容器，其中，所述细胞为间充质干细胞、脂肪干细胞、或神经干细胞。
31.根据权利要求26～30中任一项所述的容器，其为小瓶或袋。
32.一种设备，其含有权利要求26～31中任一项所述的容器和注射器，是所述容器与所述注射器一体化而成的。
33.根据权利要求32所述的设备，其中，
安装于所述注射器的针贯穿所述容器的表面。
34.根据权利要求32或33所述的设备，其中，
所述注射器装有药学上可接受的载体的冷冻物。
35.一种设备，其含有容器和注射器，是所述容器与所述注射器一体化而成的，
所述容器装有颗粒状的含细胞组合物。
36.权利要求35所述的设备的冷冻物。
37.一种再生医疗用医药组合物，其含有细胞和冷冻保护剂，
所述冷冻保护剂的含量为1％(v/v)以下。
38.根据权利要求37所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述细胞为干细胞。
39.根据权利要求37或38所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。
40.根据权利要求37～39中任一项所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述细胞为间充质干细胞。
41.根据权利要求37～40中任一项所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述细胞的浓度为1.0×105个/mL以上。
42.根据权利要求37～41中任一项所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述冷冻保护剂的含量为1×10-6～0.5％(v/v)。
43.根据权利要求37～42中任一项所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述细胞为单细胞群。
44.根据权利要求37～43中任一项所述的再生医疗用医药组合物，其中，所述再生医疗是将含有所述细胞和冷冻保护剂的组合物施用于受试者。
45.一种注射器，其装有权利要求37～44中任一项所述的再生医疗用医药组合物。
46.一种袋，其装有权利要求37～44中任一项所述的再生医疗用医药组合物。
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