JP5069558B2 - HIVgp41融合中間物質の安定したペプチド模倣薬 - Google Patents
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(c)CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKLLQLTVWGIKALAAAIA(SEQ ID NO:5、「CCIZN17Ala4」)、
(d)CCGGIEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEKLLQLTVWGIKALAAAIA(SEQ ID NO:9、「CCEZN17Ala4」)、
(e)CCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:13、「CCIZN23」)、
(f)CCGGIEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEEKIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:15、「CCEZN23」)、
(g)GCCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:12、「ビオチン−CCIZN23」)、
(h)SGGCCGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:21、「SCCIZN17」)、
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(j)CCGGIEKKIEAIEKKIEAIEKLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:100、「CCS17N17」)、
(k)CCGGIEEKIEEIEELLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:109、「CCE10N17」)、
(l)CCGGIEKKIEEIEKKIEEIEKLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:116、「CCE17N17」)、
(m)CCGGIEKKIEEIEEKIEEIEKLLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:120、「CCE17GluN17」)
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
(a)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:2(「CCIZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(b)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:7(「CCEZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(c)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:5(「CCIZN17Ala4」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(d)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:9(「CCEZN17Ala4」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(e)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:13(「CCIZN23」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(f)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:15(「CCEZN23」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(g)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:12(「ビオチン−CCIZN23」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(h)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:21(「SCCIZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(i)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:98(「CCSZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(j)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:100(「CCS17N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(k)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:109(「CCE10N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(l)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:103(「CCCIZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(m)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:105(「CCCS17N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(n)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:106(「GGGS17N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(o)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:111(「CCCE10N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(p)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:110(「GGGE10N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(q)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:121(「GGGEZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(r)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:122(「CCCEZN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(s)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:125(「GGGE17N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(t)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:126(「CCCE17N17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(u)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:123(「GGGE17GluN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
(v)前記キメラペプチドは、SEQ ID NO:124(「CCCE17GluN17」)で規定されているようなアミノ酸配列からなる。
IZN17およびCCIZN17−ペプチドIZN17(SEQ ID NO:1)およびCCIZN17(SEQ ID NO:2)は、Pioneer Peptide Synthesizer(Applied Biosystems)上のFmoc/t−Bu化学作用を使用して固相により合成された。使用した樹脂は、1%架橋したFmoc−Linker AM−Champion(Biosearch Technologies,Inc.)、修飾されたRinkリンカーp−[(R,S)−α−[9H−フルオレン−9−イル−メトキシホルムアミド]−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸により誘導体化されたPEG−PSベース樹脂であった(Rink,H.、1987年、Tetrahedron Lett.28:3787〜3789頁、Bernatowicz,M.S.ら、1989年、Tetrahedron Lett.30:4645〜4667頁)。樹脂遊離アミノ酸基上で4倍過剰量の活性化アミノ酸を使用して、60〜120分間、すべてのアシル化反応を実行した。アミノ酸は、等モル量のHBTU(2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)および2倍モル過剰量のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)により活性化された。側鎖保護基は、グルタミン酸(Glu)およびトレオニン(Thr)に対するtert−ブチル、システイン(Cys)およびグルタミン(Gln)に対するトリチル、リシン(Lys)およびトリプトファン(Trp)に対するtert−ブトキシカルボニル、アルギニン(Arg)に対する2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニルであった。アセチル化反応は、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中で10倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。合成が終わったら、乾燥ペプチド樹脂を88%のトリフルオロ酢酸(TFA)、5%のフェノール、および2%のトリイソプロピルシラン、および5%の水(Sole,N.A.およびG.Barany、1992年、J.Org.Chem.57:5399〜5403頁)により、室温で1.5時間かけて処理した。樹脂を濾過し、溶液を冷たいメチル−t−ブチルエーテルに加え、ペプチドを沈殿させた。遠心分離機にかけた後、ペプチドペレットを新鮮な冷たいメチル−t−ブチルエーテルで洗浄し、不要な有機物を取り除いた。このプロセスを2回繰り返した。最終のペレットを乾燥させ、H2O、20%アセトニトリル中に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
SCCIZN17の合成−SCCIZN17(SEQ ID NO:21)は、IZN17およびCCIZN17の合成について概要が述べられているのと同じプロトコルに従って合成されたが(実施例1を参照)、ただし、N−末端セリン(Ser)はNH2末端遊離アミンに残された。ペプチド原料(250mgを15mL H2O/アセトニトリル、70/30、0.1% TFAに溶解した)は、溶離液として30%アセトニトリル水溶液、0.1%TFA、流量1ml/分を使用し、TSK−gel Toyopearl HW−50S樹脂(700×26mmカラム)上でゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)により精製された。溶出留分の分析HPLCを、Phenomenex、Jupiter C4カラム(150×4.6mm、5μm)を備えるBeckman HPLC上で実行したが、その際に溶離液B(上記)の勾配は35%〜50% B(20分)−80%(3分)、流量1mL/分であった。純度に基づいて、留分をプールし、さらに、逆相HPLCにより精製したが、その際に準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)を使用し、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Bの勾配は、35%〜45%、20分間、流量80mL/分であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた(見つかったMW:5228.0Da)。
単一サイクルHIV感染アッセイ−HIV株HXB2、BaL、89.6、MN−1、およびNL4−3をAdvanced Biotechnology Inc.(Bethesda,MD)から購入した。SHIV−89.6P(Reimannら、1996年、J.Virol.70:6922〜6928頁)を、N.Letvin(Beth Israel Hospital、マサチューセッツ州ボストン)から入手し、アッセイで使用する前に末梢血リンパ球で3回継代した。VSV−Gタンパク質で偽型化されたHIVは、293T細胞にプロウイルスDNA構造R8Δenv(Tronoら、1989年、Cell 59:113〜120頁、Gallayら、1995年、Cell 83:569〜576頁)およびpCMV−VSV−G(Wuら、1999年、J.Virol.73:2126〜2135頁、J.Kappes,University of Alabama Birminghamの贈与)をトランスフェクトすることにより生成された。P4−2/R5細胞(Charneauら、1992年、J.Virol.66:2814〜2820、Dengら、1996年、Nature 381:661〜666頁、N.Landau,Salk Instituteの贈与)は、ヒトCD4およびCCR5を安定して発現し、HIV−2 LTRのtat−応答性断片により駆動されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を保有するヒーラ細胞である。P4−2/R5細胞は、37℃、フェノールレッドなしのダルベッコ変法イーグル培地中5% CO2、10%ウシ胎仔血清(FBS)で維持された。感染アッセイでは、細胞を2.5×103細胞/ウェルで96ウェルプレート(Costar)内に種まきし、ペプチドの存在下、〜0.01の感染多重度でHIV−1のさまざまな株に次の日に感染させた。37℃/5% CO2でさらに48時間インキュベートした後、細胞を溶解し、メーカー取扱説明書に従ってGalScreen化学発光基材(Tropix、マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用してβガラクトシダーゼ活性を定量した。
AlphaScreen(商標)結合アッセイ−同種AlphaScreen(商標)検出キット(PerkinElmer Cat.#6760612)を使用した。ビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジンに抱合された供与体ビーズにカップリングされ、IgGD5は、受容体ビーズにカップリングされたタンパク質Aにより捕捉される。コーティングされたビーズ複合体を混ぜ合わせ、暗所の96ウェルプレート内で一晩室温でインキュベートした。次いで、プレートを、供与体ビーズを680nmで励起するFusion α−FP HT計測器上で分析した。一重項酸素は、供与体ビーズにより放出される。受容体ビーズは、ペプチド/抗体相互作用により近接している場合、一重項酸素は、520〜620nmの光を放射する受容体ビーズにより捕捉される。計測器は、これらの放射を記録する。
CCI10N17の合成−CCI10N17(SEQ ID NO:20)は、IZN17およびCCIZN17の合成について概要が述べられているのと同じプロトコルに従って合成された(実施例1を参照)。原料CCI10N17ペプチドを準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)を使用する逆相HPLCにより精製したが、その際に、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Bの勾配は、40%〜60%、20分間、流量80mL/分であった。分析HPLCを、Phenomenex、Jupiter C4カラム(150×4.6mm、5μm)上で実行したが、その際に溶離液Bの勾配は40%〜60% B(20分)−80%(3分)、流量1mL/分であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた(見つかったMW:3536.0Da)。
EZN17の合成−EZN17(SEQ ID NO:6)は、IZN17(SEQ ID NO:1)およびCCIZN17(SEQ ID NO:2)について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、DMF中で10倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料EZN17(SEQ ID NO:6)を、準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)上で逆相HPLCにより精製したが、その際に溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Bの勾配は、45%〜65%、25分間、流量80mL/分であった。分析HPLCを、Phenomenex、Jupiter C4カラム(150×4.6mm、5μm)上で実行したが、その際に溶離液Bの勾配は30%〜70% B(20分)−80%(3分)、流量1mL/分であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均MWは、5015.06Daであるが、見つかったMWは、5013.0Daである。
材料と方法−BIACore3000計測器を、BIACore(ニュージャージー州ピスカタウェイ)が供給しているチップSA(固定化されたストレプトアビジン表面)またはC5(表面上の活性化可能カルボキシル基)と併せて、測定に使用した。ビオチニル化ペプチドは、SAチップ上で、1〜4分間、HBS(HEPES緩衝食塩水)中の1nMのペプチド溶液に10×Tweenを加えたものを流すことにより固定化された。結合ペプチドが検体完全抗体の100RUを結合するのに十分な10個の共鳴ユニット(RU)に達するまで手動注入が使用された。C5チップについては、EDC(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド酸素酸塩)およびNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)による表面活性化の後、標的固定化を1500〜1800RUに設定し、組み込み固定化ウィザード制御テンプレートを使用して、pH4.8の酢酸塩緩衝液中1〜5μg/ml(BIACore供給緩衝液を混合する)で抗体の固定化を実行した。これは、検体ペプチドの最大100RUまでに結合する十分な活性を持つD5−IgGを固定化することがわかった。流量は、会合解離フェーズでは20μl/分であり、15mM HClの1回洗浄による表面再生時には50μl/分であったが、これは、すべての結合ペプチドを解放するのに十分であると決定された。速度ウィザードは、親和性測定実験を設計するために使用され、複製および対照は拡散制限速度を検出することを求めるプロンプトが表示されたときに実行された。検体濃度は、2倍または4倍希釈系列として、Kd値よりも上および下の濃度のデータを与えるように選択された。会合時間は、典型的には3分、解離時間は、5〜10分であるが、会合解離測定は、HBS+10×Tweenにおいて25℃で実行され、非特異結合事象を取り除くよう決定された。データの分析は、BIACore曲線当てはめソフトウェアにより実行され、RUに著しい変化のある滑らかな領域からデータが選択された。第1に、解離速度が推定された。ほとんどの最も希薄な検体試料から得られたデータは、容易に当てはめられ、よく似ていた。しかし、0.25nM未満の試料では、基線変動はデータを劣化させ始め、オフレート推定値を信頼できないものとした。最良適合オフレートを使用しすることで、会合曲線をそれぞれBIACoreソフトウェアにおいて当てはめて、オンレートを求めた。使用されたすべての濃度から、容易に当てはめられるオンレートデータが得られた。
アラニンスキャンされたIZN17ペプチドの合成−40ウェル反応ブロックを使用するペプチドマルチシンセサイザAPEX 396(Advanced Chemtech)上でFmoc/t−Bu化学反応を使用して固相によりペプチド(表5を参照)を合成した。それぞれのペプチドは、1%架橋したFmoc−Linker AM−Champion(Biosearch Technologies,Inc.)0.3g、修飾されたRinkリンカーp−[(R,S)−α−[9H−フルオレン−9−イル−メトキシホルムアミド]−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸により誘導体化されたPEG−PSベース樹脂を使用して合成された(Rink、1987年、上記、Bernatowiczら、1989年、上記)。すべてのアミノ酸は、DMF中の0.5M HOBt(ヒドロキシベンゾトリアゾール)の溶液中に0.5M濃度で溶解された。樹脂遊離アミノ基上で6倍過剰量の活性化アミノ酸を使用して、60分間、アシル化反応を実行した。最初の14個のアミノ酸は、等モル量のHBTU(2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)および2倍モル過剰量のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)により活性化された。最後の27個のアミノ酸は、等モル量のHATU(N−[(ジメチルアミノ)−1H−1,2,3−トリアゾロ−[4,5−b]ピリジニルメチレン)]−N−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートN−オキシド)および2倍モル過剰量のDIEA(N,N−ジイソプロピルエチルアミン)により活性化された。側鎖保護基は、GluおよびThrに対するtert−ブチル、CysおよびGlnに対するトリチル、Lys、Trpに対するtert−ブトキシカルボニル、およびArgに対する2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニルであった。アセチル化反応は、DMF中で10倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。合成が終わったら、乾燥ペプチド樹脂を、88%のTFA、5%のフェノール、2%のトリイソプロピルシラン、および5%の水の切断混合液20mL(SoleおよびBarany、1992年、上記)により、室温で1.5時間かけて個別に処理した。それぞれの樹脂を濾過し、溶液を冷たいメチル−t−ブチルエーテルに加え、ペプチドを沈殿させた。遠心分離機にかけた後、ペプチドペレットを新鮮な冷たいメチル−t−ブチルエーテルで洗浄し、不要な有機物を取り除いた。このプロセスを2回繰り返した。最終のペレットを乾燥させ、H2O、20%アセトニトリル中に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
C−Ttds−CCEZN17の合成−C−Ttds−CCEZN17(C−Tds−SEQ ID NO:7)は、IZN17(SEQ ID NO:1)およびCCIZN17(SEQ ID NO:2)について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。Ttds(1−アミノ−4,7,10−トリオキサ−13−トリデカミンコハク酸、−NH−(CH2)3−O−(CH2)2−O−(CH2)2−O−(CH2)3−NH−CO−CH2)2−CO−)との反応は、等モル量のDIPC(N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド)およびHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)で活性化された3倍過剰量のTtdsと、3時間反応させることにより実行された。アセチル化反応は、DMF中で10倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、C−Ttds−CCEZN17(C−Tds−SEQ ID NO:7)は、溶離液として30%アセトニトリル水溶液、0.1%TFA、流量1mL/分を使用し、TSK−gel Toyopearl HW−50S樹脂(700×26mmカラム)上でゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)により精製された。GPC(25%収量)により得られたプールされた留分(純度70%)は、さらに、準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)上で、流量を80mL/分とし、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用して、逆相HPLCにより>95%の純度に精製された。使用された溶離液Bの勾配は、40%〜60%、25分間、流量80mL/分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Jupiter C4カラム(150×4.6mm、5μm、300A、Phenomenex)上で、流量を1mL/分とし、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用して、分析HPLCにより実行された。使用された溶離液Bの勾配は、45%〜65%、20分間−80%、3分間であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォームES+上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったMWは、5739.0Daであるが、計算で求められた平均MWは、5740.0Daである。
N17IZの合成−N17IZ(SEQ ID NO:94)は、IZN17(SEQ ID NO:1)およびCCIZN17(SEQ ID NO:2)について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、DMF中で10倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料N17IZ(SEQ ID NO:94)を、準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)で逆相HPLCにより精製したが、その際に溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Bの勾配は、30%〜50%、25分間、流量80mL/分であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均MWは、4667.0Daであるが、見つかったMWは、4668.77Daであった。
Br−アセチル−GGGIZN17(表7のペプチド2)の合成−GGGIZN17(SEQ ID NO:104)は、IZN17についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された(実施例1を参照)。ブロモアセチル化反応は、DMF中で10倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、Br−アセチル−GGGIZN17(表7のペプチド2)は、溶離液として30%アセトニトリル水溶液、0.1%TFA、流量1mL/分を使用し、TSK−gel Toyopearl HW−50S樹脂(700×26mmカラム)上でゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)により精製された。GPCにより得られたプールされた留分(純度70%)は、さらに、準分取水RCM Delta−Pak(商標)C−4カートリッジ(40×200mm、15μm)上で、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用して、逆相HPLCにより>95%の純度に精製された。使用された溶離液Bの勾配は、35%〜50%、20分間、流量80mL/分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Jupiter C4カラム(150×4.6mm、5μm、300A、Phenomenex)上で、流量を1mL/分とし、溶離液として(A)0.1% TFA水溶液および(B)0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用して、分析HPLCにより実行された。使用された溶離液Bの勾配は、40%〜60%、20分間−80%、3分間であった。精製されたペプチドは、Micromass LCZプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均MWは、5106Daであり、見つかったMWは、5106Daであった。
2)ブロモアセチル−GGGIZN17(表7のペプチド2):柔軟なリンカーを通じて骨格領域から分離されたブロモアセチル部分を有するペプチド(−GGG−、他の柔軟なスペーサーが適しているが、ただし、2つの誘導体化キメラNペプチド鎖と1つのCCキメラNペプチドとの間の2つのチオエーテル結合の形成と親和性があることを条件とする)。
(CCIZN17)3免疫付与ウサギからの血清はD5競合抗体を含有する−6匹のウサギに、QS21アジュバントまたは明ばんとQS21アジュバントの組合せと混合された(CCIZN17)3の筋肉注射で免疫を付与した。免疫付与してから約8週間後、これらの動物からの血清試料を試験し、D5 IgG競合抗体の有無について調べた。このような抗体は、血清原料およびタンパク質A精製抗体留分(データは示されていない)内に検出された。いずれの血清原料も精製抗体も、抗ウイルス活性を生じなかった。
Claims (18)
- (a)(i)エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、可溶性の三量体のコイルドコイルを形成することができるαヘリックス領域であって、N17(LLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:44))を含む、NH2末端7回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合するαヘリックス領域、またはこの修飾型と、
(ii)前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも2つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
(b)三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、
(c)(b)において形成された前記三量体コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含み、
前記修飾型は、gp41のアミノ酸577〜581に位置する潜在的免疫優勢エピトープを除去するものである、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。 - (a)における前記可溶性キメラペプチドが、HIV gp41のNペプチドの全部または一部を含む、請求項1に記載の三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
- (a)三量体のコイルドコイルを形成することができる可溶性のαヘリックス領域を含む骨格部分と、
(b)HIV gp41のNペプチドの全部または一部を含み、N17(LLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:44))を含むNペプチド部分、またはこの修飾型と、
(c)少なくとも2つのシステイン残基を含むシステイン部分とを含み、
(a)における前記骨格部分は、(b)における前記Nペプチド部分にヘリックスフェーズで融合されて、αヘリックス領域を形成し、(c)における前記システイン部分は、前記αヘリックス領域の外に配置される可溶性キメラペプチドであって、
前記修飾型は、gp41のアミノ酸577〜581に位置する潜在的免疫優勢エピトープを除去するものである可溶性キメラペプチド。 - (b)における前記Nペプチド部分が、HIV−1 gp41に由来する請求項3に記載のキメラペプチド。
- 前記Nペプチド部分が、前記ペプチドの前記骨格部分のCOOH末端に融合される請求項4に記載のキメラペプチド。
- 前記修飾されたNペプチド部分が、N17Ala4 (LLQLTVWGIKALAAAIA(SEQ ID NO:60))を含む請求項3に記載のキメラペプチド。
- 前記ペプチドの前記骨格部分が、Suzuki−IZコイルドコイルモチーフ(YGGIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQ ID NO:29))、IZコイルドコイルモチーフ(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK(SEQ ID NO:31))、EZコイルドコイルモチーフ(IEKKIEEIEKKIEEIEKKIEEIEK(SEQ ID NO:32))又はSZコイルドコイルモチーフ(IEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEK(SEQ ID NO:107))の全部または一部を含む請求項5に記載のキメラペプチド。
- 前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のNH2末端に配置されている少なくとも2つの連続するシステイン残基を含む請求項5に記載のキメラペプチド。
- 前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項8に記載のキメラペプチド。
- 前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のCOOH末端に配置されている少なくとも2つの連続するシステイン残基を含む請求項5に記載のキメラペプチド。
- 前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のNH2末端に配置されている3つの連続するシステイン残基を含む請求項5に記載のキメラペプチド。
- 前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項11に記載のキメラペプチド。
- 前記NH2末端に配置されている前記システイン残基が、保護されたチオール基を有する請求項12に記載のキメラペプチド。
- (a)CCIZN17と指定されたSEQ ID NO:2と、
(b)CCEZN17と指定されたSEQ ID NO:7と、
(c)CCIZN17Ala4と指定されたSEQ ID NO:5と、
(d)CCEZN17Ala4と指定されたSEQ ID NO:9と、
(e)CCIZN23と指定されたSEQ ID NO:13と、
(f)CCEZN23と指定されたSEQ ID NO:15と、
(g)ビオチン−CCIZN23と指定されたSEQ ID NO:12と、
(h)SCCIZN17と指定されたSEQ ID NO:21と、
(i)CCSZN17と指定されたSEQ ID NO:98と、
(j)CCS17N17と指定されたSEQ ID NO:100と、
(k)CCE10N17と指定されたSEQ ID NO:109と、
(l)CCE17N17と指定されたSEQ ID NO:116と、
(m)CCE17GluN17と指定されたSEQ ID NO:120とからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むキメラペプチド。 - (a)可溶性の三量体のコイルドコイルを形成することができるαヘリックス領域であって、N17(LLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:44))を含む、HIV gp41 Nペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合するαヘリックス領域、またはこの修飾型と、
(b)前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも2つのシステイン残基とを含み、
前記キメラペプチドは、個々のペプチドの前記システイン残基間のジスルフィド結合を介してコイルドコイルとして共有結合的に安定化され、前記修飾型は、gp41のアミノ酸577〜581に位置する潜在的免疫優勢エピトープを除去するものである、3つのキメラペプチドを含むHIV gp41 Nペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化された三量体コイルドコイル。 - (a)
(i)可溶性の三量体のコイルドコイルを形成することができるαヘリックス領域であって、N17(LLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:44))を含む、HIV gp41 Nペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合するαヘリックス領域、またはこの修飾型と、
(ii)前記ペプチドの前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも2つのシステイン残基とを含む1つのキメラペプチドと、
(b)それぞれチオエーテル結合を形成することができる求電子性部分とともに誘導体化された、N17(LLQLTVWGIKQLQARIL(SEQ ID NO:44))を含む、HIV gp41 Nペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む2つのキメラペプチドとを含み、
(a)における前記キメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、(b)におけるそれぞれの誘導体化されたキメラペプチドの前記求電子性部分とチオエーテル結合を形成し、
前記修飾型は、gp41のアミノ酸577〜581に位置する潜在的免疫優勢エピトープを除去するものである、
HIV gp41 Nペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル。 - (a)(CCIZN17)3([SEQ ID NO:2]3)と、
(b)(CCEZN17)3([SEQ ID NO:7]3)と、
(c)(CCIZN17Ala4)3([SEQ ID NO:5]3)と、
(d)(CCEZN17Ala4)3([SEQ ID NO:9]3)と、
(e)(CCIZN23)3([SEQ ID NO:13]3)と、
(f)(CCEZN23)3([SEQ ID NO:15]3)と、
(g)(ビオチン−CCIZN23)3([SEQ ID NO:12]3)と、
(h)(SCCIZN17)3([SEQ ID NO:21]3)
とからなる群から選択されたHIV−1 Nペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体化コイルドコイル。 - (a)試験化合物、請求項15に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル、および前記HIV gp41 Nペプチドコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する抗体を組み合わせることと、
(b)前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を測定することと、
(c)前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性と前記試験化合物がない場合の前記コイルドコイルに対する前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を比較することとを含み、
前記試験化合物が、前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性を減少させる場合に、前記試験化合物が、HIV感染阻害剤として識別されるHIV感染阻害剤を識別する方法。
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