JPH0825899B2 - 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 - Google Patents

細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物

Info

Publication number
JPH0825899B2
JPH0825899B2 JP60098129A JP9812985A JPH0825899B2 JP H0825899 B2 JPH0825899 B2 JP H0825899B2 JP 60098129 A JP60098129 A JP 60098129A JP 9812985 A JP9812985 A JP 9812985A JP H0825899 B2 JPH0825899 B2 JP H0825899B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polysaccharide
protein
conjugate
bacterial
spacer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP60098129A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS60248622A (ja
Inventor
マルバーグ ステフエン
ジエー．クニスカーン ペーター
エル．トルマン リチヤード
Original Assignee
メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド filed Critical メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド
Publication of JPS60248622A publication Critical patent/JPS60248622A/ja
Publication of JPH0825899B2 publication Critical patent/JPH0825899B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二
価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖−タン
パク質結合体、該結合体の製造方法、並びに該結合体を
含む医薬組成物に関する。
細菌の精製された莢膜多糖類はそれと同種の細菌に対
するワクチンを調製するために用いられてきたが、しか
し得られる免疫応答はしばしば望んだほどには満足でき
るものとならず、特に年少の小児又は未熟もしくは不完
全免疫系を有する個体においてはそうであつた。例えば
ヘモフイラス・インフルエンザ（Haemophilus influenz
ae）ｂ型莢膜多糖は、乳児においては免疫応答を誘発す
ることができず、このためH.インフルエンザｂ型細菌に
起因する重大な小児医学の問題にたいする防護において
この多糖単独では無効とされている。これらの多糖類の
免疫原性の増強は、しばしばそれらを蛋白質と結合させ
ることによつて達成することができる〔例えば、シユニ
ールソンら、“ヘモフイラス・インフルエンザｂ型多糖
−蛋白質結合体：莢膜多糖ワクチンの新世代のモデ
ル”、ニユーデブ・ウイズ・ハム・アンド・ベト・ワク
チン、77−94頁、1980年（Schneerson et al.,“Haemop
hilus Influenzae Type b polysaccharide−Protein Co
njugates:Model for a New Generation of Capsular Po
lysaccharide Vaccines,“New Dev.with Hum.＆ Vet.Va
ccines,77−94（1980））；シユニールソンら、ジエイ
・エクスプトル・メド、152巻、361頁、1980年（Schnee
rson,et al.,J.Exptl.Med.,152,361（1980））；及びア
ンダーソン、感染と免疫、39巻、233頁、1983年（Ander
son,Infection and Immunity,39,233（1983））参
照〕。
しかしながら、これらの多糖類と結合させる蛋白質の
選択に注意がはらわれなければならない。或種の蛋白質
（例えばペルタスシノーゲン（pertussinogen））は乳
児における免疫系の非特異的賦活剤である。これらの蛋
白質はある程度まで多糖抗原への免疫応答性を高めるこ
とができるが、あいにくこのような非特異的活性化は不
必要な生物学的効果（即ち副作用（reactogenicity））
を引き起こす。これらの多糖抗原に対する非常に好まし
く特異的に高められた免疫応答は、最初にダブリユー・
エフ・ゲベル及びオー・テー・アベリイ（W.F.Goebel a
nd O.T.Avery）によつて1929年に報告〔ジエイ・エクス
プトル・メデイシン、50巻、521−531頁、1929年（J.Ex
ptl.Medicine 50,521−531（1929））〕されたように、
適切な蛋白質にこれらの多糖類を“結合”させることに
より、乳児において達成される。
多糖と蛋白質を結合する手段も慎重に考慮しなければ
ならない。もし、考えられているように、多糖の決定基
（determinant）が蛋白質の“担体”決定基と分子的に
近接しているため免疫学的賦活が生じるとすれば、これ
らの基は生体系内において容易に分離するようなもので
あつてはならない。多糖類の多価陰イオン特性と“担
体”蛋白質の多価陽イオン特性に基づいて得られる非共
有結合結合体は免疫応答性を賦活するであろうが、しか
しこれらの結合体は化学的に不安定であり、生じる免疫
応答もＴ細胞非依存性を示すようである。逆に、多糖類
と蛋白質との共有結合結合体はより大きな化学的安定性
を有しており、Ｔ細胞依存性免疫応答を示すであろう。
共有結合した多糖−蛋白質結合体については文献で述
べられてはいるが、共有結合の分析法がただ生体内での
活性のみであつて、しかも文献に開示された方法が再現
性に乏しかつたため、共有結合の正確な本質は証明又は
定量化されていなかつた。ヘモフイラス・インフルエン
ザｂ型及びストレプトコツカス・ニユーモニア（Strept
ococcus pneumoniae）6A型多糖類は、臭化シアン、次い
でアジピン酸ジヒドラジドと反応せしめ、しかる後破傷
風トキソイド又はカブトガニのヘモシアニン蛋白質とカ
プリングさせられた〔シユニールソンら、ジエイ・エク
スプトル・メド、152巻、361頁、1980年（Schneerson e
t al.J.Exptl.Med.,152,361（1980））、及び感染と免
疫、40巻、245頁、1983年〔Infection and Immunity,4
0,245（1983）〕。肺炎球菌19F型の多糖は、この多糖類
の還元性末端と蛋白質のペンダント状アミン基（即ち、
リジン類）からイミン（シツフ塩基）を形成し次いでこ
れらのイミンを水素化シアン化ホウ素ナトリウムで還元
することにより、直接に牛血清アルブミンとカプリング
せしめられた〔リンら、免疫学、46巻、333頁、1982年
（Lin et al.,Immunology,46,333（1983））〕。
更に、ジアゾ化された芳香族アミンと結合した多糖類
は蛋白質のチロシン類と結合せしめられ〔ケイ・ケイ・
ニツクスドルフら、免疫学、29巻、87頁、1975年（K.K.
Nixdorff et al.,Immunology,29,87（1975））〕、芳香
族アミンと結合した多糖類はイソチオシアネートに変
え、しかる後蛋白質のリジンのペンダント状アミノ基に
結合せしめられた〔エス・ビー・スベンソン及びエー・
エー・リンドバーグ、ジエイ・イムノログ・メソツド、
25巻、323頁、1979年（S.B.Svenson and A.A.Lindberg,
J.Immunolog.Methods 25,323（1979））〕。しかしなが
ら、それぞれの場合において、得られる結合体の特性
は、ゲル・パーミエーシヨン・クロマトグラフイーによ
つて示されたのみである。更に別の例として〔エス・ヌ
タニら、感染の免疫、36巻、971頁、1982年（S.Nutani
et al.,Infection and Immunity 36,971（1982））〕、
多糖、即ちプルランは、塩化シアヌルで活性化され、次
いで破傷風トキソイドと反応せしめられた。この場合、
結合体は電気泳動での特性が示され、出発物質とは異な
るということが示されただけであつた。
これらのいずれの場合にも、総分子量（aggregated m
olecular weight）によつて示唆される以外には共有結
合の証明がされなかつたが、多価陰イオンおよび多価陽
イオンの結合体においても総分子量が得られるため共有
結合を分子状結合体における多価陰イオン及び多価陽イ
オンの相互作用と区別できなかつた。
したがつて、本発明の目的は、多糖の決定基を蛋白質
の“担体”決定基に、生体系においてこれらの基の分子
的近接が維持できるように結合させることである。本発
明の他の目的は、莢膜多糖類を担体蛋白質と共有結合的
に結合せしめ、更に該結合の共有性を証明及び定量化で
きる方法を開発することである。本発明のさらに他の目
的は、Ｔ細胞依存性を示し、かつある種の細菌特に用い
られる多糖類の細菌と同種の細菌に対する保護血清抗体
を誘発するためのワクチン成分として有用な化学的に安
定な多糖類−蛋白質結合体を得ることである。
本発明は共有結合的に変性された細菌性多糖類と共有
結合的に変性された免疫原性膜蛋白質、ウイルス蛋白質
サブユニツト、合成ポリペプチド、細菌性トキソイド又
は他の適切な免疫原性蛋白質とからなり、免疫原性細菌
ワクチンの有用成分である化学的に安定な結合体に関す
る。本発明の多糖−蛋白質結合体は共有結合チオエーテ
ル基を含有する二価スペーサーを介して結合されてお
り、この二価スペーサーは高分子（例えば、多糖類及び
蛋白質）を結合する原子鎖であつて、該スペーサーの一
端は一つの変性された高分子（例えば共有結合的に変性
された多糖）から始まり、その他端はもう一つの変性さ
れた高分子（例えば官能化された蛋白質）から始まつて
いる。
本発明の方法において、多糖は、ペンダント状求電子
中心又はペンダント状チオール基を有する多糖を製造す
るための一以上の工程で共有結合的に官能化される。好
ましくは多糖は、まず水酸基を有しない有機溶媒中に可
溶化され、次いで二求核剤（bis−nuclesphile）と反応
させる前に二官能性活性化剤によつて誘導体にされる。
求核的に官能化された多糖は、次に、ペンダント状求電
子部位を生じさせる試薬と反応させるか、あるいはペン
ダント状チオール基を生じさせる試薬と反応せしめられ
る。二求核剤、即ち活性化多糖と反応して、ペンダント
状求電子部位又はチオール基を有する共有結合的に変性
された多糖とする二求核剤を適正に選択するか、あるい
は適切な求核剤を選択することにより、求核的に官能化
された多糖が更に官能化されることを回避することがで
きる。
多糖を共有結合的に変性することとは別に、一もしく
は二工程の方法で、適切な細菌性“担体”蛋白質を、ペ
ンダント状チオール基生成試薬又はペンダント状基電子
中心生成試薬と反応させる。適切に共有結合的に変性さ
れた多糖類及び蛋白質が次いで反応せしめられて、共有
結合した多糖−蛋白質結合体が製造され、しかる後精製
して未結合の高分子及び過剰の試薬を除去し、免疫原の
投与量を共有結合された多糖について決定する。
共有結合性は、多糖をそのペンダント求基電子基又は
チオール基から（加水分解などで）開裂し、更に蛋白質
をその側鎖状チオール基又は基電子基から開裂し、次い
で蛋白質の指標アミノ酸（リジン）にたいするスペーサ
ーの相対濃度を測定して共有結合性を確認するようにし
てチオエーテル含有二価スペーサー分子を分析すること
により絶対的に証明確認することができる。
多糖−蛋白質結合体又はそれらの誘導体を免疫学的有
効量含む免疫原性ワクチンは、その上で製造することが
できる。
本発明の結合体は多糖−蛋白質結合体であつて該結合
体は、チオエーテル基と一級アミンを有し多糖と蛋白質
との間に加水分解に不安定な共有結合を形成する二価ス
ペーサーを介してカプリングされている。本発明におけ
る好ましい結合体は、しかしながら、式 Ps−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Pro又は Ps−Ａ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′−Proで表わされる結合体で
あり、ここでPsは多糖を表わし;Proは細菌性蛋白質を表
わし；更にＡ−Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′は
加水分解に安定なチオエーテル共有結合を有し、高分子
Pro及びPsと共有結合（例えば、加水分解に不安定なエ
ステルもしくはアミド結合）を形成する二価スペーサー
である。スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−Ｂにおいて、Ｓはイオ
ウ原子であり;Eは、チオール基と反応せしめられた親チ
オ基（thiophilic group）の変性生成物であつて、式： （式中、ＲはＨ又はCH3、ｐは１〜３である）で表わさ
れ;Aは （式中、Ｗは０又はNH、ｍは０〜４、ｎは０〜３、Ｙは
CH2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであり、Ｒ′はＨ又はC1
もしくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合はｍとｎ
が同時に０になることはなく、Ｙが０又はＳのときには
ｍは１よりも大きくｎは１よりも大きく； 更に、Ｂは である。また、スペーサーＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′におい
て、Ｓはイオウ原子であり;A′は 〔式中、ａは１〜４、Ｒ″はCH2又は （ここで、Ｙ′はNH2又はNHCOR′である）であり、Ｗ、
ｐ及びＲ′は上記定義のとおりである〕 であり;E′はチオール基と反応せしめられた親チオ基の
変換生成物であつて、 （Ｒは上記定義のとおりである）により表わされ、Ｂ′
は であるか、あるいはＥ′は であり、 Ｂ′は （ｐは１〜３である）である。更に、二価スペーサーＡ
−Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′におけるＥ−Ｓ
−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′成分は確認定量が可能であり、
こお同定により、共有結合的に変性された多糖を起点と
するチオエーテルイオウ原子側を、官能化された蛋白質
を起点とするスペーサー側と結合している結合体の結合
の共有結合性が示される。
本発明の多糖類は酸基を有するいかなる細菌性多糖類
であつてもよく、特定のタイプに限定されるものでのな
い。このような細菌性多糖類の具体例としては、ストレ
プトコツカス・ニユーモニア（肺炎球菌）6A、6B、10
A、11A、18C、19A、19F、20、22F及び23F型多糖類;B属
ストレプトコツカスI a、I b、II及びIII型多糖類；ヘ
モフイラス・インフルエンザ（H.flu）ｂ型多糖類；ナ
イセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis、
髄膜炎菌）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、W135及び29E型多糖
類；エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）K1、K1
2、K13、K92及びK100多糖類が挙げられる。特に好まし
い多糖類は、しかしながら、ローゼンベルグら、ジエイ
・バイオル・ケム;236巻、2845−2849頁、1961年〔Rose
nberg et al,J.Biol.Chem.,236,2845−2849（1961）〕
及びシアーメンホフら、ジエイ・バイオル・ケム、203
巻、695−704頁、1953年〔Zamenhof et al.,J.Biol.Che
m.,203,695−704（1953）〕に記載されたようなヘモワ
イラス・インフルエンザｂ型多糖；ロビンスら、感染の
免疫、26巻、３号、1116−1122頁、1979年12月〔Robbin
s et al.,Infection and Immunity,26,No.3,1116−1122
（Dec.,1979）〕に記載されたようなストレプトコツカ
ス・ニユーモニア（肺炎球菌）6B型もしくは6A型多糖；
シー・ジエイ・ソーら、伝染病の概観、３巻、２号、32
3−331頁;1981年〔C.J.Lee et al.,Reviews of Infecti
ous Diseases,３,No.2,323−331（1981）〕に記載され
たような肺炎球菌19F型多糖；及びオー・ラームら、ア
ドブ・カーボハイド・ケム・アンド・バイオケム、33
巻、295−321頁〔O.Larm et al.,Adv.Carbohyd Chem.an
d Biochem.,33,295−321〕及びアール・エス・テイプソ
ンら、アカデミツクスプレイ社出版、1976年〔R.S.Tips
on et al.,ed.,Academic Press,1976〕に記載されてい
るような肺炎球菌23F型多糖からなる群より選ばれるそ
れらの莢膜多糖類である。
本発明の蛋白質は、実証された安全性と実証可能な免
疫原性を有する蛋白質であり、特定のタイプのものには
限定されない。適切な蛋白質としては、細菌の膜蛋白
質；エデスチン又は大豆トリプシン阻害剤のような各種
の植物蛋白質;AもしくはＢ型肺炎、gDもしくはgC型ヘル
ペス（疱疹）、エプスタイン−バール（Epstein−Bar
r）もしくは水痘性帯状疱疹のサブユニツトのようなウ
イルス性蛋白質サブユニツト；合成ポリペプチド；ジフ
テリアトキソイド；又は破傷風トキソイドが挙げられる
が、好ましくはＴ細菌賦活剤であるナイセリア・メニン
ギチジス（髄膜炎菌）Ｂ血清型の外膜蛋白質である。こ
れらの血清型の蛋白質の具体例は、ヘルテイングら、
“ナイセリア・メニンギチジスの血清型決定蛋白質”、
アクタパス・ミクロバイオル・スカンド・Ｃ部、89巻、
69−78頁、1981年〔Helting et al.,“Serotype Determ
inant Proteins of Neisseria Meningitidis″,Actapat
h.Microbiol.Scand.Sect.C,89,69−78（1981）〕及びフ
ラツシユら、ジエイ・バクト、127巻、973−981頁、197
6年〔Frasch et al.,J.Bact.,127,973−981（1976）〕
に記載されている。
本発明における結合体Ps−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Proはス
ペーサーを有しており、その成分には、特に、二酸化炭
素、1,4−ブタンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−
Ｎ−アセチルホモシステイン；二酸化炭素、1,5−ペン
タンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチル
ホモシステイン；二酸化炭素、３−オキサ−1,5−ペン
タンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチル
ホモシステイン；二酸化炭素、1,4−ブタンジアミン及
びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルシステイン；二
酸化炭素、1,3−プロパンジアミン及びＳ−カルボキシ
メチル−Ｎ−ベンゾイルホモシステイン；二酸化炭素、
３−アザ−1,5−ペンタンジアミン及びＳ−カルボキシ
メチル−Ｎ−アセチルシステイン；並びに、二酸化炭
素、1,2−エタンジアミン、グリシン及びＳ−（スクシ
ン−２−イル）−Ｎ−アセチルホモシステインの誘導体
がある。本発明における結合体Ps−Ａ′−Ｓ−Ｅ′−
Ｂ′−Proはスペーサーを有しており、その成分には、
特に、二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチルシステアミ
ン；二酸化炭素及びＳ−（α−カルボキシエチル）シス
テアミン；二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチルホモシ
ステアミン；二酸化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）
システアミン及びグリシン；並びに、二酸化炭素及びＳ
−カルボキシメチルシステインの誘導体がある。
本発明の方法において、多糖は、（ａ）それを水酸基
のない有機溶媒中に可溶化し、次いで（ｂ）それを二官
能性試薬で活性化し、（ｃ）この活性化多糖を二求核剤
（bisnucleophile）と反応させ、最後に、必要であれ
ば、更に（ｄ）この変性された多糖を（ｉ）求電子（例
えば親チオ性）部位を生成する試薬、又は（ii）チオー
ル基を生成する試薬とのいずれかの反応によつて官能化
することにより共有結合的に変性される。蛋白質は、こ
れに対し、（ｉ）チオール基を生成する試薬、又は（i
i）親チオ性部位を生成する試薬のいずれかと反応さ
せ、次いで共有結合的に変性された多糖及び官能化され
た蛋白質を互いに反応せしめて共有結合した安定な結合
体を形成し、最終混合物を精製して未反応を多糖類及び
蛋白質を除去する。
本発明の工程には、また活性化された多糖と反応し
て、ペンダント状求電子部位又はペンダント状チオール
基を有する共有結合的に変性された多糖を生成せしめる
求核剤（nucleophile）又は二求核剤を選択することが
含まれており、これによつて共有結合的に変性された多
糖を共有結合的に変性された蛋白質と反応させる前に、
さらに二求核剤で変性された多糖を更に官能化する必要
性を除いている。また、蛋白質をいずれかの形の基に官
能化することは、これらの工程における反応物の選択に
より、２以上の工程にて行なわれる。
A.多糖の調製 多糖を共有結合的に変性するための第一工程では、固
体状多糖を可溶化する必要がある。
多糖の求核的アルコール性水酸求は、求電子剤に対し
て、水溶液における水の水酸基と化学的に競合してはな
らないため、多糖は非水性（非水酸基性）溶媒に溶解さ
れるべきである。適切な溶媒としては、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミ
ド、ホルムアミド、N,N′−ジメチルイミダゾリジノン
及び他の類似した極性の非プロトン性溶媒、が挙げら
れ、ジメチルホルムアミドが好ましい。
これらの溶媒の使用に加えて、リン酸モノエステルも
しくはジエステルのような酸性水素原子を有する本発明
の多糖類（例えば、リボース−リビトールリン酸エステ
ルポリマーであるH.インフルエンザｂ型の莢膜多糖類並
びに肺炎球菌6B、19F及び23Fの莢膜多糖類）を適切な塩
の形に変えると、これらの多糖類は上記溶媒に易溶性に
なることを本出願人は見出した。これらの高分子におけ
る酸性水素原子は、トリ−もしくはテトラ−（C1〜C
5−）アルキルアンモニウム、１−アザビシクロ〔2.2.
2〕オクタン、1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデカ
−７−エン又は類似のカチオン、特にトリ−もしくはテ
トラ−（C1〜C5−）アルキルアンモニウムのような大疎
水性陽イオンと置換することができ、得られるリン酸化
多糖類のトリ−もしくはテトラアルキルアンモニウム又
は類似の塩は、１分間から１時間撹拌すると、約17〜50
℃にて上記溶媒と容易に溶解する。
部分的に加水分解されたH.インフルエンザｂ型多糖は
テトラブチルアンモニウム塩に変えられてジメチルスル
ホキシドに溶解させられたが〔エガンら、ジエイ・アメ
ル・ケム・ソク、104巻、2898頁、1982年（Egan et a
l.,J.Amer.Chem.Soc.,104,2898（1982））〕、この生成
物はもはや抗原性を有しておらず、このためワクチンを
製造するには役立たない。これに反して、本出願人は、
多糖は強酸陽イオン交換樹脂に通してテトラアルキルア
ンモニウム型とするか、あるいは多糖を水酸化テトラア
ルキルアンモニウムにて注意深く中性化し、好ましくは
前者の操作によつて、未変性で未加水分解の多糖を可溶
化せしめることにより、免疫原性ワクチン用としての多
糖の有効性を保存せしめた。
その後の工程では、結合化が望まれるユニツトの官能
化のために一般的に又は実用的に用いられる試薬と十分
な反応性を有する水酸基以外の官能基が多糖類には存在
していないという多糖類を結合せしめる上での他の重要
な物理化学的な制約の克服が行なわれる。多糖を活性化
して活性化多糖を得、次いで二求核剤と反応させて求核
性官能化多糖を得、しかる後、求電子部位もしくはチオ
ール基を生成する試薬にて官能化することは、すべて、
多糖を共有結合的に変性し、結合化をなす上で多糖に官
能基を付加せしめるためである。
次の工程では、可溶化された多糖が、1:5〜1:12の範
囲内の活性化剤：多糖の厳守すべき重量比にて、10分間
〜１時間撹拌しながら二官能性試薬と約０〜50℃で反応
せしめることにより活性化される。従来、この活性化
は、多糖を臭化シアンと反応させることにより行なわれ
てきた。しかしながら、臭化シアンで活性化され、隣接
ジオール的な“性質”を有する誘導体は、リン酸緩衝液
に対して透析している間、一時的な安定性を示したにし
かすぎない。したがつて、臭化シアンによる活性化が本
発明においてもなお可能であつたとしても、この試薬は
多糖類の活性化にほとんど利用することができず、好ま
しいものではない。これに代り、多糖の活性化に好まし
い二官能性試薬としては、炭酸誘導体 （R2及びR3は、それぞれ独立してイミダゾリルのような
アゾリル；ハライド；又はｐ−ニトロフエニルもしくは
ポリハロフエニルのようなフエニルエステル）が挙げら
れる。
特に好ましい試薬であるカルボニルジイミダゾールは
水酸基と反応して多糖のイミダゾリルウレタンを生成
し、例えばクロルギ酸ニトロフエニルなどのクロロギ酸
アリールエステルは多糖の混合炭酸エステルを生成す
る。各場合において、得られる活性化多糖は、アミンの
ような求核剤に対して極めて反応性が高く、このためそ
れぞれのウレタンに変換される。
次の段階では、活性化多糖は、アミン、特に例えば
式： 〔式中、ｍは０〜４、ｎは０〜３、ＹはCH2、Ｏ、Ｓ、N
R′、CHCO2H（ここで、Ｒ′はＨ又はC1もしくはC2のア
ルキルである）であり、ＹがCH2の場合はｍ及びｎがと
もに０であつてはならず、Ｙが０又はＳの場合はｍが１
以上でｎが１以上である〕 のジアミン類のような求核剤と、アミン大過剰で（即
ち、例えば使用される活性化剤に対し50〜100倍モル過
剰のアミン）反応せしめられる。反応は、氷浴上で15分
間〜１時間継続され、次いで15分間〜１時間約17〜40℃
にて継続される。
活性化された多糖は、例えば1,4−ブタンジアミン等
のジアミンと反応させると、ペンダント状アミンを有す
るウレタン型の多糖となるが、更にアシル化して官能化
させてもよい。混合炭酸エステルも容易にジアミン類と
反応して、ペンダント状アミン類となる。
あるいは、活性化された多糖は、例えば４−ブロムア
セトアミドブチルアミン等のジアミノアルカンのモノハ
ロアセトアミドのような求核剤と反応させて〔ダブリユ
ー・ビー・ローソンら、ホツペ・セイラーズ・ゼツト・
フイジオル・ケム、349巻、251頁、1968年（Hoppe Seyl
er′s Z.physiol Chem.,349,251（1968））参照〕、ペ
ンダント状求電子部位を有する共有結合的に変性された
多糖を生成させてもよい。又は、活性化された多糖は、
システアミン（アミノエタンチオール）又はシステイン
のようなアミノチオール（その誘導体の具体例はペプチ
ド合成技術において周知である）と反応させ、ペンダン
ト状チオール基を有する多糖を生成してもよい。いずれ
の場合でも、共有結合的に変性された多糖を、変性され
た細菌性“担体”蛋白質に結合させる前に、更に官能化
することは必要ではない。
多糖を調製する最後の工程では、多糖のそれ以上の官
能化がもし必要であれば、求電子部位を生成する試薬又
はチオール基を生成する試薬と求核性官能化多糖を反応
せしめてもよい。
求電子部位を生成させる上で使用するのに好ましい試
薬としては、例えばα−ハロアセチル又はα−ハロプロ
ピオニルにアシル化する試薬、即ち （式中、ＲはＨ又はCH3;XはCl、Br又はI;X′はニトロフ
エノキシ、ジニトロフエノキシ、ペンタクロロフエノキ
シ、ペンタフルオロフエノキシ、ハライド、Ｏ−（Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミジル）又はアジドである） のような誘導体、特にクロル酢酸又はα−ブロムプロピ
オン酸のような誘導体が挙げられ、その反応はpH8〜11
（必要であれば塩基を加えてその範囲内に維持する）、
温度約０〜35℃にて10分間〜１時間行なわれる。アミノ
誘導体化された多糖は、マレイミドアミノ酸でアシル化
して〔オー・ケラーら、ヘルブ・キム・アクタ、58巻、
531頁、1975年（O.Keller et al,Helv.Chim.Acta.,58,5
31（1975）参照〕、マレイミド基、即ち、 （式中、ｐは１〜３である） とするか；ブロモ酢酸ｐ−ニトロフエニルのような２−
ハロアセチル化剤でアシル化するか；あるいは、チオ置
換が可能で適切に官能化された多糖類を得るために、α
−ハロケトンカルボン酸誘導体、例えば 〔ベル、67巻、1204頁、1934年（Ber.,67,1204,（193
4））〕 でアシル化してもよい。
チオール基を生成するために使用される適切な試薬と
しては、例えば、次式 （式中、R4はC1〜C4のアルキル又はC6C5もしくはC10H13
等の一もしくは二環式アリールであり、ｐは１〜３であ
る）のようなチオラクトン： （式中、ｍは０〜４、R5はC1〜C4のアルキル又はC6H5、
Ｘ′は上記定義のとおりであり、次いでHSCH2CH2OHで処
理される）；又は （式中、ｍ、R5及びＸ′は上記定義のとおりであり、次
いでジチオスレイトールで処理される） のようなアシル化剤が挙げられる。このような反応は、
窒素雰囲気下、約０〜35℃でpH8〜11にて（必要に応
じ、この範囲内にpHを維持するために塩基が加えられ
る）、１〜24時間行なわれる。例えば、アミノ誘導体化
された多糖は、次式： の化合物と反応して、適切に官能化された多糖とされて
もよい。
これらの工程によつて、Ps−AE＊又はPs−Ａ′−SH
（ここで、Ｅ＊は であり、 Ａ、Ａ′、Ｒ、Ｘ及びｐは上記定義のとおりである）の
形の共有結合的に変性された多糖類が得られる。
B.蛋白質の調製 多糖と結合される蛋白質の別途の官能化はチオール基
を生成するための一以上の試薬との蛋白質の反応、又は
求電子（即ち、親チオ性）中心を生成するための一以上
の試薬との蛋白質の反応からなる。
求電子的に官能化された多糖との結合体を製造するた
めに、蛋白質は、一もしくは二の工程において、前記第
31〜34頁にて説明した、多糖にチオール基を生成せしめ
るために使用されるそれらのアシル化剤のような一以上
のチオール基生成試薬と反応せしめられる。チオール化
蛋白質は、また、アタツシら、バイオケム・エト・バイ
オフイズ・アクタ、670巻、300頁、1981年（Atassi et
al.,Biochem et Biophys.Acta,670,300（1981））で示
されているようにカルボキシ活性化蛋白質を、チオール
化蛋白質を得るためにアミノチオールにてアミノ化する
ことにより製造してもよい。この製造工程における好ま
しい態様は、約０〜35℃、pH8〜11で５分間〜２時間、
当量の反応物を用い、蛋白質のペンダント状アミノ基
（即ち、リジル基）をＮ−アセチルホモシステインチオ
ラクトンにて直接アシル化することである。
Ｅ′Ｂ′が である場合、官能化された蛋白質の製造条件及び方法
は、活性化マレイミド酸と反応させて対応する多糖を製
造せしめる前記第31〜34頁の説明と同様である。
ペンダント状チオール基を有する共有結合的に変性さ
れた細菌性多糖と結合化させる場合は、蛋白質は、例え
ば （Ｘ及びＸ′は前記定義のとおりである）；並びに （Ｘ′は前記定義のとおりである）などのアシル化剤の
ような求電子中心をも有する適切な蛋白質としては、例
えば、式 の如き活性化されたマレイミド酸のような試薬を用いて
ペンダント状リジルアミノ基をアシル化するか、あるい
はジアミンのモノハロアセチル誘導体とカルボキシ活性
化蛋白質を反応せしめることにより得られるものが挙げ
られる。いずれの製造反応においても、温度は５分間〜
１時間の間、０〜35℃であり、pHは８〜11である。
C.結合体の製造 結合体の製造は、ペンダント状求電子中心を有する共
有結合的に変性されたいずれかの多糖類とペンダント状
チオール基を有するいずれかの蛋白質とを、pH7〜９、
ほぼ当量比で、窒素雰囲気中、６〜24時間約17〜40℃で
反応させるだけでよく、これによつて共有結合した結合
体が得られる。このような反応の具体例としては； ４−ブロモアセトアミドブチルアミンと反応させて活性
化せしめられた多糖を、Ｎ−アセチルホモシステインチ
オラクトンと反応させた蛋白質と反応せしめて結合体を
得る反応： 及び （式中、Ｙ″はC2〜C8アルキレン基である） 活性化マレイミド酸と反応させてアミノ誘導化された多
糖を、アミノチオールにてアミノ化されたカルボキシ活
性化蛋白質と反応せしめて結合体を得る反応が挙げられ
る。
同様に、側鎖状チオール基を有する共有結合的に変性
されたいずれかの多糖類を、側鎖状求電子中心を有する
いずれかの蛋白質と反応せしめて、共有結合した結合体
を得てもよい。このような反応の具体例としては、 アミノチオールと反応させて活性化された多糖をジアミ
ンのモノハロアセチル誘導体と反応させたカルボキシ活
性化蛋白質と反応せしめて結合体を得る反応がある。
ハロアセチル基の過剰な求電子活性を下げる必要があ
る場合は、ｎ−アセチルシステアミンのような低分子量
チオールを用いて結合体の反応を行なうことにより、こ
の目的が達成される。この試薬、即ちｎ−アセチルシス
テアミンを使用すると、形成されるＳ−カルボキシメチ
ルシステアミンがスパツクマン（Spackman）、ムーア
（Moore）及びスタイン（Stein）の方法によつて特有的
に検出できるため、使用したハロアチル基に基づき確認
することができる（Ｄ項参照）。
これらの結合体は、次いで、約２時間、約１〜20℃に
て固定角ローターを用い、約100,000xgで遠心分離する
か、あるいはゲル浸透、イオン排除クロマトグラフイ
ー、勾配遠心分離（gradient centrifugation）又は他
の差異吸着（differential adsorption）クロマトグラ
フイーを初めとするその他の各種の精製方法に付され、
望ましい生物学的活性に基づく方法である二価スペーサ
ーの共有結合分析（下記参照）を利用して共有結合して
いない多糖類及び蛋白質が除去される。
試薬を更に分離するには、サイズ排除クロマトグラフ
イーでも行なうことができ、あるいはN.メニンギチジス
Ｂ血清型の外膜蛋白質のように非常に大きな不溶性蛋白
質の場合には、この分離を超遠心分離にて行なうことが
できる。
D.共有結合の確認分析 共有結合を確認するための結合体の分析、および結合
体の安定性分析は、本出願人により、結合体を加水分解
し（好ましくは、110℃で20時間、6NHClにて）、次いで
チオエーテル結合を有し加水分解に安定なスペーサーの
アミノ酸及び蛋白質の構成アミノ酸を定量分析すること
により、成し遂げられる。蛋白質のアミノ酸の寄与は、
必要であれば、含有される蛋白質の適切なアミノ酸標準
と比較することにより補正することができ、残留アミノ
酸がこれにより結合体の共有結合性を反映する。あるい
はまたスペーサーのアミノ酸が、分析上、蛋白質のアミ
ノ酸標準の外側にあらわれるようにデザインすることも
できる。共有結合性の分析は精製操作を監視する上でも
有用であり、生物学的活性成分の濃度の増加を把握する
ことができる。上記の具体例としては、 を加水分解するとＳ−カルボキシメチルホモシステイン が遊離し； が加水分解するとアミノジカルボン酸 が遊離し；また を加水分解するとＳ−カルボキシメチルシステアミンH2
NCH2CH2SCH2CO2Hが遊離し、Ps−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Pro分
子におけるペプチド結合と他の加水分解に不安定な結合
とが開裂する。スペツクマン、モーア及びスタインの方
法のようなクロマトグラフイー法が次いで好都合に適用
することができ、アミノ酸成分比が決定される。
E.適用 本発明の一以上の結合体は、本発明の好ましい態様に
て、ヘモフイラス・インフルエンザｂ型又はストレプト
コツカス・ニユーモニア6B、19Fもしくは23F型細菌のよ
うな同種の細菌に起因する菌血症から予法上又は治療上
能動的に保護するために哺乳動物種において使用するこ
とができる。能動的保護は、一回当りに投与される各結
合体における結合体の形での有効量（測定可能な抗体量
を産生し得る量、例えば２〜50μｇ）の多糖を、無菌食
塩溶液のような薬学上許容される担体とともに、もしく
は該担体を用いないで注射することにより行なうことが
できる。アジユバンド〔例えばアラム（ミヨウバン）〕
の使用も、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の好ましい態様においては、結合体はヒト（特
に、乳児及び小児）の能動免疫用ワクチン化のために使
用される。更に安定化させるために、これらの結合体
は、使用に先立ち、ラクトースの存在下（例えば、H.イ
ンフルエンザの多糖20μg/ml及びラクトース4mg/ml、あ
るいは肺炎球菌の多糖50μg/ml及びラクトース10mg/m
l）で凍結乾燥してもよい。
好ましい投与量は、一回の投与で投与すべき結合体又
はその誘導体がそれぞれ、肺炎球菌多糖類の結合体とし
ての結合体型多糖25μｇに相当し、更にH.インフルエン
ザｂ型多糖の結合体としての結合体型多糖10μｇに相当
する量である。必要であれば、H.インフルエンザｂ型多
糖の結合体又はその誘導体を、結合体型の多糖10μｇに
相当する量で、更に一もしくは二回投与してもよい。
本発明を以下の実施例に基づき更に明らかにするが、
該実施例は説明するためのものであつて、限定させるた
めのものではない。
実施例１ H.インフルエンザｂ型莢膜多糖の調製接種及び種増殖 段階A:ヘモフイラス・インフルエンザｂ型の凍結乾燥管
（ロツス（Ross）768から培養、ニユーヨーク州立大学
から入取）を無菌ヘモフイラス属細菌接種培地（下記参
照）1mlに懸濁し、この懸濁液を19のチヨコレート寒天
プレート（BBL）に広げた。ローソクビン中、37℃で20
時間培養した後、各プレートでの培養物を１〜2mlのヘ
モフイラス属細菌接種培地に再懸濁し、貯蔵した。
ヘモフイラス属細菌接種培地＊ 大豆ペプトン 10 g/ NaCl 5 g/ NaH2PO4 3.1g/ Na2HPO4 13.7g/ K2HPO4 2.5g/ 蒸留水 全 量 ＊溶液のpHは目標値7.2±0.1（通常値はpH7.23）に調整
され、溶液を121℃で25分間オートクレーブにて処理し
て滅菌した。
段階B:バツフルのない２のエルレンマイヤーフラスコ “段階A"（上記）の再懸濁された細菌の1/3を、完全
ヘモフイラス種産生培地（下記参照）約1.0がそれぞ
れ入れられた３つの２フラスコに接種するために使用
した。次いで、フラスコを37℃で約５時間200rpmのロー
タリーシエーカーにて培養した。培養時間の最後におけ
る典型的なOD660値は0.37であつた。
完全ヘモフイラス産生培地 NaH2PO4 3.1g / Na2HPO4 13.7g / 大豆ペプトン 10 g / 酵母抽出物の透析過液（１） 10 ml/ K2HPO4 2.5g / NaCl 5.0g / グルコース（２） 5.0g / ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）（３）
2 mg/ ヘミン（４） 5 mg/ 塩類及び大豆ペプトンを発熱物質のない少量の熱水に
溶解し、更に発熱物質のない熱水を加えて最終容積補正
した。発酵槽又はフラスコを次いで121℃で約25分間滅
菌し、冷却後、接種するに先立ち、酵母抽出物の透析
過液（１）、グルコース（２）、NAD（３）、及びヘミ
ン（４）をフラスコ又は発酵槽に無菌的に加えた。
（１）酵母抽出物の透析過液:100gのブルーア酵母抽
出物（黄色）を１の蒸留水に溶解し、H10×50カート
リツジを備えたアミコン（Amicon）DC−30中空繊維にて
限外過し、分子量50,000の分子を除去した。過液を
集め、0.22μ膜に通して無菌生成物とした。
（２）ガラス蒸留水の無菌25％溶液としてグルコースを
調製した。
（３）NAD20mg/ml含有貯蔵溶液をミリポア（Millipor
e）フイルター（0.22μ）に通して過することにより
無菌化し、接種するに先立ち無菌的に加えた。
（４）ヘミン（Hemin）3Xの貯蔵溶液を0.1MNaOH10mlに2
00mg溶解して調製し、容量を蒸留無菌水100mlに調整し
た。この溶液を121℃で20分間滅菌し、接種前の最終培
地に無菌的に加えた。
段階C:70の種発酵槽 Ｂ段階の生成物３を用い、完全ヘモフイラス種産生
培地（前述のように調製）41.4及びUCON Ｂ 625泡
止剤17mlが入れられた70の発酵槽内に接種した。pHを
7.4から開始した。
発酵を100rpmで撹拌しながら37℃に維持し、典型的な
0.39の光学濃度（O.D.）に到達するまで（約5.5時間
後）、O.D.及びpH測定によつて監視した。
段階D:800の産生発酵槽 Ｃ段階の生成物40を用い、必要な容量であると定め
られた産生培地（前述のように調製）570及びUCON L
B 625泡止剤72mlが入れられた800の発酵槽内に接種
した。
発酵を100rpmで撹拌しながら37℃に維持し、O.D.が２
時間の間一定になり、発酵が終了するまで（典型的な最
終O.D.は12時間後の0.54である）、約２時間毎にO.D.及
びpH値を検査した。
採取及び不活性化 バツチ約600を、１％チメロサール12が入つた
“殺タンク”（kill tank）内に採取して不活性化し
た。
清澄化 ４℃で18時間不活性化した後、４インチ（約10cm）・
ボール・（60ml）・シヤープレス（Sharoles）遠心機に
て、生成物を透明に維持するために流速を調節しながら
（1.3〜3.0/minの間で変えられる）遠心分離した。遠
心分離（15,000rpm）後に得られた上澄を生成物の回収
のために用いた。
限外過による単離及び濃縮 二つの生成発酵物からの上澄液を貯蔵し、10個の（5
0,000ダルトン分離）中空繊維カートリツジを備えたロ
ミコン（Romicon）限外過ユニツトにて２〜８℃で濃
縮した（膜面積4.5m2;空気流速2.0lpmで約1.4Kg/cm2（2
0psi）；約4.5時間後に1200が32.5に濃縮されるよ
うに濃縮）。過を廃棄した。
48％及び61％のエタノール沈殿物 ロミコン残留物32.5に、48容量％エタノール最終濃
度となるまで、４℃にて撹拌しながら１時間に亘り95％
エタノール30を滴下した。混合物を、完全な沈殿物が
得られるように更に２時間４℃にて撹拌し、上澄液を単
一の４インチ・シヤープレス遠心機に通し、15,000rpm
で集めた（流速0.27/min）。不溶性ペレツトを廃棄
し、１時間に亘り95％エタノールを更に20.8加えて、
清澄化された液体を61％エタノールとした。完全な沈殿
物が得られるように混合物を更に３時間撹拌した。
第二ペレツトの回収 得られた48％エタノールに可溶で61％エタノールには
不溶の沈殿物を４インチ・シヤープレス遠心機にて15,0
00rpm（流速0.62/min）で遠心分離することにより集
め、61％エタノール上澄液を廃棄した。粗生成物の収集
は、湿潤したペーストとして0.377Kgであつた。
塩化カルシウム抽出 61％エタノール不溶性物質377gを、デイマツクス（Da
y max）分散器内で、２〜８℃にて、冷ガラス蒸留水6.5
と混合した。この混合物に冷2MCaCl2・2H2O 6.5を
加え、混合物（最終濃度1.0MCaCl2）を４℃で15分間抽
出した。容器を次いで1MCaCl2・2H2O ２で洗浄し、1
5の最終容量とした。
23％エタノール沈殿物 上記CaCl2抽出液15に、撹拌しながら４℃にて30分
間に亘り95％エタノール4.48を滴下して23％エタノー
ルとした。更に17時間撹拌後、混合物をK2限外過機に
通し、４℃で6.5時間、25,000rpm（流速165ml/min）で
遠心分離した。上澄液をチーズ布（Cheese cloth）を通
し傾潟して脂質様浮遊物質を除去し、不溶性ペレツトを
廃棄した。
37％エタノール沈殿物と粗生成物ペーストの収集 23％エタノール可溶性上澄液に、撹拌しながら30分間
に亘り95％エタノール4.33を滴下して、37％エタノー
ルとした。次いで、完全な沈殿物を得るために、撹拌し
ながら混合物を１時間放置し、しかる後撹拌せずに14時
間放置した。得られた混合物を次いで、４インチ・シヤ
ープレスユニツトを用いて15,000rpm（流速0.2/min）
で遠心分離し、ペレツト状粗多糖を集めた。
摩 砕 遠心分離されたペレツトを無水アルコール１含有約
3.8（１ガロン）ワーリングブレンダー（Waring Blen
der）に移し、最高速度で30秒間混合した。混合は、固
い白色粉末が得られるまで、30秒間作動・30秒間休止を
継続した。テフロンフイルター板を備えたブツフネル漏
斗にて粉末を集め、その場で、無水エタノール１で二
回、更にアセトン２で二回連続的に洗浄した。この物
質を次いで、４℃で24時間真空乾燥し、生成物68g（乾
燥重量）を得た。
フエノール抽出 摩砕工程で得た乾燥物質68gを、デイマツクス分散器
を用い、pH6.9の0.488M酢酸ナトリウム12に再懸濁し
た。酢酸ナトリウム溶液を、下記のようにして調製され
る新しいフエノール水溶液4.48で直ちに抽出した:20
加圧容器内で、pH6.9の0.488M酢酸ナトリウム900mlを
約2Kg（５ポンド）容器のフエノール〔マリンクロツド
（Mallinckrodt）結晶〕に加え、完全な溶液が得られる
まで混合した。各フエノール抽出液を、乳濁液の分離の
ために、K2超遠心機（エレクトロヌクレオニクス）にて
４℃で2.5時間30,000rpmで遠心分離した。水性溶出液を
新たなフエノール水溶液3.2で同様の方法にて更に三
回抽出した。フエノール相は廃棄した。
透析過 上記フエノール抽出液からの水相（17.6）を冷ガラ
ス蒸留水300で希釈し、３つのH10P10カートリツジを
使用したアミコンDC−30限外過装置で４℃にて透析
過した。アミコンユニツトを洗浄し、最終容量が17.5
となるようにこの洗浄液を残留液に加えた。限外過液
は廃棄した。
67％エタノール沈殿物 2.0MCaCl2 0.438を前工程からの透析液17.5に加
え（最終CaCl2濃度は0.05M）、激しく撹拌しているこの
溶液に95％エタノール35.88を１時間に亘り滴下し
て、溶液を67％エタノールとした。４時間撹拌し、次い
で４℃で更に12時間放置した後、透明な上澄液をサイフ
オン式に除去し、沈殿物を４インチ・シヤープレス遠心
機（15,000rpm）にて４℃で45分間遠心分離することに
より集めた。得られた多糖ペレツトを、約3.8（１ガ
ロン）のワーニングブレンダー中、30秒間作動・30秒間
休止法にて、無水エタノール２を用いて摩砕し、テフ
ロンフイルター板を備えたブツフネル漏斗上に集め、そ
の場で、無水エタノール１で四回続いてアセトン１
で二回洗浄した。試料を、次いで４℃で20時間、風袋を
はかつた皿の中で真空乾燥した。収量は、乾燥粉末とし
て39gであつた。
20％エタノールの超遠心分離及び最終生成物の収集 上記乾燥粉末39gを蒸留水15.21に溶解し、この溶液
に0.05MCaCl2・2H2Oの0.39を加えて、0.05MCaCl2であ
り且つ総容量を15.6（2.5mg多糖/ml）とした。この混
合物に30分間に亘つて95％エタノール4.93を滴下し、
この混合物を24％エタノールとした。この混合物を、K3
チタニウムボール（bowl）及びK11ノリル（Noryl）コア
を備えたK2超遠心機（30,000rpm及び100ml/min）にて４
℃で3.5時間遠心分離することにより、直ちに清澄化し
た。ペレツトを廃棄し、透明な上澄液（容量19.8）
を、30分間に亘り撹拌しながら95％エタノール4.23を
加えて37％エタノールとした。更に30分間撹拌した後、
混合物を撹拌せずに４℃で17時間放置し、次いで15,000
rpmで４インチ・シヤープレス遠心機に通して集めた（4
5分間を要する）。
得られたペーストを無水エタノール２が入れられた
約3.8（１ガロン）のワーニングブレンダーに移し、
固い白色粉末が形成されるまで最高速度で、30秒間作動
・30秒間休止サイクルを４又は５回繰返して混合した。
この粉末を、ジテツクス（Zitex）テフロン板を備えた
ブツフネル漏斗上に集め、その場で新しい無水エタノー
ル５で二回、無水エタノール１で一回、続いてアセ
トン１で二回連続的に洗浄した。生成物を漏斗から取
り除き、４℃で（25.5時間の間）真空乾燥するために風
袋をはかつた更に移した。生成物の最終収量は37gの乾
燥重量であり、その性状は下記のとおりである： 以下の方法が分析を実施するために用いられた。
1.水分−パーキン−エルマー・サーモバランスTSG−１
（Perkin−Elmer thermobalance TSG−１）を用いた標
準熱重量分析（100℃までの重量損失） 2.蛋白質−ローリー（Lowry）法；ローリー（Lowry）
ら、ジエイ・バイオル・ケム、193巻、265頁、1951年
〔Lowry et al.,J.Biol.Chem.,193:265（1951）〕 3.核酸−UV法；ワールブルグ及びクリスチヤン、バイオ
ケム・ゼツト、310巻、384頁、1942年〔Warburg and Ch
ristian,Biochem Z.,310:384（1942）〕 4.リボース−ビアル（Bial）法；デイツシエ及びシユワ
ルツ、ミクロキム・アクタ、２巻、13頁、1937年〔Disc
he and Schwartz,Mickorochim Acta ２:13（1937）〕 5.リン−モリブデート法；チエンら、アナル・ケム、28
巻、1756頁、1956年〔Chen et al.,Anal.Chem.28:1756
（1956）〕 6.KD−屈折率を利用したセフアロース4Bによる測定 多糖を下記の寒天ゲル拡散により更に同定した：寒天
上での二重拡散（Quchterlony）は、ハイランド（Hylan
d）Ｄ型プレートを用いて実施された。H.インフルエン
ザのロス（Ross）768株に対して調製された抗血清を中
心ウエル（well）に採取し、一方濃度が50、25、12.5、
6.2及び3.1μg/mlのそれぞれの多糖をサテライトウエル
に採取した。プレートを湿気室内で24時間、20〜25℃に
て培養した。多糖濃度50、25及び12.5μg/mlにおいて、
多糖と特定の抗血清との間に沈降バンドが観察された。
実施例２ ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria Meningitidi
s）B11血清型２膜蛋白質 A.発酵 1. ナイセリア・メニンギチジスB11族 ナイセリア・メニンギチジスの凍結乾燥培養菌〔ドク
ター・エム・アルテンシユタイン（Dr.M.Artenstei
n）、ウオルター・リード・アーミー・インステイテユ
ート・オブ・リサーチ（Walter Reed Army Institute o
f Research,WRAIR）、ワシントンD.C.より入手〕が入つ
た管を開き、コーゴン（Eugon）肉汁（BBL）を加えた、
培養菌をチヨコレート寒天プレート（BBL）上に線条に
接種し、37℃で５％CO2存在下36時間培養し、その後増
殖菌を10％スキムミルク培地（Difco）に移し、等分割
して、−70℃で凍結した。WRAIRからの特定の抗血清とD
ifcoにより得た典型的な血清とを用いた凝集反応によ
り、細菌を明確に同定した。
この第一継代培養菌をチヨコレート寒天プレート上に
線条に接種し、37℃で５％CO2存在下18時間培養し、そ
の後増殖菌を10％スキムミルク培地に移し、1mlに等分
割して、−70℃で凍結した。細菌は、WRAIRからの特定
の抗血清とDifcoにより得た典型的な血清とを用いた凝
集反応により明確に同定された。
第二継代からの培養菌が入つたバイアル（vial）を解
凍し、10個のコロンビア羊血液（Columbia Sheep Bloo
d）寒天プレート（CBAB−BBL）上に線条に接種した。プ
レートを37℃で５％CO2存在下18時間培養し、その後増
殖菌を10％スキムミルク培地100mlに移し、0.5mlに等分
割して、−70℃で凍結した。細菌は、特定の抗血清との
凝集反応糖発酵及びグラム染色により明確に同定され
た。
この継代からの培養菌が入つたバイアルを解凍し、ミ
ユラー−ヒントン肉汁（Mueller−Hinton Broth）で希
釈し、40個のミユラー−ヒントン寒天プレートに線条に
接種した。プレートを37℃で６％CO2存在下18時間培養
し、その後増殖菌を10％スキムミルク培地17mlに移し、
0.3mlに等分割して−70℃で凍結した。細菌は、グラム
染色、特定の抗血清との凝集反応及びオキシダーゼ試験
により明確に同定された。
2. 発酵及び細菌ペーストの収集 a.接種菌の増殖 上記（継代４）からのナイセリア・メ
ニンギチジスＢ属Ｂ−11の二つの0.5ml凍結バイアルか
ら接種菌が増殖した。４つのミユラー−ヒントン寒天ブ
レーク（Blake）瓶を接種し、約18時間後に移し変え、p
H7.29のゴツシユリツヒ（Gotschlich）酵母透析培地５
の接種菌として使用した。O.D.を660nmで0.065に調整
した（パーキン−エルマー）。細菌を、振盪機を用い、
37℃で５つの２エルレンマイヤーフラスコ（それぞれ
１の培地を含む；下記参照）内で増殖させた。O.D.を
45、75及び120分間隔で監視した。O.D.660が0.81（スペ
クトロニツク20）の約４の肉汁培地が得られた。
3mlの試料を、グラム染色;CBAB、ミユラー、ヒントン
及び酵母抽出デキストロースプレートへの分離線条接
種；並びに凝集検査のために取り出した。全ての反応が
満足すべきものであつた。
b.70の種発酵槽 約3600mlの種培養物を、完全産生培
地（下記参照）42.6が入つた無菌の70発酵槽に接種
するために用いた。
70の発酵条件は、5.5時間に亘り37℃で10/minの
空気導入下185rmpにて、pH7.0にpHを一定にコントロー
ルすることである。
培養物を、37℃で、ミユラー−ヒントン寒天プレー
ト、酵母抽出デキストロース及びウサギ血液寒天プレー
ト（メルク社製）上に接種し、Ｎ−メニンゲチジスＢ属
抗血清との凝集試験に供した。ミユラー−ヒントン寒天
プレート、酵母抽出デキストロースプレート及びウサギ
血液寒天プレートにおける増殖菌は正常であつて、凝集
反応は陽性であつた。このバツチについての最終O.D.は
5.5時間後に660μで0.840であつた。
c.800の産生発酵槽 約42.2の種培養物を用いて、568.2の完全産生培
地（下記参照）が入つた無菌の800発酵槽に接種し
た。バツチを、37℃で、60/minの空気導入下100rpmに
て、pH7.0にpHを一定にコントロールして培養した。
バツチを不活性化する前に、37℃で、ミユラー−ヒン
トン寒天プレート、酵母抽出デキストロースプレート及
びウサギ血液寒天プレート上に培養物を接種し、Ｎ・メ
ニンゲチジスＢ属抗血清との凝集試験に供した。ミユラ
ー−ヒントン寒天プレート、酵母抽出デキストロース及
びウサギ血清寒天プレートにおける増殖菌は正常であつ
て、凝集反応は陽性であつた。このバツチについて、最
終O.D.は接種13時間で2.24であつた。
3. 比濁計フラスコ並びに70及び800の発酵槽用の
完全培地 フラクシヨンＡ Ｌ−グルタミン酸 1.5 g/ NaCl 6.0 g/ 無水Na2HPO4 2.5 g/ NH4Cl 1.25g/ KCl 0.09g/ Ｌ−システインHCl 0.02g/ フラクシヨンＢ（ゴツシユリツヒの酵母透析液） Difco酵母抽出液128gを蒸留水6.4に溶解した。この
溶液を、３つのHIOSMカートリツジを備えた２つのアミ
コンDC−30中空繊維透析ユニツトで透析した。透析液、
MgSO4・7H2Oの384g及びデキストロースの3200gをこの透
析液に溶解し、総容量を蒸留水で15とした。pHをNaOH
で7.4に調整し、ミリポア（0.22μ）に通して過する
ことにより無菌化し、フラクシヨンＡが入つた発酵槽に
加えた。
比濁計フラスコ用：フラクシヨンＡの１及びフラクシ
ヨンＢの25mlを加え、pHをNaOHで7.0〜7.2に調整した。
70の発酵槽用：フラクシヨンＡの41.8及びフラクシ
ヨンＢの900mlを加え、pHをNaOHで7.0〜7.2に調整し
た。
800の発酵槽用：フラクシヨンＡの553及びフラクシ
ヨンＢの15.0を加え、pHをNaOHで7.0〜7.2に調整し
た。
d.採取及び不活性化 発酵が完結した後、フエノール（0.5％v/v最終濃度）
を各容器に加え、次いでこれに細胞肉汁を移した。培養
菌がもはや存在しなくなるまで（約24時間）物質を静か
に撹拌しなら室温で保持した。
e.遠心分離 ４℃にて約24時間経過した後、不活性化された培養液
614.4をシヤープレス遠心機によつて遠心分離した。
フエノール添加後の細胞ペースト重量は3.875Kgであつ
た。
B.単離 工程1. 細菌細胞の洗浄 各々の単離のために、上記0.5％フエノール不活性化
ペーストの200g等分割物を滅菌蒸留水800mlに懸濁し、
粒状懸濁液となるまで磁気的に撹拌した。懸濁した細胞
を20,000xgで60分間、５℃にてペレツト化した（ベツク
マン19Ti ローター、14,500rpm）。
工程2. 抽 出 この洗浄された細胞を、60秒間で３回に調節されたソ
ルボール（Sorvall）約1.8（２クオーツ）のオムニミ
キサー（omnimixer）にて、0.5％デオキシコール酸ナト
リウムを含有したpH8.5の0.1Mトリス（Tris）−0.01MED
TA緩衝液（TED緩衝液）2000ml中に懸濁した。56℃で振
盪液）2000ml中に懸濁した。56℃で振盪水浴中にて15分
間で抽出するために（加温）、均一な懸濁液を16個の50
0mlのエルレンマイヤーフラスコに移した。
抽出液を20,000xgで60分間、５℃にて遠心分離した
（ベツクマン19Tiローター、14.500rpm）。次いで粘稠
な上澄液を傾潟し（総容量1980ml）、４℃で貯蔵した。
抽出された細胞ペレツトを上記のようにTED緩衝液200
0mlに再懸濁した。懸濁液を56℃で15分間抽出し、上記
のように遠心分離した。上澄液を傾潟し（容量2100m
l）、４℃で貯蔵した。
工程3. 限外過による濃縮 工程２の抽出上澄液をプールした（総容量4005ml）。
プール液２を、２つの0.45μデユラポア（durapore）
膜〔1/2平方フイート（約15平方cm）の表面積〕を備え
たミリポア・ペリコンフイルター装置に装填された２
のニユーブランスウイツク（New Brunswick）発酵容器
の中に入れた。抽出上澄液を、90分間の濃縮操作中に亘
つて、発酵容器の内部で25℃に保持した。試料を約1.9K
g/cm2（27.5psi）の平均伝播膜圧（average transmembr
ane pressure）で10倍に濃縮した。
工程4. 血清型蛋白質の収集と洗浄 工程３からの残留物（205ml）を遠心分離し、160,000
xgで２時間、５℃にて血清型蛋白質をペレツト化した
（ベツクマン45Tiローター、37,000rpm）。上澄液を傾
瀉し廃棄した。蛋白質ペレツトの重量を測定し（8.12
g）、次いでこれをガラスロツドとドウアンス（Dounc
e）ホモゲナイザーにて、手作業でTED緩衝液（190ml緩
衝液;20ml/gペレツト）中に懸濁した。懸濁液を56℃で1
5分間（加温）振盪しながら500mlエルレンマイヤーフラ
スコ中で抽出した。懸濁液を160,000xgで２時間、５℃
にて遠心分離した（ベツクマン45Tiローター、37,000rp
m）。上澄液を傾瀉し、廃棄した（容量190ml）。ペレツ
トを上記のようにTED緩衝液190mlで二回洗浄した。
工程5. 生成物の回収 工程４の洗浄された蛋白質ペレツトをガラスロツドと
ドウアンス・ホモゲナイザーにて蒸留水100mlに懸濁
し、完全な懸濁液を得た。17.0mg/mlのローリー蛋白質
価がこの懸濁液について得られた。この時点において、
懸濁液200mgを実験的使用のために保存した。残つた懸
濁液（91ml）をガラス蒸留水102.4mlにて8.0mg/mlに希
釈した。水性懸濁液を12,000xgで15分間遠心分離し、そ
れを凝集物から清澄化した（ベツクマン45Tiローター、
10,000rpm）。
上澄の生成物を、軟かな凝集ペレツトから分けるため
に、ピレツトで注意深く回収した。生成物をラベルし
（容量182.5ml）、一部を無菌性と発熱物質について分
析した（無菌生成物；無発熱物質）。生成物を、分析的
に特徴付けられ複合化（conjugation）に使用されるま
で、無菌原料として４℃で貯蔵した。収量は、元の細胞
ペースト1gに対し9.5mgローリー蛋白質であつた。
以下の方法が分析を行なう上で使用された： 1. 蛋白質−実施例１と同様 2. 核酸−オルシノール（orcinol）反応〔ビアル（Bia
l）〕における呈色を観察したが、それが蛋白質度の％
として計算される1.8％RNAに相当した。DNAに関するジ
フエニルアミン試験では、原溶液中での蛋白質の％とし
て計算された0.6％DNA量を示した。
3. 中性糖−蛋白質の％として計算される中性糖の含有
量は、アンスロン比色試験にて判明した〔スコツト及び
メルビン、アナル・ケム、25巻、1656頁;1953年（Scott
and Meluin,Anal.Chem.25,1656（1953））〕。
4. シアル酸−シアル酸含有量は、レゾルシノール−HC
l法にて判明した〔スベンナーホルム、バイオケム・バ
イオフイズ・アクタ、24巻、604頁、1957年（Svennerho
lm,Biochem.Biophys.Acta.,24,604（1957））〕。
5. 分子量−SDAポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定できるようにメルカプトエタノール変性された蛋
白質の分子量（ネイチヤー、227巻、680頁、1970年（Na
ture 227,680（1970））、LKB出願番号306〕。
実施例３ Ｈ・インフルエンザｂ型多糖−Ｎ・メニンギチジスＢ血
清型外膜蛋白質結合体の製造 I. テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム型ダウエツクス
（Dowex）50×８（200−400メツシユ）の調製 新しいDowex 50×８（200−400メツシユ）強酸陽イオ
ン交換樹脂（バイオ−ラツド、Bio−Rad）360mlを無菌
クロマトグラフイー用カラムに充填し、無菌蒸留（sd）
水1500mlで洗浄し、sd水800mlに一夜浸漬した。樹脂
を、次いで、60:40のsd水：メタノール１、40:60のsd
水：メタノール１及びsd水１で連続的に洗浄した。
樹脂を、次いで3N塩酸650ml（200mlHCl、水で800mlに希
釈）に浸漬して滅菌した。この酸型樹脂を19.5時間熟成
し、しかる後、過剰の酸をH2Oで洗い流した。
このカラムに次いで水:40％水酸化テトラブチルアン
モニウムの1:1混合物700mlを加え、溶出液が塩基性（pH
〜10）となるまで樹脂に浸透させた。樹脂を水約２で
洗浄して過剰の塩基を除き、しかる後、無菌ジヤーに移
した。最終の溶出液は無菌で発熱物質もなかつた。
II. Ｈ・インフルエンザｂ型多糖（HIb）のテトラ−ｎ
−ブチルアンモニウム塩の調製 マグネチツクスターラーを備えた250mlの丸底フラス
コにHIb3.29g及び水84mlを入れた。混合物を20分間撹拌
し、次いで水15mlを追加した。撹拌を全てのHIbが溶解
するまで更に30分間続けた。次いで、HIb溶液を45mm×2
70mmカラム内のDowex50×８（200−400メツシユ、テト
ラブチルアンモニウム型）150mlに供した。水10mlにす
すぎ液として用いた。カラムの上部に水を加え、手動ポ
ンプにて加圧した〔ミレツクス（Millex）FG0.22μフイ
ルターを通過させる〕。
50mlの画分を無菌ナルゲン（Nalgene）遠心管（50m
l）に集め、各管について、無菌融点毛管を用いて約10
μ分をシリカゲルプレートに移し、有機物質を分析し
た。プレートにCeIV（SO4）2/H2SO4と溶液〔10％硫酸水
溶液中の１％CeIV（SO4）２〕を噴霧し、熱プレート上
で加熱し、“有機”分を黒点として検出した。管2,3,4
及び５からの総量190mlを無菌の250ml遠心管に集め、混
合し、しかる後６つの既知重量の（tared）250ml丸底フ
ラスコに等分割してArFの標識を付けた。分割液を試験
し、無菌で発熱物質のないことが判明した。
６つのフラスコ内容物をドライアイス−アセトンで凍
結し、２つの持運び可能な三ツ口真空多岐管に接続して
凍結乾燥した。真空多岐管を層流フード内に移し、フラ
スコを外して無菌紙袋で密封した。これらをデシケータ
ー内でP2O5により高真空下−20℃で貯蔵した。乾燥試料
は出発HIbと同様のKdを有していた。
III. 多糖−ブタンジアミン付加物（HIb−BuA2）の製
造 工程A:1,4−ブタンジアミン溶液の調製 1,4−ブタンジアミン二塩酸塩1.46gを100mlの丸底フ
ラスコに入れ、水58mlに溶解した。2.5NNaOH5.0mlを加
え、pH10.35に調整した。溶液を0.22μシブロン−ナル
ジ（Sybron−Nalge）フイルターに通して過し、保存
した。
工程B:HIbの活性化と1,4−ブタンジアミンとの反応 PRPのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩0.64gが入つ
た（II部で得た）フラスコＡに、マグネチツク撹拌棒と
ジメチルホルムアミド17.5mlとを入れた。混合物を室温
で25分間撹拌すると、ほとんど全ての物質が溶解したよ
うであつた。
カルボニルジイミダゾール80mgを無菌の6ml血清バイ
アル中に秤り取り、次いでDMF溶液へ一度に加えた。フ
ラスコに栓をつけ、溶液を室温で35分間撹拌した。この
間に、Ａで調製したブタンジアミン32mlをマグネチツク
撹拌棒が入つた100mlの丸底フラスコに入れ、氷浴上で
約５分間撹拌した。
35分間の撹拌時間終了後、DMF溶液をピペツトで冷1,4
−ブタンジアミン溶液に加えた。氷浴上での撹拌を15分
間続け、その後、氷浴を除いて更に17分間撹拌し続け
た。
工程C:透析及び凍結乾燥 溶液を、オートクレーブ化されたスペクトローパー
（Spectropor）２透析管〔シリンダー容積0.21ml/mm;17
インチ（約43mc）〕に移し、４℃の室温で透析した。ま
ず、溶液をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液８に対して５時
間透析し、次いで新しいリン酸緩衝液８に対し５時
間、しかる後11時間の二回透析した。最後に、溶液を水
18に対して６時間透析した。無菌性及び発熱物質の試
験用の一部を分取した後（結果：無菌で発熱物質はなか
つた）、透析液（約125ml）を２つの250mlの丸底フラス
コに分けた。これらのフラスコの内容物をドライアイス
−アセトンで凍結し、上記II部の方法によつて凍結乾燥
した。総量480mgが得られた。
フルオレサミン分析によるとNH2が468nmol/mgであつ
た。
IV. 多糖−ブタンジアミンブロモアセトアミド（HIb−
BuA2−BrAc）の製造 工程A:p−ニトロフエニルブロモアセテートの製造 ブロモ酢酸6.30g（45mmol）及びｐ−ニトロフエノー
ル6.25g（45mmol）を250mlの丸底フラスコに入れ、塩化
メチレン（CH2Cl2）50mlに溶解した。この溶液を氷浴上
で10分間撹拌し、次いでCH2Cl210mlに溶解されたジシク
ロヘキシルカルボジイミド10.3g（50mmol）をそれに加
えた。次いで、反応混合物を４℃で17.25時間撹拌し
た。
次に、沈殿したジシクロヘキシル尿素を過し、液
を濃縮して真空乾燥した。黄色残渣を１−クロロブタン
35mlに加え、次いで再結晶するとm.p.85〜87℃の生成物
6.5gが得られ、この生成物をシクロヘキサン100mlに加
え、しかる後再結晶するとm.p.86〜87℃のｐ−ニトロフ
エニルブロモアセテート4.59gが得られた。
計算値（C8H6NO4Br）： Ｃ、36.92;H、2.30;N、5.38;Br、30.77 実測値:C、37.66;H、2.48;N、5.28;Br、30.571 HNMRは一致した。
工程B:HIb−BuA2の反応 上記III部で得た（２つのフラスコからの）HIb−BuA2
380mgを、マグネチツク撹拌棒を備えた250mlの丸底フラ
スコ内のpH9.15の緩衝液37mlに溶解した。この溶液にア
セトニトリル9ml中の（上記工程Ａからの）ｐ−ニトロ
フエニルブロモアセテート346mgを加え、混合物を４℃
にて24時間撹拌し、次いで18インチ（約45cm）透析管
（スペクトローパー２、III部参照）に移した。しかる
後、この溶液を水18に対し5.25時間、続いて新しい水
18に対して17.25時間（いずれも４℃にて）透析し
た。
透析液100mlを、0.45μシブロン・ナルゲフイルター
及び0.20μフイルターに連続的に通過させて過した。
次いで、それを６つの100ml丸底フラスコに等量に分
け、しかる後凍結し、II部と同様に凍結乾燥した。総量
0.28gのHIb−BuA2−BrAcが得られた。フルオレサミン分
析によるとNH2が128mmol/mgであつて、その差からブロ
モアセチル基が340mmol/mgとなる。比濁計分析で出発多
糖と同様の抗原性が示された。
V. HIb−BuA2−BrAcと官能化Ｎ・メニンギチジス膜蛋
白質（NMP）との結合化 工程A:N−アセチルホモシステインチオラクトンによるN
MPの官能化 エチレンジアミン四酢酸42mg及びジチオスレイトール
8mgを含む6mlの血清バイアルに、pH11.3のホウ酸緩衝液
5mlを加えた。この溶液3.8mlを50mlの丸底フラスコに入
れ、ナイセリア・メニンギチジス外膜蛋白質（NMP）の
溶液11.5mlを加えた。得られた混合物のpHを2.5NNaOH40
〜50μにて11.39に調整した。フラスコをマツシユル
ーム型シーラムストツパーで栓をし、フアイヤーストー
ン（Firestone）バルブ（ACEガラス社製）を用いて空気
を窒素に置換した。Ｎ−アセチルホモシステインチオラ
クトン53mgを窒素ボツクス内で加え、得られた溶液をN2
雰囲気中、室温で16.7時間熟成した。次いで、この溶液
をセフアデツクス（Sephadex）G25（細粒）120mlが入つ
たカラムに供し、それを窒素ボツクス内で処理した。溶
出はpH8のリン酸緩衝液で行ない、5mlの画分を集め、エ
ルマン（Ellman）試験によつてチオールを分析した。低
分子量物質から高分子量（即ち、蛋白質）チオールのベ
ースライン分離を行なつた。
工程B:結合化 高分子量画分を集め、HIb−BuA2−BrAc（IV部）0.06g
が入つた50mlのフラスコの一つに加えた。この溶液をN2
ボツクス内で室温にて６時間熟成し、無菌スペクトロー
パー透析管に仕込み、４℃で水18に対し15時間、続い
て新しい水18に対して24時間透析した。
工程C:遠心分離 透析液（約32ml）をピペツトで２つのポリカーボネー
ト製遠心管に25mlと7mlとの画分に分けて移し、ベツク
マンTi60ローターにて、４℃で２時間、37,000rpm（10
0,000xg）で遠心分離した。上澄液を傾瀉し、ペレツト
を水約8mlとともにドウアンス（Dounce）ホモゲナイザ
ーに移し、均質化し、遠心管の一つに戻した。この管を
水で25mlに満たし、完全な再懸濁液とし、管を４℃で２
時間、37,000rpm（100,000xg）で再遠心分離した。第二
の上澄液を傾瀉し、ペレツトを水8mlとともにドウアン
スで均質化した。ホモゲネートを無菌の15mlナルジ遠心
管に移し、水で15mlにまで希釈した。
４℃で一夜熟成した後、少量の凝集物が現れた。これ
を臨床遠心機にて約2500rpmで短時間（５分間）回転さ
せて除去した。
上記の活性化、結合化及び遠心分離の操作を同様の方
法で二回繰返した。それらを、蛋白質、多糖含量、Ｓ−
カルボキシメチルホモシステイン（SCMHC）、リジン
比、無菌性及び発熱物質性について分析した。
全ての試料は無菌で発熱物質が存在していなかつた。
その他の結果を下記に掲載した。
複合体を特徴づける多糖／蛋白質比の一致は操作の再
現性を確約するものであり、Ｓ−カルボキシメチルホモ
システイン／リジン比は反応効率の指標であつて、０を
超える結果は共有結合的に変換された多糖類及び蛋白質
の間に共有結合が存在することを証明する。
臨床用ロツトとして供するために溶液を集め；ラクト
ースの存在下（多糖20μg/ml、ラクトース4mg/ml）で凍
結乾燥した。
実施例４ Ｎ−アセチルシステアミンに“キヤツプ化”されたＨ・
インフルエンザｂ型多糖−N.メニンギチジスＢ血清型外
膜蛋白質結合体の製造 官能化された多糖HIb−BuA2−BrAcの製造法は実施例
３（Ｉ〜IV部）と同様である。官能化されたNMPの製造
法は、実施例８のIV.A部（工程Ｂ（III）−NMP結合体の
製造）と同様である。
チオール化蛋白質（エルマン分析で5.6μmolのSH）4m
lが入つたフラスコにHIb−BuA2−BrAc（差から、ブロモ
アセチルが300nmolである）59mgを加えた。フラスコを
隔膜（septume）で密封し、脱気して空気を窒素で置換
し、溶液を18.5時間熟成した。水6mlを加え、溶液を10m
lのポリカーボネート製遠心管に移し、ベツクマン75Ti
ローターにおいて４℃で、43,000rpmにて２時間遠心分
離した。上澄を除去し、ペレツトをドウアンスホモゲイ
ナイザーによつて、Ｎ−アセチルシステアミン106mgを
含有したpH8の0.1Mリン酸緩衝液10mlに再懸濁し、溶液
を脱気して室温で19.5時間熟成した。
次いで、上記のように遠心分離した43,000rpm、４
℃、２時間、75Tiローター）。ペレツトを水9.7mlに
（ホモゲナイズせずに）懸濁し、上記と同様に再遠心分
離した。得られたペレツトをホモゲナイズしながら水25
mlに再懸濁し、次いで水で30mlに希釈し、“キヤツプ
化”生成物の水性懸濁液を得た。
複合体の分析結果は以下のとおりである： 多糖濃度 蛋白質濃度 HIb/蛋白質比 188μg/ml 1200μg/ml 0.157 （Spinco）:SCMHC/リジン＝0.096 Ｓ−カルボキシメチルシステアミン／リジン＝0.20 実施例５ H.インフルエンザｂ型多糖−Ｎ・メニンギチジスＢ血清
型外膜蛋白質結合体の動物における抗体応答試験 実施例３の操作で凍結乾燥して得られたH.インフルエ
ンザｂ型多糖−N.メニンギチジスＢ血清型外膜蛋白質結
合体を様々な年令のICR/Haマウス及び赤毛猿（Rhesus m
onkey）にて免疫原応答性に関し試験し、その結果を表
２及び３にまとめた。
結合体の分析結果は以下のとおりである： 多糖濃度 蛋白質濃度 Ps/蛋白質比 収率Ps 276μg/ml 2.38mg/ml 0.12 6.1％ 表２に示したように、H.インフルエンザｂ型多糖結合
体は様々な年令の赤毛猿においても高い免疫原応答性を
誘起した。
実施例６ 肺炎球菌19F型多糖とナイセリア・メニンギチジス外膜
蛋白質との結合体 I. 肺炎球菌19F型多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモニ
ウム塩の製造 マグネチツク撹拌装置を備えた25mlの丸底フラスコに
多糖19F型（メルク社製）50mg及びH2O 5mlを入れ、混
合物を20分間撹拌した。次いで、この溶液をダウエツク
ス50×８（200×400メツシユ、テトラブチルアンモニウ
ム型）が充填された3mlのカラムに供し、水で溶出し、2
5mlのエルレンマイヤーフラスコに集めた。
この溶液について、Ce IV（SO4）2/H2SO4溶液を噴霧
し次いで熱プレート上で加熱したシリカゲルプレートに
より多糖含有物を分析した。その結果、黒点として検出
可能な多糖が分取液中に含有されていたことが判明し
た。多糖19Fが含有溶液を凍結乾燥し52mgを回収した。
II. 肺炎球菌19F型テトラブチルアンモニウム塩のカル
ボニルジイミダゾールとの反応、及びその後の1,4−ブ
タンジアミンとの反応（19F−BuA2） 工程A:1,4−ブタンジアミン溶液の調製 1,4−ブタンジアミン二塩酸塩40mgをH2O 1.0mlに溶
解し、2.5NNaOHでpH9.15に調整した。
工程B:19F型多糖の活性化及び1,4−ブタンジアミンとの
反応 テトラブチルアンモニウム型の19F多糖20mgが入つた2
5mlの丸底フラスコに、マグネチツク撹拌棒とジメチル
スルホキシド（DMSO）4mlとを入れた。この混合物を室
温で20分間撹拌して、全ての物質を溶解した。カルボニ
ルジイミダゾール5mgを加え、反応系を室温で30分間撹
拌した。この間に工程Ａで得た1,4−ブタンジアミン溶
液を、マグネチツク撹拌棒を備えた25mlの丸底フラスコ
に加え、氷浴上で約５分間撹拌した。30分間撹拌した
後、DMSO溶液をピペツトで冷1,4−ブタンジアミン溶液
に加えた。氷浴上での撹拌を15分間続けた後、氷浴を除
いたが、更に15分間室温で撹拌を続けた。
工程C:透析及び凍結乾燥 次いで、溶液をスペクトローパー２透析管に移し、４
℃の室内で撹拌しながら透析した。溶液をまず、pH7.0
の0.01Mリン酸緩衝液４に対して８時間透析し、しか
る後pH7.0の0.01Mリン酸緩衝液４に対して８時間透析
した。最後に、溶液を水４に対し６時間透析した。溶
液を次いで凍結乾燥し、19F型多糖のブタンジアミン誘
導体（19F−BuA2）19mgを回収した。フルオレサミン分
析では物質1mgについて100nmolのNH2が示された。
III. 19F−BuA2のｐ−ニトロフエニルブロモアセテー
トとの反応 工程A:19F−BuA2の反応 上記IIで得た19F−BuA215mgを、マグネチツク撹拌棒
を備えた25mlの丸底フラスコ内のpH9.15の緩衝液2mlに
懸濁し、全ての物質が溶解するまで10分間撹拌した。こ
の溶液に、アセトニトリル0.2mlに溶解されたｐ−ニト
ロフエニルブロモアセテート15mgを加えた。混合物を４
℃で24時間撹拌し、スペクトローパー２透析管に移し
た。これを水４に対して二回透析した。試料を凍結乾
燥し、19F−BuA2のＮ−ブロモアセチル化誘導体（19F−
BuA2−BrAc）9mgを得た。
フルオレサミン分析ではNH2は57nmol/mgであつて、そ
の差よりブロモアセチルが43nmol/mgとなる。
IV.ナイセリア・メニンギチジスの官能化された外膜蛋
白質（NMP）への19F−BuA2−BrAcの結合化 工程A:NMPのＮ−アセチルホモシステインチオクラクト
ンによる官能化 エチレンジアミン四酢酸43mg及びジチオスレイトール
8mgをpH1 1.30の飽和ホウ酸緩衝液5mlに溶解した。上記
溶液0.4mlを15mlの遠心管に入れ、ナイセリア・メニン
ギチジス外膜蛋白質（NMP）の溶液1ml（13.7mg）を加え
た。この溶液を脱気し、室温で16時間N2雰囲気下におい
た。次いでこの溶液に、pH8.0のリン酸緩衝液1.1mlを加
えて総容量2.5mlに希釈した。次いで、この溶液をN2下
でpH8.0のリン酸緩衝液により予め平衡化されたPD10カ
ラム（セフアデツクスG25M）に供した。試料をpH8.0の
リン酸緩衝液3.5mlで溶出した。チオール含量をエルマ
ン分析にて測定すると、1.89μmol/試料であつた。試料
2.5mlをpH8.0のリン酸緩衝液で予め平衡化された第二の
PD10カラムに供した。それをpH8.0のリン酸緩衝液3.5ml
で溶出した。エルマン分析によるチオール含量は0.44μ
mol/試料であつた。
工程B:結合化 蛋白質溶液が入つた15mlのパイレツクス（pyrex）遠
心管に、上記IIIからの19F−BuA2−BrAc9mgを入れた。
この溶液をN2グローブボツクス内で室温にて６時間熟成
した。次いで、それをスペクトローパー２透析管に供
し、４℃でH2O ４に対し８時間、続いて再びH2O ４
に対して８時間透析した。一部をアミノ酸分析用に凍
結乾燥した。
実測値： リジン0.141μmol/mg SCMHC 0.0062μmol/mg（この０を超える値は共有結合
性を示す） 工程C:遠心分離 透析液（約10ml）をピペツトでポリカーボネート製遠
心管に移し、４℃で２時間、ベツクマンTi60ローターに
よつて37,000rpm（100,000xg）で遠心分離した。上澄を
傾瀉し、ペレツトをH2O 約2mlとともにホモゲナイザー
に移し、そこでホモゲナイズして、遠心管の一つに戻し
た。これをH2Oで10mlにまで満たし、４℃にて２時間、3
7,000rpm（100,000xg）で遠心分離した。第二の上澄を
傾瀉し、ペレツトをH2O 8mlとともにホモゲナイズし
た。ホモゲネートをプラスチツク製の15ml遠心管にて貯
蔵し、免疫原性について試験した。
表６−１に示したように、結合体は高い免疫原性を有
していることが証明された。
実施例７ 肺炎球菌19F型多糖と三回精製された大麻種子グロブリ
ン（エデスチン）との結合体 I.肺炎球菌19F型多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム塩の調整 マグネチツク撹拌棒を備えた50mlの丸底フラスコに多
糖19F型（メルク社製）105mg及び水6mlを入れた。混合
物を20分間撹拌し、溶液をダウエツクス50×８（200〜4
00メツシユ、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム型）が充
填された6mlのカラムに供した。カラムを水で溶出し、
溶出液を50mlのエルレンマイヤーフラスコに集めた。溶
出液について、Ce IV（SO4）2/H2SO4溶液を噴霧し、次
いで熱プレート上で加熱して、シリカゲルプレートによ
り多糖成分を分析した。多糖を含有する分取液は黒点と
して検出された。多糖19F含有溶液を凍結乾燥し、19Fの
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩112mgを回収した。
II.多糖19F型のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩のカ
ルボニルジイミダゾールとの反応、及びそれに続く1,4
−ブタンジアミンとの反応 工程A:1,4−ブタンジアミン溶液の調整 1,4−ブタンジアミン二塩酸塩175mgをH2O7mlに溶解
し、2.5NNaOHでpH9.5に調整した。
工程B:19F型多糖の活性化および1,4−ブタンジアミンと
の反応 テトラブチルアンモニウム型の19F型多糖112mgが入つ
た50mlの丸底フラスコにマグネチツク撹拌棒とジメチル
スルホキシド（DMSO）5mlとを加えた。混合物を室温で1
0分間撹拌し、全ての物質を溶解させた。カルボニルジ
イミダゾール13mgを加え、反応系を35分間室温で撹拌し
た。この間に、上記工程Ａで得た1,4−ブタンジアミン
溶液を、マグネチツク撹拌棒が備えられ、かつ氷浴中に
おかれた50mlの丸底フラスコに入れ、溶液を約５分間撹
拌した。35分間撹拌した後、DMSO溶液をピペツトで冷1,
4−ブタンジアミン溶液に加えた。撹拌を15分間続け、
しかる後氷浴を除いて、更に15分間室温で溶液の撹拌を
再開した。
工程C:透析と凍結乾燥 次いで、溶液を４℃にて撹拌しながらスペクトローパ
ー２透析管で透析した。まず、溶液をpH7.0の0.01Mリン
酸緩衝液４に対して８時間透析し、しかる後、pH7.0
の0.01Mリン酸緩衝液４に対し８時間透析した。最後
に、溶液を水４に対して４時間透析した。溶液を次い
で凍結乾燥し、19F型多糖のブタンジアミン誘導体（19F
−BuA2）80mgを回収した。フルオレサミン分析によると
NH2が77nmol/mgであつた。
III.19FBuA2のｐ−ニトロフエニルブロモアセテートと
の反応 工程A:19F−BuA2の反応 上記II部で得た19F−BuA250mgを、マグネチツク撹拌
棒を備えた25mlの丸底フラスコ内のpH9.15の緩衝液4ml
に懸濁し、全ての物質が溶解するまで10分間撹拌した。
この溶液に、アセトニトリル0.5mlに溶解されたｎ−ニ
トロフエニルブロモアセテート50mgを加えた。混合物を
４℃で24時間撹拌し、しかる後スペクトローパー２透析
管に移した。これを水４に対して二回透析した。試料
を次いで凍結乾燥し、19F−BuA2のＮ−ブロムアセチル
誘導体（19F−BuA2−BrAc）44mgを得た。フルオレサミ
ン分析ではNH2が7.5nmol/mgであり、その差からブロム
アセチル基が69.5nmol/mgとなる。
IV.19F−BuA2の官能化され精製された大麻種子グロブリ
ン（エデスチン）への結合化 工程A:高性能液体クロマトグラフイー（HPLC）によるエ
デスチンの精製 大麻種子から二回結晶化されたエデスチン（シグマ社
製）240mgをpH7.0の3Mグアニジン4mlに溶解した。試料
を激しく振盪し、メルカプトエタノール0.1mlを加え
た。振盪によつて、大量の泡を形成した。
試料を室温で１時間放置し、小型（table top）遠心
機で遠心分離して泡を除去し、ミレツクス（Millex）−
GV 0.22μフイルター（ミリポア）に通して過した。
次いで、試料の半分（2ml、120mg）を、次の条件：流速
1ml/min;λmax280nm;溶媒3Mグアニジン:UV範囲2.0;チヤ
ート速度0.25cm/minで準備サイズ（prep size）のTSK30
00モレキユラーシーブのカラムに注入した。
UVにより検出される適切な画分を集め、スペクトロー
パー２透析管によつて水30に対し16時間透析した。透
析中に3Mグアニジンを水で置換すると、精製されたエデ
スチンの沈殿物が生じた。
全ての試料を透析袋から遠心管に移し、小型遠心機で
５分間遠心分離した。精製されたエデスチンを含むペレ
ツトを集め、真空下P2O5で乾燥した。原試料の残りの半
分（2mg、120mg）を次いで注入し、同一の工程を繰返し
た。精製されたエデスチン110mgを単離した。精製され
たエデスチンを次いで3Mグアニジン2.0mlに溶解し、遠
心分離し、過し、更に二回同一の操作にて再度クロマ
トグラフイーに供した。三回の精製後、総量18mgが単離
されたが、これは分析用Ｂ TSK3000カラムでは単一の
ピークであつた。
工程B:三回精製されたエデスチンの官能化 エチレンジアミン四酢酸3mg及びメルカプトエタノー
ル５μを3Mグアニジン1ml中に入れた。この溶液に、
上記工程Ａで得た三回精製されたエデスチン14mgを加え
た。溶液のpHを2.5MNaOH20μで9.5に調整し、溶液を
脱気し、N2下においた。Ｎ−アセチルホモシステインチ
オラクトン13mgを窒素ボツクス内で加え、得られた溶液
をN2雰囲気下、室温で16時間熟成した。
次いで、溶液を3Mグアニジン1.4mlの添加により最終
容積2.5mlに希釈し、N2下3Mグアニジンの予め平衡化さ
れたPD10カラム（Sephadex G25M、フアルマシア社製）
に供した。試料を3Mグアニジン3.5mlに溶出した。チオ
ール含量をエルマン分析により測定すると、約4.38μmo
l/試料であることが判明した。試料2.5mlを、3Mグアニ
ジンで予め平衡化された第二のPD10カラムに供し、次い
で3Mグアニジン3.5mlで溶出した。エルマン分析による
チオール含量は3.24μmol/試料であつた。
工程C:結合化 エデスチン溶液が入つた遠心管に、ブロモアセチル化
された19F型多糖（19F−BuA2−BrAc）（III部）7mgを加
えた。この溶液をN2ボツクス内にて室温で６時間熟成し
た。次いで、スペクトローパー２透析管に供し、水４
に対して二回、それぞれ８時間透析した。全ての溶液を
凍結乾燥し、小量をアミノ酸分析に供した。
実測値：リジン 0.105μmol/mg SCMHC 0.003μmol/mg （変換された多糖類及び蛋白質の間の共有結合が証明さ
れた） 実施例８ ストレプトコツカス・アガラクテイア〔Streptococcus
agalactiae（ストレプトコツカスＢ型III）〕多糖−N.
メニンギチジスＢ血清型外膜蛋白質結合体の製造 I.工程Ｂ（III）のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
の調製 工程Ｂ（III）の多糖カルロ（Carlo）らの米国特許第
4,413,057号の方法により実質的に製造される〕100mgを
水4mlに溶解し、テトラブチルアンモニウム型のダウエ
ツクス50×８（200〜400メツシユ）陽イオン交換樹脂が
充填された7mlのカラムに供した。カラムを水で溶出
し、画分（3ml）の有機物質についてCe IV（SO4）2/H2S
O4法により調べた、適切な画分を凍結乾燥し、工程Ｂ
（III）の多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩100
mgを得た。
II.多糖−ブタンジアミン付加物（ストレプトコツカス
Ｂ型（III）−BuA2）の製造 ストレプトコツカス（Strep）Ｂ型（III）テトラブチ
ルアンモニウム塩50mgを乾燥ジメチルホルムアミド（DM
F）2.5mlに懸濁し、完全な溶液ができるまで10分間撹拌
した。次いで、1,1−カルボニルジイミダゾール5mgを一
度に加え、溶液を室温で35分間保存した。次いで、この
溶液を、pHが2.5NNaOHで10.3に調整されかつ氷浴上で冷
却された1,4−ブタンジアミン二塩酸塩80mgを含有する
溶液3mlに加えた。得られた混合物を氷浴上で15分間、
室温で更に15分間保存した。
次いで、混合物を、0.1Mリン酸緩衝液（pH7）４に
対し、それぞれ５時間、17時間及び７時間の三回透析し
た。水４に対する18時間の最終透析物を次いで凍結乾
燥すると、ストレプトコツカスＢ型（III）−ブタンジ
アミン付加物、即ちStrep B（III）−BuA2が32mg得られ
た。フルオレサミン分析ではNH2が212nmol/mgであつ
た。
III.多糖−ブタンジアミンブロムアセトアミド（Strep
B（III））−BuA2−BrAc）の製造 Strep B（III）−BuA2 26.8mgをpH9のホウ酸緩衝液2.
5mlに溶解し、アセトニトリル0.4ml中のｐ−ニトロフエ
ニル ブロモアセテート28mgをこの溶液に加えた。混合
物を４℃で23.5時間撹拌し、次いで４℃にて水30に対
し17時間、続いて水４に対して６時間透析した。凍結
乾燥すると、Strep B（III）−BuA2−BrAc 27mgが得ら
れた。フルオレサミン分析ではNH2が35nmol/mgであつ
て、その差よりブロモアセチルが177nmol/mgとなる。こ
の物質は比濁計によると充分に抗原性を有していた。
IV.Step B（III）−BuA2−BrAcの官能化されたN.メニン
ギチジス膜蛋白質（NMP）への複合化 A.NMPの官能化:NMP溶液10ml（5mg/ml）をポリカーボネ
ート製遠心管に供し、ベツクマン75Tiローターにて４℃
で２時間、43,000rpmで遠心分離した。上澄を除去し、
ペレツトをエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩33.6
mg及びジチオスレイトール6.4mgが含有されたpH11.3の
ホウ酸緩衝液4mlに再懸濁した。再懸濁液をドウアンス
ホモゲナイザーに入れた。混合物を遠心管に入れ、シー
ラムキヤツプで栓をし、脱気し、窒素置換し、これにＮ
−アセチルホモシステインチオクラクトン55mgを加え
た。得られた混合物をN2下で18時間室温にて熟成した。
次いで、1MKH2PO4 2.6ml及び0.1Mリン酸緩衝液2.6mlで
pH7.25に調整し（N2下）、混合物を（N2下で）遠心管に
移した。次いで、これを上記と同様に遠心分離した（２
時間、４℃、Ti 75ローター43,000rpm）。上澄を除去し
た後、ペレツトをpH8の0.1Mリン酸緩衝液10mlに（上記
と同様にドウアンスホモゲナイザーで）再懸濁した。こ
の懸濁液を（上記のように）再遠心分離し、続いてpH8
の緩衝液4mlにペレツトを再懸濁すると、チオール価が
総量で5.6μmolSHの溶液が得られた。対照実験により、
これが純粋にチオール化された蛋白質のみであつて、小
さな分子（例えば加水分解されたチオラクトン）が存在
していないことが明らかとなつた。
B.結合化及び精製：再懸濁されたペレツト4mlにStrep B
（III）−BuA2−BrAc 24mlを（N2下で）加え、この混合
物をN2下で室温にて18.75時間熟成した。混合物を10ml
のポリカーボネート製遠心管に移し、水を頂部に注い
だ。（上記のように）遠心分離した後、水10mlに（上記
のようにして）再懸濁し、（上記のように）再遠心分離
した。最終ペレツトを（上記のように）水15mlに再懸濁
したところ、懸濁液は2.7mg/mlの蛋白質含量と0.263mg/
mlの多糖含量とを有していた。
SCMHC/リジン比は0.044であつた。
実施例９ エシエリヒア・コリ（Escherichia Coli）K1莢膜多糖の
調製 接種及び増増殖 エシエリヒア・コリK1種の凍結乾燥バイアル〔ドクタ
ー・ジヨン・ロビンス（Dr.John Robbins）より入手、B
OB〕を解凍し、トリプチカーゼ−ハイソイ（hysoy）−
グルコース（THG）培地約1mlで希釈した。しかる後、一
つのトリプチカーゼ−大豆寒天斜面に発酵操作前の日に
線条に接種し、37℃で一夜培養し、斜面上の増殖菌を採
取し、THG培地１に懸濁した。
トリプチカーゼ−ハイソイ−グルコース（THG）培地
は、溶液A9.5を121℃で90分間オートクレーブにて処
理し、次いでそれを冷却し、別個に121℃で30分間オー
トクレーブで処理された溶液B500mlをそれに加えること
により調製される。
溶液Ａ a.トリプチカーゼ大豆肉汁（BBL） 300 g b.ハイソイ（シエフイールド） 100 g c.フエノール・レツド 90mg d.UCON LB−625泡止剤（ユニコンカーバイド社製） 10
ml e.蒸留水（全量9.5の溶液となる量） 溶液Ｂ a.デキストロース（無水） 50g b.蒸留水（全量500mlの溶液となる量） 発酵 寒天斜面から接種された増殖THG培地１を、２の
エルレンマイヤーフラスコ内で37℃にて200rpmで６時間
撹拌しながら増殖させた（この時、細胞の増殖が観察さ
れた）。次いで、この１を14のニユー・ブランスウ
イツク・サイエンテイフイツク（New Brunswick Scient
ific）発酵槽内のTHG培地10に接種し、空気流速を２
/minに、撹拌機を200rpmに調節した。pHを調整し、10
％NaOHで6.8〜7.4に６時間維持して、２つの同様なO.D.
値を観察した。
採取及び清澄化 次いで、上記の最終発酵肉汁を、ヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロミド（最終濃度0.3％w/v）が入つ
た５ガロン（約19）のプラスチツク製容器に加えた。
４℃で４時間、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブ
ロミドにより沈殿する多糖を析出させた後、肉汁を不活
性化するためにサンプリングし、確認後、実験室用シヤ
ープレス遠心機にて約30,000rpmで20分間遠心分離し、
上澄を廃棄した。細胞ペレツト（約66g）を、単離する
目的で保存した。
懸濁及び抽出 ３つの発酵バツチからの３つのペレツトをそれぞれ1.
0MCaCl2 400mlに懸濁し、これらの懸濁液を、氷水浴に
入れられたオムニ（Omni）ミキサーで、２に調節して30
分間抽出し、一つに集めた。
汚染物を除去するための25％エタノール沈殿 無水エタノール373mlを、前工程のCaCl2懸濁液1130ml
に撹拌しながら滴下し（25％エタノール濃度となる）、
混合物を４℃で一夜放置した。得られた沈殿物をベツク
マンＪ−21B遠心機にて４℃で30分間11,000xgで遠心分
離することにより分離し、廃棄した。
粗多糖を回収するための75％エタノール沈殿 無水エタノール2560mlを、前沈殿工程からの透明な上
澄液1280mlに撹拌しながら滴下し（75％最終濃度）、混
合物を４℃で一夜放置して粗多糖の完全な沈殿を得た。
粗多糖の回収 不溶性沈殿物を、ベツクマン−21Bユニツトにて４℃
で30分間11,000xGで遠心分離することにより回収し、無
水エタノール約200mlで一回、アセトン約200mlで一回洗
浄し、再洗浄液を廃棄した。不溶性生成物を次いで無水
CaCl2にて４℃で真空乾燥した（収量4.6g）。
フエノール抽出及び透析 粗多糖4.6gを、ドウアンスホモゲナイザーを用いて、
pH6.9の0.488M酢酸ナトリウム400mlに懸濁し（濃度11.5
mg/ml）、この溶液を、pH6.9の0.488酢酸ナトリウム180
mlを完全な溶液が得られるまで約0.5Kg（１ポンド）瓶
のマリンクロツツ（Mallincrodt）結晶フエノールに加
えて調製されたフエノール水溶液200mlでそれぞれ三回
抽出した。各フエノール抽出液を次いで11,000xGで30分
間、４℃にて遠心分力して乳濁を破壊し、水相を吸引
し、プールし、抽出してフエノール相を廃棄した。
プールされた水相を、最終透析比が1:100,000以上と
なるようにガラス蒸留水を代えながら４℃で24時間透析
した。
多糖を回収するための75％エタノール沈殿 2MCaCl2 7.6mlを上記工程の透析液305mlに加えて、最
終濃度0.05MCaCl2とし、無水エタノール938mlを急速に
撹拌した溶液に滴下した（75％エタノール濃度）。４℃
で一夜放置した後、得られた沈殿物を、ベツクマンユニ
ツトにて30分間、11,000xGで４℃にて遠心分離すること
により集め、しかる後、無水エタノール約200mlで一
回、アセトン約200mlで一回洗浄し、無水CaCl2で４℃に
て真空乾燥した（収量1.7g）。
超遠心分離 多糖1.7gを0.05MCaCl2 170mlに再懸濁し、無水エタノ
ール18.9mlを撹拌しながら滴下し、溶液を４℃にて２時
間、100,000xGで遠心分離した。
生成物の回収 得られた透明な上澄液180mlを傾瀉して除去し、多糖
が沈殿するようにエタノール468mlを撹拌しながら滴下
した（75％エタノール濃度まで）。混合物を４℃で一夜
放置して完全に沈殿させ、生成物を11,000xgで30分間、
４℃にて遠心分離することにより集め、無水エタノール
200mlで一回、アセトン200mlで一回洗浄し、無水CaCl2
にて４℃で真空乾燥した（収量1.46g）。
超遠心分離 多糖1.46gを0.05MCaCl2 150mlで再懸濁し、無水エタ
ノール50mlを急速に撹拌している溶液に滴下し（25％濃
度まで）、溶液を100,000xG、４℃で２時間超遠心分離
した。
最終生成物の回収 得られた透明な上澄液190mlを傾瀉してペレツトから
除去し、エタノール190mlを撹拌しながら滴下した（50
％濃度まで）。混合物を４℃で二日間放置して完全に沈
殿させ、最終生成物をベツクマンＪ−21B遠心機にて、1
1,000xGで30分間、４℃で遠心分離することにより回収
した。最後に、生成物をエタノール約200mlで一回、ア
セトン約200mlで一回洗浄し、無水CaCl2にて４℃で真空
乾燥した（収量1.2g）。
実施例10 E.コリK1莢膜多糖−N.メニンギチジスＢ血清型外膜蛋白
質結合体の製造 I.E.コリK1多糖のテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム塩の
調製 E.コリK1多糖（実施例９の方法により得た）103mgを
水2mlに溶解し、溶液をダウエツクス50×８（200〜400
メツシユ、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム型）が充填
された4mlのカラムに供した。カラムを水で溶出し、画
分（3ml）の有機物質についてCe IV（SO4）2/H2SO4法に
より調べた。適切な画分を凍結乾燥し、生成物をデシケ
ーター中P2O5で乾燥するとテトラブチルアンモニウム塩
134mgが得られ、同様の先の製剤を1HNMRにより分析する
と、おおよそ化学量論量のテトラ−ｎ−ブチルアンモニ
ウムイオンを有していた。
II.多糖−ブタンジアミン付加物（E.コリK1−BuA2）の
製造 Ｉで得た塩134mgを無水かつ脱気されたジメチルホル
ムアミド3mlに溶解し、12分間撹拌した。次いで、1,1−
カルボニルジイミダゾール12.7mgを一度に加え、溶液を
30分間撹拌した。しかる後、2.5NNaOHでpHが10.35に調
整された1,4−ブタンジアミン二塩酸塩145mgを含有する
氷冷水溶液6mlにこの溶液を加えた。この溶液を氷浴上
で15分間、室温で20分間撹拌した。次いで、それを、0.
1Mリン酸緩衝液（pH7）４に対して、それぞれ5.5時
間、16時間及び3.75時間の三回透析した。水４に対す
る最終透析を4.5時間行なつた。凍結乾燥すると、73mg
のE.コリK1−BuA2が得られた。フルオレサミン分析では
NH2が180nmol/mgであつた。
III.多糖−ブタンジアミン−ブロムアセトアミド（E.コ
リK1−BuA2−BrAc）の製造 E.コリK1−BuA2 68mgをpH9のホウ酸緩衝液6.7mlに溶
解し、アセトニトリル1.5mlの中のｐ−ニトロフエニル
ブロモアセテートを加えた。混合物を４℃で19時間保存
し、次いで水32及び水４に対してそれぞれ８時間及
び13時間透析した。溶液を凍結乾燥すると74mgのE.コリ
K1−BuA2−BrAcが得られた。フルオレサミン分析ではNH
2が50nmol/mgであり、その差からブロモアセチルが120n
mol/mgとなる。
IV.E.コリK1−BuA2−BrAcの官能化されたN.メニンギチ
ジス膜蛋白質（NMP）への複合化 官能化されたNMPの製造法は実施例８のIV−Ａと同様
である。チオール化されたNMP蛋白質（エルマル分析で
は９μモルSH）4mlが入つた遠心管にE.コリK1−BuA2−B
rAc（120nmolブロモアセチル/mg）25mgを加えた。管を
シーラムキヤツプで密封し、脱気、窒素置換して、18.5
時間熟成した。それを次いでpH8の緩衝液6mlで希釈し、
Ti 75ローターにて４℃、43,000rpmで２時間遠心分離
した。上澄を除去し、ペレツトをドウアンスホモゲナイ
ザーでpH8の緩衝液10mlに再懸濁し、次いで上記のよう
に再遠心分離した。この第二の遠心分離によるペレツト
を水10mlに懸濁し、上記のように三回目の遠心分離を行
なつた。ペレツトを次いで水20mlに再懸濁した。
結合体の分析結果は下記のとおりである： 多糖濃度 蛋白質濃度 Ps/蛋白質比 336μg/ml 1000μg/ml 0.34 SCMHC/リジン:0.015
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ａ６１Ｋ 39/385 39:102 39:09 39:095 39:108） (72)発明者 リチヤード エル．トルマン アメリカ合衆国．07060 ニユージヤーシ イ．ウオーレン．アパー ウオーレン ウ エイ 29 (56)参考文献 特開 昭58−167519（ＪＰ，Ａ) Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．29 （1975），ＰＰ．87−102 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏ ｄｓ，Ｖｏｌ．15（1979），ＰＰ．323− 335 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．46 （1982），ＰＰ．333−342

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】チオエーテル結合を含む二価スペーサーを
    介して結合された、酸基含有細菌性多糖類及び免疫原性
    タンパク質からなる安定な、共有結合された多糖−タン
    パク質結合体であって、 該二価スペーサーが、式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり、ｍは０〜４、ｎは０〜３、Ｗは０又はNH、Ｙは
    CH2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC
    1若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、Ｙが０またはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝０、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである）であらわさ
    れ、 該酸基含有細菌性多糖は、ヘモフィラス・インフルエン
    ザ（heamophilus influenzae）ｂ型、並びにストレプト
    コッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）
    6B、19F及び23F型の細菌莢膜多糖類からなる群より選ば
    れ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパク質である、上記細菌感染
    症に対するワクチンとして使用できる共有結合された多
    糖−タンパク質結合体。
  2. 【請求項２】二価スペーサーが、式： によって表される特許請求の範囲第１項に記載の共有結
    合された多糖−タンパク質結合体。
  3. 【請求項３】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、ヘモフィ
    ラス・インフルエンザｂ型多糖であり、免疫原性タンパ
    ク質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タンパク質であり、さら
    に二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  4. 【請求項４】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、肺炎球菌
    6B型多糖であり、免疫原性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血清
    型の外膜タンパク質であり、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  5. 【請求項５】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、肺炎球菌
    19F型多糖であり、免疫原性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血
    清型の外膜タンパク質であり、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  6. 【請求項６】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、肺炎球菌
    23F型多糖であり、免疫原性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血
    清型の外膜タンパク質であり、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  7. 【請求項７】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、Ｂ群スト
    レプトコッカスI a、I b、II若しくはIII型多糖であ
    り、免疫原性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質であり、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  8. 【請求項８】酸基を有する細菌性莢膜多糖が、エシェリ
    チア・コリ（Escherichia coli）K1多糖であり、免疫原
    性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タンパク質であ
    り、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  9. 【請求項９】共有結合された多糖−タンパク質結合体の
    製造方法であって、 該結合体がチオエーテル結合を含む二価スペーサーを介
    して結合された、酸基含有細菌性多糖類及び免疫原性タ
    ンパク質からなる安定な、共有結合された多糖−タンパ
    ク質結合体であって、 該二価スペーサーが、式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり、ｍは０〜４、ｎは０〜３、Ｗは０又はNH、Ｙは
    CH2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC
    1若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、Ｙが０またはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝０、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである）であらわさ
    れ、 該酸基含有細菌性多糖は、ヘモフィラス・インフルエン
    ザｂ型、並びにストレプトコッカス・ニューモニア6B、
    19F及び23F型の細菌莢膜多糖類からなる群より選ばれ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパク質である、 上記細菌感染に対するワクチンとして用いられる多糖−
    タンパク質であり、該方法が （ａ）酸基を有する細菌性莢膜多糖を可溶化し、 （ｂ）多糖を二官能性試薬で活性化し； （ｃ）この活性化多糖を二求核剤と反応させ； （ｄ）二求核剤と反応させた活性化多糖を、求電子部位
    を生成する試薬と反応させて、ペンダント状求電子部位
    含有多糖を形成させ、 （ｅ）別個に、免疫原性タンパク質を、チオール基を生
    成する試薬と反応させて、ペンダント状チオール基含有
    タンパク質を形成させ、 （ｆ）ペンダント状チオール基を有するタンパク質から
    超遠心分離で低分子量チオール群を除去し； （ｇ）ペンダント状求電子部位含有多糖をペンダント状
    チオール基含有タンパク質と反応させて、チオエーテル
    共有結合を介して結合させた多糖−タンパク質結合を結
    合させ、次いで （ｈ）得られた混合物を遠心分離して、共有結合してい
    ない多糖及びタンパク質を除去する ことからなる共有結合された多糖−タンパク質結合体の
    製造方法。
  10. 【請求項１０】酸基を有する細菌性莢膜多糖類の可溶化
    が、 （ｉ）該多糖の酸基の水素原子を大疎水性陽イオンで置
    換することにより多糖の塩形を形成させ、次いで （ii）多糖の塩形を非水性で極性の非プロトン性溶媒に
    溶解させて可溶化する、特許請求の範囲第９項記載の製
    造方法。
  11. 【請求項１１】大疎水性陽イオンが、トリ−若しくはテ
    トラ（C1−C5）アルキルアンモニウム、１−アザビシク
    ロ［2,2,2］オクタン及び1,8−ジアザビシクロ［5,4,
    0］ウンデカン−７−エンからなる群から選ばれる特許
    請求の範囲第10項記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】非水性で極性の非プロトン性溶媒が、ジ
    メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチル
    アセトアミド、ホルムアミド及びN,N′−ジメチルイミ
    ダゾリジノンからなる群から選ばれる特許請求の範囲第
    10項に記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】大疎水性陽イオンがテトラ−ｎ−ブチル
    アンモニウム、非水性で極性の非プロトン性溶媒がジメ
    チルホルムアミドである特許請求の範囲第10項記載の製
    造方法。
  14. 【請求項１４】二官能性試薬が、炭酸誘導体 （式中、R2及びR3はそれぞれ独立してアゾリル、ハライ
    ド、又はフェニルエステルである）である特許請求の範
    囲第９項記載の製造方法。
  15. 【請求項１５】二官能性試薬がカルボニルジイミダゾー
    ルである特許請求の範囲第14項に記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】二求核剤が、式： H2N（CH2）mY（CH2）nNH2 （式中、ｍは０〜４、ｎは０〜３、ＹはCH2、Ｏ、Ｓ、N
    R′、CHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC1若しくはC2のア
    ルキルであり、ＹがCH2の場合はｍ及びｎがともに０で
    あってはならず、Ｙが０又はＳの場合はｍが１より大で
    ｎが１より大である）のジアミンである特許請求の範囲
    第９項記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】二求核剤が1,5−ブタンジアミンである
    特許請求の範囲第16項記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】求電子部位を生成する試薬が、 （式中、Ｘ′はニトロフェノキシ、ジニトロフェノキ
    シ、ペンタクロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキ
    シ、ハライド、０−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
    ル）又はアジドであり、ＲはＨ又はCH3であり、ＸはC
    l、BrまたはＩである）；あるいは活性化されたマレイ
    ミド酸 （式中、ｐは１〜３、Ｘ′は上記定義の通りである。） である特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  19. 【請求項１９】求電子部位を生成する試薬がブロム酢酸
    ｐ−ニトロフェニルである特許請求の範囲第18項に記載
    の製造方法。
  20. 【請求項２０】大疎水性陽イオンがテトラ−ｎ−ブチル
    アンモニウム、非水性で極性の非プロトン性溶媒がジメ
    チルホルムアミド、二官能性試薬がカルボニルジイミダ
    ゾール、二求核剤が1,4−ブタンジアミン、さらに求電
    子部位を生成する試薬ブロム酢酸エステルである特許請
    求の範囲第９項に記載の製造方法。
  21. 【請求項２１】チオール基を生成する試薬がＮ−アセチ
    ルホモシステインチオラクトンである特許請求の範囲第
    ９項又は第19項に記載の製造方法。
  22. 【請求項２２】多糖−タンパク質結合体を、該複合体に
    おける過剰の求電子活性を減少させるために、低分子量
    チオールと反応させる特許請求の範囲第９項に記載の製
    造方法。
  23. 【請求項２３】低分子量チオールがｎ−アセチルシステ
    アミンである特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  24. 【請求項２４】さらに、 （ａ）結合体を加水分解して、該結合体のペプチド結合
    及び他の加水分解に不安定な結合を開裂させた後、 （ｂ）加水分解に安定なチオエーテル含有スペーサーの
    アミノ酸を定量分析して共有結合の存在を確認すること
    を含む特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  25. 【請求項２５】菌血症から哺乳動物種を能動的に保護す
    るための組成物であって、チオエーテル結合を含むに二
    価スペーサーを介して結合された、酸基含有細菌性多糖
    類及び免疫原性タンパク質からなる安定な、共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体 ［該二価スペーサーが、式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり、ｍは０〜４、ｎは０〜３、Ｗは０又はNH、Ｙは
    CH2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC
    1若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、Ｙが０またはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝０、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである）であらわさ
    れ、 該酸基含有細菌性多糖は、ヘモフィラス・インフルエン
    ザｂ型、並びにストレプトコッカス・ニューモニア6B、
    19F及び23F型の細菌莢膜多糖類からなる群より選ばれ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパク質である］の免疫学的有
    効量並びに薬学上許容される担体からなる組成物。
  26. 【請求項２６】さらに、アジュバントを含有する特許請
    求の範囲第24項記載の組成物。
  27. 【請求項２７】多糖−タンパク質結合体が、式 の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質に結合されたヘモフィラス・インフルエンザｂ型
    多糖； 式 の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質に結合された肺炎球菌6B型多糖； 式 の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質に結合された肺炎球菌19F型多糖；及び 式 の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質に結合された肺炎球菌23F型多糖； からなる群のうちの一以上の成分よりなる特許請求の範
    囲第25項又は第26項記載の組成物。
  28. 【請求項２８】免疫学的有効量が、組成物中の各結合体
    が結合多糖として２−50μｇの多糖を含んでいるもので
    ある特許請求の範囲第27項に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】哺乳動物種がヒトである特許請求の範囲
    第27項記載の組成物。
  30. 【請求項３０】免疫学的有効量が、組成物中において、
    肺炎球菌多糖類の結合体を結合多糖として25μｇ、並び
    にヘモフィラス・インフルエンザｂ型多糖の結合体を結
    合多糖として10μｇを含んでいるものである特許請求の
    範囲第28項に記載の組成物。
JP60098129A 1984-05-10 1985-05-10 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 Expired - Lifetime JPH0825899B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60873884A 1984-05-10 1984-05-10
US608738 1984-05-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS60248622A JPS60248622A (ja) 1985-12-09
JPH0825899B2 true JPH0825899B2 (ja) 1996-03-13

Family

ID=24437774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60098129A Expired - Lifetime JPH0825899B2 (ja) 1984-05-10 1985-05-10 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物

Country Status (19)

Country Link
US (1) US4695624A (ja)
EP (1) EP0161188B1 (ja)
JP (1) JPH0825899B2 (ja)
KR (1) KR910002553B1 (ja)
CN (1) CN1020733C (ja)
AT (1) ATE62255T1 (ja)
AU (1) AU589559B2 (ja)
CA (1) CA1259450A (ja)
CY (2) CY1765A (ja)
DE (1) DE3582356D1 (ja)
DK (2) DK171420B1 (ja)
ES (1) ES8700298A1 (ja)
GR (1) GR851120B (ja)
HK (1) HK18894A (ja)
IE (1) IE58088B1 (ja)
IL (1) IL75064A (ja)
NZ (1) NZ211953A (ja)
PT (1) PT80413B (ja)
ZA (1) ZA853505B (ja)

Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8304304A (nl) * 1983-12-14 1985-07-01 Landbouw Hogeschool Werkwijze voor het winnen van een gelvormend polysaccharide, het gewonnen gelvormende polysaccharide, het met behulp van een dergelijk polysaccharide gewonnen gel alsmede werkwijze ter bereiding van synthetische oligo- en polysacchariden.
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US4837003A (en) * 1984-09-13 1989-06-06 Mallinckrodt, Inc. Radiolabeled antibody fragments
US4659839A (en) * 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
NZ214503A (en) * 1984-12-20 1990-02-26 Merck & Co Inc Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates
US4851521A (en) * 1985-07-08 1989-07-25 Fidia, S.P.A. Esters of hyaluronic acid
US5202431A (en) * 1985-07-08 1993-04-13 Fidia, S.P.A. Partial esters of hyaluronic acid
US5283323A (en) * 1985-08-07 1994-02-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing immune response
DE3601136A1 (de) * 1986-01-16 1987-07-23 Max Planck Gesellschaft Hemmstoffe der reversen transkriptase fuer prophylaxe und therapie von retrovirus-infektionen in saeugetieren
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation
US5374426A (en) * 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
EP0267038A3 (en) * 1986-11-06 1989-07-12 The University Of British Columbia Anhydrous enhanced coupling
US5976839A (en) * 1987-03-13 1999-11-02 Bioenterprises Pty Limited Immunopotentiation through covalent linkage between immunogen and immunopotentiating molecules
US5002883A (en) * 1987-10-30 1991-03-26 Abbott Laboratories Covalent attachment of antibodies and antigens to solid phases using extended length heterobifunctional coupling agents
US4994385A (en) * 1987-10-30 1991-02-19 Abbott Laboratories Heterobifunctional coupling agents
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5204098A (en) * 1988-02-16 1993-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugates
US5010176A (en) * 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US7118757B1 (en) * 1988-12-19 2006-10-10 Wyeth Holdings Corporation Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US4963534A (en) * 1989-05-19 1990-10-16 Merck & Co., Inc. Process for solubilizing polyanoinic bacterial polysaccharides in aprotic solvents
US5045456A (en) * 1989-06-12 1991-09-03 Merck & Co., Inc. Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides
US5019502A (en) * 1989-06-12 1991-05-28 Merck & Company, Inc. Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides
US5039610A (en) * 1989-06-12 1991-08-13 Merck & Co., Inc. Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides
JPH04506662A (ja) * 1989-07-14 1992-11-19 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 接合体ワクチンのためのサイトカイニンおよびホルモンのキヤリヤー
EP0484403A4 (en) * 1989-07-27 1993-03-17 Univax Biologics Incorporated Lipid a analog/immunogenic carrier conjugates and the use thereof as vaccines
US6406696B1 (en) 1989-10-27 2002-06-18 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods of stimulating the immune system with anti-CD3 antibodies
EP0497883B1 (en) * 1989-10-27 1998-07-15 Arch Development Corporation Compositions and their use for promoting immunopotentiation
IT1237764B (it) * 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
DE69019164T2 (de) * 1989-12-14 1995-09-07 National Research Council Of Canada, Ottawa, Ontario Verbessertes meningokokkale polysaccharidkonjugatvakzin.
CA2047031A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-20 Stephen Marburg Peptide-polysaccharide-protein conjugate vaccines
IL98845A0 (en) * 1990-07-19 1992-07-15 Merck & Co Inc Coconjugate vaccines comprising immunogenic protein,hiv related peptides,and anionic moieties,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
IL99077A0 (en) * 1990-08-13 1992-07-15 Merck & Co Inc New embodiments of the hiv principal neutralizing determinant and pharmaceutical compositions containing them
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
EP0513332A4 (en) * 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
EP0630260B1 (en) * 1991-03-12 2001-01-24 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Polysaccharide-protein conjugates
AU668870B2 (en) * 1991-05-14 1996-05-23 Targetech, Inc Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
CA2070961C (en) * 1991-06-14 2004-12-07 Michael Chorev Thiol-reactive maleimido-based radiolabeling reagents
US5370872A (en) * 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
US5314811A (en) * 1992-07-13 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide
US5371197A (en) * 1991-09-24 1994-12-06 Merck & Co., Inc. Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
FR2682388B1 (fr) * 1991-10-10 1995-06-09 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal.
IT1262896B (it) * 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
US5463028A (en) * 1992-04-03 1995-10-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagents
US5470997A (en) * 1992-04-06 1995-11-28 Biosite Diagnostics Incorporated Amphetamine derivatives and protein and polypeptide amphetamine derivative conjugates and labels
US5331109A (en) * 1992-04-06 1994-07-19 Biosite Diagnostics Incorporated Phencyclidine derivatives and protein and polypeptide phencyclidine derivative conjugates and labels
AU3941893A (en) * 1992-04-06 1993-11-08 Biosite Diagnostics Incorporated Novel opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US5314822A (en) * 1992-10-15 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Method of clonal growth of Streptococcus pneumoniae
US5274122A (en) * 1992-10-15 1993-12-28 Merck & Co., Inc. Acidic derivatives of homocysteine thiolactone
US6037455A (en) * 1992-11-09 2000-03-14 Biosite Diagnostics Incorporated Propoxyphene derivatives and protein and polypeptide propoxyphene derivative conjugates and labels
US20030108548A1 (en) * 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5885573A (en) * 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6153406A (en) * 1993-07-23 2000-11-28 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5695768A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
US5780606A (en) * 1995-06-07 1998-07-14 Connaught Laboratories Limited Neisseria meningitidis capsular polysaccharide conjugates
US5866132A (en) * 1995-06-07 1999-02-02 Alberta Research Council Immunogenic oligosaccharide compositions
DK1082965T3 (da) 1995-06-23 2009-07-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Et vaccinepræparat der omfatter et polysaccharidkonjugatantigen adsorberet på aluminiumphosphat
DK0897427T3 (da) * 1996-02-14 2005-02-14 Merck & Co Inc Fremgangsmåde til fældning af polysaccharid
US6410025B1 (en) 1996-02-14 2002-06-25 Merck & Co., Inc. Polysaccharide precipitation process
US6309646B1 (en) 1996-05-09 2001-10-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates
US6267961B1 (en) 1996-11-22 2001-07-31 Baxter International Inc. Direct methods for molar-mass determination of fragments of Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharides and vaccine preparation
NZ331578A (en) * 1997-01-21 2000-05-26 Pasteur Merieux Serums Vacc Polysaccharide-peptide-conjugates
US6087328A (en) * 1997-04-24 2000-07-11 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Coupling of unmodified proteins to haloacyl or dihaloacyl derivatized polysaccharides for the preparation of protein-polysaccharide vaccines
EP1849860B1 (en) * 1997-05-28 2010-11-17 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Process for preparing an immunogenic factor of Corynebacterium diphtheriae using a culture medium with yeast extract as aminoacid source and no protein complexes of animal origin
US20040087020A1 (en) * 1997-05-28 2004-05-06 Chiron S.P.A. Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin
CN1272062A (zh) * 1997-07-17 2000-11-01 北美疫苗公司 含有b组脑膜炎球菌膜孔蛋白和流感嗜血菌多糖的免疫偶联物
US6224880B1 (en) 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
MXPA00003108A (es) * 1997-10-03 2001-07-01 Polisacaridos formadores de iminas, preparacion de los mismos y el uso como adyuvantes e inmunoestimulan
US6756361B1 (en) * 1997-10-14 2004-06-29 Nabi Enterococcus antigens and vaccines
GB9808932D0 (en) * 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
EP1073667A2 (en) 1998-04-28 2001-02-07 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US20030224011A1 (en) * 2001-05-29 2003-12-04 Conley Anthony J Hepatitis c virus conjugates
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
ATE419005T1 (de) * 2001-12-11 2009-01-15 Merck & Co Inc Staphylococcus aureus exopolysaccharid und verfahren
WO2004014417A2 (en) 2002-08-02 2004-02-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine compositions comprising l2 and/or l3 immunotype lipooligosaccharides from lgtb- neisseria minigitidis
DK1549338T3 (da) 2002-10-11 2011-03-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Polypeptidvacciner til bred beskyttelse mod hypervirulente meningokok-afstamningslinier
AU2003278166B2 (en) 2002-11-01 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
EP1587537B1 (en) 2003-01-30 2012-04-11 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
AU2004220549B2 (en) * 2003-03-07 2007-07-05 Instituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Influenza virus vaccine
GB0313916D0 (en) 2003-06-16 2003-07-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
EP1667712B1 (en) 2003-10-02 2010-07-21 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. B. pertussis antigens and use thereof in vaccination
CN103405761A (zh) 2003-10-02 2013-11-27 诺华疫苗和诊断有限公司 多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗
JP2007519746A (ja) * 2004-01-29 2007-07-19 バイオシネクサス インコーポレーティッド ワクチン調製におけるアミノ−オキシ官能基の使用
CN1946772B (zh) 2004-04-20 2013-01-02 德瑞迪克纳米科技公司 具有增强的扩增性和内部官能度的树枝状聚合物
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
ATE512670T1 (de) 2004-04-30 2011-07-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Meningokokken-konjugat-impfung
JP5069558B2 (ja) 2004-06-01 2012-11-07 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション ＨＩＶｇｐ４１融合中間物質の安定したペプチド模倣薬
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
MX2007010402A (es) 2005-04-20 2008-01-22 Dendritic Nanotechnologies Inc Polimeros dendriticos con amplificacion mejorada y funcionalidad interior.
US9931397B2 (en) 2005-06-27 2018-04-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
WO2007009064A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
KR20080028941A (ko) * 2005-07-19 2008-04-02 다우 글로벌 테크놀로지스 인크. 재조합 인플루엔자 백신
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
EP1973564B1 (en) 2005-12-22 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CN101024669B (zh) * 2006-02-17 2013-03-13 福州昌晖生物工程有限公司 一种可溶性的多糖-蛋白交联抗原的制备方法
EP2357001B1 (en) 2006-03-22 2018-03-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
EP2037961B1 (en) * 2006-06-14 2015-11-11 MacroGenics, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using monoclonal antibodies with reduced toxicity
US7491517B2 (en) * 2006-07-19 2009-02-17 Jeeri R Reddy Method of producing meningococcal meningitis vaccine for Neisseria meningitidis serotypes A,C,Y, and W-135
BRPI0716519A2 (pt) 2006-09-07 2013-10-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Método para fabricar uma vacina
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
KR20100017569A (ko) 2007-05-02 2010-02-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
US20100183662A1 (en) 2007-06-26 2010-07-22 Ralph Leon Biemans Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0713880D0 (en) * 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
RU2475496C2 (ru) 2008-02-21 2013-02-20 Новартис Аг МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHBP
US11065323B2 (en) 2008-10-27 2021-07-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purification method
NZ612315A (en) 2009-04-14 2014-10-31 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
US20120135037A1 (en) 2009-06-01 2012-05-31 Mizel Steven B Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
WO2011017101A2 (en) 2009-07-27 2011-02-10 Fina Biosolutions, Llc Method for producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
BR112012004275A2 (pt) 2009-08-27 2016-11-16 Novartis Ag polipeptídios híbridos incluindo sequências meningocócicas de fhbp
EP2475385A1 (en) 2009-09-10 2012-07-18 Novartis AG Combination vaccines against respiratory tract diseases
WO2011039631A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
GB0917647D0 (en) 2009-10-08 2009-11-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Expression system
MX2012004850A (es) 2009-10-27 2012-05-22 Novartis Ag Polipeptidos fhbp meningococicos modificados.
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
MX2012006961A (es) 2009-12-17 2012-10-03 Fina Biosolutions Llc Reactivos quimicos para la activacion de polisacaridos en la preparacion de vacunas conjugadas.
US9173954B2 (en) 2009-12-30 2015-11-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polysaccharide immunogens conjugated to E. coli carrier proteins
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
WO2011110636A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
US8383783B2 (en) 2010-04-23 2013-02-26 Serum Institute Of India, Ltd. Simple method for simultaneous removal of multiple impurities from culture supernatants to ultralow levels
US9057716B2 (en) 2010-09-04 2015-06-16 Novartis Ag Bactericidal antibody assays to assess immunogenicity and potency of meningococcal capsular saccharide vaccines
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
WO2012065034A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Enolase peptide conjugate vaccines against staphylococcus aureus
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
WO2012085668A2 (en) 2010-12-24 2012-06-28 Novartis Ag Compounds
GB201106225D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
JP6170932B2 (ja) 2011-11-07 2017-07-26 ノバルティス アーゲー ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含むキャリア分子
DK3269386T3 (da) 2011-12-06 2022-10-24 Valneva Austria Gmbh Aluminiumforbindelser til anvendelse inden for behandling og i vacciner
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
US20150132339A1 (en) 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EA201590427A1 (ru) 2012-10-02 2015-09-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Нелинейные сахаридные конъюгаты
CA2886938A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Non-cross-linked acellular pertussis antigens for use in combination vaccines
SG11201504258RA (en) 2012-11-30 2015-07-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Pseudomonas antigens and antigen combinations
CA2896157A1 (en) 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197
ES2670863T3 (es) 2013-02-01 2018-06-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Administración intradérmica de composiciones inmunológicas que comprenden agonistas del receptor de tipo Toll
BR112015021523A8 (pt) 2013-03-08 2021-06-29 Crucell Holland Bv composição de uma vacina contra a tosse convulsa acelular, e, usos da composição e de antígenos da bordetella pertussis
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
EP3443983B1 (en) * 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
KR20230035455A (ko) 2014-02-28 2023-03-13 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
US11191822B2 (en) 2016-06-22 2021-12-07 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3269385A1 (en) 2016-07-12 2018-01-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
LT3506935T (lt) 2016-09-02 2024-04-25 Sanofi Pasteur, Inc. Vakcina nuo neisseria meningitidis
EP3530285B1 (en) 2016-10-20 2023-08-09 KM Biologics Co., Ltd. METHOD FOR PRODUCING HIB CONJUGATE VACCINE USING PRP WITH
LOWERED MOLECULAR WEIGHT
EP3551668A1 (en) 2016-12-06 2019-10-16 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Purification process for capsular polysaccharide
CN110234658B (zh) 2017-01-31 2024-03-12 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof
US12018134B2 (en) 2018-07-19 2024-06-25 Glaxosmithkline Biological Sa Processes for preparing dried polysaccharides
EP3607967A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified meningococcal fhbp polypeptides
EP3894431A2 (en) 2018-12-12 2021-10-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Modified carrier proteins for o-linked glycosylation
CA3129425A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3757217A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for protein purification
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20220401544A1 (en) 2019-09-27 2022-12-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3799884A1 (en) 2019-10-01 2021-04-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic compositions
EP3900739A1 (en) 2020-04-21 2021-10-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein
EP3919076A1 (en) 2020-06-02 2021-12-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations
CA3185429A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using nanoparticle vaccine
CA3185639A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
GB202013262D0 (en) 2020-08-25 2020-10-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine Composition
WO2022101434A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial protein carriers and conjugation methods
CA3211240A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Meningococcal b recombinant vaccine
WO2023111826A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacterial immunization using qbeta hairpin nanoparticle constructs
WO2023200704A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Sanofi Pasteur Inc. Protein-saccharide conjugation with sodium cyanoborohydride
GB202208089D0 (en) 2022-06-01 2022-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
GB202208093D0 (en) 2022-06-01 2022-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
TW202423477A (zh) 2022-08-03 2024-06-16 美商賽諾菲巴斯德公司 針對腦膜炎奈瑟氏菌b的含佐劑免疫原性組成物
GB202215414D0 (en) 2022-10-18 2022-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
GB202302579D0 (en) 2023-02-23 2023-04-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4003792A (en) * 1967-07-01 1977-01-18 Miles Laboratories, Inc. Conjugates of acid polysaccharides and complex organic substances
US3856471A (en) * 1968-08-05 1974-12-24 Nasa Amino acid analysis
GB1316990A (en) * 1970-09-17 1973-05-16 Roche Products Ltd Imidazolyl derivatives
US4185090A (en) * 1972-02-02 1980-01-22 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
CA1023287A (en) * 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
SE431758B (sv) * 1977-03-04 1984-02-27 Pharmacia Fine Chemicals Ab Som tioleringsreagens eller berarmatris for enzymer anvendbart derivat av en sh-grupphaltig polymer
IT1107772B (it) * 1977-08-22 1985-11-25 Cancer Res Inst Royal Procedimento per la produzione di complessi macromolecolari prodotto ottenuto e composizioni farmaceutiche che lo contengono come ingrediente attivo
US4286964A (en) * 1979-10-12 1981-09-01 Seed Brian S Polyfunctional epoxides and halohydrins used as bridging groups to bind aromatic amine group-containing alcohols and thiols to hydroxyl bearing substrates
US4415665A (en) * 1980-12-12 1983-11-15 Pharmacia Fine Chemicals Ab Method of covalently binding biologically active organic substances to polymeric substances
US4379843A (en) * 1981-01-26 1983-04-12 Peter Cashion Immobilization of polynucleotides and polypeptides with tritylated polysaccharides
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4451446A (en) * 1982-03-04 1984-05-29 Smithkline-Rit Process for the preparation of polysaccharide-protein complexes from bacterial capsules, obtained products and immunogenic compositions containing them
JPS58167519A (ja) * 1982-03-30 1983-10-03 Teijin Ltd 細胞毒性複合体及びその製造法
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4459286A (en) * 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
IE940698L (en) * 1984-04-05 1985-10-05 Univ Missouri Vaccine and serum for endotoxin associated disease and method of preparing same as well as to methods of immunization and treatment of such disease and to a detoxified endotoxin and bacterial mutant
NZ214503A (en) * 1984-12-20 1990-02-26 Merck & Co Inc Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９（１９７５），ＰＰ．８７−１０２
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６（１９８２），ＰＰ．３３３−３４２
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１５（１９７９），ＰＰ．３２３−３３５

Also Published As

Publication number Publication date
NZ211953A (en) 1990-01-29
IL75064A (en) 1988-11-30
ES8700298A1 (es) 1986-10-16
DK205585A (da) 1985-11-11
PT80413A (en) 1985-06-01
US4695624A (en) 1987-09-22
ATE62255T1 (de) 1991-04-15
EP0161188A2 (en) 1985-11-13
ZA853505B (en) 1985-12-24
IE851134L (en) 1985-11-10
CN1020733C (zh) 1993-05-19
DK205585D0 (da) 1985-05-09
JPS60248622A (ja) 1985-12-09
KR910002553B1 (ko) 1991-04-24
DK171137B1 (da) 1996-06-24
PT80413B (en) 1987-04-16
IE58088B1 (en) 1993-06-30
CA1259450A (en) 1989-09-12
HK18894A (en) 1994-03-11
EP0161188A3 (en) 1987-07-22
KR850007982A (ko) 1985-12-11
EP0161188B1 (en) 1991-04-03
DK98595A (da) 1995-09-07
CY1765A (en) 1994-07-15
DE3582356D1 (de) 1991-05-08
AU589559B2 (en) 1989-10-19
CN85104164A (zh) 1987-02-04
CY98041I2 (en) 2010-07-28
GR851120B (ja) 1985-11-25
DK171420B1 (da) 1996-10-21
IL75064A0 (en) 1985-09-29
AU4221485A (en) 1985-11-14
ES542919A0 (es) 1986-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0825899B2 (ja) 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物
US4882317A (en) Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5371197A (en) Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
US4830852A (en) Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins and methods of preparing such polysaccharides and conjugates
US20240033367A1 (en) Immunogenic glycoprotein conjugates
RU2645071C2 (ru) Способы гликоконъюгирования и композиции
JP3828145B2 (ja) 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
EP0467714A1 (en) The class II protein of the outer membrane of neisseria meningitidis
CZ283284B6 (cs) Pneumokoková polysacharidová konjugátová vakcína
JPH05148157A (ja) 肺炎連鎖球菌からの多糖抗原
CA3105361A1 (en) Improvements in immunogenic conjugates
JPH0656690A (ja) 免疫キャリア及び増強性質を有するネイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉタンパク質
BG60630B2 (bg) Ковалентно модифицирани полианионни бактериални полизахариди,техни стабилни ковалентни конюгати с имуногенни протеини свързани с хибридни молекули,
CA2047030A1 (en) Class ii protein of the outer membrane of neisseria meningitidis having immunologic carrier and enhancement properties

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term