JPH0625066B2

JPH0625066B2 - 血小板貯蔵培地

Info

Publication number: JPH0625066B2
Application number: JP59504179A
Authority: JP
Inventors: マーフイー，スコツト
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1983-11-09
Filing date: 1984-10-30
Publication date: 1994-04-06
Anticipated expiration: 2009-04-06
Also published as: FI852628L; DK305785A; FI852628A0; IE57593B1; DE3477872D1; ES8608318A1; DK160535C; MX161253A; AU571616B2; EP0142339A1; IE842871L; WO1985002116A1; DK160535B; FI81721C; CA1244774A; JPS61500360A; AU3671684A; DK305785D0; FI81721B; EP0142339B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血小板を貯蔵する方法及び培地に関し、特にか
かる血小板を約１８゜−３０℃、好ましくは約２０゜−
２４℃の範囲で、さらに好ましくは約２２℃にて貯蔵す
る方法及び培地に関する。

血小板は全供血からの、また血小板フェレーシス(plate
letpheresis)過程による副産物として得られる。それら
は現在典型的に大気中の気体が透過し得る器壁を有する
プラスチック製容器内にて自身の血漿内に貯蔵されてい
る。通常かかる血小板に伴う血漿は正常な血漿の全成分
に加え抗凝固剤として加えられるクエン酸塩及び生理学
的レベルの５倍の右旋糖を含有する。右旋糖のレベルを
増大して加えてあるのは貯蔵中に赤色球がそれを必要と
するためであり、また血小板の貯蔵にも同様に必要であ
ると一般に理解されている。

通常の血液銀行での処理においては単位血液量（67.5凝
固剤に対し450ml）の供血は遠心処理されて３つの部分
−赤血球，血漿，及び血小板に分離される。一単位の血
液からの充填赤血球の体積は約 180mlで、残りの約 33
7.5mlの体積は血漿及び抗凝固剤である。本出願の以下
において「血漿」なる語は当初の採取の際加えられたあ
るゆる抗凝固剤をも含むものとする。赤血球（充填赤血
球と称する）は典型的に約47.5mlの血漿中に懸濁され
る。血小板は約５０mlの血漿中に懸濁される。この血小
板を含有する生成物を血小板濃縮物と典型的に称する。
残りの 240mlの血漿は新鮮冷凍血漿として冷凍される。

最近の進歩により血液銀行は血小板を２２℃にて５日間
貯蔵できるようになつた。これについてマーフィー他、
「新規な容器中における輸注のための血小板の改良され
た貯蔵」ブラッド，６０(1)： 194− 200（1982）；サ
イモン他、「血小板濃縮物の貯蔵の延長」，トランスフ
ュージョン，２３(3)： 207−212(1983)を参照された
い。２２℃での血小板貯蔵期間の延長は在庫管理を柔軟
にし、血小板が広く分散した場所においても必要な場合
に入手し得るようなす。しかし、上の貯蔵法においては
血小板は５０mlの血漿中に懸濁されることを必要とし、
その結果血漿も血小板に伴って患者内に注入されること
になる。

血小板を受皿者に注入される大量の血漿中に貯蔵するこ
とは多くの問題を有する。血漿の注入により疾病が伝搬
される可能性がある。ヘピテーチス−Ｂ（hepitatis−
Ｂ）及び非Ａ，非Ｂ−ヘピテーチスがかかる血漿注入に
より伝搬されうることは確実である。また最近発見され
た後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）も血漿注入により
伝搬される可能性が高い。また患者が血漿に対し少なか
らず面倒で、時には致命的なアレルギー反応を示すこと
もある。さらに血漿は特定の患者の治療のためアルブミ
ン及び凝固因子の如き成分へと分別されるので高価であ
る。１ミリリットルの血漿は４〜５セントする。従って
血小板を懸濁するのに用いられる血漿は１単位当り２ド
ル５０セントもする。合衆国では年間 400万単位の血小
板が投与されているので血小板の貯蔵のために血漿を用
いることは年間1000万ドルに達する血漿が無駄にされて
いることになる。さらに合衆国での血小板の使用は一般
的傾向として増加している。

人間の血小板細胞については非常に多くのことが知られ
ている。血小板の貯蔵に関する技術，材料及び方法につ
いて記述した一般的論文としてマーフィー他による「新
規な容器中における輸注のための血小板の改良された貯
蔵」，ブラッド６０(1)，１９８２年７月；マーフィ
ーによる「輸注のための血小板の調製及び貯蔵」，マモ
ン，バーンハート，ラスター及びウォルシュ，ＰＪＤ
パブリケーションズＬtd.,ウェストベリー，ニューヨ
ーク（1980）；マーフィーによる「血小板の輸注」，プ
ログレスインヘモステーシスアンドトロンボー
シス，第III巻，テオドーアＨ．スペート偏，グルー
ンアンドストラットン，Inc.(1976)；及びマーフィ
ー他による「２２℃での血小板の貯蔵：生存力（viabil
ity）の維持に対するプラスチック容器を通るガス輸送
の役割」，ブラッド，４６(2)： 209− 218（1975）が
ある。各出版物は文献としてここに完全に引用してお
く。

他にも多くの脊髄動物細胞を維持及び／又は培養するの
に適当な多くの培地及び／又は生理溶液がある。かかる
溶液にはアール液（組織培養用培地）；フォニオ液（血
小板の染色塗抹に用いられる）；ゲイ液（動物細胞培養
用）；ハンク液（動物細胞培養用）；ヘエム液（赤血球
細胞の計数前に用いられる血液希釈剤）；クレッブスー
リンゲル液（ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ_３，ＭｇＳＯ
_４，及びリン酸塩バッファの混合により調製されるリン
ゲル液の変形，ｐＨ7.4）；乳酸加リンゲル液（ＮａＣ
ｌ，乳酸ナトリウム，ＣａＣｌ_２２水和物及びＫＣｌを
蒸留水中に含有）；ロック液（動物細胞培養用）；ロッ
ク−リンゲル液（ＮａＣｌ，ＣａＣｌ_２，ＫＣｌ，Ｍｇ
Ｃｌ_２，ＮａＨＣＯ_３，グルコース及び水を含有）；リ
ンゲル液（血清と類似し、塩類成分としてＮａＣｌ 8.6
グラム，ＫＣ10.3グラム，ＣａＣｌ_２ 0.33グラムを蒸
留水1000ml中に含有し、局所的に火傷及び創傷・挫傷に
用いられ、あるいは自然に生ずる生体物質、例えば血
清，組織抽出物及び／又はより複雑な化学的に規定され
る核溶液等と共に動物細胞の培養に用いられる）；及び
タイロード液（ロック液の変形）が含まれる。これらに
ついてはステッドマンの医学辞典，1300-1301頁，ウィ
リアムスアンドウイルキンス，バルチモア，メリー
ランド（1982）を参照されたい。

生きた脊髄動物細胞の保存及び／又は培養は用いられる
特定の細胞のタイプにより異なった問題を生ぜしめる。
例えば血小板の如き血球は他のあるタイプの細胞のもの
と類似の多数の代謝特性を有することが知られている。
例えばブラッド３０： 151(1967)には血球の代謝特性
はある面で腫瘍細胞のものと類似していることが示され
ている。一方血小板の如き安定な血球の懸濁の問題に特
に向けられた多数の先行技術がある。血小板の貯蔵に関
する従来の研究は血小板の貯蔵期間が血小板による右旋
糖からの乳酸の生成により限定されることを示した。こ
れは血小板にエネルギーを与えるはずが、乳酸が培地を
酸性化し、この酸性により血小板が破壊される。また血
小板は貯蔵中エネルギー生成のため酸素を消費すること
が示された。この過程の最終生成物は気体のＣＯ_２であ
り、これは乳酸と異なり通常血小板が貯蔵されている容
器のプラスチック壁を通って容器より脱出し得る。ＣＯ
_２の生成はかかる血小板用の貯蔵培地を酸性化しない。
右旋通の解糖作用の外に血漿中に典型的に存在する脂肪
酸及びアミノ酸が貯蔵された血小板の酸化的代謝作用の
基質として用いられることもある。

血液の有用な終局体への分別に関しては特許文献中に種
々の技術が開示されている。英国特許第1,283,723号に
は血漿を全血液より分離して血漿終局体を生成する方法
及び装置が開示されており、この場合は残った血液部分
は供血者に還元される。米国特許第4,269,718号（ペル
シドスキー）は塩類を洗浄及びディスプレースメント
（dsplacement）溶液として用いた血液からの血小板の
遠心分離法を開示している。パラディによる米国特許第
4,387,031号は血液中の赤血球と血漿を分離する構成を
開示している。

特許文献には血小板の貯蔵に関して有用な多くの保存及
び培養用培地が開示されている。米国特許第4,390,619
号（ハーメニング−ピッティグリオ）はリン酸塩バッフ
ァの低速放出のためのイオン交換樹脂を開示している。
この特許は血小板の酸化的リン酸化及び解糖作用機構、
及びそれらの血小板貯蔵に関する広範囲な論議を含んで
いる。米国特許第2,786,014号（テュリス）及び米国特
許第3,629,071号（セカール）では４〜５℃の温度範囲
での血小板の貯蔵での使用を意図された種々のグルコー
ス及び電解質を含有する血小板貯蔵培地が開示されてい
る。同様に米国特許第4,152,208号は安定化された白血
球を貯蔵する方法と培地を開示し、白血球は約４℃ない
し約３０℃の温度にて貯蔵し得ることが開示されてい
る。白血球は塩基性塩類溶液又は最少必須培地中に保た
れ、これは血液中における白血球の生存力を持続させ
る。米国特許第4,267,269号（グローデ他）においては
アデニン，グルコース又は果糖，塩化ナトリウム及びマ
ンニトールを含む赤白球貯蔵溶液が開示されている。米
国特許第3,814,687号（エリス他），米国特許第 3,850,
174号に（アレイス）及び前記英国特許第1,283,273号は
一般に血液分別過程における血漿から形成された要素の
分離に関する。米国特許第4,152,208号（カルタヤ）に
おいてはクエン酸ナトリウムの如き抗凝固剤と共に使用
される、特にグルタミン，ロイシン，イソロイシン，フ
ェニルアラニン，チロジン，リン酸塩及び塩化ナトリウ
ム及びカリウムを含むイーグルのＭＥＭ（コラム３及び
４）を含む種々の白血球保存溶液及びかかる溶液の血液
分別過程での使用が開示されている。さらに米国特許第
4,205,126号（カルタヤ）をも参照されたい。米国特許
第3,753,357号（シュワルツ）は血球の貯蔵に関して有
用な種々の保存又は培養培地を広範囲に開示している。

以下検討する如く、本発明の一つの好ましい実施例はグ
ルタミンが加えられた合成血小板貯蔵培地を利用する。
血球の貯蔵又は培養には関係しないが、以下の出版物は
グルタミンがあるタイプのガン細胞，すなわちＨｅＬａ
細胞における酸化的附リン酸反応の基質として用いうる
ことを開示する。ワイス他による「糖の非存在下におけ
る脊髄動物細胞の連続的成長」，ジャーナルオブバ
イオロジカルケミストリー，256（15）：7812-7819(198
1)；ライツァー他による「ペネトースサイクル」，ジャ
ーナルオブバイオロジカルケミストリー，255(1
2)：5616-5626(1980)；及びライツァー他による「糖で
なくグルタミンが培養ＨｅＬａ細胞の主要エネルギー源
であることの証拠」，ジャーナルオブバイオロジカル
ケミストリー，254(8)：2669-2676(1979)を参照された
い。さらにクフラーによるバイオケミカルメソッズア
ンドセルカルチュラルアンドヴァイロロジー，ハ
ルステッドプレス (1977)の８３頁，８７−８８頁を
も参照されたい。

この分野でなされた大量の研究にもかかわらず、人間の
血小板を生存状態で貯蔵し一方で他の目的を使用のため
自由にされる血漿の量を増加せしめる簡単で安全、かつ
安価な方法がなお必要とされている。

本発明は血小板を生存状態で３日か７日間、好ましくは
少なくとも５日間以上、約１８゜−３０℃の温度で、特
に約２０゜−２４℃で、さらに好ましくは約２２℃にて
貯蔵する新規な方法及び貯蔵用培地を提供する。本発明
による方法は血漿中に血小板に富んだ血小板懸濁液を形
成する段階と；この懸濁液から上澄の血漿を１単位の血
小板につき１ないし１５mlの血漿が残るように抽出し、
かかる血小板より血小板の小さなかたまりとしての濃縮
された血小板ボタンを作る段階と；該濃縮血小板ボタン
に緩衝されたリンゲル形クエン酸塩溶液を加える段階
と；生じた溶液を撹拌して血小板を再懸濁させてかかる
血小板の合成懸濁液を形成する段階と；合成懸濁液を酸
素が透過し得る容器内で約２２℃で必要になるまで貯蔵
する段階とを有する。リンゲルクエン酸塩溶液は１単位
の血小板及び１５mlを超えない随伴する血漿のｐＨを、
これが１単位当り６０mlの培地と共に酸素を透過し得る
２２℃に維持された容器内に７日間貯蔵された場合、6.
2以上に維持するよう緩衝されるのが好ましい。

他の血小板貯蔵培地はさらにグルタミンの如き酸化的附
リン酸反応のための血小板に浸透しうる非解糖基質を有
する。他の基質にはオキサロ酢酸塩，マリン酸塩，フマ
ル酸塩，コハク酸塩，α−ケトグルタル酸塩，オキサロ
コハク酸塩，イソクエン酸塩，cis−アコニット酸塩，
及び／又はグルタミン酸塩あるいはアスパラギン酸塩の
如き、クエン酸サイクルの中間体へと変換されうるアミ
ノ酸が含まれる。

さらに別の基質にはロイシン，イソロイシン，フェニル
アラニン，チロシン，アセト酢酸，アセトン及びベータ
位酸化により代謝さる脂肪酸を含む、アセチル−ＣｏＡ
を生じるアミノ酸及び脂肪酸が含まれる。特に現時点で
好ましいのはグルタミンを酸化的リン酸化の基質として
添加することである。酸化的リン酸化の基質としてのグ
ルタミンの添加は貯蔵された血小板の活発な代謝を延長
し、その結果その生存力が７日間までも延長されること
が見出された。

従って、本発明の目的は人間の血小板を処理し貯蔵する
新規な方法を提供するにある。

本発明はさらに実質的な量の自然の血漿が他の目的のた
めに自由にされる、新規な血小板貯蔵培地を提供するに
ある。

本発明のこれら及び他の目的は以下の詳細な説明より明
らかになろう。

本発明の目的は血小板を少なくとも５日間、約１８゜−
３０℃の温度で、好ましくは約２０゜−２４℃で、また
最も好ましくは約２２℃にて貯蔵することを可能とする
血小板の疾病のない人工貯蔵用培地を提供するにある。
貯蔵の末期にあっても血小板は生存力を有さねばならな
い。これは貯蔵されていた血小板が受体への注入後正常
に循環することを意味する。いくつかの研究によると血
小板の生存力は正常な血小板の形態の維持に関係してい
ることが示されている。マーフィ他による「新規な容器
中における輸注のための血小板の改良された貯蔵」ブラ
ッド，６０(1)： 194-200(1982)；クニキ他による
「『室温』で貯蔵された血小板の品質に影響する変数に
ついての研究」，トランスフュージョン，１５(5)： 41
4-421(1975)；及びホルム他による「２２℃での血小板
の貯蔵：撹拌のタイプが形態，生存力，及び試験管中で
の機能に与える影響」，ブラッド，５２(2)： 425-435
(1978)を参照されたい。その名の如く、血小板は薄い突
起のない小円板として循環する。多くの場合生存力の損
失は球状化，膨張及び偽足形成に関係している。以下説
明する実験では血小板形態を生存力の指標として用い
た。これは通常の位相差顕微鏡を用いることにより得ら
れた。さらに、トロンビンに対する血小板形態変化及び
クールターカウンターによる大きさ分布の分散が客観的
に測定された。上記のマーフィー他及びホルム他の論文
に報告された如く、これら測定は顕微鏡下での形態と生
体内での生存力とを相関づけることが示された。

生存力を維持するためには細胞はそのエネルギーの需要
に合わせて連続的に新たなアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）を生成せねばならない。これには通常２通りの経路
−解糖作用と酸化的リン酸化−が可能である。

解糖作用では１分子のグリコースが２分子の乳酸に変換
され、２分子のＡＴＰを生じる。酸化の場合はグルコー
ス，脂肪酸，あるいはアミノ酸がクエン酸サイクルに入
り二酸化炭素（ＣＯ_２）と水に変換される。この経路で
は適量の酸素の供給が必要である。これは解糖作用より
はるかに効率的なシステムである。例えばグルコースか
らＣＯ_２への酸化的代謝は３６分子のＡＴＰを生じる。

血小板はそのエネルギーの需要に対しその生存力を保っ
た状態での長期間の貯蔵とは必ずしも相容れない方法で
適合することが認識された。適度な酸素が与えられると
血小板はＡＴＰの大部分を酸化によって生ぜしめるが、
全ての代謝グルコースを酸化経路にふりむけず乳酸をも
生じさせ続ける。血漿内での血小板の貯蔵の間乳酸濃度
は１日当り約 2.5ミリモル上昇する。マーフィー他によ
る「２２℃での血小板の貯蔵：生存力の維持に対するプ
ラスチック容器を通るガス輸送の役割」，ブラッド，４
６(2)： 209-218(1975)を参照されたい。これはｐＨの
徐々な低下をもたらす。前記マーフィー他による論文中
に説明された如く、乳酸濃度が２０ミリモル以上に上昇
するとｐＨ（7,2にて開始）は6.0に到達する。血小板の
生存力はｐＨが 6.1あるいはそれ以下に落ちると不可逆
的に失なわれるので血小板保存に関する主要な限定変数
はｐＨである。マーフィー他による「２２℃での血小板
の貯蔵」，ブラッド，３５(4)： 549-557(1970)を参照
されたい。この乳酸生成速度においてｐＨは基本的には
二炭酸ナトリウムである自然に生ずる血漿緩衝剤がなか
った場合はるかに急速に落ちていたであろう。

本発明は人間の血小板を処理し貯蔵する方法を提供す
る。本発明は血漿（当初の採血の際加えらたあらゆる抗
凝固剤を含む）中の血小板よりなる血小板濃縮物を形成
する段階と；該濃縮物より血漿上澄を１単位の血小板当
り約１ないし１５（好ましくは４ないし１５）ミリリッ
トルの血漿が残るように抽出し血小板ボタン及びそれに
伴い残留する血漿とを形成する段階と；緩衝されたリン
ゲルクエン酸液を該血小板ボタン及びそれに伴う残留血
漿に加える段階と；該液を撹拌し該血小板を再懸濁し血
小板の合成懸濁液を形成する段階と；該合成懸濁液を酸
素が透過し得る容器内に約１８゜−３０℃の温度で、好
ましくは約２０゜−２４℃で必要になるまで貯蔵する段
階を含む。上記リンゲルクエン酸塩溶液は約 120- 30
0，好ましくは約 170- 180，さらに好ましくは175ｍＥ
ｑ／Ｌ（ミリ当量／リットル）のナトリウムと；約０−
１０，好ましくは約２−５，さらに好ましくは約３ mＥ
ｑ／Ｌのカリウムと；約０〜１０，好ましくは２−５，
さらに好ましくは約 3.4mEq/Lのカルシウムと；約８０
− 180，好ましくは約 110- 125，さらに好ましくは約1
17mEq/Lの塩化物と；約１０−３５，好ましくは約１５
−２５，さらに好ましくは約２１ mEq/Lのクエン酸塩
と；１単位の血小板と１５mlを超えない該伴う血漿のｐ
Ｈを、血小板が１単位当り６０mlの該培地と共に、酸素
を透過し得、最も好ましい２２℃の温度の如く特定の温
度に維持された容器中に７日間貯蔵されても 6.2以上に
維持するのに有効な緩衝剤とよりなる。好ましい血小板
貯蔵培地はこのようにさもなくば凝固を開始させうるカ
ルシウムを結合するために含まれているある濃度のクエ
ン酸塩の他に生理学的レベルのナトリウム，カリウム，
カルシウム及び塩化物を含有する。デゴス他による「血
小板貯蔵の際の血小板解通作用III。外因性クエン酸塩
を利用する際の血小板の不安定性」，トランスフュージ
ョン，１９(5)： 601-603(1979)を参照されたい。グル
コースは、必然的な乳酸の生成を招来し、許容できない
ｐＨの低下及び血小板生存力の損失を来たすもので、本
培地には含有されない。

本発明による好ましい実施例では貯蔵された血小板によ
り利用可能で、従って乳酸生成用基質として作用するグ
ルコースの量が限定されるよう設計されている。血小板
濃縮物より除去されたグルコースを含有する血漿上澄及
び血小板並びにそれに伴う残留血漿に加えられたグルコ
ースを含有しない貯蔵培地の量は生ずる合成懸濁液中で
のグルコース濃度が貯蔵用開始時点で確実に約１０ mM/
L以下になるよう選ばれる。好ましくは抽出及び貯蔵培
地追加過程は生成する懸濁液中のグルコース濃度が約５
mM/Lとなるよう実行される。以下説明する如く、この
グルコース濃度は解糖作用が約 1.5mMの濃度が達成され
るまで進行することを許し、これは本発明の好ましい方
法及び培地を用いると貯蔵後約３日後に起こる。

生じた血小板合成懸濁液のｐＨを許容し得るレベルに維
持するため前記培地もまた貯蔵開始時点でのｐＨが 7.0
を超え、好ましくは約 7.2〜 7.4の間にあるよう製剤さ
れる。

上記の如く、リンゲルクエン酸塩溶液は懸濁液のｐＨを
７日間の貯蔵後で 6.2以上に維持する。これは溶液内の
ＨＰＯ_４濃度が約０−100m Eq/L，好ましくは８ mEq/L
のリン酸塩緩衝剤，好ましくはリン酸ナトリウムを用い
て達成される。以下に示す如く、この緩衝作用は血小板
グリコゲン及び濃縮物調整中に除去されなかった残留血
漿中のグルコースの代謝作用により誘導された乳酸を受
容するに十分である。

現時点では貯蔵に先立ち合成血小板懸濁液に酸化的リン
酸化のため血小板透過性・非解糖基質をさらに加えるの
が好ましい。グルタミンが酸化的リン酸化のための好ま
しい非解糖基質である。好ましい実施例においてグルタ
ミンは血小板貯蔵培地内に５ないし２５，好ましくは２
０ mM/Lの濃度で成分として含有される。あるいは酸化
的附リン酸反応のための非解糖基質はオキサロ酢酸塩，
マリン酸塩，フマル酸塩，コハク酸塩，α−ケトグルタ
ル酸塩，オキサロコハク酸塩，イソクエン酸塩，cis−
アコニット酸，グルタミン，クエン酸サイクル中間生成
物のアミノ酸前駆体，アセチル−ＣｏＡ（アセチル−コ
エンザイムＡ）のアミノ酸及び／又は脂肪酸前駆体及
びこれら混合物よりなるグループより選択してもよい。
かかるクエン酸サイクル中間生成物のアミノ酸前駆体は
グルタミン酸，アスパラギン酸及びこれらの混合物より
選ばれたものを含む。かかるアセチル−ＣｏＡ前駆体は
ロイシン，イソロイシン，フェニルアラニン，チロシ
ン，アセト酢酸，アセトン，ベータ位酸化により代謝さ
れた脂肪酸及びこれら混合物よりなるグループより選ば
れる。

現時点ではさらに貯蔵対象培地にマグネシウムを添加す
るのが好ましい。これはこの元素が正しい細胞機能に重
要だからである。これを用いる場合はマグネシウムは０
−３，好ましくは約 2.0mEq/Lの濃度で存在せねばなら
ない。

本発明はさらに以下の実例より理解されよう。

血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）及び血小板濃縮物（Ｐ
Ｃ）はクエン酸塩−リン酸塩−右旋糖（ＣＰＤ）又は酸
クエン酸塩右旋糖により抗凝固処置された全供血よりブ
ラッド，５２(2)： 425- 435に述べられた如く、ただし
上澄血漿がフェンワル血漿抽出器（フェンワルラボラ
トリーズ、ディアフィールド，イリノイ）を用いて血小
板ボダンを有する袋から可能な限り完全に抽出される点
を除いて、調製される。血漿残留量は４ないし１５ml範
囲である。４５mlのリンゲル液（トラヴェノールラボ
ラトリーズ，ディアフィールド，イリノイ）及び１５ml
の 2.5％クエン酸塩溶液が血小板ボタンを有する袋に加
えられる。袋は血小板撹拌器（ヘルマーラブズ，セント
ポール，ミシガン）に再懸濁のため載置される前に４５
分間静置される。かかる培養段階を血小板を再懸濁すべ
く液を撹拌する前に少なくとも３０分間実行するのが好
ましい。２時間の撹拌後、血小板は完全に再懸濁され
る。ＰＣは次いでＰＬ／723容器（フェンワル Inc.）
に移される。ブラッド，６０(1)： 194- 200(1982)に参
照されたい。テストせんとする種々の追加物が次いで撹
拌器上に２２℃にて貯蔵されている容器に加えられる。
テストされた終局的な培地は下の如くである（ここで示
した濃度は終局的濃度である）：１．リンゲル液及びクエン酸塩のみ：Ｒｉ−Ｃｉ（ナ
トリウム175mEq/L；カリウム３ mEq/L；カルシウム 3.4
mEq/L；塩化物117mEq/L；クエン酸塩２１ mEq/L）。

２．リンゲル液−クエン酸塩及びリン酸塩：Ｒｉ−Ｃ
ｉ−Ｐｈｏ（ＨＰＯ_４，８ mEq/L）。

３．リンゲル液−クエン酸塩，リン酸塩及びグルタミ
ン：Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｔ（Ｌ−グルタミン）
（ＧＩＢＣＯラブズ，グアンドアイランド，ニューヨ
ーク），２０ mM）。

４．リンゲル液−クエン酸塩，リン酸塩及びグルコー
ス：Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｃ（グルコース，２５
mM）。

５．血漿対照。ＰＣのいくつかは血漿中に比較の目的
で通常通り再懸濁された。

血小板計数，平均血小板体積，及び寸法分布の分散（幾
何学的標準偏差）はクールターカウンターを用いて決定
された。

ｐＯ_２及びｐＨは前記の如くｐＨ／血液ガス分析器を用
いて決定した。

酸素消費速度Ｃ（Ｏ_２）（ｎモル／分／１０⁹血小板）
は定常状態技術：により決定された。

ＫＯ_２は容器のＯ_２輸送能力（ｎモル／分／原子）であ
る。上記状態方程式は容器内の血小板の酸素消費速度が
容器壁を通る酸素の流れと等しいことを意味する。

乳酸及びグルコース濃度は先に述べた如く決定した。
（ブラッド，４６(2)： 209- 218(1975)を参照）。

血小板のトロンビン（１ml当り１Ｕの最終濃度）による
形態変化の程度はペイトンアグレゴメータを用いて計
測した。これは消滅比Ｅ₁₂₀₀ｌ／Ｅ₁₂₀₀により定量化さ
れた。ここでＥ₁₂₀₀はトロンビンの添加前における血小
板の消滅であり、Ｅ₁₂₀₀ｌはその後の消滅である。ホル
ム他によるジャーナルオブラボラトリカルアンド
クリニカルメディスン，９７(5)，： 610- 622(198
1)を参照。

３mlのＰＣ研究試料が１，３，５及び７日目に取出され
た。ＰＣの最終体積は７日目で５１〜５８mlの範囲であ
った。

血小板が塩基性リンゲル−クエン酸培地Ｒｉ−Ｃｉ中に
貯えられた場合 6.2未満へのｐＨレベルの減少が観察さ
れた。リン酸ナトリウムの追加、すなわちＲｉ−Ｃｉ−
ＰｈｏはこのｐＨの降下の大部分を防止した。グルタミ
ンの追加、すなわちＲｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−ＧｌｕｔはＲ
ｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏで観察された一連のｐＨ測定を変化さ
せなかった。しかしグルコースが培地に加えられた場
合、すなわちＲｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Glucの場合、リン酸
塩の緩衝能力はｐＨを維持するのに十分でなかった。グ
ルコースの存在は乳酸の蓄積の増大を招き、Ｒｉ−Ｃｉ
−Ｐｈｏの緩衝能力を上回った。かかるｐＨ結果を表Ｉ
に示す。

以下の表IIはＲｉ−Ｃｉ液にグルコースが加えられると
乳酸生成が増大することを確認する。

表IIIはかかる貯蔵条件下でのグルコース濃度を示す。
グルコースの消費と乳酸の生成はグルコースが 1.5mM以
上の濃度で存在している限り継続することは明白であ
る。かかる乳酸生成は緩衝能力は超過する。Ｒｉ−Ｃｉ
−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｔの場合基質が枯渇するため３日目に
乳酸生成は停止する。これらの結果もまたグルコースが
存在すると人工培地中の乳酸生成速度と血漿中のそれと
は同様であることを裏付ける。

表IVは貯蔵中にいくらかの酸素消費の減少があったこと
を示す。しかしこの減少は血漿中に貯蔵された血小板の
場合でも生じているので培地中におけるグルコースある
いは血漿の非存在とは関係しない。Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ
−Ｇｌｕｔにおける結果はグルコースが消費されない場
合酸素消費は３日目から７日目まで継続することを確立
する。

血小板の形態はリンゲル−クエン酸塩培地中のリン酸塩
及びグルタミンの追加と共に貯蔵された場合３ないし５
日間は良好に保存される。血小板の凝集は５日目にいく
らか明らかになった。これはその時点での血小板計数の
１０％の減少に反映されている（表Ｖ）。１０％の血小
板計数の減少はまた血小板が血漿中に貯蔵されている場
合も観察された。

位相差顕微鏡を用いるとリン酸塩及びグルタミンと共に
リンゲル−クエン酸塩中に貯蔵された血小板は３日及び
５日目においても大部分円板状で完全な内部構造を有し
ていた。内部崩壊し膨張した（気球状）血小板のパーセ
ントは５日間の貯蔵で５−１０％の範囲内にあった。こ
れらの主観的な印象は血小板形状変化の程度についての
客観的測定（表VI）及びクールタ寸法分布の分散（表VI
I）に反映されている。

従来の研究において生体中における血小板の生存力は分
散が 2.0未満で形状変化の程度が 1.08を越える場合に
維持されるのが観察された。

ブラッド，６０(1)： 194- 200及びブラッド，５２(2)
425- 435を参照。本実験では血小板がリン酸塩及びグル
タミンと共にリンゲル液−クエン酸培地中に貯蔵されて
いる場合３日及び５日間にて分散測定値が 2.0未満、ま
た形状変化の程度の測定値が 1.10の近傍であった。

上記実験のいくつかは異なるバッチの血小板ボタンを用
いてくりかえされた。このグループにおいても血漿残留
量はやはり４ないし１５mlであった。これらのテストの
間先のテストで用いられたリン酸塩の濃度の計算に誤り
があったことが明らかとなった。上に報告した如く、現
在では上記テストは８ mEq/Lのリン酸塩を用いて（親出
願で先に報告した５０ mEq/Lではなく）行なわれたもの
と信じられる。

以下のテストは各試料が７又は８日目に観察された点を
除き上記と同様に実行された。以下のデータに見られる
如くこれらの研究は先の結果を確認する。この特定の一
連のテストの間、リンゲル−クエン酸塩培地を用いたｐ
Ｈは 6.2より下に降下するのは観察されないばかりか約
6.5であり、その後の観察では上昇するのが観察され
た。それでもなおこれらの研究はリンゲル−クエン酸塩
溶液にリン酸塩を追加して用いて培地のｐＨをこれらの
値より実質的に上に維持するのが好ましいことが確認
し、またさらにリン酸塩と共にあるいは単独でのグルコ
ースの添加は許容し得ない低いｐＨ値への降下を生ずる
ことが確認された。

このように血小板は人工培地内に満足すべきｐＨ，酸素
消費及び形態をもって少なくとも５日間貯蔵し得ること
が示された。これらの発見は保持された形態より予測さ
れる如く生体中における生存力及び臨床的降下と相容れ
る。ブラッド，６０(1)： 194- 200；トランスフュージ
ョン，１５(5)： 414- 421及びブラッド，５２(2)： 4
25- 435を参照。リンゲル−クエン酸塩培地にｐＨの降
下を防ぐため緩衝剤を加えることの必要性が明白に示さ
れた。本発明になる方法に従っても濃縮物中には常に残
留血漿が存在する。残留血漿には、血漿中のグルコース
が乳酸に変換される場合ｐＨが降下するのを防ぐ十分な
緩衝能力がなく、加えられたクエン酸塩は培地の緩衝能
力を十分には補わない。同様にリン酸塩の追加も貯蔵用
培地にグルコースが著しく追加されるとかかる追加が乳
酸生成をさらに生ぜしめるのでｐＨを維持するのに十分
でない。

グルコースは従って血小板代謝用の主要な基質に選ばな
かった。その代り、各細胞の代謝的要求は参加的附リン
酸反応の基質として作用する内因性あるいは外因性アミ
ノ酸又は脂肪酸により応じられる。出願者等の発見は、
ちょうどワイス他及び他の著者がＨｅＬａ細胞の如きあ
る種の組織培養細胞がグルタミンを主要エネルギー源と
して成長し得ることを示した如く、糖の非存在下でも人
間の血小板が維持されることを示唆する。ワイス他によ
る「糖の非存在下における脊髄動物細胞の連続的成
長」，ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー，256(15)：7812-7819(1981)；及びライツァー他によ
る「糖でなくグルタミンが培養されたＨｅＬａ細胞の主
要エネルギー源であることの証拠」，ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー，254(8)：2669-2676(19
79)を参照されたい。

上に示す如く、血小板は糖の非存在下でも酸化的代謝作
用を維持し得るもののようである。最初の３日間の貯蔵
で全てのグルコースが代謝された後も血小板は形態を維
持し、グルタミンが存在しクエン酸サイクルに酸化する
場合さら４日間酸素消費を持続した。またグルタミンが
リンゲル−クエン酸塩−リン酸塩培地より省略された際
もかなりの程度形態及び酸素消費の維持がなされたこと
は驚くべきである。クエン酸塩は外因性基質としては用
い得ないという文献報告を受入れるならば貯蔵中内因性
基質が血小板により使われたように見うけられる。

以上のことより数種の新規な人間の血小板の合成貯蔵培
地が人間の血小板を処理し約２２℃にて酸素の透過し得
る容器内に貯蔵する新規な方法にて使用し得ることが理
解されよう。かかる物質及び方法は現在貯蔵中に血小板
の保存に専用されている天然の血漿の実質的な節約をも
たらす。さらにここで説明した物質及び方法は血小板の
輸注により疾病が伝達される可能性を実質的に減少させ
ることが予想される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）血漿内の血小板よりなる血小板濃縮
物を形成する段階と、（ｂ）該濃縮物より上澄血漿を抽
出し血小板１単位当り約１ないし１５mlの血漿を残し、
血小板の小さなかたまりよりなる血小板ボタンと残留す
る付随血漿とを形成する段階と、（ｃ）該血小板ボタン
及び付随残留血漿に緩衝されたリンゲル−クエン酸塩溶
液を加える段階と、（ｄ）該溶液を撹拌して該血小板を
再懸濁し、血小板の合成懸濁液を形成する段階と、
（ｅ）該合成系を必要になるまで約２０゜ないし２４℃
にて維持された酸素が透過し得る容器内に貯蔵し、該血
小板は少なくとも３ないし７日間の間生存力を保持する
ことを特徴とする人間の血小板を処理し貯蔵する方法で
あって、段階（ｂ）及び（ｃ）は該合成懸濁液の中のグルコース
濃度が貯蔵開始時点で１０ｍＭ／Ｌ未満であるように実
行されることを特徴とする方法。
【請求項２】貯蔵に先立ち懸濁液に酸化的リン酸化のた
め非解糖反応的基質を加えることを特徴とする請求の範
囲第１項記載の方法。
【請求項３】該基質はグルタミンであることを特徴とす
る請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】段階（ｂ）及び（ｃ）は該懸濁液中のグル
コース濃度が貯蔵開始時点で約５ｍＭ／Ｌであるように
実行されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項５】段階（ｂ）は血小板１単位当り４ないし１
５mlの血漿を残すことを有することを特徴とする請求の
範囲第１項記載の方法。
【請求項６】ナトリウム１７０ないし１８０ｍＥｑ／
Ｌ；カリウム約２ないし５ｍＥｑ／Ｌ；カルシウム約２
ないし５ｍＥｑ／Ｌ；塩化物約１１０〜１２５ｍＥｑ／
Ｌ；クエン酸塩約１５〜２５ｍＥｑ／Ｌ；及び血小板１
単位並びにそれに伴随する１５mlを超えない量の血漿の
ｐＨを、１単位当り６０mlの該培地と共に約２０ないし
２４℃に維持された酸素が透過し得る容器内に７日間貯
蔵した場合６．２を超えるｐＨに維持するのに有効な緩
衝剤とし、貯蔵開始時点のグルコース濃度が１０ｍＭ／
Ｌ未満であることを特徴とする人間の血小板用合成貯蔵
培地。
【請求項７】酸化的附リン酸反応のための血小板用に浸
透可能な非解糖反応基質を特徴とする請求の範囲第６項
記載の人間の血小板合成貯蔵培地。
【請求項８】該非解糖反応の基質はグルタミンであるこ
とを特徴とする請求の範囲第７項記載の人間の血小板用
合成貯蔵培地。
【請求項９】オキサロ酢酸塩、マリン酸塩、フマル酸
塩、オキサロコハク酸塩、イソクエン酸塩、ｃｉｓ−ア
コニット酸塩、グルタミン、クエン酸サイクル中間体の
アミノ酸前駆体、アセチル−ＣｏＡのアミノ酸及び脂肪
酸前駆体、及びこれらの混合物よりなるグループより選
ばれた酸化的リン酸化の非解糖反応基質をさらに特徴と
する請求の範囲第６項記載の培地。