JPWO2019230972A1 - 組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、微小気泡を含む対象物の製造方法、細胞の保存方法、細胞の培養方法、および細胞製剤の製造方法 - Google Patents
組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、微小気泡を含む対象物の製造方法、細胞の保存方法、細胞の培養方法、および細胞製剤の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明の組成物は、前述のように、微小気泡を含む。本発明の組成物は、前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下の抑制、細胞の活性/不活性化の制御、および/または代謝の制御が可能である(以下、「細胞保存効果」ともいう)。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制または機能の保持が可能である(以下、「血小板保存効果」ともいう)。
本発明の細胞保存組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞保存組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞保存組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞保存組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の保存方法を簡便に実施できる。本発明の細胞保存組成物は、例えば、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞培養組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。すなわち、本発明の細胞培養組成物は、微小気泡を含む。本発明の細胞培養組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の細胞培養組成物によれば、例えば、後述の本発明の細胞の培養方法を簡便に実施できる。本発明の細胞培養組成物は、例えば、前記本発明の組成物および細胞保存組成物の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤は、前述のように、細胞および微小気泡を含む。本発明の細胞製剤は、前記細胞および前記微小気泡を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の細胞製剤によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、前記細胞製剤に含まれる血小板の血小板数の減少を抑制できる。本発明の細胞製剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、および細胞培養組成物の説明を援用できる。
本発明の微小気泡を含む対象物の製造方法は、前述のように、対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む。本発明の対象物の製造方法は、前記導入工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制可能な対象物を製造できる。また、本発明の組成物によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、後述の血小板保存時における血小板数の減少を抑制可能な対象物を製造できる。本発明の対象物の製造方法によれば、例えば、本発明の組成物を製造できる。このため、本発明の対象物の製造方法は、本発明の組成物の製造方法ということもできる。本発明の対象物の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、および細胞製剤の説明を援用できる。
本発明の細胞の保存方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む。本発明の保存方法は、前記微小気泡の存在下、前記細胞を保存する保存工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞保存時における細胞の生存率の低下を抑制できる。また、本発明の保存方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、血小板保存時における血小板数の減少を抑制できる。本発明の保存方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、および対象物の製造方法の説明を援用できる。
本発明の細胞の培養方法は、前述のように、微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む。本発明の培養方法は、前記微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の培養方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できる。本発明の培養方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、および保存方法の説明を援用できる。
本発明の細胞製剤の製造方法は、前述のように、細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む。本発明の細胞製剤の製造方法は、前記細胞と前記微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる細胞の生存率の低下をより抑制できる。本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、メカニズムは不明であるが、得られた細胞製剤に含まれる血小板数の減少をより抑制できる。また、本発明の細胞製剤の製造方法によれば、例えば、前記本発明の細胞製剤を製造できる。本発明の細胞製剤の製造方法は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
本発明の微小気泡の密度向上剤(以下、「向上剤」ともいう)は、有効成分として、界面活性剤を含む。本発明の微小気泡の密度向上剤は、有効成分として、界面活性剤を含むことが特徴であり、その他の構成および特徴は、特に制限されない。本発明の向上剤によれば、微小気泡を含む媒体を製造する際に、得られた生産物における微小気泡の密度を向上できる。本発明の向上剤は、例えば、前記本発明の組成物、細胞保存組成物、細胞培養組成物、細胞製剤、対象物の製造方法、保存方法、および培養方法の説明を援用できる。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
本発明の組成物は、図1に示すベンチュリ式の微小気泡の製造装置100を用いて製造した。図1に示すように、製造装置100は、モータ1を基準として、チューブ2a、ベンチュリ管3a、接続管4a、4b、チューブ2b、ベンチュリ管3b、および接続管4cが、この順序で互いに連通するように接続された循環系の流路を有する。ベンチュリ管3aの側面の突出部に形成された開口は、封止されている。また、ベンチュリ管3bの側面の突出部に形成された開口は、三方活栓5と連通するように接続されている。まず、三方活栓5を開放し、三方活栓5からDMEM培地を製造装置100内の流路に導入した。この際に、前記流路内に気体が含まれないように充填した。また、充填したDMEM培地の液量を併せて測定した。つぎに、一酸化炭素(住友精化株式会社製、CO濃度:99.999(v/v)%)および医療用酸素(住友精化株式会社製、O2濃度:99.999(v/v)%)を、導入したDMEM培地100mLに対して約20mL(約10mLガス/50mL溶媒(DMEM培地))となるように前記流路に導入し、三方活栓5を閉鎖した。前記流路に導入された一酸化炭素および酸素の体積比(VCO:VO2)は、10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、または0:10とした。そして、モータ1にて、前記流路内のDMEM培地水および空気を5〜10分間循環させることにより、微小気泡を形成することで、組成物を製造した。なお、モータ1で前記DMEM培地を循環させる際の流速は、3.6L/分とした。
前記実施例1(1)により得られた組成物について、約2時間静置後、NanoSight(登録商標)NS300(Malvern Instrument社製)を用い、デフォルトのパラメータで、前記組成物の物性を測定した。なお、前記測定は、25℃で行なった。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、114.8nmであり、微小気泡の密度は、6.46×108個/mLであった。
ラット心臓横紋筋細胞(H9c2細胞、浜松医科大学より入手)の細胞懸濁液を、80%コンフルエント/ウェルとなるように、96ウェルディッシュに播種後、1〜2日間培養した。培地の組成は、前記組成物に、10%FBS(牛胎児血清)を添加したものとした。また、培養条件は、37℃、5%CO2とした。なお、10%FCS添加後の培養液における微小気泡の密度は、5.81×108個/mLであると推定される。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、血小板を保存できることを確認した。
体積比(VCO:VO2)=3:7とした以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例2(1)の組成物を用い、約2時間静置した以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、93.6nmであり、微小気泡の密度は、6.87×108個/mLであった。
血小板は、ウサギの耳静脈由来の末梢血から調製した。具体的には、ウサギの耳静脈から1回につき8mLの採血後、得られた血液に対して、3mLの抗凝固液(10%ACD−A液、3.13%クエン酸ナトリウム)を加え軽く振とうした。つぎに、振とう後の血液に対して2回遠心分離を実施することにより血小板を分離した。まず、24℃の条件下で、PRP(Platelet Rich Plasma:多血小板血漿)の調製法に準じて200×gで10分間遠心分離を実施した。つぎに、得られたPRPに対して、24℃の条件下で、2000×gで10分間、再度遠心分離を実施し、血小板を分離した。得られた血小板5×106個/mL〜2×107個/mLに対し、微小気泡の密度が、5×108個/mLとなるように、前記組成物を添加した。得られた混合物について、常温(約25℃)で3日間保存した。また、保存開始時および保存後、1、2、または3日目において、血小板の数をカウントした。そして、保存開始時の血小板数を100%として、保存後1、2、または3日目における血小板数の増減率を算出した(実施例)。比較例は、ACD−A液を用いた以外は、同様にして血小板数の増減率を算出した。これらの結果を図3に示す。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、腎臓を保存できることを確認した。
体積比(VCO:VO2)=3:7とし、DMEMに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック(大塚製薬株式会社製)またはUniversity of Wisconsin(UW)液とした。以下、ラクテックおよびUW液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Lおよび組成物UWともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例1(1)および(2)と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、131nmであり、微小気泡の密度は、8.04×108個/mLであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
死後30または40分経過したラットより腎臓を摘出し、前記組成物Lを腎臓の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物UWに浸漬した。この状態で、4℃で1時間または2時間、腎臓を保存した。前記保存後の腎臓に対して、前記組成物UWを用いて体外循環を実施した。そして、体外循環開始後、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100分後において、尿管から得られた尿量(積算値)を計測することにより腎機能を評価した(実施例)。また、比較例は、前記灌流保存液を用いた以外は、同様にして腎機能を評価した。これらの結果を図4に示す。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素(住友精化株式会社製)および医療用酸素を用い、体積比(VH2S:VO2)=2:8とした以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例4(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、115.8nmであり、微小気泡の密度は、8.32×108個/mLであった。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例4(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(3)と同様にして、吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、10%FCS含有DMEM培地を用いた以外は、同様にして測定した。これらの結果を図5に示す。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、肺を保存できることを確認した。
体積比(VCO:VO2)=3:7とし、DMEMに代えて、灌流保存液を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。前記灌流保存液は、ラクテック(大塚製薬株式会社製)またはUniversity of Wisconsin(UW)液とした。以下、ラクテックおよびUW液を用いて調製された組成物を、それぞれ、組成物Lおよび組成物UWともいう。なお、前記灌流保存液と類似する生理食塩水を用いて、前記実施例1(1)および(2)と同様にして調製および測定した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、131nmであり、微小気泡の密度は、8.04×108個/mLであった。このため、前記灌流保存液を用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
生体のラットまたは塩化カリウムによる犠死後40分または2時間経過したラットより肺を摘出し、前記組成物Lを肺の血管に導入することにより脱血した。前記脱血後、前記組成物UWに浸漬した状態とした。この状態で、4℃で24時間、肺を保存した。前記保存後、肺の重量を測定することにより、臓器が保存できているかを評価した(実施例)。コントロール1は、摘出後保存をしなかった以外は同様にして、コントロール2は、前記組成物Lおよび組成物UWに代えて、前記ラクテックおよびUW液を用いた以外は同様にして、評価した。これらの結果を図6に示す。
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
一酸化炭素および医療用酸素に代えて、空気(住友精化株式会社製)を用い、前記DMEM培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。HUVEC用培地は、EGM2(Endothelial Cell Basal Medium 2)培地を使用した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例6(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、126.2nmであり、微小気泡の密度は、6.84×108個/mLであった。
ヒト血管内皮細胞(HUVEC細胞、Promo Cell社より入手)を前記組成物に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、80%コンフルエント/ウェルとなるように、96ウェルディッシュに播種した。そして、下記条件1または2で培養した。前記培養後、各細胞について、前記MTTアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記HUVEC用培地を用いた以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を100%として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図7に示す。
組成物(微小気泡の密度:6.84×108個/mL)の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で48時間培養後、前記組成物(微小気泡の密度:6.84×108個/mL)の存在下、4℃の条件で24時間培養
条件2:
HUVEC用培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で48時間培養後、組成物(微小気泡の密度:6.84×108個/mL)の存在下、4℃の条件で24時間培養
本発明の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、本発明の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
前記DMEM培地に代えて、前記HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、異なる体積比(VCO:VO2)=0:10、1:9、2:8、3:7、6:4、7:3、8:2、9:1、または10:0の組成物を製造した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例7(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、132.3nmであり、微小気泡の密度は、8.89×108個/mLであった。
ヒト血管内皮細胞をHUVEC用培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、96ウェルディッシュに播種した。そして、コンフルエントとなるまで培養後、さらに、下記条件3または4で培養した。前記培養後、各細胞について、前記MTTアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、測定した。これらの結果を図8および9に示す。
組成物(微小気泡の密度:8.89×108個/mL)の存在下、5%CO2、37℃の条件で5日間(120時間)培養後、HUVEC用培地の存在下、5%CO2、37℃の条件で1時間培養
条件4:
HUVEC用培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で18時間培養後、組成物(微小気泡の密度:8.89×108個/mL)の存在下、5%CO2、37℃の条件で48時間培養し、HUVEC用培地の存在下、5%CO2、37℃の条件で1時間培養
異なる気泡密度の組成物または細胞保存組成物により、細胞の保存ができ、異なる気泡密度の細胞培養組成物により細胞培養時における細胞の生存率の低下を抑制できることを確認した。
前記DMEM培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例1(1)と同様にして、体積比(VCO:VO2)=3:7の組成物(組成物(CO/O2))を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、前記空気を用い、前記DMEM培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は前記実施例1(1)と同様にして、組成物(組成物(Air))を製造した。また、一酸化炭素および医療用酸素に代えて、硫化水素および医療用酸素を用い、体積比(VH2S:VO2)=2:8とし、前記DMEM培地に代えて、HUVEC用培地を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物(組成物(H2S/O2))を製造した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例8(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、各組成物における微小気泡の平均径および微小気泡の密度は、下記の通りであった。
組成物(CO/O2) 平均径:132.3nm、密度:8.89×108個/mL
組成物(Air) 平均径:126.2nm、密度:6.84×108個/mL
組成物(H2S/O2) 平均径:115.8nm、密度:8.32×108個/mL
前記ラット心臓横紋筋細胞(H9c2細胞)または前記ヒト血管内皮細胞(HUVEC細胞)の細胞懸濁液を、80%コンフルエント/ウェルとなるように、96ウェルディッシュに播種後、下記条件5〜9で培養した。各条件の組成物添加培地では、各組成物が所定倍率(1倍(未希釈)、1/2倍、1/5倍、1/10倍、1/50倍、1/100倍、または1/1000倍)に希釈されるように、前記組成物を添加した。前記培養後、各細胞について、前記MTTアッセイキットを用い、添付のプロトコルに基づき、各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を検討した。コントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして、検討した。そして、コントロールの生存率を100%として、生存率の相対値を算出した。これらの結果を図10〜14に示す。
組成物未添加の培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で24間培養後、組成物(Air)添加後の培地の存在下、4℃の条件で6時間培養
条件6(H9c2細胞):
組成物(Air)添加後の培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で24間培養後、組成物(Air)添加後の培地の存在下、4℃の条件で6時間培養
条件7(H9c2細胞):
組成物未添加の培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で24間培養後、組成物(CO/O2)添加後の培地の存在下、5%CO2、4℃の条件で6時間培養
条件8(HUVEC細胞):
組成物未添加の培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で24間培養後、組成物(Air)添加後の培地の存在下、4℃の条件で6時間培養
条件9(HUVEC細胞):
組成物未添加の培地の存在下、0.5〜1%O2、37℃の条件で48間培養後、組成物(H2S/O2)添加後の培地の存在下、4℃の条件で24時間培養
本発明の組成物または細胞保存組成物により、心臓を保存できることを確認した。
体積比(VCO:VO2)=3:7とし、前記蒸留水に代えてET−Kyoto液(ETK、大塚製薬株式会社製)を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、組成物を製造した。
前記ETKと類似する生理食塩水を用いて前記組成物を調製した場合、得られた組成物における微小気泡の平均径は、131nmであり、微小気泡の密度は、8.04×108個/mLであった。このため、前記ETKを用いて調製した組成物における微小気泡は、同程度の平均径および密度を示すと推定される。
6週齢のLEW/SsN Slc雄ラット(n=5)に、50mg/kg(薬剤/体重)となるようペントバルビタール(共立製薬社製)を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開後、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を調製した。
心臓の保存は、特開2015−174823号公報の保存装置を用いて実施した。具体的には、特開2015−174823号公報の図2の保存装置内に、蒸留水が入ったフラスコを配置した。さらに、前記フラスコ内に生体材料吊り下げ手段を配置し、前記生体材料吊り下げ手段に前記心臓を吊り下げた。そして、医療用ガス供給手段により、前記保存室内の一酸化炭素の分圧(PCO)が、0.15MPa、酸素の分圧(PO2)が、0.2MPaとなるように一酸化炭素および酸素を供給した。そして、この状態で、心臓を4℃の冷蔵庫内で48時間保存した。
気体の種類によらず、同程度の密度の微小気泡を含む組成物が製造できることを確認した。
一酸化炭素および医療用酸素に加えて、二酸化炭素(住友精化株式会社製)および窒素(住友精化株式会社製)を用い、前記DMEM培地に代えて生理食塩水を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、気体として、酸素、一酸化炭素、酸素および一酸化炭素の混合気体、二酸化炭素または窒素を含む微小気泡を含む組成物を製造した。なお、気体以外の製造条件は全て同じとした。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例10(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。なお、各組成物について、3回、同様の測定を実施した。この結果、前記組成物における各気体を含む微小気泡の平均径は、下記のとおりであった。各気体の微小気泡の密度を図16に示す。
組成物(O2) 平均径:104.5nm
組成物(CO) 平均径:117.0nm
組成物(CO/O2) 平均径:112.3nm
組成物(CO2) 平均径:117.5nm
組成物(N2) 平均径:132.7nm
本発明の組成物または細胞保存組成物で心臓を前処理することにより、心臓を保存できることを確認した。
前記DMEM培地に代えて、前記生理食塩水を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、異なる体積比(VCO:VO2)=10:0の組成物を製造した。
前記実施例1(1)の組成物に代えて、前記実施例11(1)の組成物を用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、測定した。この結果、前記組成物における微小気泡の平均径は、約100nmであり、微小気泡の密度は、約1×109個/mLであった。
6週齢のLEW/SsN Slc雄ラット(n=6)に、50mg/kg(薬剤/体重)となるようペントバルビタール(共立製薬社製)を投与し、深麻酔を行った。つぎに、前記ラットから心臓を摘出した。さらに、前記心臓の大動脈および肺動脈を切開し、摘出した。
つぎに、得られた心臓に対して、前記組成物を注入して血液を除き、心臓を前処理した。前記前処理後、前記心臓に対して、UW液を注入して灌流した。そして、前記心臓を、UW液に浸漬し、4℃の冷蔵庫内で24時間保存した。
界面活性剤存在下で微小気泡を製造することにより、溶媒中の微小気泡の密度を向上できることを確認した。
実施例1〜12の組成物において、微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
装置: GC−2014 FID(島津製作所社製)
充填剤の種類:MS−13X(Molecular Sieve 13X)(ジーエルサイエンス株式会社製)
カラムの種類:島津GC用ステンレスカラム(内径3mm、長さ3m、島津製作所社製)
温度
気化器:220℃
カラム:50℃
検出器:250℃
キャリア
N2(窒素ガス)
流量:20mL/分
メタナイザー:400℃
装置: GC−2014 FPD(島津製作所社製)
カラムの種類:5rings Shimalite(登録商標)TPA(Polyphenyl Ether(5 rings) OS-124/Shimalite TPA)
(内径3.2mm、長さ3.1m、信和化工株式会社製)
温度
気化器:200℃
カラム
開始温度:50℃
開始温度での保持時間:3分間
昇温速度:50℃/分
終了温度:100℃
終了温度での保持時間:5分間
検出器:250℃
キャリア
N2(窒素ガス)
流量:20mL/分
実施例1〜12の組成物において、使用時に微小気泡が存在していることを確認した。
N2Oを含む組成物において、製造後1時間の時点で微小気泡を形成していない気体が実質的に存在しないことを確認した。
装置: GC−2014 TCD(島津製作所社製)
充填剤の種類:Porapak(登録商標)Q(ジーエルサイエンス株式会社製)
カラムの種類:島津GC用ステンレスカラム(内径3mm、長さ2m、島津製作所社製)
温度
気化器:150℃
カラム:40℃
検出器:100℃
キャリア
He(ヘリウムガス)
流量:30mL/分
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
(付記1)
微小気泡を含む、組成物。
(付記2)
前記微小気泡は、水素(H2)、一酸化窒素(NO)、亜酸化窒素(N2O)、一酸化炭素(CO)、二酸化炭素(CO2)、硫化水素(H2S)、酸素(O2)、オゾン(O3)、ヘリウム(He)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)、キセノン(Xe)、窒素(N2)、空気、メタン(CH4)、エタン(CH3CH3)、プロパン(CH3CH2CH3)、フルオロメタン(CH3F)、ジフルオロメタン(CH2F2)、四フッ化炭素(CF4)、および酸化エチレン(C2H4O)からなる群から選択された少なくとも1つを含む、付記1記載の組成物。
(付記3)
前記微小気泡は、気体として、生体ガスを含む、付記1または2記載の組成物。
(付記4)
前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素(CO)および硫化水素(H2S)の少なくとも一方を含む、付記1から3のいずれかに記載の組成物。
(付記5)
前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、付記4記載の組成物。
(付記6)
前記微小気泡の密度は、5×105〜5×1012個/mLである、付記1から5のいずれかに記載の組成物。
(付記7)
さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、付記1から6のいずれかに記載の組成物。
(付記8)
付記1から7のいずれかに記載の組成物を含む、細胞保存組成物。
(付記9)
付記1から7のいずれかに記載の組成物を含む、細胞培養組成物。
(付記10)
細胞および微小気泡を含む、細胞製剤。
(付記11)
前記微小気泡は、付記1から7のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記10記載の細胞製剤。
(付記12)
前記細胞は、血小板である、付記10または11記載の細胞製剤。
(付記13)
対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む、微小気泡を含む対象物の製造方法。
(付記14)
前記微小気泡は、付記1から7のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記13記載の対象物の製造方法。
(付記15)
前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、付記13または14記載の対象物の製造方法。
(付記16)
微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む、細胞の保存方法。
(付記17)
前記微小気泡は、付記1から7のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記16記載の細胞の保存方法。
(付記18)
前記細胞は、血小板である、付記16または17記載の細胞の保存方法。
(付記19)
微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む、細胞の培養方法。
(付記20)
前記微小気泡は、付記1から7のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記19記載の細胞の培養方法。
(付記21)
細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む、細胞製剤の製造方法。
(付記22)
前記微小気泡は、付記1から7のいずれかに記載の組成物における微小気泡を含む、付記21記載の細胞製剤の製造方法。
(付記23)
有効成分として、界面活性剤を含む、微小気泡の密度向上剤。
Claims (22)
- 微小気泡を含む、組成物。
- 前記微小気泡は、水素(H2)、一酸化窒素(NO)、亜酸化窒素(N2O)、一酸化炭素(CO)、二酸化炭素(CO2)、硫化水素(H2S)、酸素(O2)、オゾン(O3)、ヘリウム(He)、アルゴン(Ar)、クリプトン(Kr)、キセノン(Xe)、窒素(N2)、空気、メタン(CH4)、エタン(CH3CH3)、プロパン(CH3CH2CH3)、フルオロメタン(CH3F)、ジフルオロメタン(CH2F2)、四フッ化炭素(CF4)、および酸化エチレン(C2H4O)からなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項1記載の組成物。
- 前記微小気泡は、気体として、生体ガスを含む、請求項1または2記載の組成物。
- 前記微小気泡は、気体として、一酸化炭素(CO)および硫化水素(H2S)の少なくとも一方を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記微小気泡は、気体として、酸素を含む、請求項4記載の組成物。
- 前記微小気泡の密度は、5×105〜5×1012個/mLである、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- さらに、媒体を含み、
前記媒体は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞保存組成物。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞培養組成物。
- 細胞および微小気泡を含む、細胞製剤。
- 前記微小気泡は、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項10記載の細胞製剤。
- 前記細胞は、血小板である、請求項10または11記載の細胞製剤。
- 対象物に微小気泡を導入する導入工程を含む、微小気泡を含む対象物の製造方法。
- 前記微小気泡は、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項13記載の対象物の製造方法。
- 前記対象物は、液体および固体の少なくとも一方である、請求項13または14記載の対象物の製造方法。
- 微小気泡の存在下、細胞を保存する保存工程を含む、細胞の保存方法。
- 前記微小気泡は、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項16記載の細胞の保存方法。
- 前記細胞は、血小板である、請求項16または17記載の細胞の保存方法。
- 微小気泡の存在下、細胞を培養する培養工程を含む、細胞の培養方法。
- 前記微小気泡は、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項19記載の細胞の培養方法。
- 細胞と微小気泡とを混合することにより、細胞製剤を製造する製剤工程を含む、細胞製剤の製造方法。
- 前記微小気泡は、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物における微小気泡を含む、請求項21記載の細胞製剤の製造方法。
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