CN103502264A - Hiv立体结构识别抗体诱导肽 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够诱导针对HIV的更优异的或者新的中和抗体的肽，由此实现HIV感染症的预防、治疗或丰富其选择项。作为解决方法，其特征在于使用识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，该HIV立体结构识别抗体诱导肽的特征在于，通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子结合。

Description

HIV立体结构识别抗体诱导肽
技术领域
本发明涉及一种诱导识别HIV（人类免疫缺陷病毒：HumanImmunodeficiency Virus）的立体结构的抗体的肽、其合成方法、以及以由该肽诱导的HIV立体结构识别抗体或该肽作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗剂。特别涉及一种相对于作为向HIV的靶细胞内的侵入机制的HIV疫苗的HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34和N36的六聚体的形成，通过作用于螺旋区域C34的三聚体区域，阻碍该gp41的C34和N36的六聚体形成，阻止向HIV的靶细胞侵入的识别HIV立体结构的抗体诱导肽、其合成方法、以及以由该肽诱导得到的HIV立体结构识别抗体或该肽作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗剂。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome；AIDS）是1983年由Montagnier L等分离并发现的人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus；HIV）引起的疾病（参照非专利文献1）。HIV的起源认为是以灵长类为自然宿主的猴子免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus；SIV）因突变而获得对人的感染能力引起的。HIV不以空气感染，主要通过性感染、血液感染、母婴感染这3条途径感染。性感染的最大原因是接触性分泌液，血液感染的原因是输血、伤痕、随意使用注射针等而引起感染。因此，需要从伦理观点出发预防感染。另外，母婴感染的原因是生产时接触产道中的体液、母亲的哺乳、病毒移动通过妊娠中的胎盘等。
HIV为逆转录病毒的一种，特别是以人CD4阳性T细胞为靶点而感染的外来性病毒（参照非专利文献1）。HIV感染于人CD4阳性T细胞之后，经过比较长的潜伏期而活化，破坏该T细胞。T细胞在免疫系统中发挥重要的作用，因此，T细胞的破坏使得体内的免疫能力显著降低。其结果，对于正常状态下能够简单排除的病原体也不能发挥充分的抵抗力，从而陷入慢性的免疫缺陷状态，即，陷入被称为“AIDS发病”的状态。
全世界的HIV感染者数虽然增加的速度缓慢，但是已经达到3300万人，2007年的新增HIV感染人数为240万人，与HIV相关的死亡人数为200万人（参照非专利文献2）。特别是在具有世界最多人口的亚洲，HIV的感染增长迅速。日本也不例外，虽然在发达国家中为特例，但是也在一直增加。具体而言，日本的现状为在2007年AIDS患者数为418人，HIV感染人数为1082人，首次超过1000人，且现在也没有停止的迹象（参照非专利文献3）。但是，HIV从其发现时开始就进行着积极的研究，在至今为止的25年之间，关于感染症的诊断方法的确立、进而治疗方法而言，与其它感染症相比也看到了极大的进步（参照非专利文献4及5）。通过对治疗药物进行深入的研究开发，使AIDS成为非直接至死的疾病。但是，根本的治疗方法尚未确立，新的问题点也出现了。因此，期望新型的治疗药物。
HIV在来自宿主细胞的病毒膜上具有为了与靶细胞结合所需要的被称为gp120、gp41的包膜蛋白。在病毒膜的内部作为支架蛋白存在基质（Matrix）蛋白，由此保持HIV的结构。另外，HIV的类核体具有被衣壳（Capsid）蛋白包围的正12面体结构，在其内部含有RNA基因组、整合酶（integrase；IN）、蛋白酶（protease；PR）、逆转录酶（reverse transcriptase；RT）（图1）。HIV的RNA基因组约为9000bp，该基因组夹入被称为末端重复序列（long terminal repeat；LTR）的结构中而存在。该基因所编码的十几种病毒蛋白控制着复杂的复制（参照非专利文献4及5）。
将从侵入HIV的靶细胞至出芽的一系列的增殖循环称为生命周期。该生命周期分为以下的［1］～［6］的各阶段，即，［1］病毒向细胞膜吸附及膜融合、［2］RNA基因组的逆转录、［3］病毒DNA插入宿主染色体和复制、［4］病毒结构蛋白的加工、［5］病毒颗粒的组装、［6］出芽的过程，HIV经过以上过程而进行增殖（参照图2）（参照非专利文献4～7）。
在1985年作为最初的抗HIV药被开发的叠氮胸苷（AZT）是逆转录酶的竞争性抑制剂，是通过抑制上述生命周期而抑制HIV增殖的药剂。该AZT开发以后，更详细地明白了HIV的生命周期，抗HIV药物的开发也得到迅速的发展（参照非专利文献8及9）。其结果，目前，临床应用的抗HIV药物达到15种以上，并用作用机制不同的抗HIV药物的高效抗逆转录病毒治疗（Highly Active Anti Retroviral Therapy；HAART）成为可能。该HAART目前成为HIV感染者及AIDS患者的治疗的主流，提高一定的效果。但是，为了持续极力抑制体内病毒量，需要将药剂长期给药，其结果，也存在出现药剂耐性株、严重的副作用、进而需要高额的治疗费用的问题点。特别是药剂耐性病毒的出现是很严重的。作为药剂耐性病毒出现的原因，除了药剂的长期服用之外，还可列举以下原因：由于HIV不具有DNA聚合酶那样的DNA的修复机制，因此非常容易引起变异（易变异性）。
因此，期望开发出治疗费用的负担轻、且对耐性HIV病毒也有效的HIV感染症的预防剂、治疗剂。作为着眼于上述HIV的生命周期的［1］“病毒向细胞膜吸附和膜融合”的HIV感染症的预防、治疗剂的候补，进行了以HIV的包膜蛋白gp120及gp41为靶点的药物开发。gp120及gp41与HIV侵入宿主细胞时的膜融合有关。在感染前，gp41的大部分被gp120覆盖（参照图3的左图），在感染时露出（参照图3的右图）。gp41的N末端侧区域称为N36，C末端侧区域称为C34，N36和C34分别形成三聚体结构。图4表示与HIV的宿主细胞的膜融合的机制。HIV向宿主细胞侵入时，首先，gp120与宿主细胞的CD4结合，接着，与辅助受体结合。其后，gp41扎入宿主细胞中，引起立体结构变化。而且，以3条C34从外侧包围3条N36的方式结合，形成总计6条肽链聚集的六螺旋束（6-helical bundle），由此，HIV膜和宿主细胞的膜靠近，膜融合成立（参照图4）。
基于HIV这样的侵入机制，诱导了几种以gp120或gp41为靶点且具有抗HIV活性的抗体。目前，作为表现出比较强的抗HIV活性（HIV中和活性）的人单克隆抗体，发现了作为针对gp41的抗体的2F5抗体（非专利文献10～13）和4E10抗体（非专利文献12～14）等，此外还有作为针对gp120的抗体的2G12抗体（非专利文献15）和b12抗体（非专利文献16）等。另外，在专利文献1中记载了为了阻止HIV的感染或为了使HIV的生命周期所必须的阶段失活而使用针对gp120的抗体。但是，由于HIV基因组具有显著的易变异性，因此，虽然上述抗体对于某种特定的HIV株显示抗HIV活性，但是，对于其他株则不那么显示抗HIV活性，因此目前尚未达到临床应用。
另外，本发明的发明人等迄今为止在诱导特异性识别与gp41的C34肽相互作用的N36肽的三聚体结构的中和抗体的肽抗原的合成方面取得成功（专利文献2）。该肽抗原为在带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物的各自的接头结构上各自结合一个N36肽的衍生物而成的抗原分子。使用该N36肽三聚体抗原诱导得到的中和抗体与使用N36肽单体诱导得到的中和抗体相比，对于N36肽三聚体的特异性更高，抗HIV活性也高出3倍。可以认为，由上述专利文献2中的N36肽三聚体抗原诱导得到的抗体与N36肽的三聚体特异性结合，抑制由N36肽和C34肽形成六螺旋束（6-helical bundle），由此抑制HIV膜融合。另外，作为进行过临床试验的已知的抗HIV活性肽，已知有C34肽衍生物单体fuzeon（T-20/DP178）（非专利文献17）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-080118号公报
专利文献2：WO/2010/134305小册子
非专利文献
非专利文献1：Sinoussi,B.F.,Montagnier,L.Isolation of aT-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunedeficiency syndrome(AIDS).Science20,868-871(1983)
非专利文献2：WHO,World Health Statistics2008
非专利文献3：厚生劳动省艾滋病动向委员会报道《エイズ発生動向報告》2008年发行
非专利文献4：山本直树编ヒトレトロウイルス研究の最前線施普林格东京株式会社2002年2月22日发行
非专利文献5：Koyanagi,Y.Outline of the HIV replication and itscelluiar:the track of an invader in cell.Virus55,251-258(2005)
非专利文献6:Carter,C.A.,Ehrlich,L.S.Cell biology of HIV-1infection of macrophages.Annu.Rev.Macrobiol.62,425-443(2008)
非专利文献7:Eckert,D.M.,Kim,P.S.Mechanisms of viralmembrane fusion and its inhibition.Annu.Rev.Biochem.70,777-810(2001)
非专利文献8:Baba,M.Recent progress of anti-HIV-1reseach.Virus54,59-66(2004)
非特許文献9:Kwong,P.D.,Wyatt,R.,Robinson,J.Sructure of anHIV gp120envelope glycoprotein in complex with the CD4receptor and anewtralizing human antibody.Nature393,648-659(1997)
非专利文献10:Conley,A.J.,Kessler,J.A.II,Boots,L.J.,Tung,J.S.,Arnold,B.A.,Keller,P.M.,Shaw,A.R.,and Emini,R.A.Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type1variantsand primary isolates by IAM-41-2F5,an anti-gp41human monoclonalantibody Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,3348-3352(1994)
非专利文献11:Ofek,G.,Tang,M.,Sambor,A.,Katinger,H.,Mascola,J.R.,Wyatt,R.,and Kwong,P.D.Structure and mechanisticanalysis of theanti-human immunodeficiency virus type1antibody2F5incomplex with its gp41epitope.J.Virol.78,10724-10737(2004)
非专利文献12:Alam,S.M.,McAdams,M.,Boren,D.,Rak,M.,Scearce,R.M.,Gao,F.,Camacho,Z.T.,Gewirth,D.,Kelsoe,G.,Chen,P.,and Haynes,B.F.The role of antibody polyspecificity and lipid reactivityin binding ofbroadly neutralizing anti-HIV-1envelope human monoclonalantibodies2F5and4E10to glycoprotein41membrane proximal envelopeepitopes.J.Immunol.178,4424-4435(2007)
非专利文献13:Nelson,J.D.,Brunel,F.M.,Jensen,R.,Crooks,E.T.,Cardoso,R.M.F.,Wang,M.,Hessell,A.,Wilson,I.A.,Binley,J.M.,Dawson,P.E.,Burton,D.R.,and Zwick,M.B.An affinity-enhancedneutralizing antibody against the membrane-proximal external region ofhuman immunodeficiency virus type1gp41recognizes an epitope betweenthose of2F5and4E10.J.Virol.81,4033-4043(2007)
非专利文献14:Cardoso,R.M.F.,Zwick,M.B.,Stanfield,R.L.,Kunert,R.,Binley,J.M.,Katinger,H.,Burton,D.R.,and Wilson,I.A.Broadly neutralizing anti-HIV antibody4E10recognizes a helicalconformation of a highly conserved fusion-associated motif in gp41.Immunity22,163-173(2005)
非专利文献15:Trkola,A.,Purtscher,M.,Muster,T.,Ballaun,C.,Buchacher,A.,Sullivan,N.,Srinivasan,K.,Sodroski,J.,Moore,J.P.,andKatinger,H.Human monoclonal antibody2G12defines a distinctiveneutralization epitope on the gp120glycoprotein of humanimmunodeficiency virus type1.J.Virol.70,1100-1108(1996)
非专利文献16:Pantophlet,R.,Saphire,E.O.,Poignard,P.,Parren,P.W.H.I.,Wilson,I.A.,and Burton,D.R.Fine mapping of the interaction ofneutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies with the CD4binding site of human immunodeficiency virus type1gp120.J.Virol.77,642-658(2003)
非专利文献17:Akira Otaka,Miki Nakamura,Daisuke Nameki,Eiichi Kodama,Susumu Uchiyama,Syota Nakamura,Hiroaki Nakano,Hirokazu Tamamura,Yuji Kobayashi,Masao Matsuoka,and NobutakaFujii Remodeling of gp41-C34Peptide Leads to Highly Effective Inhibitorsof the Fusion of HIV-1with Target Cells.Angew.Chem.Int.Ed.,41(16),2937-2940(2002)
发明内容
发明所要解决的课题
在HIV疫苗的开发中，迄今为止对感染症有效的减毒疫苗、活疫苗这种方法存在以下的问题，即，有时由于HIV的易变异性，所以认为危险而不能使用，另外，在进行通常抗体诱导时，合成其蛋白质中的部分序列，以诱导其序列特异性抗体为目的，虽然使用部分序列所诱导得到的抗体可以与氨基酸序列特异性地结合，但对于中和靶点的立体结构的特异性及结合活性一般较低。这样，就需求对于非常容易变异的HIV也能够毫无问题地使用，并且对于作为HIV向靶细胞的侵入机制的中和靶点的立体结构的特异性及结合活性方面也具有优异的特异性及结合活性的抗体、或者在疫苗等HIV感染症的预防、治疗剂的开发中有效的HIV抗体诱导肽。作为这种肽，本发明的发明人等此前进行了诱导特异性识别HIV的gp41的N36肽的三聚体结构的中和抗体的肽抗原的开发（参照专利文献2）。
但是，为了HIV感染症的预防、治疗，或为了预防、治疗的选择项的丰富化，谋求对于HIV更优异的、或可以诱导新的中和抗体的肽。用于解决课题的技术方案
本发明的发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究，在研究中发现，通过化学合成在gp41的螺旋区域中据称重要的C34的部分的三聚体，用作HIV立体结构识别抗体诱导肽，可以诱导抗HIV活性和对HIV感染的中和活性优异的抗体，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：［1］一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，包括：合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序；和通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体的工序；［2］如上述［1］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在作为C34的天然序列的C34肽的C末端侧导入为了与模板化合物结合所需要的连接位点，在该C34肽的序列和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基；［3］如上述［1］或［2］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（1）所示的化合物或其盐，
Figure BDA0000392475280000071
（式中，X表示正整数）
［4］如上述［3］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（2）所示的化合物或其盐，
Figure BDA0000392475280000081
［5］如上述［1］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在C34肽的C末端侧赋予亲水性氨基酸残基，而且，在其C末端侧导入连接位点，在该亲水性氨基酸残基和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基；［6］如上述［5］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物为下述通式（3）所示的化合物，
Figure BDA0000392475280000082
［7］如上述［1］～［6］中任一项所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，在通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合而合成C34肽的衍生物的三聚体的工序中，将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物和C34肽的衍生物在缓冲液中进行搅拌，由此使带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体。
本发明还涉及：［8］一种识别HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于，其为利用上述［1］～［7］中任一项所述的合成方法所合成的；［9］一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于，通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子结合；［10］如上述［8］或［9］所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其由下述通式（4）所示的化合物或其盐构成，
Figure BDA0000392475280000091
（式中，X表示正整数，Monomer表示下述通式（5）所示的化合物）。
Figure BDA0000392475280000092
而且，本发明涉及：［11］一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体的诱导方法，其特征在于，使用识别上述［8］～［10］中任一项所述的识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽对宿主动物进行致敏，诱导针对该肽的抗体。
另外，本发明涉及：［12］一种HIV感染症的预防和／或治疗剂，其以识别上述［8］～［10］中任一项所述的肽的C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体或上述［8］～［10］中任一项所述的肽作为有效成分；［13］如上述［12］所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于，利用上述［8］～［10］中任一项所述的肽的抗HIV活性进行HIV感染症的预防和／或治疗；［14］如上述［12］所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于，HIV感染症的预防和／或治疗是通过HIV立体结构识别抗体对HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的作用，阻碍gp41的C34和N36形成六聚体，阻止向HIV的靶细胞的侵入；［15］如上述［12］所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于，其为以上述［8］～［10］中任一项所述的肽作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗用疫苗。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种HIV抗体诱导肽，该HIV抗体诱导肽对于对作为HIV向靶细胞的侵入机制的中和靶点的立体结构具有优异的特异性及结合活性的抗体或疫苗的开发是有效的。通过提供该HIV抗体诱导肽，可以制造HIV立体结构识别抗体及疫苗，可以提供以该肽、该疫苗或HIV立体结构识别抗体作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗剂。在HIV疫苗的开发中，迄今为止对感染症有效的减毒疫苗、活疫苗这种方法存在以下的问题，即，有时由于HIV的易变异性，所以认为危险而不能使用，但本发明的HIV抗体诱导肽不仅提供以非常容易变异的HIV为靶点的氨基酸序列，而且可提供对于作为HIV向靶细胞的侵入机制的中和靶点的立体结构具有特异性及结合活性方的抗体或者在疫苗的开发中有效的HIV抗体诱导肽，因此，能够解决如上所述的现有的HIV疫苗的开发中的问题，提供对于HIV感染症安全且有效的HIV抗体及HIV疫苗，并能够提供对于HIV感染症安全且有效的HIV感染症的预防和／或治疗剂。
另外，专利文献2中的N36肽衍生物的情况，其三聚体的抗HIV活性与其单体相比为3倍高的程度，与此相对，本发明中的C34肽衍生物的情况，其三聚体的抗HIV活性与其单体相比，提高至20倍～100倍。因此，以本发明的HIV抗体诱导肽为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗剂，肽本身显示很高的抗HIV活性，因此，在不通过抗体诱导的状况，例如从抗体被诱导之前就能够发挥其效果。
附图说明
图1是表示HIV的示意图的图。
图2是表示HIV的生命周期的图。
图3是表示HIV的包膜蛋白的图。
图4是表示HIV膜融合的机制的图。
图5是表示自然化学连接反应的概要的图。
图6是表示C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）的形成机制的图。
图7是表示C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）的设计的图。
图8是与C34肽衍生物1（C34衍生物1）的合成有关的图。
图9是与C34肽衍生物2（C34衍生物2）的合成有关的图。
图10是与模板化合物的合成有关的图。
图11是表示模板化合物的合成方案的图。
图12是表示C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）形成的反应过程的图。
图13是与C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）的合成有关的图。
图14是表示C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）的二维结构分析的结果的图。图（A）中的实线表示C34肽衍生物三聚体的CD光谱，图（A）中的虚线表示C34肽衍生物单体的CD光谱。图（B）中的虚线表示C34肽衍生物单体和N36肽衍生物单体的混合物的CD光谱，图（B）中的实线表示C34肽衍生物三聚体和N36肽衍生物单体的混合物的CD光谱，图（B）中的点线表示N36肽衍生物单体的CD光谱。
图15是表示将C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）等免疫而得到的血清的抗体值的图。图（A）表示在微孔板上包被C34肽衍生物单体时的结果，图（B）表示在微孔板上包被C34肽衍生物三聚体时的结果。另外，图（A）及（B）的图表中的黑方块表示使用以C34肽衍生物单体诱导得到的血清时的结果，黑圆表示使用以C34肽衍生物三聚体诱导得到的血清时的结果。
图16是表示以C34肽衍生物三聚体诱导得到的抗血清对HIV感染的中和活性的图。“uninf.”表示非感染细胞时的结果，“cr1”～“cr3”表示使用免疫1周前的血清（对照）时的结果，“m1”～“m3”表示使用以C34肽衍生物单体诱导得到的血清时的结果，“t1”～“t3”表示使用以C34肽衍生物三聚体诱导得到的血清时的结果。
图17是表示C34肽衍生物三聚体对HIV感染的抗HIV活性的图。“C34”表示使用C34天然肽单体时的结果，“C34REG”表示使用C34肽衍生物单体时的结果，“triC34e”表示使用C34肽衍生物三聚体时的结果。横轴表示各肽的浓度（μM），纵轴表示各情况下的p24量（ng/mL）。
具体实施方式
1.HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法
本发明的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法（以下，也仅表示为“本发明的肽的合成方法”。）包括合成识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽的方法，其特征在于，包括如下工序：合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物（以下，也仅表示为“C34肽衍生物”。）的工序；和通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物（以下，也仅表示为“本发明中的模板化合物”。）与上述C34肽衍生物结合，合成C34肽衍生物的三聚体的工序。
本发明中的C34肽衍生物是指：在C34肽的氨基酸序列（序列号1）中，由1或2个以上（优选2～15个、更优选2～10个、进一步优选2～5个）的氨基酸被取代、缺失、插入而得到的氨基酸序列构成、且可以用于HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成的肽。作为上述的C34肽衍生物，可以优选例示在C34肽的C末端侧配置有可以与本发明中的模板化合物连接的连接位点（优选硫酯基）的肽，其中，可以更优选例示在C34肽的序列和C末端侧和连接位点之间导入有用于防止空间位阻引起的反应性降低的间隔氨基酸残基（优选Gly残基）1～20个氨基酸残基（优选1～10个氨基酸残基、更优选1～5个氨基酸残基、特别优选1个氨基酸残基）的肽、及在C34肽的序列和C末端侧和连接位点之间导入有用于增强水溶性的亲水性氨基酸残基（优选Arg残基、Glu残基）1～20个氨基酸残基（优选2～18个氨基酸残基、更优选3～12个氨基酸残基、特别优选6个氨基酸残基）的肽，其中，可以进一步优选例示同时导入有上述间隔氨基酸残基及亲水性氨基酸残基的肽，其中，可以更优选例示从N末端侧依次配置有C34肽的序列、亲水性氨基酸残基、间隔氨基酸残基、连接位点的肽，其中，可以特别优选例示下述通式（3）所示的化合物。
Figure BDA0000392475280000121
需要说明的是，某种特定的C34肽衍生物是否可以用于HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成，可以通过研究该肽是否能够诱导识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体来确认。
在本发明的肽的合成方法中，在合成C34肽衍生物的工序中，为了合成C34肽衍生物，可以使用Fmoc固相多肽合成（Fmoc solid-phasepeptide synthesis；SPPS）（参照Hirokazu Tamamura et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry6（1998）1033-1041及“Solid phase peptidesynthesis-a practical approach”by E Atherton&R C Sheppard IPIPRESS）。即，根据固相合成法，通过重复作为主链氨基的保护基的9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethoxycarbonyl；Fmoc）基的选择性脱保护和缩合反应的操作，最后进行从树脂的脱树脂、脱保护，能够合成目的肽。
在本发明中，在合成C34肽衍生物的三聚体的工序中可使用本发明中的模板化合物。作为本发明中的模板化合物，可以优选例示下述通式（1）（式中，X表示正整数）所示的化合物或其盐。
Figure BDA0000392475280000131
作为上述X，从更接近于天然的gp41蛋白质中的C34的三聚体的结构并得到C34肽衍生物的三聚体的观点出发，优选为1～10的范围内的整数，更优选为2～8的范围内的整数，进一步优选为2～6的范围内的整数，更优选为3～5的范围内的整数，特别优选为4。若使用上述的模板化合物，则可以将C34肽衍生物简便且在类似于天然结构的结构中进行三聚体化。本发明中的模板化合物的末端的Cys部分可以在与C34肽衍生物的自然化学连接中利用。
本发明中的模板化合物可以为酸加成盐或碱加成盐等盐的形态。例如，作为酸加成盐，可以列举：盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等无机酸盐及草酸盐或酒石酸盐等有机酸盐。另外，作为碱加成盐，可以列举：钠盐、钾盐、镁盐或钙盐等金属盐及铵盐或三乙基胺盐或乙醇胺盐等有机胺盐等。另外，本发明中的模板化合物只要可以在本发明中使用，则可以具有1或2个以上的任意的取代基。在具有2个以上的取代基的情况下，这些取代基可以相同或不同。只要可以在本发明中使用，则取代基的存在位置没有限定，可以存在于能够取代的任意的位点。取代基的种类没有特别限定。本发明中的模板化合物可以利用例如后述的实施例1（3）记载的方法来制作。
在通过将本发明中的C34肽衍生物与本发明中的模板化合物结合而合成C34肽衍生物的三聚体的工序中，为了形成C34肽衍生物的三聚体，可以使用自然化学连接反应（Dawson,P.E.,Muir,T.W.,Clark-Lewis,I.,and Kent,S.B.H.（1994）Synthesis of proteins by nativechemical ligation.Science266,776-779.；Dawson,P.E.,Churchill,M.J.,Ghadiri,M.R.,and Kent,S.B.H.（1997）Modulation of reactivity innative chemical ligation through the use of thiol additives.J.Am.Chem.Soc.119,4325-4329.）。即，自然化学连接反应作为以下方法而通用，
即，使用C末端进行了硫酯化的肽与在N末端导入有Cys的肽，使2个肽段缩合而得到长肽链的方法。首先，C末端的硫酯与苯硫酚发生酯交换反应，变换为反应性更高的硫酯（图5a）。接着，N末端Cys的硫醇基对活性酯的羰基进行亲核攻击（图5b），其后，通过自发的S、N酰基转位，在与天然相同的位点上形成酰胺键（图5c及d）。由于在NCL法中能够将肽的C末端用于结合，且能够在中性附近的温和条件下进行反应，因此特别适合本发明的肽的合成方法。可以认为，本发明中的C34肽衍生物与本发明中的模板化合物以图6所示的机制进行反应，生成C34肽衍生物三聚体。
作为上述自然化学连接反应的方法，可以优选例示以下方法，即，通过将本发明中的模板化合物和本发明中合成的C34肽衍生物在缓冲液中、更优选在溶解有三(2-羧乙基)膦盐酸盐（tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP·HCl）（773μg、2.67μmol）及苯硫酚（9μL、89μmol）的0.1M磷酸钠缓冲液（含有60μL、pH8.5、6M尿素及2mM EDTA）中进行搅拌，使带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与上述C34肽的衍生物结合而合成C34肽的衍生物的三聚体的方法。上述的自然化学连接反应在C34肽衍生物的C末端侧的连接位点（优选硫酯基）与本发明中的模板化合物的Cys中特异性地发生，可以使用HPLC、ESI-TOF-MS跟踪反应的过程，探测反应结束。
2.HIV立体结构识别抗体诱导肽
作为本发明的HIV立体结构识别抗体诱导肽（以下，也仅表示为“本发明的肽”。），只要是以通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物、HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子结合为特征的识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，就没有特别限制，可以优选例示下述通式（4）（式中，X表示正整数，Monomer表示下述通式（5）所示的化合物。）所示的肽（C34肽衍生物的三聚体）。其中，Monomer在G的部分与通式（4）的化合物的Monomer以外的部分结合。
Figure BDA0000392475280000151
作为上述通式（4）中的X，从更接近于天然的gp41蛋白质中的C34的三聚体的结构并得到C34肽衍生物的三聚体的观点出发，优选为1～10的范围内的整数，更优选为2～8的范围内的整数，进一步优选为2～6的范围内的整数，更优选为3～5的范围内的整数，特别优选为4。
3.HIV立体结构识别抗体的诱导方法及HIV立体结构识别抗体
作为本发明的HIV立体结构识别抗体的诱导方法（以下，也仅表示为“本发明的诱导方法”。），只要是使用本发明的肽将宿主动物致敏，诱导针对该肽的抗体（以下，也仅表示为“本发明的抗体”。）的方法，就没有特别限制。使用肽诱导针对该肽的抗体的方法可以使用现有公知的方法。利用本发明的诱导方法诱导的本发明中的抗体为识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体。本发明的抗体包括人抗体。在此，在本发明中，“人抗体”是指作为来自人的抗体基因的表达产物的抗体。人抗体可以通过对导入人抗体基因座而具有产生来自人的抗体的能力的转基因动物投与本发明的肽来得到。作为该转基因动物的实例，可列举例如小鼠。作为可以产生人抗体的小鼠，可以列举例如：缺少内源性小鼠免疫球蛋白（Ig）重链及小鼠κ轻链，且同时保持含有人Ig重链基因的14号染色体片段（SC20）及人Igκ链转基因（KCo5）的小鼠。该小鼠通过具有人Ig重链基因座的A系小鼠和具有人Igκ链转基因的B系小鼠的交配来制作。A系为对于内源性Ig重链及κ轻链破坏的两者而言为纯合子，保持有可以传递给后代的14号染色体片段（SC20）的小鼠系（Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,2000Vol97:722）。另外，B系为对于内源性小鼠Ig重链及κ轻链缺损的两者而言为纯合子，保持由人Igκ链转基因（KCo5）的小鼠系（NatBiotEChnol.,1996Vol14:845）。
另外，多克隆抗体、单克隆抗体及其功能性片段的任一种，只要是识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体，则为本发明中的抗体。本发明的抗体的功能性片段是指：对于本发明的抗体特异性地结合的抗原可特异性结合的抗体的片段，更具体而言，可列举F（ab’）2、Fab’、Fab、Fv、二硫键稳定性FV（disulphide-linked FV）、单链FV（Single-Chain FV；scFV）及它们的聚合物等（D.J.King,Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies,1998T.J.International Ltd）。这样的抗体片段可以利用惯用法，例如利用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶对抗体分子的消化或公知的基因工程的方法来得到。
本发明的多克隆抗体可以利用例如以下所述的方法而制造。通过将本发明的肽根据需要与免疫佐剂（Freund's Adjuvant等）同时免疫小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物来得到。本发明的单克隆抗体可以通过如下方法来取得，即，由从免疫致敏动物得到的抗体产生细胞和没有自抗体产生能力的骨髓瘤系细胞（骨髓瘤细胞）制备杂交瘤，将杂交瘤克隆化，选择产生对于用于免疫的抗原显示特异性亲和性的单克隆抗体的克隆。该杂交瘤的制备可以根据
Figure BDA0000392475280000161
及Milstein等的方法（Nature,1975Vol.256:495-497）而进行。产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可以通过如下方法来进行，即，将杂交瘤在例如微量滴定板中进行培养，使用例如ELISA等酶免疫测定法、放射免疫分析、荧光抗体法等免疫学的方法测定对于看到了增殖的孔中的培养上清液的免疫抗原的反应性。
由杂交瘤制造单克隆抗体可以将杂交瘤在体外进行培养，从培养上清液中分离。另外，也可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等的腹水中等中进行体内培养，从腹水中分离。另外，可以从杂交瘤等抗体产生细胞克隆编码单克隆抗体的基因，插入适当的载体中，将其导入宿主（例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等）中，使用基因重组技术制备重组型抗体（P.J.Delves,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES,1997WILEY、P.Shepherd and C.Dean,MonoclonalAntibodies,2000OXFORD UNIVERSITY PRESS、J.W.Goding,Monoclonal Antibodies:principles and practice,1993ACADEMICPRESS）。
而且，也可以使用转基因动物制作技术制作在内源性基因中重组有目的抗体的基因的转基因牛、山羊、绵羊或猪，从该转基因动物的奶中大量地取得来自该抗体基因的抗体。
产生的抗体可以通过适当组合在该领域中众所周知的方法，例如利用蛋白A柱的色谱、离子交换色谱、疏水色谱、硫酸铵盐析法、凝胶过滤、亲和色谱等来精制。
4.HIV感染症的预防和／或治疗剂
本发明的HIV感染症的预防和／或治疗剂（以下，也仅表示为“本发明的药剂”。）只要以本发明的抗体或本发明的肽为有效成分，就没有特别限制。本发明的肽诱导的本发明的抗体具有优异的抗HIV活性及对于HIV感染的优异的中和活性，因此，本发明的药剂能够适合用作HIV感染症的预防和／或治疗剂。另外，本发明的药剂中包括以本发明的肽作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗用疫苗。
在以本发明的药剂中含有的本发明的抗体、本发明的肽作为有效成分制备HIV感染症的预防和／或治疗剂的情况下，可以采用在以肽、抗体作为有效成分的感染症的预防和／或治疗剂中通常采用的制剂形态。例如，可以使用在以肽、抗体作为有效成分的感染症的预防和／或治疗剂或疫苗中通常采用的制剂的形态或辅助剂、添加剂。
作为本发明的药剂中的本发明的抗体、本发明的肽的含量，只要可得到所期望的HIV感染症的预防效果及治疗效果，就没有特别限制，例如，可以相对于药剂的总量设定为0.00001～90质量%、优选0.0001～70质量%、更优选0.001～50质量%。
作为本发明的药剂的给药方法，只要可以得到所期望的HIV感染症的预防效果及治疗效果，就没有特别限制，可以例示静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药等。另外，本发明的药剂的给药量、给药次数及给药浓度可以根据给药对象的体重等适当调节。
本发明中的HIV感染症只要为感染了HIV的状态，其症状的有无及程度没有特别限制，包含急性期的状态、无症候期的状态、AIDS的状态的任一种。另外，本发明的药剂具有的HIV感染症的预防效果中包含预防HIV的感染本身的效果及预防AIDS的发病的效果的任一种，本发明的药剂具有的HIV感染症的治疗效果中包含减轻来自HIV感染的症状的效果，其中，优选包含减轻AIDS的症状的效果。
另外，作为成为本发明的药剂的给药对象的哺乳动物，没有特别限制，可以优选例示人、猴子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、猪、马、兔、绵羊、山羊、猫、狗等，其中，可以更优选例示人。
此外，作为本发明的其它方式，也可以例示如下方法：用于在HIV感染症的预防和／或治疗中使用的本发明的抗体或肽、在HIV感染症的预防和／或治疗中使用本发明的抗体或肽的方法；通过将本发明的抗体或肽给药于对象，预防和／或治疗HIV感染症的方法。这些发明中的词句的内容及其优选的方式如上上述。
以下，利用参考例及实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限定于下述实施例的范围。
实施例1
［C34肽衍生物三聚体的设计、合成］
（1）C34肽衍生物三聚体的设计
作为目的的抗原分子C34肽衍生物三聚体如下设计，即，模拟了C34肽的肽（C34肽衍生物）在配置3个该肽的模板化合物中分别合成，并将它们结合（图7）。C34肽认为是在与N36肽形成6螺旋束（6-helicalbundle）时，从C34肽的N末端侧与N36肽相互作用。因此推定：为了诱导在更早期的阶段抑制HIV的膜融合的抗体，识别C34肽的N末端侧区域的抗体是重要的。因此，为了在更接近于天然的状态下保持C34肽的N末端侧区域，将C34的C末端侧设定为与C3对称性模板化合物的结合位点（图7）。
（2）C34肽衍生物的设计、合成
作为C34肽衍生物三聚体的构成片段用的C34肽衍生物，设计了C34肽衍生物1（C34衍生物1）（图8），作为模拟了C34肽单体的比较例用抗原分子，设计了C34肽衍生物2（C34衍生物2）（图9）。关于C34衍生物1，为了使水溶性提高，对C34天然氨基酸序列的C末端侧赋予了作为亲水性氨基酸的Arg（R）和Glu（E）的重复序列。另外，为了减轻与模板化合物结合时的空间位阻，作为间隔，在亲水性氨基酸的重复序列的C末端导入Gly（G）。而且，为了导入与C3对称性模板结合所需要的连接位点，做成将C末端进行了硫酯化的设计（图8）。另一方面，关于C34衍生物2，由于不与模板化合物结合，所以设为在C34衍生物1中不导入连接位点的序列（图9）。
C34衍生物1及C34衍生物2的合成及鉴定具体而言用如下的方法进行。从Novabiochem公司、国产化学株式会社及渡边化学工业株式会社购入作为肽合成用的含有Fmoc保护氨基酸的化学试剂，使用NovaSyn（注册商标）TGR树脂（0.23mmol/g、0.20mmol刻度）合成C34关联肽。接着，按照手册合成固相肽。另外，作为侧链保护氨基酸，对于Lys使用Boc，对于Arg使用Pbf，对于Asp及Glu使用Obut，对于Asn及Gln使用Trt，对于Ser、Thr及Tyr使用But。肽完全利用Fmoc-化学法制备。各循环包含：（i）脱保护（20%哌啶／DMF）15分钟和（ii）DMF中与5当量的Fmoc-氨基酸（Fmoc-AA-OH）、HOBt及DIPCI偶联90分钟。通过凯泽茚三酮（Kaiser ninhydrin）试验研究了偶联效率，结果为阴性，因此暗示游离氨基的存在量低于0.05%。在凯泽试验的结果为弱阳性的情况下，使用由Fmoc氨基酸（3当量）、HOBt（3当量）、DIPEA（6当量）及HBTU（2.9当量）构成的混合物重复偶联步骤（双重偶联）。保护肽的构筑结束后，将树脂充分地清洗（DMF及MeOH），真空干燥6小时。
［C34衍生物2］为了合成C34衍生物2，使用TFA、茴香硫醚、乙烷二硫醇、间甲酚、H2O及三异丙基硅烷的混合液（10／0.75／0.75／0.25／0.25／0.1，v/v）（40mL），在室温下处理90分钟，由此，从树脂中切取合成肽。过滤该反应混合液，用TFA清洗树脂（50mL×3次）。使滤液及清洗液真空蒸发，使肽沉淀，用冷Et2O清洗3次。用反相HPLC精制得到的粗肽，得到C34衍生物2。
［C34衍生物1］为了合成C34衍生物1，使用TFE、醋酸及二氯甲烷的混合液（1／1／3、v/v）（67mL），在室温下处理120分钟，由此从树脂中切取合成肽。过滤该反应混合液，用二氯甲烷清洗3次树脂。使滤液及清洗液真空蒸发，使肽作为固体沉淀。将未精制的保护肽（522mg）在DMF（1.5mL）中利用3-巯基丙酸乙酯（20当量）、HOBt·H2O（10当量）及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺（EDCI·HCl）（10当量）在0℃下进行硫酯化1.5小时。将该反应混合液在室温下搅拌一夜，在减压下进行浓缩。在该残留物中加入H2O（50mL），将得到的沉淀物用H2O清洗3次。将得到的肽（692mg）利用TFA／茴香硫醚／间甲酚／H2O／三异丙基硅烷（TIS）（8.81／0.50／0.32／0.32／0.05、v/v）（30mL）在室温下处理2小时。进行真空蒸发，使未精制的肽-硫酯在冷Et2O（50mL）中沉淀，用冷Et2O清洗3次，利用反相HPLC精制，得到C34衍生物1。
使精制的C34衍生物1及C34衍生物2这两种肽进行冷冻干燥，利用ESI-TOF-MS尝试鉴定。ESI-TOF-MS如下进行。使用Bruker AV500分光计记录1H NMR谱。化学位移用相对于作为内部标准的Me4Si（CDCl3中）的δ（ppm）表示。使用JMS-T1000LC AccuTOF及BruckerDaltonics microTOF-2focus，用正和负检测模式记录低分解能和高分解能的质谱。在快速色谱中使用Wakogel C-200（和光纯药工业株式会社制）及silica gel60N（关东化学株式会社制）。作为分析用HPLC，将Cosmosil5C18-ARII柱（4.6×250mm、Nacalai Tesque株式会社制）在JASCO PU-2089plus（日本分光株式会社（英文名称为JASCO）制）上，以流速1cm3/min－1使用含有0.1%（v/v）TFA的CH3CN的直线梯度，用220nm的紫外线检测其洗脱物。作为分取HPLC，将Cosmosil5C18-AR II柱（10×250nm、Nacalai Tesque株式会社制）在含有JASCOPU-2089plus（JASCO公司制）上，以流速3cm3/min－1使用0.1%（v/v）TFA的CH3CN的适当的梯度模式。以下表示在这样的条件下对C34衍生物1及C34衍生物2进行ESI-TOF-MS分析的结果。C34衍生物2：C219H341N66O77S［M＋H］＋的m/z计算值5159.5、实测值5160.1（5.3mg、收率1%）。C34衍生物1：C224H349N66O78S2［M＋H］＋的m/z计算值5275.5、实测值5275.6（11.3mg、收率1%）。这样，C34衍生物2、C34衍生物1均以收率1%得到。
（3）模板化合物的设计、合成
模板化合物设定为在C34肽的C末端导入。模板化合物具有C3对称性的特征，以使其能够较高地反映天然的C34肽三聚体结构。另外，为了提高水溶性，在该模板化合物的接头上导入聚乙二醇（PEG）基，另外，导入与C34衍生物1的C末端硫酯的缩合所需要的Cys（图10）。以图11所示的方案进行该模板化合物的合成。具体而言，用如下的方法进行。
1）化合物2的合成
图11中的化合物2的合成如下进行。在含有NaH（矿物油中60%分散物208mg、5.21mmol）的干燥THF（2mL）中，在0℃下用10分钟添加含有三-［3-{2-（双-［2-乙氧基］）-乙酰基}-丙氧基］-硝基甲烷（439mg、0.69mmol）的干燥THF溶液（4mL）。将该混合液在0℃下搅拌10分钟。在该反应混合液中，在0℃下用10分钟添加含有（3-溴-丙基）-氨基甲酸叔丁酯（992mg、4.17mmol）的干燥THF溶液（1.5mL）。将该反应混合液在室温下搅拌一夜，用硅藻土垫过滤。将该过滤溶液在减压下进行浓缩，使用CHCl3-MeOH（50／1）在硅胶上供色谱，作为无色油，得到目标化合物2（425mg、收率88%）。
1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ＝1.44（s，27H），1.48（m，6H），1.76（q，6H），1.95-1.99（m，6H），3.22-3.25（m，6H），3.44（t，6H），3.52-3.66（m，42H）；13C-NMR（400MHz）δ＝156.0（3C），94.1，78.7（3C），70.6（3C），70.5（3C），70.5（3C），70.1（3C），70.1（3C），69.5（3C），66.5（3C），38.5（3C），32.2（3C），29.6（3C），28.4（9C），24.0（3C），22.2（3C）；C52H102N4NaO20［M＋Na］＋的HRMS（ESI）m/z计算值1125.6985，实测值1125.6980
2）化合物3的合成
图11中的化合物3的合成如下进行。将在4M的HCl／1,4-二噁烷（1mL）中加入有化合物2（118mg、0.11mmol）的溶液在室温下搅拌5小时。在减压下进行浓缩，作为无色油，得到粗化合物3（104mg），不进行精制而供于以下的步骤。
3）化合物4的合成
图11中的化合物4的合成如下进行。将在干燥DMF（0.45mL）中加入有化合物3（95.9mg、0.12mmol）及三乙基胺（0.17mL、1.18mmol）的混合液在室温下搅拌10分钟，在该反应混合液中添加含有Boc-Cys（Trt）-OH（183mg、0.39mmol）及HOBt·H2O（60.3mg、0.39mmol）的干燥DMF溶液（0.40mL），在室温下搅拌10分钟。在该混合液中添加EDCI·HCl（75.5mg、0.39mmol），在室温下搅拌过夜。将得到的混合液用醋酸乙酯稀释之后，用饱和水性NaHCO3及盐水清洗，在Na2SO4上进行干燥。在减压下进行浓缩，使用CHCl3-MeOH（30／1）在硅胶上供给色谱，作为无色油，得到化合物4（147mg、收率58%）。
1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ＝1.45-1.49（m，6H），1.57-1.60（m，6H），1.73（q，6H），1.92-1.96（m，6H），3.29（m，6H），3.43（t，6H），3.52-3.62（m，42H），4.98（s，3H），7.19-7.41（m，45H）；13C-NMR（400MHz）δ＝170.2（3C），144.5（3C），129.6（27C），128.0（18C），126.8（9C），94.1，80.1（3C），70.7（3C），70.6（3C），70.5（6C），70.5（6C），70.2（3C），69.4（3C），67.0（3C），37.5（3C），34.3（3C），32.2（3C），29.0（9C），28.3（3C），24.0（3C）；C118H159N7NaO23S3［M＋Na］＋的HRMS（ESI）m/z计算值2161.0547，实测值21621.0543
4）化合物5的合成
图11中的化合物5（作为目的的模板化合物）的合成如下进行。将在TFA、H2O、乙烷二硫醇及三异丙基硅烷（90／5／2.5／2.5、v/v）的混合液中加入有化合物4（103mg、0.048mmol）的溶液在室温下搅拌3小时，在减压下进行浓缩。在残留物中添加Et2O（15mL）。将得到的沉淀物通过离心分离进行回收，除去上清液。其后，将沉淀物用Et2O清洗3次。用分取HPLC进行精制，作为无色油，得到化合物5（作为目的的模板化合物）（28.8mg、收率54%）。
1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ＝1.41（s，27H），1.44-1.48（m，6H），1.76（q，6H），1.95-1.97（m，6H），2.94-3.04（m，6H），3.19-3.36（m，6H），3.48-3.63（m，48H），4.07（t，3H）；13C-NMR（400MHz）δ＝167.7（3C），70.3，69.6（15C），69.4（3C），69.2（3C），68.3（3C），54.6（3C），36.7（3C），31.6（3C），28.2（3C），24.8（3C），23.1（3C）；C46H94N7O17S3［M＋H］＋的HRMS（ESI）m/z计算值1112.5868，实测值1112.5858
（4）C34肽衍生物三聚体的合成
准备在上述实施例1（2）中合成的C34衍生物1和在上述实施例1（3）中合成的模板化合物，接着，进行C34衍生物1和模板化合物的结合。在结合中选择自然化学连接（Native Chemical Ligation；NCL）法（Dawson,P.E.,Muir,T.W.,Clark-Lewis,I.,and Kent,S.B.H.（1994）Synthesis of proteins by native chemical ligation.Science266,776-779.；Dawson,P.E.,Churchill,M.J.,Ghadiri,M.R.,and Kent,S.B.H.（1997）Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thioladditives.J.Am.Chem.Soc.119,4325-4329.）。NCL法的概要如图5所示。可以认为，合成的模板化合物和C34衍生物1通过图6所示的机制进行反应，生成C34肽衍生物三聚体（C34Trimer）。
C34肽衍生物三聚体的合成及鉴定具体而言用如下的方法进行。将TCEP·HCl（773μg、2.67μmol）及苯硫酚（9μL、89μmol）在0.1M磷酸钠缓冲液（含有60μL、pH8.5、6M尿素及2mM EDTA）中，在氮氛围下溶解，在其中加入作为化合物5的模板化合物（100μg、0.090μmol）、C34衍生物1（1.77mg、0.30μmol）及乙腈20μL。在37℃下在搅拌下反应5小时，用HPLC观察反应过程。图12表示从反应开始经过3小时后的HPLC图。将C34肽衍生物三聚体作为单峰进行分离。而且，利用反相HPLC进行C34肽衍生物三聚体的精制。在反相HPLC中，使用乙腈（0.1%TFA）的33～43%直线梯度洗脱40分钟。图13表示其HPLC图等。以收率17%得到精制C34肽衍生物三聚体。用ESI-TOF-MS鉴定了该精制C34肽衍生物三聚体
C703H1108N205O245S6［M＋H］＋的m/z计算值16533.9，实测值16542.6
为了加盖半胱氨酸残基的硫醇基，利用含有碘乙酰胺（777μg、4.2μmol）的0.1M磷酸钠缓冲液（含有74μL、pH7.8、6M尿素及5mMEDTA）对C34肽衍生物三聚体（368μg、0.02μmol）在室温下进行处理。但是，在HPLC及ESI-TOF-MS分析中没有观察到反应，暗示半胱氨酸残基的硫醇基为非反应性。为了研究是否通过C34肽衍生物三聚体的半胱氨酸残基间的二硫醚交联形成二聚物或低聚物，将C34肽衍生物三聚体的分子量在还原条件及非还原条件下进行测定。其结果暗示，在缓冲液条件下，C34肽衍生物三聚体的大部分作为单体（单一的C34肽衍生物三聚体）存在。
实施例2
［C34肽衍生物三聚体的二维结构分析］
为了进行C34肽衍生物三聚体的二维结构分析，进行圆偏光二色性（CD）光谱的测定。具体而言，用如下的方法进行。将上述实施例1得到的C34肽衍生物三聚体（最终浓度2μM）溶解于PBS（50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.2）。在具备温度调节器的J-720圆偏光二色性分光计（JASCO公司制）中固定该溶解液，其摩尔椭圆率［θ］的波长依赖性在25℃下、195～250nm下进行观察。另外，取代C34肽衍生物三聚体（最终浓度2μM），使用由上述实施例1得到的C34肽衍生物单体（C34衍生物2）（最终浓度6μM），用同样的方法测定CD光谱。图14（A）表示其结果。
C34肽衍生物三聚体的CD光谱（图14（A）中的实线）及C34肽衍生物单体的CD光谱（图14（A）中的虚线）均以约200nm显示了极小值。约200nm附近的负的极大为无规卷曲结构的特征，因此暗示，C34肽衍生物三聚体及C34肽衍生物单体形成无规卷曲结构。在以前的文献中报道了N36的单体（N36RE）及N36的三聚体（triN36e）形成高度的α-螺旋性，就螺旋含量而言，与N36RE相比，triN36e更多（Nakahara,T.,Nomura,W.,Ohba,K.,Ohya,A.,Tanaka,T.,Hashimoto,C.,Narumi,T.,Murakami,T.,Yamamoto,N.,and Tamamura,H.（2010）Remodeling of dynamic structures of HIV-1envelope proteins leads tosynthetic antigen molECules inducing neutralizing antibodies.Bioconjugate Chem.21,709-714.；Chan,D.C.,Chutkowski,C.T.,andKim,P.S.（1998）Evidence that a prominent cavity in the coiled coil ofHIV type1gp41is an attractive drug target.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,15613-15617.）。由这些结果暗示，来自C34的单体肽及三聚体肽与来自N36的肽相比，倾向于形成无规卷曲结构。
而且，为了评价C34肽衍生物三聚体与N36肽的相互作用，测定来自作为N36由来肽的N36肽衍生物单体（参照以下的N36RE）和C34肽衍生物（三聚体或单体）的混合物的CD光谱。
Figure BDA0000392475280000251
具体而言，用如下的方法进行。准备含有C34肽衍生物单体（最终浓度6μM）和N36肽衍生物单体（最终浓度6μM）的PBS溶解液，用与上述的方法同样的方法测定了CD光谱。另外，对于含有C34肽衍生物三聚体（最终浓度2μM）和N36肽衍生物单体（最终浓度6μM）的PBS溶解液，也用同样的方法测定了CD光谱。而且，对于仅含有N36肽衍生物单体（最终浓度6μM）的PBS溶解液，也用同样的方法测定了CD光谱。图14（B）表示这些结果。在C34肽衍生物单体和N36肽衍生物单体的肽混合物的CD光谱（图14（B）中的虚线）及C34肽衍生物三聚体和N36肽衍生物单体的肽混合物的CD光谱（图14（B）中的实线）中，均出现2次极小值208nm和222nm，因此显示两种肽混合物形成α-螺旋。另外，由图14（B）的结果显示，C34肽衍生物三聚体和N36肽衍生物单体的肽混合物中的螺旋含量比C34肽衍生物单体和N36肽衍生物单体的肽混合物中的螺旋含量少。由此证明，在C34肽衍生物三聚体中，3条肽链通过共价键而聚集，因此，与C34肽衍生物单体相比，与N36的相互作用比较困难。
实施例3
［C34肽衍生物的抗体诱导实验］
为了确认C34肽衍生物三聚体的抗体诱导能力，使用C34肽衍生物三聚体及C34肽衍生物单体尝试抗体诱导实验。具体而言，用如下的方法进行。从三协实验室服务株式会社购入BALB/c系的6周龄的雄性小鼠，在不含有特定病原体的条件下在动物施设中进行饲养。弗氏不完全佐剂及PBS使用从和光纯药工业株式会社购入的制品。另外，DMSO（无内毒素）使用从Sigma-Aldrich社购入的制品。以下的实验方案由东京医科牙科大学的伦理委员会承诺。
将100μg的C34肽衍生物三聚体溶解于50μL的PBS中。在该溶液中添加弗氏不完全佐剂50μL并进行混合。将该混合液在第0、7、14、21及28日对麻醉下的各小鼠进行皮下注射。在进行免疫的1周前进行采血，另外，在从免疫至第5、12、19、26及33天进行采血。将以上各血液在4℃下进行离心分离（1500rpm）10分钟而分离血清。将该血清在56℃下加热30分钟，使补体失活。各血清在使用之前在－80℃下保存。另外，取代C34肽衍生物三聚体，使用同重量的C34肽衍生物单体，且在50μL的PBS中溶解于1μL的DMSO，除此之外，用相同的方法得到血清。
实施例4
［将C34肽衍生物免疫而得到的血清的抗体值的评价］
作为用于评价由上述实施例3得到的血清的抗体值的体系，采用ELISA法。即，用对于包被的合成抗原的血清效价来评价由上述实施例3得到的从免疫至第33天的血清的抗体值及选择性。具体而言，用以下的方法进行。
首先，进行试剂的准备。Tween-20（聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单月桂酸）及30质量%过氧化氢从和光纯药工业株式会社购入。2,2-叠氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）从Sigma-Aldrich公司购入。抗小鼠IgG（H＋L）（山羊）-HRP抗体从EMD Chemicals公司（加利福尼亚州圣地亚哥）购入。接着，使用以10μg/mL含有合成肽（C34肽衍生物三聚体或C34肽衍生物单体）的PBS25μL将96孔的微孔板在4℃下包被过夜。将包被的微孔板用去离子水清洗10次之后，使用含有150μL的封闭液（含有5质量%脱脂牛奶的0.02质量%的PBST（含有0.02质量%Tween20的PBS））在37℃下进行封闭1小时。将该微孔板用去离子水清洗10次。另一方面，将由上述实施例3得到的各小鼠血清用含1质量%脱脂牛奶的0.02质量%PBST稀释，对各血清制作从200倍至409600倍的2倍稀释系列。分别在上述的微孔板的各孔中添加这些各稀释液各50μL，在37℃下孵育2小时。接着，将这些微孔板用去离子水清洗10次。接着，在各孔中分别添加用0.02质量%PBST稀释至2000倍的HRP结合抗小鼠IgG抗体（2次抗体）溶液各25μL，孵育45分钟。然后，将该微孔板清洗10次。接着，在各孔中分别添加通过在HRP染色缓冲液200μL（0.5M柠檬酸缓冲液（pH4.0、1mL）、H2O2（3μL）及H2O（8.8mL）的混合液）中溶解10mg的ABTS而制备的HRP基质溶液各25μL。孵育30分钟之后，每1孔添加0.5M的H2SO425μL，使反应停止，在405nm下测定该溶液的吸光度。
通过以上的操作测定了所得到的血清的抗体值。图15（A）表示在微孔板上包被C34肽衍生物单体时的结果，图15（B）表示在微孔板上包被C34肽衍生物三聚体时的结果。图15（A）及（B）的图表中的黑方块表示使用以C34肽衍生物单体诱导而得到的血清时的结果，黑圆表示使用以C34肽衍生物三聚体诱导而得到的血清时的结果。
为C34肽衍生物单体诱导得到的抗体的50%结合血清稀释液的浓度为，相对于包被的C34肽衍生物单体为1.06×10－3，相对于包被的C34肽衍生物三聚体为1.30×10－3，后者的浓度相对于前者的浓度的比率约为1.2倍。另一方面，C34肽衍生物三聚体诱导得到的抗体的50%结合血清稀释液的浓度为，相对于包被的C34肽衍生物三聚体为3.15×10－4，相对于包被的C34肽衍生物单体为7.30×10－3，后者的浓度相对于前者的浓度的比率约为23倍。在本评价中，虽然没有使用精制单克隆抗体，但是，产生的抗体特别是应该显示出对于单体或三聚体的各抗原的结构选择性。该结果强烈暗示，通过合成伴有立体结构的抗原，能够有效地制作具有结构特异性的抗体。
实施例5
［C34肽衍生物三聚体诱导抗血清对HIV感染的中和活性的评价］
为了研究C34肽衍生物三聚体是否具有对HIV感染的中和活性（抑制活性），对由上述实施例3得到的血清进行了p24分析。已知p24为构成HIV-1核的衣壳蛋白，HIV在感染了HIV的生物中增殖时，其生物的血清中的p24浓度上升。在进行p24分析时，首先，进行HIV-1病毒的制备。具体而言，使用如下的方法。
准备作为HIV-1molecular clone的pNL4-3（clade B；X4-tropicvirus）。接着，在加入有10%FBS／DMEM（WAKO公司制）的直径6cm的培养皿中添加293FT细胞，培养至60%融合。利用磷酸钙法将10μg的pNL4-3转导293FT细胞。转导后培养48小时之后，回收培养液的上清液，将用直径0.45μm的过滤器过滤了其上清液的物质作为病毒溶液。将该病毒溶液用液氮骤冷之后，在－80℃以下保存至使用。
通过将含有50ng p24的NL4-3病毒在4℃以2100g进行离心孵育（spinoculation）20分钟，使MT-4细胞（5×104细胞/200μL）感染。从该MT-4细胞清洗除去非结合病毒之后，将MT-4细胞重悬于含有由上述实施例3得到的各小鼠血清10μL的培养基200μL中，接着进行培养。培养时，每2～3天更换培养基的一半。在从感染至第7天，使用p24ELISA试剂盒（PerkinElmer公司制）测定培养上清液中的p24的量（Ohba,K.,Ryo,A.,Dewan,M.Z.,Nishi,M.,Naito,T.,Qi,X.,Inagaki,Y.,Nagashima,Y.,Tanaka,Y.,Okamoto,T.,Terashima,K.,and Yamamoto,N.（2009）Follicular dendritic cells activate HIV-1replication inmonocytes/macrophages through a juxtacrine mechanism mediated byP-selectin glycoprotein ligand1.J.Immunol.183,524-532.）。对各血清各进行3次测定。
图16表示培养上清液中的p24量（pg/mL）。“uninf.”表示非感染细胞时的结果，“cr1”～“cr3”表示使用免疫1周前的血清（对照）时的结果，“m1”～“m3”表示使用以C34肽衍生物单体诱导得到的血清时的结果，“t1”～“t3”表示使用以C34肽衍生物三聚体诱导得到的血清时的结果。由C34肽衍生物单体免疫的小鼠的血清和由C34肽衍生物三聚体免疫的小鼠的血清均显示对于病毒感染的同程度的中和活性。由C34肽衍生物三聚体免疫而得到的血清不仅具有中和活性（参照实施例5），还具有结构特异性（参照上述实施例4），因此，有可能虽然与由C34肽衍生物单体免疫的小鼠的血清和中和活性为同程度，但含有的抗体组本质上不同，中和机理也本质上不同，可以认为，由C34肽衍生物三聚体免疫而得到的结构特异的单克隆抗体对于gp41简单的氨基酸的差异／变异具有抵抗性。因此，可以认为，与本发明的发明人等此前表达的N36肽衍生物三聚体（Nakahara,T.,Nomura,W.,Ohba,K.,Ohya,A.,Tanaka,T.,Hashimoto,C.,Narumi,T.,Murakami,T.,Yamamoto,N.,and Tamamura,H.（2010）Remodeling of dynamicstructures of HIV-1envelope proteins leads to synthetic antigen molECulesinducing neutralizing antibodies.Bioconjugate Chem.21,709-714.）同样，C34肽衍生物三聚体作为新分类的HIV-1疫苗有效地发挥作用。
实施例6
［C34肽衍生物三聚体的抗HIV活性的评价］
为了研究C34肽衍生物三聚体是否具有抗HIV活性，进行了使用TZM-bl细胞的病毒融合抑制分析。在TZM-bl细胞中插入有与HIV-1的LTR（long terminal repeat）序列连结的虫荧光素酶基因，可以基于虫荧光素酶信号检测HIV-1的感染。具体而言，病毒融合抑制分析用以下的方法进行。在含有5ng p24的NL4-3病毒及稀释系列肽的情况下培养TZM-bl细胞（2×104细胞/100μL）。培养48小时后，将TZM-bl细胞溶解，使用Steady-Glo虫荧光素酶分析体系（Promega公司制）测定了虫荧光素酶活性（Platt,E.J.,Wehrly,K.,Kuhmann,S.E.,Chesebro,B.,and Kabat,D.（1998）EffECts of CCR5and CD4cellsurface concentrations on infection by macrophage tropic isolates of humanimmunodeficiency virus type1.J.Virol.72,2855-2864.）。基于虫荧光素酶活性的测定值，算出各肽的EC50（μM）。另外，基于该病毒融合抑制分析中的TZM-bl细胞的生存率的减少，算出各肽的CC50（μM）。此外，作为稀释系列肽的肽，除了C34肽衍生物三聚体（triC34e）、C34肽衍生物单体（C34REG）之外，也使用了C34天然肽单体（C34）（从C34肽衍生物单体中除去了RE的重复序列和G残基的单体）。
表1表示由该病毒融合抑制分析算出的EC50（μM）及CC50（μM）的结果。其中，表1的数值均表示至少重复3次以上实验而得到的数据的平均值。
［表1］
Figure BDA0000392475280000301
如表1的EC50所示，即使C34肽衍生物单体（C34REG）也显示很强的抗HIV活性（病毒融合抑制活性），但C34肽衍生物三聚体（triC34e）进一步显示其100倍的显著的抗HIV活性。三聚体肽特别是应该具有格外强力的抗HIV活性，显示三聚体形态作为抑制剂的活性结构是重要的。另一方面，如表1的CC50所示，在15μM的C34肽衍生物单体（C34REG）及5μM的C34肽衍生物三聚体（triC34e）的情况下，没有观察到细胞毒性。
实施例7
为了研究C34肽衍生物三聚体是否具有抗HIV活性，采用与上述实施例6同样的方法进行了使用MT-4细胞的分析。使含有1ng p24的NL4-3病毒感染MT-4细胞（5×10,000cells），在5%CO2存在下，在4℃下孵育30分钟。离心沉淀后，除去培养上清液，在MT-4细胞中加入含有进行了阶段稀释的肽溶液的150μL的培养基。在5%CO2存在下，在37℃下培养3天。使用市售的ELISA kit（ZeptoMetrix Corp.,Buffalo,NY）测定培养后的培养上清液中的p24浓度（ng/mL）。图17及表2表示其结果。由图17得知，使用C34肽衍生物三聚体（C34tri）时，与使用C34天然肽单体（C34peptide）及C34肽衍生物单体（C34monomer）时相比，p24浓度显著地降低。表2表示由以上结果算出的EC50（μM）。其中，表2的数值均表示至少重复3次以上实验而得到的数据的平均值。在C34天然肽单体（C34）及C34肽衍生物单体（C34REG）的情况下，其为1μM以上，与此相对，在C34肽衍生物三聚体（triC34e）的情况下，约为50nM。由此，C34肽衍生物三聚体（triC34e）相对于C34天然肽单体（C34）及C34肽衍生物单体（C34REG）分别显示具有约30倍或约20倍的优异的抗HIV-1活性。
［表2］
C34 C34REG triC34e
EC50(μM) 1.59 1.06 0.0547
需要说明的是，作为进行过临床试验的已知的抗HIV活性肽，已知有C34肽衍生物单体fuzeon（T-20/DP178）（非专利文献17）。在非专利文献17中显示了利用C34天然肽单体及fuzeon（DP178）的MAGI分析的抗HIV活性测定结果，并报告了在EC50值的比较中，fuzeon显示出C34天然肽单体的约10倍的活性。与此相对，如本申请实施例的实验结果所示，虽然分析法不同，但是在EC50值的比较中，本发明的C34肽衍生物三聚体相对于C34天然肽单体显示约30倍高的抗HIV活性。根据这些见解可以推定，本发明的C34肽衍生物三聚体与fuzeon相比，具有优异的高活性的抗HIV活性。
产业上的可利用性
本发明在HIV感染症的预防及治疗的领域中是特别有用的。
Figure IDA0000392475340000011

Claims (15)

1.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，包括：
合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序；和
通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体的工序。
2.如权利要求1所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于：
合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在作为C34的天然序列的C34肽的C末端侧导入为了与模板化合物结合所需要的连接位点，在该C34肽的序列和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基。
3.如权利要求1或2所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，
作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（1）所示的化合物或其盐，
Figure FDA0000392475270000011
式中，X表示正整数。
4.如权利要求3所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于：
作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（2）所示的化合物或其盐，
Figure FDA0000392475270000021
5.如权利要求1所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于：
合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在C34肽的C末端侧赋予亲水性氨基酸残基，而且，在其C末端侧导入连接位点，在该亲水性氨基酸残基和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基。
6.如权利要求5所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，
合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物为下述通式（3）所示的化合物。
7.如权利要求1～6中任一项所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于：
在通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合而合成C34肽的衍生物的三聚体的工序中，将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物和C34肽的衍生物在缓冲液中进行搅拌，由此使带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体。
8.一种识别HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于：
其为利用权利要求1～7中任一项所述的合成方法所合成的。
9.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于：
通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子结合。
10.如权利要求8或9所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于：
其由下述通式（4）所示的化合物或其盐构成，
Figure FDA0000392475270000031
式中，X表示正整数，Monomer表示下述通式（5）所示的化合物，
Figure FDA0000392475270000032
11.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体的诱导方法，其特征在于：
使用权利要求8～10中任一项所述的识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽对宿主动物进行致敏，诱导针对该肽的抗体。
12.一种HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于：
其以识别权利要求8～10中任一项所述的肽的C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体或权利要求8～10中任一项所述的肽作为有效成分。
13.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于：利用权利要求8～10中任一项所述的肽的抗HIV活性进行HIV感染症的预防和／或治疗。
14.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于：HIV感染症的预防和／或治疗是通过HIV立体结构识别抗体对HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的作用，阻碍gp41的C34和N36形成六聚体，阻止向HIV的靶细胞的侵入。
15.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和／或治疗剂，其特征在于：其为以权利要求8～10中任一项所述的肽作为有效成分的HIV感染症的预防和／或治疗用疫苗。
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