CN101024669B - 一种可溶性的多糖-蛋白交联抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种可溶性的多糖-蛋白交联抗原的制备方法，涉及多糖-蛋白交联物的化学合成方法。本方法含有将可溶性抗原多糖与蛋白通过双功能团交联试剂共价连接的化学合成步骤，以及离子交换分离和凝胶柱层析分离结合的纯化步骤。采用的双功能团交联试剂为(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，n＝2—10，(C2H3O)为环氧基团；选用吐温或SDS或TritionX-100为表面活性剂。本发明提供的交联方法操作简单，试剂来源方便，无毒性。
Description
技术领域
本发明涉及多糖-蛋白交联物的化学合成方法。
背景技术
蛋白质和多糖可以通过酶催化或化学合成的方法进行交联。目前在固定化酶和亲和层析固定相的制备中，多数制备过程涉及蛋白质与多糖的化学交联方法。固定化所用的载体有相当数量和种类是多糖物质，这些多糖载体是大分子量的凝胶多糖。
在抗体药物生物技术领域，制备可溶性的、具有特定化学组成结构的多糖-蛋白交联抗原已成为巨大需求。为了高效率地获取某种特异性抗体，往往需要对可溶性的特异性抗原进行化学修饰。通过合适的化学合成方法，原有的多糖抗原分子可以通过共价键连接上特定的蛋白质或其他化合物，或原有的蛋白抗原分子可以通过共价键连接上特定的多糖或其他化合物。
在抗原改性设计中，要求原抗原分子在连接其他化合物分子后能保持或增强原有的免疫原性，同时尽可能地避免引入与交联剂分子有关的、可能形成抗原表位的组成结构。化学交联反应的条件必须是温和的，能最大程度地保留原抗原分子的免疫原性；同时，要求反应过程中所用的试剂低毒、低污染。在现有的合成方法中，很少方法能满足以上要求。
多糖-蛋白交联的方法很多，如溴化氰法、重氮盐偶联法、异硫氰酸酯法、还原胺化法、活化酰基化法、双功能试剂交联法等。人或动物用交联疫苗的制备方法需满足以下条件：1)选用合适的交联剂，避免引入可能诱导出不期望抗体的基团；2)反应条件应温和，避免抗原结构被破坏；3)所用试剂尽可能无毒或低毒。理想的制备方法还应当操作方便，所用试剂环境友好且来源方便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶性的多糖-蛋白交联抗原的新制备方法。
本发明包括将可溶性抗原多糖与蛋白通过双功能团交联试剂(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)共价连接的化学合成步骤；双功能团交联试剂(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，式中的n＝2—10，(C2H3O)为环氧基团。所用的交联试剂是含6-14个碳原子的直链化合物，可使交联物结构紧凑，同时保持一定的伸展和旋转空间。双功能团交联试剂优选1，4—丁二醇缩水二甘油醚。
前述抗原多糖包括来源于细菌的荚膜多糖以及来源于微生物和海藻的多糖，分子量20-500KDa
在可溶性抗原多糖与双功能团交联试剂反应过程中，可溶性抗原多糖与双功能团交联试剂的重量配比为1：1-20，pH9.0-11.0，反应温度20-80℃。抗原多糖与载体蛋白的摩尔比为1/10-10/1。
适量的表面活性剂的存在有利于形成均相反应系统，可加快反应速度，同时保证了多糖抗原与蛋白交联的完全性。
常用的表面活性剂如吐温、SDS或TritionX-100等均可选用。
本发明还包括离子交换分离和凝胶柱层析分离结合的纯化步骤。
纯化步骤由离子交换分离和凝胶柱层析分离组合而成。当抗原多糖为酸性多糖时，采用732阳离子交换树脂分离游离的酸性多糖；当抗原多糖为中性多糖时，采用DEAE纤维素分离游离的中性多糖。然后采用凝胶层析柱分离游离蛋白和多糖-蛋白交联物，最终获得多糖-蛋白交联物。
本发明提供的交联方法操作简单，试剂来源方便，无毒性。
具体实施方式
实施例1海藻多糖与血清白蛋白(BSA)交联物的制备
(1)称取500mg海藻多糖(20KDa)，加入50ml0.3％醋酸钠溶液中，充分搅拌，使之溶解。再加入150mg NaBH4，溶解后，用饱和NaOH溶液调节pH至11.0，然后用0.2μ膜过滤；
(2)称取10g的1，4—丁二醇缩水二甘油醚，加入溶液(1)中，再加入3.0g表面活性剂SDS，强力搅拌，使混合均匀；
(4)在50℃条件下，反应20h，使多糖的羟基活化，交联试剂的一个环氧键打开与之连接，形成多糖-交联剂中间产物；
(5)将上述的反应混合物取出，采用截留分子量3000的超滤膜，进行循环过滤。超滤过程可基本去除游离的交联试剂。
(6)活化多糖与BSA的交联
称取3000mg BSA(60KDa)，加入100ml蒸馏水，加热(50℃)，强力搅拌，使之溶解，用0.2μ膜过滤。将活化多糖溶液(150ml)和BSA溶液混合，用5mol/LNa2CO3调节pH至10.5，置于55℃恒温振荡箱内，反应24小时。多糖-交联剂中间产物的另一个环氧键打开，与蛋白质中的氨基或羟基反应，生成多糖-蛋白交联物。反应完毕后，再往反应液中加入10g甘氨酸，65℃，继续反应24小时，封闭活化多糖分子中残留的环氧键活性基团。
(7)上述的反应液取出后，采用截留分子量3000的超滤膜，进行超滤分离操作，去除游离的甘氨酸。采用离子交换和凝胶柱层析方法，分离游离的多糖和BSA，最终获得海藻多糖—BSA交联物纯品。
(8)多糖蛋白交联物的特征分析
对所制备的海藻多糖—BSA交联物纯品，采用苯酚硫酸法测定多糖含量，多糖含量246mg；采用福林酚法测蛋白含量，蛋白含量为：2590mg。所制备的多糖—蛋白交联物中，多糖与蛋白的摩尔比约为1/3.5。
实施例2黄杆菌荚膜多糖与BSA交联物的制备
(1)黄杆菌荚膜多糖的活化
将40.0mg黄杆菌荚膜多糖(200KDa)溶于8ml0.3％醋酸钠溶液中，加入5mgNaBH4，混合均匀后，用饱和NaOH溶液调节pH至11.0，然后用0.2μ膜过滤。在上述过滤液中，加入0.5g交联剂(1，4—丁二醇缩水二甘油醚)和100mg表面活性剂TritionX-100，先用超声波振荡器剧烈振荡20分钟，再放入65℃恒温振荡箱内，进行多糖活化，反应18小时。活化18小时后的多糖溶液取出后放入截留分子量为10000的透析袋中，对蒸馏水透析48小时，去除游离的交联试剂。
(2)活化荚膜多糖与BSA的交联
取出透析后的反应液，50℃浓缩至5ml，加入1ml BSA水溶液(50.0mg/ml)，振荡使之混合均匀后，用饱和Na2CO3溶液调节pH至10.5，置于65℃恒温振荡箱中，交联反应20小时。反应后，在反应液中加入1.0g甘氨酸，继续反应24小时以封闭荚膜多糖分子中残留的活性基团。上述反应液取出后，放入截留分子量为10000的透析袋中，4℃下用蒸馏水透析48小时以上以去除游离甘氨酸。
(3)多糖—蛋白交联物的分离纯化
黄杆菌荚膜多糖是中性多糖。采用DEAE纤维素层析柱进行分离，可去除残留的中性多糖。将上述透析后的反应液用Na2CO3溶液调节pH至8.0，然后以1倍过柱液体积/层析柱体积/时的流速流经DEAE纤维素层析柱，游离的BSA以及多糖—蛋白偶联物被吸附在层析柱上，而残留的中性多糖直接流过层析柱，达到分离的目的。用3％NaCl溶液将吸附在层析柱上的BSA以及多糖—蛋白交联物洗脱。
洗脱下来的BSA与多糖—蛋白交联物的混合物再用凝胶层析柱(saphadexG-100)进行分离，利用BSA与多糖—蛋白交联物分子量的差异，可获得黄杆菌荚膜多糖—BSA交联物纯品。冻干后得干粉纯品(61.7mg)。
(4)黄杆菌荚膜多糖—BSA交联物的特征分析
对于最终所获得的黄杆菌荚膜多糖—BSA交联物样品，采用苯酚硫酸法测定多糖含量，采用福林酚法测定蛋白质含量。所制备的多糖—蛋白交联物中，多糖/蛋白比例约为1/3.2(摩尔比)。
采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对BSA、多糖、以及反应后的料液进行检测，并分别进行糖染色(schiff法)和蛋白染色(银染)。银染检测结果显示：多糖—蛋白交联反应液在BSA位置未观察到电泳带，在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的区域存在片装(多条)的电泳带，表明反应后BSA已基本以交联物形式存在。糖染检测结果显示：纯多糖在电泳胶上无法染出颜色；而多糖—蛋白交联反应液在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的区域存在片装的电泳带，其显色位置与银染显色位置对应，表明反应液中有大量与蛋白交联的糖类物质存在，即黄杆菌荚膜多糖—BSA交联物。
实施例3肺炎球菌荚膜多糖与BSA交联物的制备
(1)肺炎球菌荚膜多糖的活化
将100mg肺炎球菌荚膜多糖Pn1-Ps(280KDa)溶于15ml0.6mol/L的NaOH溶液中，加入2ml2mg/ml NaBH4溶液，调节pH至11.0，混合均匀后加入1.0g交联剂(1，4—丁二醇缩水二甘油醚)和300mg表面活性剂TritionX-100，先用超声波振荡器剧烈振荡20分钟，剧烈振荡，放入55℃恒温振荡培养箱，活化20小时。
活化20小时后的多糖溶液取出放入截留分子量为10000的透析袋中，4℃下对蒸馏水透析48小时，去除游离的交联试剂。
(2)活化多糖与BSA的交联
取出透析后的反应液，50℃浓缩至18ml。加入50mgBSA，振荡使之溶解后，采用饱和的Na2CO3溶液调节pH至10.5。反应液置于50℃恒温震荡培养箱中，交联反应24小时。反应结束后，再在反应液中加入1.3g甘氨酸，55℃继续反应24小时以封闭残留的环氧活性基团。
封闭后的反应液取出后，放入截留分子量为10000的透析袋中，4℃下用蒸馏水透析48小时以上以去除游离的甘氨酸。
(3)多糖—BSA交联物的分离纯化
荚膜多糖Pn1-Ps是酸性多糖。将上述透析后的反应液用HCl溶液调节pH至2.0，然后以1倍过柱液体积/层析柱体积/时的流速流经732阳离子交换树脂，游离的BSA以及多糖—BSA交联物带正电荷，被吸附在阳离子交换树脂上，而残留的酸性多糖直接流过层析柱，达到分离的目的。最终用3％NH4OH溶液将吸附在阳离子交换树脂上的BSA以及多糖—BSA交联物洗脱。
洗脱下来的BSA与多糖—BSA交联物的混合物再用凝胶层析柱(saphadexG-100)进行分离，获得荚膜多糖—BSA交联物。冻干后得干粉纯品(101.5mg)。
(4)荚膜多糖—BSA交联物的特征分析
对所制备的荚膜多糖—BSA交联物纯品，采用苯酚硫酸法测定多糖含量，采用福林酚法测蛋白含量。所制备的多糖—BSA交联物中，多糖/蛋白的摩尔比约为1/2.4。
采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对BSA、荚膜多糖、荚膜多糖—BSA交联物的样品进行检测，分别进行糖染色(schiff法)和蛋白染色(银染)。银染检测结果显示：多糖—BSA交联物样品在BSA位置未观察到电泳带，在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的区域存在片装的电泳带，表明所制备的多糖—BSA交联物纯度较高，残留的BSA没有或很少。糖染检测结果显示：纯多糖样品在电泳胶上无法染出颜色，多糖—BSA交联物样品在BSA位置以上(大于BSA分子量64000DA)的区域有片装的电泳带，其显色位置与银染显色位置对应，表明存在与蛋白交联的糖类物质，即所制备的荚膜多糖—BSA交联物。
采用高效液相色谱(G—5000凝胶柱)，并分别采用紫外或示差检测器对所制备的纯品进行检测。实验结果显示：BSA约在24.5分钟出峰(紫外检测器)，Pn1-Ps荚膜多糖约在18.5分钟出峰(示差检测器)，而荚膜多糖—BSA交联物的出峰时间在16.2-17.0分种(紫外和示差检测器)。荚膜多糖—BSA交联物提前出峰，这是由于交联物分子量更大的缘故；交联物的峰形较为尖锐，表明交联物的分子量分布较为集中。
Claims (1)
1.一种可溶性的多糖-蛋白交联抗原的制备方法，其特征在于：采用的双功能团交联试剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚，双功能交联基团分别与可溶性抗原多糖的羟基以及蛋白的氨基共价交联，其中所述的抗原多糖为来源于细菌的荚膜多糖，分子量2-28万Da；所述的交联反应过程中可溶性抗原多糖与双功能团交联试剂的重量配比为1∶10-20，pH11.0，反应温度50-65℃；抗原多糖与载体蛋白的摩尔比为1/2.4-1/3.5；将可溶性抗原多糖与蛋白通过双功能团交联试剂共价连接过程中，需添加表面活性剂SDS或TritionX-100；抗原多糖与载体蛋白交联反应后，需添加过量的甘氨酸封闭抗原多糖分子中残留的活性基团。
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