CN111154012A - 一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，该方法包括对肝素钠副产物进行溶解、沉淀，得到硫酸乙酰肝素粗品；然后对硫酸乙酰肝素粗品进行二次溶解、氧化、冷沉取上清液，再次沉淀，再溶解，吸附，洗脱，沉淀，最终获得超高纯度硫酸乙酰肝素。本发明方法克服了硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高了硫酸乙酰肝素的收率和纯度，并且本发明方法操作简单，产品质量稳定，适合规模化生产。

Description

一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说，尤其涉及一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法。

背景技术

硫酸乙酰肝素是一种天然的糖胺聚糖，与肝素钠结构类似，但是硫酸乙酰肝素分子量较小，乙酰化程度高，硫酸基含量较少，抗凝活性缓和。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护，是今年来研究最热的粘多糖类生化药物。硫酸乙酰肝素、肝素钠、硫酸皮肤素、硫酸软骨素这几种物质性质相似，采用传统的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀方法难以将硫酸乙酰肝素纯化。

中国专利ZL 201510127522.2公开了一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素(CS) 及硫酸皮肤素(DS)含量的方法，该方法步骤如下：(1)向含类肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，待DS含量达到预期值时，终止酶解反应；(2)向溶液中继续加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，待CS含量达到预期值时，终止酶解反应，即得到期望CS及DS含量的肝素样品或类肝素样品。而硫酸乙酰肝素是粗肝素经过乙醇沉淀、阴离子交换层析后得到的一种肝素衍生物。尽管上述发明中能够精确定量控制硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量，但是无法实现类肝素中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的分离或者精确定量控制。

中国专利ZL 201610010556.8公开了一种从十二指肠中提取硫酸乙酰肝素的方法，该方法以生物酶与酸碱处理方法相结合，经过猪十二指肠→绞碎→酶解→加热→离心→树脂吸附→洗脱→沉淀→碱加热→酸处理→低倍沉淀→氧化→沉淀→真空干燥得到硫酸乙酰肝素。该专利方法实质上是去除十二指肠的油脂、酸性蛋白质、碱性蛋白质和核酸后得到硫酸乙酰肝素，但因为其它种类的糖胺聚糖(比如硫酸皮肤素)也会被树脂吸附，并在直接的氯化钠浓度下洗脱，从而导致糖胺聚糖与硫酸乙酰肝素混杂在一起。虽然后续步骤使用了调酸离心方法来去除硫酸皮肤素，但该方法会有硫酸皮肤素残留在上清液，因此硫酸乙酰肝素始终伴随有硫酸皮肤素，故得到的硫酸乙酰肝素纯度不高。

中国专利ZL 201510394022.5公开了一种从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，该方法将肝素副产物废蛋白溶解，加吸附剂，洗脱醇沉，氧化醇沉烘干，得到类肝素干品，但该类肝素干品不仅含有硫酸乙酰肝素、至少还含有抗凝活性较高的快肝素等粘多糖，说明类肝素干品中硫酸乙酰肝素纯度不高。

中国专利ZL 200910039359.9公开了一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，该方法以肝素副产物为原料，溶解后加入醋酸钾，通过醋酸调节溶液的pH值，去沉淀后得到硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，沉淀中再加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，清液合并，上一根阴离子交换性质的层析柱，以氯化钠溶液洗去铜离子，再以氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩以乙醇沉淀得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该发明使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂，且除铜效果如何不得而知。

中国专利ZL 201210424451.9公开了一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括将原料肝素副产物溶解后加入醋酸钾使肝素钠沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的肝素钠；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该发明使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂。

中国专利ZL 200610040707.0公开了一种肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，该方法涉及一种从肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，以生产肝素钠的副产物为原料，该原料是含有硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的混合物，原料通过乙醇分级沉淀，得到硫酸皮肤素粗品；然后采用亚硝酸盐或亚硝酸酯类化合物为氧化剂，使该粗品中含有的硫酸乙酰肝素被降解成高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，再通过乙醇分级沉淀分离得到高纯度的硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素。该发明得到的硫酸乙酰肝素是经过降解得到的低分子硫酸乙酰肝素，与通常意义上的硫酸乙酰肝素有较大不同。

中国专利ZL 201410274835.6公开了一种乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法，该方法将肝素副产物溶解，以氢氧化钠调节溶液至高pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；以盐酸调该硫酸多糖溶液至低pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；再以氢氧化钠调节该溶液至pH中性，以适量乙醇做室温沉淀，取沉淀烘干得到制得的舒洛地特原料。该发明得到的舒落地特原料含有硫酸皮肤素和快肝素或硫酸乙酰肝素，因此，硫酸乙酰肝素纯度不高。

中国专利申请201710220707.7公开了一种羊肝素钠粗品提取废液制备硫酸乙酰肝素的方法，该方法采用对羊肝素钠粗品提取废液进行稀释、吸附、洗涤、洗脱、沉淀、干燥得到硫酸乙酰肝素。该专利方法通过树脂吸附洗脱得到硫酸乙酰肝素的同时，也混杂了硫酸皮肤素等糖胺聚糖，因此硫酸乙酰肝素的纯度不高。

中国专利申请201410819670.6公开了一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，该方法选用水解酶对动物肺脏的盐水提取物进行组合酶降解，随后在酶解液中加入氧化剂和活性炭进行氧化吸附脱色，然后采用丙酮对氧化后的溶液分级沉淀，并脱水干燥制得硫酸乙酰肝素粗品，然后对粗品硫酸乙酰肝素的水溶液依次采用膜分离和阴离子交换层析，将硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素等杂质分离，再使用5000-7000Da的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩，最后使用凝胶过滤层析脱盐并冻干，得硫酸乙酰肝素精品，但该发明工艺流程冗长，需要繁杂的中间过程控制，且工艺条件不易放大，工业化前景堪忧。

中国专利申请200610044491.5公开了一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法，该方法将鼠组织绞碎均质后，脱脂，用蛋白酶水解，再用碱水解，脱蛋白，离心取清液，透析，透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀，用核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解，再用离子交换柱分离，该方法得到的硫酸乙酰肝素抗凝活性强。但是，硫酸乙酰肝素的纯度越高，抗凝活性越低，故该专利得到的硫酸乙酰肝素纯度不高。并且该方法还存在原料来源和产品安全性方面的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，克服硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高硫酸乙酰肝素的收率和纯度。

本发明的目的通过如下技术方案来实现：

一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，包括以下步骤：

(1)一次溶解：向肝素钠副产物中加入浓度2％的盐水，溶解成5％-15％的溶液；

(2)一次沉淀：向(1)中溶液加入0.5-1.1倍体积的95％乙醇，在40℃沉淀3-5h；

(3)二次溶解：去除上清液，向(2)中沉淀物加入浓度2％的盐水，溶解成5％-15％的溶液；

(4)氧化：用4M氢氧化钠溶液调(3)中溶液pH至11.0，加入总体积2％的过氧化氢溶液，室温氧化4-8h；

(5)二次沉淀：用盐酸调(4)中溶液pH至6.0-7.0，加入0.4-0.6倍体积的95％乙醇，在5℃沉淀16-24h，收集上清液；

(6)三次沉淀：向(5)中上清液加入1.0-2.0倍体积的95％乙醇，室温沉淀3-5h；

(7)三次溶解：去除上清液，向(6)中沉淀物加水溶解成1％-9％的溶液；

(8)吸附：将(7)中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附1-2h；

(9)洗脱：用浓度2％-8％的盐水洗涤树脂，收集洗涤液；

(10)四次沉淀：向(9)中洗涤液加入1.0-2.0倍体积的95％乙醇，室温沉淀8-16h，将沉淀物干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素。

优选的，所述步骤(4)中使用的过氧化氢溶液浓度为30％；所述步骤(8)中使用的大孔吸附树脂柱为D204肝素钠专用吸附树脂；所述步骤(10)中的干燥条件为：在真空度0.06-0.09MPa、50-60℃条件下干燥5-10小时。

本发明通过对肝素钠副产物进行溶解、沉淀，得到硫酸乙酰肝素粗品；然后对硫酸乙酰肝素粗品进行二次溶解、氧化、冷沉取上清液，再次沉淀，再溶解，吸附，洗脱，沉淀，获得超高纯度硫酸乙酰肝素，克服了硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高了硫酸乙酰肝素的收率和纯度；并且本发明方法操作简单，产品质量稳定，适合规模化生产。

附图说明

图1为实施例1中硫酸乙酰肝素含量测定图谱；

图2为实施例2中硫酸乙酰肝素含量测定图谱；

图3为实施例3中硫酸乙酰肝素含量测定图谱；

图4为实施例4中二糖标准品紫外色谱图(232nm)；

图5为实施例4中肝素钠美国药典对照品二糖分析紫外色谱图(232nm)；

图6为实施例4测试样品二糖分析紫外色谱图(232nm)；

图7为实施例5肝素钠美国对照品的紫外色谱图(210nm)；

图8为实施例5测试样品的紫外色谱图(210nm)；

图9为实施例6肝素对照品与测试样品的1H NMR谱图；

图10为实施例6肝素对照品与测试样品的13C NMR谱图；

图11为实施例6肝素对照品及测试样品的HSQC谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1超高纯度硫酸乙酰肝素的制备

(1)一次溶解：向肝素钠副产物50.23g加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成5％(w/w)的溶液；

(2)一次沉淀：加入0.5倍体积的95％乙醇，在40℃沉淀3h；

(3)二次溶解：将(2)中沉淀物加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成5％(w/w)的溶液；

(4)氧化：用4M氢氧化钠溶液调(3)中溶液pH＝11.0，加总体积2％的过氧化氢溶液(30％浓度)，室温氧化4h；

(5)二次沉淀：用盐酸调pH＝6.0，加入0.4倍体积的95％乙醇，在5℃沉淀16h，收集上清液；

(6)三次沉淀：向(5)中上清液中加入1.0倍体积的95％乙醇室温沉淀3h；

(7)三次溶解：向(6)中沉淀中加水溶解成3％(w/w)的溶液；

(8)吸附：将(7)中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附1h；

(9)洗脱：用2％(w/w)盐(氯化钠)水洗涤树脂，收集洗涤液；

(10)四次沉淀：向洗涤液加入1.0倍体积95％乙醇，室温沉淀8h，将沉淀干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素22.31g。

实施例1得到的超高纯度硫酸乙酰肝素的一些主要理化性质如下：

项目	标准	实施例1结果
			抗FIIa效价	0-12USPU/mg	8USPU/mg
分子量	20000-40000Da	34851Da
			纯度	≥98％	99.40％
DS含量	＜1％	0.34％
			IV(A+S)含量	≥60％	62.14％
IS含量	≤10％	8.83％

实施例2超高纯度硫酸乙酰肝素的制备

(1)一次溶解：向肝素钠副产物50.55g加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成10％(w/w)的溶液；

(2)一次沉淀：加入0.8倍体积的95％乙醇，在40℃沉淀4h；

(3)二次溶解：将(2)中沉淀物加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成10％(w/w)的溶液；

(4)氧化：用4M氢氧化钠溶液调(3)中溶液pH＝11.0，加总体积2％的过氧化氢溶液(30％浓度)，室温氧化6h；

(5)二次沉淀：用盐酸调pH＝6.5，加入0.5倍体积的95％乙醇，在5℃沉淀20h，收集上清液；

(6)三次沉淀：向(5)中上清液中加入1.5倍体积的95％乙醇室温沉淀4h；

(7)三次溶解：向(6)中沉淀中加水溶解成5％(w/w)的溶液；

(8)吸附：将(7)中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附1.5h；

(9)洗脱：用5％(w/w)盐(氯化钠)水洗涤树脂，收集洗涤液；

(10)四次沉淀：向洗涤液加入1.5倍体积95％乙醇，室温沉淀12h，将沉淀干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素24.07g。

实施例2得到的超高纯度硫酸乙酰肝素的一些主要理化性质如下：

项目	标准	实施例2结果
			抗FIIa效价	0-12USPU/mg	9USPU/mg
分子量	20000-40000Da	34738Da
			纯度	≥98％	99.88％
DS含量	＜1％	0.09％
			IV(A+S)含量	≥60％	66.81％
IS含量	≤10％	6.88％

实施例3超高纯度硫酸乙酰肝素的制备

(1)一次溶解：向肝素钠副产物50.41g加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成15％(w/w)的溶液；

(2)一次沉淀：加入1.1倍体积的95％乙醇，在40℃沉淀5h；

(3)二次溶解：将(2)中沉淀物加2％(w/w)盐(氯化钠)水溶解成15％(w/w)的溶液；

(4)氧化：用4M氢氧化钠溶液调(3)中溶液pH＝11.0，加总体积2％的过氧化氢溶液(30％浓度)，室温氧化8h；

(5)二次沉淀：用盐酸调pH＝7.0，加入0.6倍体积的95％乙醇，在5℃沉淀24h，收集上清液；

(6)三次沉淀：向(5)中上清液中加入2.0倍体积的95％乙醇室温沉淀5h；

(7)三次溶解：向(6)中沉淀中加水溶解成9％(w/w)的溶液；

(8)吸附：将(7)中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附2h；

(9)洗脱：用8％(w/w)盐(氯化钠)水洗涤树脂，收集洗涤液；

(10)四次沉淀：向洗涤液加入2.0倍体积95％乙醇，室温沉淀16h，将沉淀干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素23.78g。

实施例3得到的超高纯度硫酸乙酰肝素的一些主要理化性质如下：

实施例4超高纯度硫酸乙酰肝素二糖组成分析

二糖组成分析是肝素类药物结构分析中的重要内容。该实施例首先通过肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对本专利方法制得的超高纯度硫酸乙酰肝素和肝素进行彻底酶解，释放出所有二糖单元，再经过强阴离子色谱对酶解得到的二糖混合物进行有效分离、归属和相对含量分析。该项工作是利用所建立的方法比较肝素钠美国对照品和测试样品的二糖组成异同。表1为肝素/硫酸乙酰肝素中常见的二糖。

表1.肝素/硫酸乙酰肝素中常见的二糖组成

主要实验仪器：高效液相，Agilent；型号：1260。

对比样品：肝素钠美国对照品(USP)；测试样品：本专利方法生产的超高纯度硫酸乙酰肝素。

实验方法：

(1)肝素钠美国药典对照品和测试样品分别准确称取约5.0mg，分别加入适量体积的超纯水，准确配置浓度为5.0mg/mL储备液。分别吸取每个样品溶液200μL，并分别加入肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各0.1IU，置于37℃恒温水浴箱中降解48h。

(2)将酶解后的肝素钠对照品及测试样品溶液置于沸水中加热15min，12000rpm/min 转速离心20分钟，取上清液待用。

(3)色谱条件：

流动相A：称取0.3640g二水磷酸二氢钠溶于950mL纯水中，磷酸调节溶液pH＝3.0，纯水稀释至1L，0.22μm滤膜过滤，脱气待用。

流动相B：称取64.2304g一水高氯酸钠溶于400mL流动相A中，磷酸调节溶液pH＝3.0， 0.22μm滤膜过滤，脱气待用。

色谱柱：Welch Ultimate XB-SAX(4.6mm×250mm,3μm)

检测波长：232nm；

流速：0.6mL/min；

柱温：40℃；

进样量：3μL；

流动相梯度如表2：

表2.二糖组成分析梯度洗脱程序

(4)彻底酶解产物分析结果

8个二糖标准品和肝素钠对照品及测试样品的彻底酶解产物利用强阴离子交换色谱柱的高效液相方法进行分离，232nm紫外检测二糖图谱分别见附图4、5和6。肝素钠对照品和测试样品酶解组分相对含量如表3。

表3.肝素钠对照品和测试样品彻底酶解产物紫外图谱中二糖的峰面积百分比

注：N.D.,not detected.

结果显示，通过肝素钠对照品及测试样品酶解组分含量百分比进行对比，测试样品与肝素钠美国对照品酶解后各二糖含量不同，肝素中高硫酸化二糖含量较高，测试样品中低硫酸化二糖含量较高，表明该样品的结构与肝素不同，根据经验和文献[1]推测该样品为硫酸乙酰肝素。

实施例5未降解的超高纯度硫酸乙酰肝素高效液相分析

主要实验仪器：高效液相，Agilent；型号：1260。

对比样品：肝素钠美国对照品(USP)；测试样品：本专利方法生产的超高纯度硫酸乙酰肝素。

实验方法：

(1)肝素钠USP对照品和测试样品分别准确称取约5.0mg，分别加入适量的超纯水，准确配置浓度为5.0mg/mL储备液，待测。

(2)色谱条件：

流动相A：2.5mM NaH₂PO₄，称取0.3640g二水磷酸二氢钠溶于950mL纯水中，磷酸调节溶液pH＝3.0，纯水稀释至1L，0.22μm滤膜过滤，脱气待用。

流动相B：2M NaClO₄，称取112.3680g一水高氯酸钠溶于400mL流动相A中，磷酸调节溶液pH＝3.0，0.22μm滤膜过滤，脱气待用。

色谱柱：Welch Ultimate XB-SAX(4.6mm×250mm,3μm)

检测波长：210nm。

流速：0.4mL/min。

柱温：40℃。

进样量：3μL。

流动相梯度如表4：

表4.分析梯度洗脱程序

未降解样品分析结果：

肝素美国对照品和测试样品，利用强阴离子交换色谱柱的高效液相方法进行分别测定， 210nm紫外检测多糖图谱见附图7和8。

结果显示，肝素美国对照品的出峰时间为20.747min，测试样品的出峰时间为18.273min。测试样品与肝素美国对照品相比出峰时间更早，提示该样品离子强度较弱，应该含有较少硫酸根。该样品具有硫酸乙酰肝素的色谱特征。

实施例6超高纯度硫酸乙酰肝素的核磁共振分析

主要实验仪器：布鲁克ASCEND^TM 600型核磁共振波谱仪，配备超低温探头。

主要实验试剂：重水(D₂O，d≥99.96％)和氘代3-(三甲基硅烷基)丙酸钠(TSP-d4，d≥98％)。肝素钠中国药典标准品，后续统称，ChP_standard。测试样品为本发明方法生产的超高纯度硫酸乙酰肝素

实验方法：称取干燥样品～25mg于500μL D₂O(含50μg/mL TSP-d4)中，涡旋溶解后进行1D和2D NMR分析。¹H NMR谱扫描次数为16、¹³C NMR谱扫描次数为10000、HSQC 谱扫描次数为16。试验温度均为298.2K。数据处理过程中各峰的化学位移均以内标TSP作为0ppm进行校准。

实验结果：

将测试样品按上述实验方法进行NMR谱图采集，其H谱如图9所示，C谱如图10所示，图9和图10中红色箭头为乙醇残留峰，各峰的化学位移如表5、表6所示。

从图、表中可以看出，测试样品大部分信号峰的化学位移与ChP_standard的一致，表明测试样品的糖基组成与肝素基本相同。测试样品的具体糖基组成，见表5归属部分。

表5.肝素对照品与测试样品氢谱中各峰化学位移及归属

“a”如图9所示

“b”参考相关文献^[2]

表6.测试样品碳谱中部分特征峰的化学位移及归属

“a”如图10所示

“b”参考相关文献^[2]并结合HSQC谱图分析

(1)糖基相对比例计算

运用¹H NMR进行定量分析遵循的指导原则是：各化学位移处H信号的积分峰面积与该质子的物质的量浓度c呈线性正相关关系，且不同化学环境下的质子在NMR氢谱中的响应一致。^[3]因此，基于这一规律，可根据各糖元残基的特征信号氢峰面积比，计算出测试样品中各组成糖基的相对物质的量浓度比例，具体公式如下：

A_TU＝A_P4+A_P5+A_P14

A_TG＝A_P1+A_P2+A_P3

R¹ _IdoA2S％＝A_P4/A_TU×100

R¹ _IdoA％＝A_P5/A_TU×100

R¹ _GlcA％＝A_P14/A_TU×100

R² _6SGlcNS3S％＝A_P2/A_TG×100

R² _GlcNAc％＝A_P16/3A_TG×100(GlcNAc:6SGlcNAc+GlcNAc)

R² _6SGlcNS％＝(A_P3’-1/3A_P16)/A_TG×100

R² _GlcNS％＝A_P3”/A_TG×100

R² _GlcNS-GlcA％＝A_P1/A_TG×100

其中，A为氢谱中各氢积分峰面积，TU表示总糖醛酸，TG表示总氨基糖，R¹为单一糖醛酸残基物质的量浓度占总糖醛酸残基物质的量浓度的比，R²单一氨基糖残基物质的量浓度占总氨基糖残基物质的量浓度的比，小写字母为图9氢谱中峰位的标注。

根据氢谱，按上述方法计算出测试样品及ChP_standard组成糖基的相对物质的量浓度比例，结果如表7所示。

从表中可以看出，测试样品各组成糖基的相对比例与ChP_standard相比，差异较大：首先，测试样品的R¹ _IdoA2S远小于ChP_standard，测试样品的R¹ _GlcA要高于ChP_standard；其次，测试样品的R² _GlcNAc、R² _GlcNS均要显著高于ChP_standard。测试样品的这一结构特点与硫酸乙酰肝素(HS)的结构特征相符合。^[2]

表7.测试样品中各组成糖基物质的量浓度比例

说明：数据以五次积分去除最大值与最小值后，余下三个数据的平均值计算。

(2)二维NMR分析

为了验证1D NMR的分析结果，同时进一步确认测试样品结构特征，我们展开了¹H-¹³C HSQC图谱分析，如图11所示。

从图中可以看出，ChP-standard谱图中的绝大多数相关信号，测试样品中也存在，同时，这些共存的相关信号的相对强度又有明显差异。表明，测试样品与ChP-standard的组成糖基种类基本一致，但各糖基的相对比例又显著不同，验证了1D NMR的分析结果。

(3)结论

综上，通过对测试样品与肝素对照品降解后的二糖相对含量分析、未降解样品高效液相分析以及核磁共振定性和半定量分析，虽然测试样品糖基组成与肝素基本相同，但组成糖基差的相对比例异较大。这些结构特征表明测试样品为硫酸乙酰肝素(HS)。此外，再结合实施例4和实施例5，未经降解样品的高效液相分析结果显示此HS样品中没有肝素交叉存在。所以，按本发明方法制得的测试样品可以确定为硫酸乙酰肝素。

参考文献

[1].Hidenao Toyoda,Hiromi Yamamoto,Rapid and sensitive analysis ofdisaccharide composition in heparin and heparan sulfate by reversed-phaseion-pair chromatography on a 2mm porous silica gel column.Journal ofChromatography A.1999,830,197–201

[2]Pomin,V.H.NMR Chemical Shifts in Structural Biology ofGlycosaminoglycans.Analytical Chemistry,2014,86:65-94.

[3]陈玉兰，等.核磁共振内标法测定盐酸小檗碱的含量.第三军医大学学报，2009,22, 2217-2219。

Claims (4)

1.一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）一次溶解：向肝素钠副产物中加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；

（2）一次沉淀：向（1）中溶液加入0.5-1.1倍体积的95%乙醇，在40℃沉淀3-5h；

（3）二次溶解：去除上清液，向（2）中沉淀物加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；

（4）氧化：用4M氢氧化钠溶液调（3）中溶液pH至11.0，加入总体积2%的过氧化氢溶液，室温氧化4-8h；

（5）二次沉淀：用盐酸调（4）中溶液pH至6.0-7.0，加入0.4-0.6倍体积的95%乙醇，在5℃沉淀16-24h，收集上清液；

（6）三次沉淀：向（5）中上清液加入1.0-2.0倍体积的95%乙醇，室温沉淀3-5h；

（7）三次溶解：去除上清液，向（6）中沉淀物加水溶解成1%-9%的溶液；

（8）吸附：将（7）中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附1-2h；

（9）洗脱：用浓度2%-8%的盐水洗涤树脂，收集洗涤液；

（10）四次沉淀：向（9）中洗涤液加入1.0-2.0倍体积的95%乙醇，室温沉淀8-16h，将沉淀物干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素。

2.根据权利要求1所述的超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中使用的过氧化氢溶液浓度为30%。

3.根据权利要求1所述的超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：所述步骤（8）中使用的大孔吸附树脂柱为D204肝素钠专用吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：所述步骤（10）中的干燥条件为：在真空度0.06-0.09MPa、50-60℃条件下干燥5-10小时。

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