KR20140117214A - 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산소 및 이산화탄소가 2:1의 비율로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물은 기존에 임상적으로 이식용 장기의 보존에 사용된 허혈-재관류 손상 방지 효과를 갖는 조성물들의 효과를 탁월하게 증가시킬 수 있어, 이식용 장기의 수급을 보다 용이하게 할 수 있기 때문에, 장기 이식 및 보존과 관련된 의료 산업분야에 유용하다.

Description

나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물{Nanobubble Liquid for Organ Preservation}
본 발명은 산소 및 이산화탄소로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물에 관한 것이다.
장기 이식은 인체의 각종 장기들의 말기 기능부전으로 인해 약 1년여 정도밖에 생존 가능성이 없는 환자들에게 뇌사 또는 사망한 자를 포함하는 장기 기증자들로부터 제공되어진 장기를 대체 이식하여 환자들을 장기적으로 생존할 수 있도록 하기위한 목적으로 수행되어 왔다.
이러한, 장기 이식은 최근 외과수술의 기술적인 발전 및 면역억제제(immunosuppressant)와 같은 약제의 발전에 따라 그 사례가 점점 늘어나고 있다. 그러나, 장기 이식을 기다리는 환자의 수가 많음에도, 장기 기증자 수의 절대적 부족 및 현재의 장기 보존 기술의 한계로 인하여 이식에 적합한 상태로 유지되지 않아 버려지는 장기가 많다는 문제점들로 인해 장기 이식이 활발히 이루어지지 못하고 있는 실정이다.
장기이식에서 필연적으로 제공자의 장기가 적출된 이후부터 수혜자의 혈관에 장기를 연결되어 혈액의 관류가 재개될 동안의 허혈(ischemia)시간이 있게 되는데, 이 동안에 이식장기의 조직 및 세포의 손상을 최소화하는 노력이 필요하다 이식용 장기를 보존하는데 있어서는 생체 내와 유사한 생리적 환경을 제공하는 것보다는 20도 이하, 일반적으로는 섭씨 4도의 장기 내에서 발생하는 대사를 억제하는 저온에서 보관 후 재관류하는 방법을 주로 이용하며, 이러한 방법은 필연적으로 장기 이식시 허혈-재관류에 의해 산화성 스트레스에 의한 손상뿐만 아니라, 세포수축과 내피세포(endothelial cell) 형태 변화로 인한 미세순환 교란(microcirculatory disturbance), 호중구 이동(neutrophil migration)으로 인한 염증 손상(inflammation damage) 등에 의한 장기 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다
허혈시간 동안의 세포변화는 일차적으로 산소와 영양분의 손실 무산소 상태에 대사산물의 발생 때 문에 초래되며, 세포 내 ATP가 급격히 감소한다. ATP는 세포막에 전해질 균형을 유지하기 위하여 매우 중요하여 ATP가 손실되면 세포 내에 K+과 Mg2+이온이 세포 외로, Na+와 Ca2+이온이 세포 내로 이동하면서 세포는 부종이 발생한다. 무산소 대사의 결과로 젖산(lactic acid)이 형성되어 세포 내에 pH 가 감소한다. 이는 세포 내에 단백질 분해 효소를 함유하고 있는 lysosome의 세포막을 불안정하게 하며, 단백질에 부착된 철이나 구리 이온을 유리시킨다. 혈류가 재개된 후에는 세포에 다시 산소가 공급되며, 세포 내에 증가된 Ca2+은 세포질의 단백 효소를 활성화하고, xanthine을 형성하며, superoxide 및 H2O2 자유 유리기(free radical)를 발생시킨다. 이는 세포막의 지질성분을 산화시켜 구조적 손상을 초래하며, 특히 혈관내피세포의 손상은 이식장기에 혈류를 저하 시키게 된다.
허 혈시간 동안에 이식되는 장기의 세포손상은 정도의 차이는 있으나 필연적으로 존재하게 되며, 세포의 손상을 최소화하기 위한 방법의 개발과 이식장기 보관액의 발전이 필수적이다. 허혈 및 재관류 손상을 억제하기 위하여 장기보관액에는 다양한 물질이 함유되어 있다. 세포에 부종을 방지하기 위하여 세포막을 투과하지 않는 mamnitol, sucrose, hydroxyethyl starch, lactobionace, raffinose, gluconate 등의 성분이 포함되고, 세포 내에 에너지를 공급하기 위하여 ATP 전구 물질인 adenosine, xanthine oxydase 억제물질인 allopurinol, 자유 유리기를 처리하기 위하여 glutathione, 세포막을 안정하기 위하여 insulin과 steroid, 세포의 pH 감소를 완충하기 위한 buffer 물질 등이 함유되어 있다. 또한 세포 내에 많이 함유되어 있는 K+이온의 방출을 억제하여 세포부종을 방지하기 위하여 고농도의 K+이온을 첨가하기도 한다.
현재 장기 이식시 허혈-재관류에 의한 장기 손상을 최소화하기 위해 여러 가지 보존액이 개발되어 임상적으로 사용되고 있다. 이러한 보존액으로서는 초기에는 유로코린즈액(Euro-Collin's)이 사용되었지만, 현재는 미국 위스콘신 대학에서 개발한 UW(Univ. Wisconsin, Wahlberg, J.A., et al., Transplantation, 43:5, 1987)액이 가장 널리 이용되고 있다. 그러나, 비록 UW액이 락토바이온산(lactobionic acid)과 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch) 사용으로 인해 삼투압(osmolarity) 조절 효과를 갖으며, GSH(reduced glutathione), 알로푸리놀(allopurinol) 등의 항산화 능력이 추가되기는 하였지만, 높은 가격, 높은 K+함량과 허혈-재관류에 의한 장기 손상을 효과적으로 방어하지 못하는 문제점을 갖는 것으로 알려져 있다.
허혈-재관류에 의한 장기 손상을 보다 효과적으로 방어할 수 있는 다양한 장기 보존제에 대한 연구가 활발히 진행되어 히스티딘(histidine), 트립토판(tryptophan), 케토글루타레이트(ketoglutarate)를 주성분으로 포함하는 결정성 심정지 용액(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution), 히드록시 에틸 전분에 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 담체를 포함하는 장기 보존용액(대한민국 특허 제304594호), 장기 보존액에 폴리페놀을 첨가하여 이식용 장기의 보존기간을 향상시키는 보존액(대한민국 특허출원공개 제2001-0029692호), 퍼플루오르카본을 함유하는 장기보존액(대한민국 특허출원공개 제2001-0029692호), 시스타민 (cystamine)을 포함하는 장기 보존 조성물(대한민국 특허 제665976호) 등이 개발되어 보고되고 있으나, 아직까지 이식용 장기를 보존하는데 있어 뚜렷하게 효과적인 보존제는 알려져 있지 않은 실정이다.
나노버블은 5㎛ 이하의 눈으로 확인할 수 없는 초미세 기포로 일반 버블의 1/2,000 크기를 가지며, 기포 생성 소멸 과정에서 초고온, 초고압 상태를 순간적으로 유도함으로써, 온열 초음파를 일으키고, 대량의 음이온을 방출하기도 한다.
나노버블은 온열 초음파를 통해 음이온을 생성하여 피부 각질은 물론 모공 속 노폐물을 제거해 외부에서 영양 공급과 산소공급을 원활히 이뤄지게 할 뿐만 아니라 혈액순환을 촉진해 신진대사를 원활 하게 하며, 피로해소와 근육 탄력성을 높이고 모공에 기생하는 모낭충, 세균, 피지, 각질 등에도 효과 적이어서 피부 재생에 많은 도움을 준다. 뿐만아니라 한국 원적외선응용평가연구원에서 실시한 실험 결과 에 따르면 대장균, 녹농균, 살모넬라균, 비브리오균에 대한 99%의 높은 살균력이 있다고 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 이식용 장기의 손상을 최소화하여 보존할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하던 중, 기존의 허혈-재관류에 의한 장기의 손상을 방지하는 장기 손상 방지액에 대해 생체 내와 유사한 생리적 환경을 제공할 수 있는 기체를 이용한 미세 버블을 병용하여 사용하는 경우, 보다 효과적으로 이식용 장기를 안정적으로 보존할 수 있다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 산소 및 이산화탄소로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산소 및 이산화탄소가 2:1의 비율로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물은, 기존에 임상적으로 이식용 장기의 보존에 사용된 허혈-재관류 손상 방지 효과를 갖는 조성물들의 효과를 탁월하게 증가시킬 수 있어, 이식용 장기의 수급을 보다 용이하게 할 수 있기 때문에, 장기 이식 및 보존과 관련된 의료 산업분야에 유용하다.
도 1은 나노제너레이터 장치의 구성도이다.
도 2는 랫트의 심장을 미세 버블을 포함하지 않은 대조구, 산소 미세 버블을 포함하는 조성물 1 및 오존 미세 버블을 포함하는 조성물 2를 사용하여 체외에서 24시간 보존시켜 얻어진 절편들의 Hoechst 33342 염색, TUNEL 분석 및 이들의 병합 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
혈액은 몸의 각 조직에 산소와 영양소를 공급하고 이산화탄소와 노폐물을 교환하는 역할하며, 장기 이식을 위해 적출된 장기에는 혈관이 끊겨 혈액을 공급받을 수 없기 때문에, 보존액으로 사용하면 장기가 계속 기능을 유지할 수 있는 시간이 늘어나 보존 시간이 늘어날 수 있다는 점에 착안하여 장기 보존액이 개발되었다.
그러나, 일반적으로 체내 동맥혈 가스 분압은 산소 12.9 kPa, 이산화탄소 5.7 kPa, 수소 43.3 kPa로 알려져 있으며, 이러한 가스 분압으로 생리학적 현상이 유지될 수 있기 때문에, 본 발명에서는 보존액뿐만 아니라, 가스 분압을 실제 장기 적출 전 환경과 유사한 조건으로 유지되도록 하기 위하여, 장기 보존용 조성물에 나노버블을 혼입하는 기술을 개발하였다.
따라서, 본 발명자들은 종래에 개발된 장기 보존용 조성물의 보존 능력을 개선하기 위해 노력한 결과, 장기 보존용 조성물에 산소 및 이산화탄소을 활성기체를 나노버블로 혼입시켜 장기 보존효과를 관찰하였으며, 그 결과 산소와 이산화탄소의 비율을 2:1로 혼합하여 제조된 나노 버블을 장기 보존용 조성물에 혼입했을 경우, 가장 세포 보존 상태가 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 일 관점에서, 산소 및 이산화탄소가 2:1로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 장기 보존용 조성물은 아데노신 트리포스페이드(adenosine triphosphate) 공급원, 삼투압 조절제, 항산화제, 항생제, 및 전해질 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 호르몬, 성장인자, 효소, 및 천연 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어 "장기"는 본 발명의 조성물이 적용되는 대상을 구체적으로 표현한 것일 뿐이며, 본 발명의 조성물은 좁은 의미의 장기 이외에도 좁은 의미의 장기의 일부분, 조직 그리고 조직의 일부분, 세포의 보존에도 적용된다. 따라서 본 발명의 장기 보존용 조성물과 관련하여 이용되는 용어 "장기"는 상기한 좁은 의미의 장기 및 이의 일부, 조직 그리고 조직의 일부분을 포함하는 포괄적인 의미로 해석된다. 상기 조직으로서는, 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 상피조직, 결합 조직, 근육조직, 신경 조직 등이 포함된다. 또한, 상기 좁은 의미의 장기로서는, 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 피부, 혈관, 각막, 신장, 심장, 간장, 탯줄, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장, 뇌, 사지 말초, 망막 등이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "허혈-재관류로 인한 손상" 또는 "허혈-재관류로 인한 장기의 손상"은 혈액의 공급정지 및 재공급 현상으로 인해 야기되는 혈류 결핍을 경험한 장기에 대한 혈류의 회복으로부터 발생되는 손상을 의미한다. 이러한, 허혈-재관류 손상은 예컨대, 심근 경색 후의 혈류의 회복과 같은 자연적 사건, 외상, 또는 혈액 공급 감소를 겪었던 장기에 혈류를 회복시키는 하나 이상의 외과적 시술 또는 다른 치료적 개입(therapeutic intervention)에 의해 야기될 수 있다. 본 발명과 관련하여 허혈-재관류 손상은 동물 또는 사람의 각종 장기를 이식하는 외과적인 수술 방법에 있어서, 상기 조직 또는 장기를 체외로 적출하여 20도 이하, 일반적으로는 섭씨 4도의 저온에서 보관 후, 다시 체내로 이식하는 과정상 필연적으로 발생하게 되는 허혈-재관류에 의한 손상을 포함한다. 일반적으로 허혈-재관류 손상은 생화학적으로 허혈성 사건 동안의 산소의 고갈, 이에 이어지는 재산소화 및 이에 수반되는 재관류 동안의 반응성 산소종의 발생과 같은 산화적 스트레스에 의해 발생하는 것으로 보고되어 있다.
본 발명의 장기 보존용 조성물은 장기들이 체외에서 보관되는 경우, 장기에 가해지는 각종 스트레스로 인한 손상을 방지하는 효과를 갖는 물질 및 이들의 조합에 의한 조성물을 추가 구성으로 함유할 수 있다.
상기 추가 조성물은 동물 또는 사람의 각종 장기를 이식하는 외과적인 수술 과정에 있어 이들 장기가 체외에서 보관 후, 이식되는 단계를 거치게 되어 허혈-재관류에 의한 손상을 받게 되기 때문에, 이를 방지하기 위하여 일반적으로 장기의 냉장 보관에서 자주 발견되는 세포 부종(cell oedema)을 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있는 삼투압 조절제, 장기 손상을 가져오는 중요한 요인 중에 하나인 ATP(adenosine 5'-triphosphate) 결여 (depletion)를 방지하는 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate) 공급원, 허혈-재관류에 의해 산화성 스트레스를 억제하는 항산화제, 및 전해질 이온 등을 단독 또는 조합하여 함유할 수 있다.
그 외에, 호르몬, 성장인자, 효소, 천연 추출물 등을 함유할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 장기 보존용 조성물은 또한 콜린스(Collins)액, 유로-콜린스(Euro-Collins)액, UW액, 결정성 심정지 용액(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution) 등으로 구성될 수 있으며, 최근에 히드록시 에틸 전분에 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 담체를 사용하는 기술(대한민국 특허 제304594호), 폴리페놀을 사용하는 기술(대한민국 특허출원공개 제2001-0029692호), 퍼플루오르카본을 사용하는 기술(대한민국 특허출원공개 제2001-0029692호) 및 시스타민(cystamine)을 사용하는 기술(대한민국 특허 제665976호) 등의 공지 조성물을 주요 성분으로 사용할 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명에 따른 장기 보존용 조성물에 함유된 상기 전해질 이온은 나트륨 이온(Na+), 칼륨 이온(K+), 인산이수소 이온(H2PO4-), 인산수소 이온 (HPO4 2-), 마그네슘 이온(Mg2 +), 황산 이온(SO4 2 -), 염소 이온(Cl-), 및 탄산 이온(H2CO3 -)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물에 함유된 상기 삼투압 조절제는 포도당(glucose), 락토비오네이트(lactobionate), 라피노즈(raffinose), 하이드록시에틸 전분(Hydroxyethyl starch), 수크로즈(Sucrose), 글루코네이트(Gluconate),및 만니톨(Mannitol)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물에 함유된 상기 항생제는 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin), 겐타마이신(Gentamycin), 네오마이신(Neomycin), 및 아프라마이신(Apramycin)으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물에 함유된 상기 항산화제는 플라보노이드(Flavonoid), 글루타치온(Glutathione), 카테킨(Catechin), 폴리페놀(polyphenol), 아스코르브 산(Ascorbic acid), 및 알로푸리놀(allopurinol)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물에 함유된 상기 아데노신 트리포스페이드(adenosine triphosphate) 공급원은 글루코즈(Glucose), 아데노신(Adenosine), 및 알파-케토글루타레이트(α-Ketoglutarate)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 장기 보존용 조성물은 희석제, 부형제, 완충제, 온도 충격 완화제 등을 추가로 함유할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다.
따라서, 본 발명에 따른 장기 보존용 조성물의 추가 성분은 상기 효과를 갖는다면 특별히 제한되지는 않고, 물질 단독, 조합 및 상기 기존 장기 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "나노 버블"은 내부에 산소, 오존, 이산화탄소 또는 일산화질소 등과 같은 활성 기체(active gas)를 포함하고 있는 1000nm 미만인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장기 보존용 조성물의 나노 버블은 산소 및 이산화탄소를 활성 기체로 하여 단독 또는 조합으로 혼용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장기 보존용 조성물의 나노 버블은 산소 및 이산화탄소이 2:1의 비율로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 체내 동맥혈 가스 분압은 산소 12.9 kPa, 이산화탄소 5.7 kPa, 수소 43.3 kPa로 알려져 있으며, 이러한 가스 분압으로 생리학적 현상이 유지될 수 있기 때문에, 이와 유사한 비율의 기체 혼합물을 사용하여 나노버블을 제조하였다.
본 발명에서 나노버블은 상기 산소 및 이산화탄소에 추가로 황화수소(H2S)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 나노 버블을 제조하기 위한 방법으로는 당업계에 널리 알려진 다양한 기술이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 나노 여과막 또는 가스 분리막과 같은 마이크로미터 이하의 미세한 구멍을 가지는 다공질체를 이용하여 가압한 기체를 조성물 내에 보냄으로써 제조될 수 있으며, 베르누이, 렌즈, 페러데이 법칙을 이용한 전자기 유체 역학(magnetohydrodynamics) 현상과 공진공명(共振共鳴) 현상을 유도하여 제조될 수 있다.
본 발명의 나노 버블의 직경은 1 ㎛ 이하 일 수 있다. 상기 나노 버블의 직경은 조성물에 함유된 미세 버블의 평균 직경을 의미할 수 있다. 미세 버블이 상기와 같은 범위의 직경을 갖는 경우, 조성물 내에서 우수한 안정성 및 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
실시예 1: 장기 보존용 액상 조성물의 제조
본 발명에 따른 조성물을 효과를 확인하기 위해, 장기 손상 방지제로서 결정성 심정지 용액(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution, HTK solution)을 대조군으로 하고, 산소 및 이산화탄소의 혼합물을 2:1의 비율로 혼합하여 나노 버블을 혼입시켜 장기 보존용 액상 조성물을 제조하였다.
나노 버블 제조기는 도 1에 도시된 바와 같이, 용액압송펌프, 펌프가변장치, 스크류 타입의 제너레이터, 가스 유입구 및 후레임으로 구성된 장치를 사용하였으 며, 비이커에 결정성 심정지 용액 500 ml에 대하여, 기체 압력 0.1 ~ 0.5 kg/cm2로 조절하고, 배관압력 2 ~ 5 kg/cm2를 유지하면서 펌프의 rpm을 저속에서 고속으로 가변하면서 15 ~ 20 동안 가동하여, 스크류타입 제너레이터에 의하여 용액에 나노버블이 생성될 수 있도록 반응시켰다.
실시예 2: 나노버블 함유 조성물의 장기보존
상기 방법으로 얻어진 HTK 대조군 및 각각의 조성물에 대하여 장기 보존능을 다음과 같이 확인하였다.
7주령의 Wistar계 수컷 랫트(체중 300g, (주)오리엔트바이오, 한국)의 복강 내에 넴푸탈 0.25㎖ 및 5mg 헤파린 나트륨(Heparin Sodium Salt)을 투여하고, 심장을 적출한 다음, 즉시 얼음 냉각된 식염수에 침지 하였다. 그 후, 대동맥에 관을 삽입하고 관류기구에 연결하여 37℃에서 초기 세척과 심장의 박동상태 회복을 위한 안정화를 수행 하였다. 안정화 이후에 상기 실시예 1의 방법에 따라 제조된 각각의 조성물을 사용하여 관류세척된 심장을 4℃에서 24시간 동안 보존하였다.
상기 보존된 심장은 그 보존 효과의 확인을 위해, 24 시간 동안 10% PBS-완충된 포르말린 중에서 고정한 후, 다시 파라핀을 사용하여 고형화하고 5 ㎛ 두께의 조직 절편으로 잘라 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드 상에 올려 조직 염색에 사용하였다.
실시예 3: 장기 보존 효과
세포핵 염색을 위한 Hoechst 33342(Molecular Probes, USA) 염색 및 핵산의 말단을 표지함으로써, DNA 단편화를 검출하여 세포의 사멸 여부를 확인할 수 있는 TUNEL(R&D systems, US) 분석을 수행하여, 보존되었던 심장의 조직상태를 확인하였다.
Hoechst 33342 염색은 상기 실시예 2에서 준비된 조직 절편들을 Hoechst 33342 염료를 처리하여 30분간 반응 후, 1 X PBS로 3번 세정한 다음, 결과를 LSM510 공초점 레이저 현미경(칼짜이즈, 독일)을 사용하여 관찰하였다.
또한, TUNEL 분석은 상기 절편들을 제조사로부터 제공된 방법(Chemicon International Inc. Temecula, CA, USA)에 따라 절편의 조직 상태분석에 사용하였으며, 양성 대조군은 조직 절편에 DNase I(10 U/㎖, 실온에서 10분)으로 처리하여 준비하였고, 시험군은 조직 절편을 3.0% H2O2로 전처리하고, 37℃에서 1시간 동안 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)를 처리한 후, 37℃에서 30분 동안 디옥시게닌-접합된 뉴클레오티드 기질과 순차적으로 반응시켜 준비하였다.
상기 처리를 거친 절편에 3,3-디아미노벤지딘(Vector Laboratories, Burlingame, 미국)을 5분 동안 처리하여 DNA 단편화를 보이는 핵을 가시화하였으며, 마지막으로 메틸 그린으로 카운터 염색한 다음, 광학 현미경을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 오존 나노 버블을 포함하는 조성물에 24시간 보관했을 경우, 세포핵이 감소 되었으나, 산소, 산소와 이산화탄소의 2:1 혼합에 의한 나노 버블을 포함하는 조성물에서는 세포 생존율이 95% 이상으로 나타났으며, 반면 대조군의 경우에는 45% 이하인 것으로 확인되었다(도 2).

Claims (9)

  1. 산소 및 이산화탄소가 2:1의 비율로 구성된 활성 기체의 나노 버블이 혼입된 장기 보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성 기체는 황화수소(H2S)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 아데노신 트리포스페이드(adenosine triphosphate) 공급원, 삼투압 조절제, 항산화제, 항생제, 및 전해질 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 호르몬, 성장인자, 효소, 및 천연 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 전해질 이온은 나트륨 이온(Na+), 칼륨 이온(K+), 인산이수소 이온(H2PO4-), 인산수소 이온 (HPO4 2 -), 마그네슘 이온(Mg2 +), 황산 이온(SO4 2 -), 염소 이온(Cl-), 및 탄산 이온(H2CO3 -)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 삼투압 조절제는 포도당(glucose), 락토비오네이트(lactobionate), 라피노즈(raffinose), 하이드록시에틸 전분(Hydroxyethyl starch), 수크로즈(Sucrose), 글루코네이트(Gluconate), 및 만니톨(Mannitol)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin), 겐타마이신(Gentamycin), 네오마이신(Neomycin), 및 아프라마이신(Apramycin)으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 항산화제는 플라보노이드(Flavonoid), 글루타치온(Glutathione), 카테킨(Catechin), 폴리페놀(polyphenol), 아스코르브산(Ascorbic acid) 및 알로푸리놀(allopurinol)로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
  9. 제3항에 있어서, 상기 아데노신 트리포스페이드(adenosine triphosphate) 공급원은 글루코즈(Glucose), 아데노신(Adenosine), 및 알파-케토글루타레이트(α-Ketoglutarate)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 장기 보존용 조성물.
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