PL215170B1 - Sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu zawierajacego amyloidogenne bialko docelowe oraz bialko opiekuncze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych - Google Patents

Abstract

Niniejszy wynalazek dotyczy diagnozowania zakażeń HIV. W szczególności wynalazek ten dotyczy wytwarzania kompleksu rozpuszczalna retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa (lub glikoproteina transbłonowa) - białko opiekuńcze, a także korzystnego zastosowania kompleksu białko opiekuńcze - antygen w procesie wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV w testach immunologicznych, korzystnie według koncepcji podwójnego mostka antygenowego, lub też jako immunogenu. Wynalazek ujawnia również rozpuszczalne kompleksy obejmujące odpowiednio wariant gp4l HIV, lub też wariant gp36 HIV, oraz białko opiekuńcze wybrane spośród białek należących do klasy izomeraz peptydyloprolilowych. Opisane są również warianty obejmujące specyficzne podstawienia aminokwasowe w domenie N-helikalnej, odpowiednio gp41 HIV lub gp36 HIV.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu, zawierającego amyloidogenne białko docelowe oraz białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem wywołującym chorobę określaną jako nabyty zespół niedoboru odporności (AIDS). Dwa główne szczepy tego wirusa oznaczone zostały jako HIV-1 oraz HIV-2. Wirus HIV jest obecnie dość szeroko rozpowszechniony i stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia i dobrobytu ludzi na całym świecie, co zmusza publiczne systemy opieki zdrowotnej do wydawania ogromnych sum pieniędzy na cele diagnostyki HIV i leczenia AIDS.

Jedną z dróg rozpowszechniania wirusa HIV jest przetaczanie zakażonej krwi lub preparatów krwiopochodnych. Wszystkie uprzemysłowione kraje, podobnie jak wiele krajów rozwijających się, wymagają więc obecnie wykonywania obowiązkowych testów u dawców krwi w celu zapobieżenia dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusa. Zadaniem wszystkich stosowanych w tym celu metod diagnostycznych jest wykrywanie infekcji wirusowej HIV we krwi tak szybko i skutecznie jak to jest tylko możliwe.

Zasadniczo wyróżnić można trzy dostępne obecnie sposoby diagnozowania:

(1) wykrywanie obecności genomu wirusa we krwi przez czułe procedury diagnostyczne kwasu nukleinowego, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), (2) wykrywanie obecności antygenów wirusowych we krwi, i (3) wykrywanie w płynach ustrojowych przeciwciał skierowanych przeciwko HIV.

W przebiegu zakażenia wirusem HIV wyróżnia się kilka faz o różnym znaczeniu diagnostycznym. We wczesnej fazie zakażenia (faza wiremii) wykrywa się jedynie białka i peptydy pochodzące od wirusa HIV, podczas gdy nie obserwuje się jeszcze przeciwciał przeciwko HIV. W kolejnej fazie, określanej terminem serokonwersji, pojawiają się przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi HIV, podczas gdy ilość antygenów wirusowych (czyli tzw. obciążenie wirusem) spada. Większość przeciwciał wytwarzanych we wczesnej fazie serokonwersji należy do klasy immunoglobulin M (IgM). W późniejszym okresie infekcji, odpowiedź odpornościowa na zakażenie HIV przestawia się na produkcję immunoglobulin klasy G (IgG), które stanowią wtedy większość przeciwciał skierowanych przeciwko HIV. Podczas dalszego przebiegu zakażenia poziom przeciwciał przeciwko HIV może się obniżyć, podczas gdy obciążenie wirusem (obecność cząstek lub antygenów wirusowych) w płynach ustrojowych może ponownie ulec podwyższeniu. Przeszukiwanie na obecność wirusa HIV jest korzystnie wykonywane przy użyciu testów serologicznych wykrywających przeciwciała przeciwko HIV, czasami w połączeniu z wykrywaniem antygenów wirusa HIV. Ponieważ odpowiedź odpornościowa zmienia się w trakcie przebiegu zakażenia u pacjenta, a także wykazuje zróżnicowany przebieg u poszczególnych pacjentów, bardzo ważnym czynnikiem jest dysponowanie wyjątkowo czułym i niezawodnym testem immunologicznym, wykrywającym przeciwciała klasy IgM i IgG skierowane przeciwko HIV. Opisano wiele różnych podejść metodycznych do problemu wykrywania infekcji HIV. Sposoby wczesnego, niezawodnego i czułego wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko białkom wirusowym odgrywają w tym względzie kluczową rolę.

Białka wirusowe, określane często jako antygeny wirusowe, mogą być wykrywane jedynie w momencie rozpoczęcia infekcji i w bardzo późnym stadium choroby. Testy wykrywające antygeny wirusowe, np. testy, w których oznacza się p24 (wirusa HIV-1) lub p26 (wirusa HIV-2), z których oba są białkami rdzenia wirusa, mogą być więc stosowane tylko w kombinacji z innymi środkami diagnostycznymi, aby zapewnić skuteczne wykrywanie infekcji wirusem HIV.

Istnieją trzy grupy antygenów wirusowych, które są teoretycznie dostępne i które mogą indukować tworzenie się przeciwciał u gospodarza, a zatem mogą być wykorzystane jako antygeny w procedurach diagnostycznych. Są to białka otoczki wirusa (kodowane przez geny z regionu env), enzymy wirusowe lub wirusowe białka regulatorowe wirusa, takie jak odwrotna transkryptaza lub integraza (kodowane przez geny z regionu pol), oraz strukturalne białka rdzenia (kodowane przez geny z regionu gag). Białka otoczki wirusów HIV-1 i HIV-2 są glikoproteinami, syntetyzowanymi jako polipeptydowe prekursory białek (gp160 w przypadku HIV-1 oraz gp140 w przypadku HIV-2). Po syntezie wysokocząsteczkowych prekursorów są one cięte, co prowadzi do powstania odpowiednio gp120 i gp41 (w przypadku HIV-1) oraz gp110 i gp36 (w przypadku HIV-2). Większe z tych polipeptydów (odpowiednio gp120 i gp110) tworzą podjednostkę powierzchniową, która jest związana z mniejszymi błonowymi polipeptydami (odpowiednio gp41 i gp36) przez luźny kontakt. U wielu gospodarzy (pacjentów) glikoproteiny otoczki są korzystnymi celami przeciwwirusowej odpowiedzi odpornościowej. Ratner L.

PL 215 170 B1 i wsp., Nature 313 (1985) 277-84 wykazali, że zwłaszcza błona obejmująca te białka otoczki, tj. odpowiednio gp41 lub gp36, niesie największy potencjał immunogenny wśród białek wirusowych.

Testy immunologiczne, takie jak np. ELISA (ang. enzymelinked immunosorbent assay), wykorzystujące polipeptydy kodowane przez wirusa HIV, są szeroko wykorzystywane w diagnostyce i badaniach przesiewowych. Polipeptydy wirusowe są bezpośrednio wytwarzane z materiału wirusowego, lub też uzyskiwane są przy użyciu technologii rekombinacji DNA w systemach ekspresji in vitro lub in vivo. Obydwa te sposoby otrzymywania antygenów cechują poważne ograniczenia. Polipeptydy pochodzące z preparatów wirusowych mogą być zanieczyszczone żywymi wirusami lub zakaźnym materiałem genetycznym, co stanowi zagrożenie dla personelu stosującego taki materiał. Z kolei materiał uzyskany dzięki technikom rekombinacji może być zanieczyszczony innymi białkami, które nie pochodzą od gospodarza HIV, co może prowadzić do zmniejszenia swoistości lub zmniejszenia czułości takiego testu.

W sposobie wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom patogennym, takim jak patogeny wirusowe, bardzo często i z dużym sukcesem wykorzystuje się systemy oparte na podwójnym mostku antygenowym, opisane w opisie patentowym USA 4,945,042. Testy immunologiczne oparte na idei mostka wymagają zastosowania antygenu bezpośrednio lub pośrednio związanego z fazą stałą oraz tego samego lub wykazującego reaktywność krzyżową antygenu w postaci łatwo rozpuszczalnej, który wykrywany może być w sposób pośredni lub bezpośredni. Badane przeciwciała, jeśli są obecne w testowanym materiale, tworzą mostek pomiędzy antygenem związanym z fazą stałą a wyznakowanym wykrywanym antygenem. Tylko w przypadku połączenia obu antygenów mostkiem tworzonym przez swoiste przeciwciała otrzymuje się pozytywny sygnał.

Opisano szereg prób wykorzystania wyprodukowanego technikami rekombinacyjnymi białka gp41 jako antygenu do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV. Do detekcji przeciwciał przeciwko HIV może być stosowane, z pewnymi ograniczeniami, rekombinowane białko gp41 wytwarzane techniką rekombinacji. Takie gp41 może być użyte samo lub w kombinacji z innymi antygenami HIV do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV. Znane są też obecnie testy, które w sposób niezależny wykrywają obecność zarówno antygenów HIV i/lub przeciwciał przeciw HIV. W WO 93/21346 opisano taki „kombinowany test do jednoczesnego wykrywania antygenu gp24 oraz przeciwciał skierowanych przeciwko HIV-1 gp41 i HIV-2 gp36. W teście tym zastosowano fazę stałą, którą bezpośrednio opłaszcza się gp41 wytworzonym techniką rekombinacji.

Stwierdzono także, że jednym ze sposobów na utrzymanie gp41 (lub gp36) w roztworze jest zastosowanie wyjątkowo wysokiej lub niskiej wartości pH. Wiadomo, że wytwarzane metodami rekombinacji gp41 zachowuje rozpuszczalność przy wartości pH zbliżonej do 3,0 i niższej, lub też przy wartości pH zbliżonej do 11,0 i wyższej.

Jednak niestety, HIV-1 gp41 i HIV-2 gp36 odpowiednio są w zasadzie nierozpuszczalne w fizjologicznym zakresie pH.

Testy immunologiczne są na ogół przeprowadzane przy fizjologicznym pH. Z powodu nierozpuszczalności przy fizjologicznym pH retrowirusowe glikoproteinowe antygeny powierzchniowe stosowane w licznych testach immunologicznych są stosowane w postaci bezpośrednio naniesionej na materiał fazy stałej. Bezpośrednie opłaszczenie materiałów fazy stałej antygenami jest jednak w wielu przypadkach niekorzystne, i prowadzi do niepożądanych zmian, jak zmiany konformacyjne, rozfałdowanie cząsteczkowe, zmiana w antygenowości, zwiększona niestabilność i problemy z sygnałem tłem (patrz Butler J.E. i wsp., J. Immunol. Methods 150 (1992) 77-90).

Choć możliwa jest solubilizacja retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych (rsgp) za pomocą silnie chaotropowych odczynników lub odpowiednich detergentów, to jednak solubilizowany w ten sposób materiał ma ograniczone zastosowanie jako narzędzie diagnostyczne.

Nierozpuszczalność retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych w fizjologicznych warunkach pH sprawia, że te białka są trudnym celem w rutynowych procedurach (bio)chemicznych. Zdecydowana większość procedur „znakowania związków chemicznych, tj. chemicznych procedur wykorzystanych do związania znacznika np. grupy znacznikowej z polipeptydem, opiera się na chemii nukleofilowej i jest skuteczna w dość wąskim zakresie pH, między wartością pH od około 6 do około 8, a zatem stosowana jest tylko w warunkach mniej lub bardziej fizjologicznej wartości pH. Takie rutynowe procedury, np. jak opisane w Aslam M., Dent A., „Bioconjugation, rozdz. „The preparation of protein-protein conjugates (1998) 216-363, wyd. M. Aslam i A. Dent, McMillan Reference, Londyn) albo nie działają skutecznie albo są trudne do przeprowadzenia przy skrajnych wartościach pH (lub

PL 215 170 B1 w obecności detergentów takich jak SDS) wymaganych do solubilizacji retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych.

Jak wspomniano powyżej, zastosowanie testów immunologicznych opartych na koncepcji mostka okazało się korzystne w przypadku szerokiego zakresu testów mających na celu wykrycie przeciwciał reaktywnych wobec organizmów patogennych. Jednak z powodu jej niskiej rozpuszczalności, nie było np. możliwe wykorzystanie cząsteczki e-gp41 (tj. ektodomeny glikoproteiny 41) HIV-1 lub odpowiednio e-gp36 w takim układzie testowym.

W celu skompensowania wad związanych z bezpośrednim spłaszczaniem zaprojektowano szereg testów, w których zamiast antygenu e-gp41 zastosowano syntetyczne lub wyprodukowane drogą rekombinacji częściowe sekwencje tego antygenu, pokrywające się w większym lub mniejszym stopniu z immunodominującym regionem tzw. pętli. Przykłady takich testów są wskazane w literaturze patentowej podanej poniżej.

Region pętli w zewnątrzkomórkowej części gp41 jest niehelikalnym fragmentem o wierzchołkowej strukturze spinki do włosów, który łączy N-końcową domenę helikalną z C-końcową domeną helikalną. Znaczna część surowic odpornościowych reagujących z gp41 zawiera przeciwciała przeciwko temu wierzchołkowemu motywowi pętli. Zatem struktura „spinki do włosów lub „pętli, utrzymywana mostkiem disulfidowym, stanowi immunodominujący region gp41. Jednym ze sposobów na ominięcie problemu związanego ze stosowaniem rekombinowanego gp41 jest więc chemiczne wytwarzanie peptydów przedstawiających częściowe sekwencje gp41. Należy zauważyć, że gp41 lub gp36, odpowiednio, są określane tutaj jako tzw. ektodomeny obejmujące połączone pętlą N-końcowe i C-końcowe helisy, lecz pozbawione N-końcowego peptydu fuzyjnego oraz C-końcowej części przezbłonowej.

Fragmenty peptydowe wielu antygenów HIV ujawnione zostały w dotyczącej tego zagadnienia literaturze patentowej (australijskie zgłoszenie patentowe nr 597884 (57733/86), oraz zgłoszenia patentowe USA 4735896 i 4879212). W szczególności, te trzy opisy ujawniają konserwowany region immunodominujący glikoproteiny gp41, region pętli w głównym białku otoczki wirusa HIV-1. Zsyntetyzowano również analogiczny region immunodominujący białka gp36 z HIV-2. Peptydy odpowiadające tym regionom pętli, tworzącym wierzchołek ektodomeny, umożliwiają wczesną diagnostykę HIV-1 i HIV-2 oraz dostarczają testów o wystarczającej, choć nie optymalnej czułości i dobrej swoistości. Jednak ich ograniczenia widoczne są w odniesieniu do wykrywania przeciwciał IgM podczas pierwszych dni fazy serokonwersji u niektórych pacjentów.

WO 92/22573 ujawnia peptydy o własnościach immunologicznych wspólnych ze szkieletem białka tj. immunodominującym regionem przezbłonowego białka otoczki (np. gp41 lub gp36) różnych ssaczych wirusów niedoboru odporności. Potwierdza to także, że ten immunodominujący region obejmuje pętlę z mostkiem disulfidowym, która jest silnie konserwowana w wirusach niedoboru odporności pochodzących od różnych gatunków ssaków.

EP 396 559 dotyczy sztucznych peptydów niosących sekwencję aminokwasową odpowiadającą naturalnie występującej sekwencji aminokwasowej w HIV. Podobnie jak uprzednio, epitopy pochodzą z sekwencji odpowiadających strukturze pętli odpowiednio, gp41 lub gp36. Udoskonalono je dalej tak, aby zawierały mostek disiarczkowy, utworzony w wyniku chemicznej oksydacji zachodzącej między dwoma resztami cysteinowymi w pętli immunodominującej.

Dość znaczny procent przeciwciał obecnych w surowicy odpornościowej anty-HIV pacjentów zainfekowanych wirusem HIV nie reaguje jednak z motywem sekwencji lub jego wariantami pochodzącymi z immunodominującej pętli gp41 lub gp36. Podczas gdy te antygeny peptydowe mogą być stosowane z wykorzystaniem korzystnej idei mostka, to przeciwciała reagujące z epitopami położonymi poza regionem pętli gp41 HIV nie są wykrywane. Nie tylko kluczowa jest bardzo wczesna diagnostyka infekcji wirusem HIV, ale jest również szczególnie ważne wykrywanie możliwie najwięcej podtypów wirusów HIV-1 i HIV-2. Im więcej epitopów, zwłaszcza prawidłowo sfałdowanych konformacyjnych epitopów rsgp, jest obecnych, tym mniejsze jest ryzyko niewykrycia zainfekowanej próbki z powodu fałszywie ujemnego wyniku.

Z powyższego powodu podjęto nieustanne wysiłki dostarczenia większych części cząsteczki retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, zwłaszcza gp41 z HIV-1, w postaci rozpuszczalnej.

Biofizyczne i biochemiczne właściwości gp41 były w ubiegłych latach intensywnie badane. Lu M. i wsp. (Nat. Struct. Biol. 2 (1995) 1075-82) wyjaśnili częściowo trimerową strukturę gp41. Ponieważ w warunkach fizjologicznych gp41 tworzy nierozpuszczalne agregaty, badania ograniczono do skróconych wersji ektodomeny gp41.

PL 215 170 B1

Przy pomocy spektroskopii NMR udało się niedawno potwierdzić, że natywny trimer gp41 tworzy wiązkę sześciu helis, obejmującą trzy równoległe centralne helisy N-końcowe, do których przylegają helisy C-końcowe o orientacji antyrównoległej (Caffrey M. i wsp. J Biol Chem 275 (2000) 19877-82).

Opisano również wysokocząsteczkowe agregaty gp41. Takie agregaty tworzą się najprawdopodobniej przez oddziaływanie tzw. wierzchołkowego regionu pętli gp41.

Projektując strukturę białek, opracowano inhibitor wejścia HIV-1 do komórek docelowych (Root M.J. i wsp, Science 291 (2001) 884-888). Inhibitor ten obejmuje trzy odcinki pochodzące z N-końcowej domeny helikalnej gp41 i dwa odcinki C-końcowej domeny helikalnej tej cząsteczki. Ten wytworzony przy użyciu inżynierii genetycznej konstrukt nie obejmuje jednak wielu domen i wielu epitopów antygenowych natywnej cząsteczki, a zwłaszcza nie zawiera tzw. motywu pętli, o którym wiadomo, że obejmuje szczególnie immunogenne epitopy (patrz powyżej).

Istnieje zatem wciąż ogromna potrzeba dostarczenia jak największej liczby epitopów retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych w rozpuszczalnej postaci. Zwłaszcza istnieje potrzeba dostarczenia takich rozpuszczalnych antygenów obejmujących odpowiednio gp41 z HIV-1 lub gp36 z HIV-2, do wykorzystania w wielu leczniczych i diagnostycznych zastosowaniach.

Zadaniem niniejszego wynalazku było zbadanie, czy możliwe jest dostarczenie większej liczby epitopów retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych, lub nawet odpowiednio cząsteczek e-gp41 lub e-gp36, w postaci rozpuszczalnej.

Ponadto zbadano możliwość dostarczenia wariantów gp41 lub gp36, które byłyby łatwiejsze do manipulowania, i/lub które, zwłaszcza w warunkach buforowych wymaganych do przeprowadzenia testu immunologicznego lub wymaganych do immunizacji, są rozpuszczalne w postaci kompleksu obejmującego wariant białka i białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.

Białka opiekuńcze, znane jako klasyczne „białka wspomagające fałdowanie, są polipeptydami obecnymi w procesie fałdowania i podtrzymywania strukturalnej integralności innych białek. Mają one zdolność do pobudzania procesu fałdowania polipeptydu zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. Cząsteczki wspomagające fałdowanie dzieli się na ogół na dwie podgrupy: katalizatory fałdowania oraz cząsteczki pełniące rolę „opiekunów. Katalizatory fałdowania przyspieszają etapy ograniczające szybkość fałdowania z powodu swoich katalitycznych właściwości. Przykłady takich katalizatorów zostały opisane poniżej. O „białkach opiekuńczych wiadomo, że wiążą się ze zdenaturowanymi lub częściowo zdenaturowanymi polipeptydami i w ten sposób ułatwiają ich renaturację. Zatem, w przeciwieństwie do katalizatorów procesu fałdowania, białka opiekuńcze ograniczają się jedynie do funkcji wiążącej (Buchner i wsp., Faseb J 10 (1996) 10-19).

Białka opiekuńcze są wszechobecnymi białkami, indukowanymi przez stres włączonymi w dojrzewanie, fałdowanie, translokację i degradację białek (Gething M. J. oraz Sambrook J., Nature 355 (1992) 33-45). Choć białka te obecne są w normalnych warunkach wzrostu, są obficie indukowane w warunkach stresu. Potwierdza to dalej ideę, że ich fizjologiczną funkcją jest radzenie sobie z warunkami stresu.

Obecnie znanych jest kilka różnych rodzin białek opiekuńczych. Wszystkie te białka opiekuńcze charakteryzują się zdolnością do wiązania niesfałdowanych lub częściowo sfałdowanych białek i mają fizjologiczną funkcję związaną z prawidłowym fałdowaniem białek lub z usuwaniem białek zdenaturowanych lub tych, które uległy agregacji.

Dobrze scharakteryzowanymi przykładami białek opiekuńczych są członkowie rodzin tak zwanych białek szoku termicznego, które noszą nazwy odpowiadające ich względnej masie cząsteczkowej; na przykład hsp100, hsp90, hsp70, oraz hsp60, jak również tak zwane małe białka szoku termicznego shsp (small heat-shock proteins), opisane przez J. Buchnera (Faseb J 10 (1996) 10-19) oraz M. Beissingera i J. Buchnera (J. Biol. Chem. 379 (1998) 245-259).

W odróżnieniu od białek opiekuńczych, katalizatory fałdowania wspomagają fałdowanie przez przyśpieszenie określonych etapów ograniczających szybkość całego procesu, obniżając w ten sposób stężenie produktów pośrednich fałdowania, podatnych na agregację. Jedna z klas tych katalizatorów, obejmująca tzw. białkowe izomerazy disulfidowe (noszące również nazwę oksydoreduktaz tiolowo-disulfidowych), katalizuje tworzenie się i rearanżację wiązań disulfidowych w białkach sekrecyjnych. U bakterii Gram-ujemnych, proces oksydatywnego fałdowania białek sekrecyjnych w periplazmie jest dostosowywany przez kaskadę białkowych izomeraz disulfidowych, oznaczonych jako DsbA, DsbB, DsbC oraz DsbD (Bardwell J.C., Mol Microbiol 14 (1994) 199-205 oraz Missiakas D. i wsp. Embo J 14 (1995) 3415-3424).

PL 215 170 B1

Inna ważna klasa katalizatorów fałdowania, określonych jako izomerazy cis/trans peptydyloprolilowe (PPI) obejmuje takie białka jak CypA, PpiD (Dartigalongue, C. oraz Raina S., Embo J 17 (1998) 3968-3980), FkpA (Danese, P.N. i wsp., Genes Dev 9 (1995) 387-398) czynnik wyzwalający (Crooke E. oraz Wickner W., Proc Natl Acad Sci USA 84 (1987) 5216-5220; Stoller G. i wsp., Embo J 14 (1995) 4939-4948) oraz SlyD (Hottenrott S. i wsp., J Biol Chem 272 (1997) 15697-15701). Spośród nich FkpA, SlyD i czynnik wyzwalający, wykazują pokrewieństwo na podstawie zestawienia ich sekwencji.

Izomerazę peptydyloprolilową FkpA zlokalizowano w periplazmie bakterii Gram-ujemnych. Podejrzewano, że to białko opiekuńcze jest istotne dla transportu i translokacji bakteryjnych białek zewnętrznej błony komórkowej. Ramm K., i Pluckthun A. (J Biol Chem 275 (2000) 17106-1713) stwierdzili, że FkpA wykazuje podwójnie korzystny wpływ na prawidłowe fałdowanie białek. Po pierwsze, FkpA oddziałuje z wczesnymi produktami pośrednimi fałdowania, zapobiegając w ten sposób ich agregacji. Po drugie, białko FkpA ma zdolność reaktywowania nieaktywnego białka, prawdopodobnie również przez związanie się z częściowo niesfałdowanymi białkami, które mogą istnieć w stanie równowagi z postacią zagregowaną.

Niektóre białka wspomagające proces fałdowania zawierają zarówno domenę aktywną katalitycznie, jak i domenę „opiekuńczą (lub wiążącą polipeptyd). Reprezentatywne przykłady obejmują np. czynnik wyzwalający (Zarnt T. i wsp., J Mol Biol 271 (1997) 827-837; Wang C.C. oraz Tsou C.L., Faseb J 7 (1993) 1515-1517), SurA (Behrens i wsp., EMBO J. 20 (2001) 285-294) oraz DsbA (Frech C. i wsp., EMBO J. 15 (1996) 392-398). Zgodnie z naszymi obserwacjami, wydaje się, że taka sama struktura modułowa występuje odpowiednio w izomerazach peptydyloprolilowych FkpA oraz SlyD.

Stosując różne niezależne systemy wykazano, że wzmożona ekspresja białek opiekuńczych może ułatwiać wytwarzanie rekombinowanych polipeptydów. Odpowiedni przykład można znaleźć w publikacji WO 94/08012.

Wiadomo również, że zwiększone wytwarzanie białek można osiągnąć wykorzystując konstrukt genowy obejmujący sekwencję kodującą zarówno żądany polipeptyd, jak i sekwencję białka opiekuńczego. Ta koncepcja białka fuzyjnego zastosowana została z sukcesem, na przykład, do uzyskania znacznego zwiększenia wytwarzania ludzkiej proinsuliny w periplazmie Escherichia coli przez wykorzystanie konstruktu genowego obejmującego gen ludzkiej proinsuliny i DsbA (Winter J., i wsp. Journal of Biotechnology 84 (2000) 175-185).

Podejście do stosowania białek opiekuńczych do zwiększenia wytwarzania prawidłowo sfałdowanych polipeptydów wynika głównie ze zdolności tych białek do wiązania, a następnie działania solubilizacyjnego. Po rekombinacyjnym wytworzeniu polipeptydu fuzyjnego obejmującego białko opiekuńcze i żądany produkt białkowy dochodzi zazwyczaj do odcięcia białka opiekuńczego i otrzymania żądanego polipeptydu w czystej postaci. Niniejszy wynalazek jest natomiast oparty na wykorzystaniu korzystnego wpływu odpowiedniego białka opiekuńczego na rozpuszczalność związanej z nim na stałe retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej.

Ku naszemu zaskoczeniu, stwierdziliśmy, że białka wspomagające fałdowanie, np. wielu członków z klasy izomeraz peptydyloprolilowych (PPI), zwłaszcza z rodziny FKBP, nie tylko wykazują aktywność katalityczną, ale także w drastyczny sposób wpływają na rozpuszczalność amyloidogennych białek, lub, mówiąc bardziej ogólnie, białek wykazujących skłonność do agregacji. Osiągają to tworząc rozpuszczalne kompleksy z takimi białkami, które w innym wypadku (tj. w izolowanej postaci, bez asocjacji z białkiem opiekuńczym) byłyby skłonne do agregacji. Takie białka, które w innym wypadku prawie by się nie rozpuszczały lub w ogóle nierozpuszczały w warunkach fizjologicznych, po związaniu w kompleksie z odpowiednim białkiem opiekuńczym PPI stają się rozpuszczalne w łagodnych fizjologicznych warunkach (tj. bez potrzeby stosowania solubilizatorów, takich jak detergenty lub czynniki chaotropowe). Zatem, jesteśmy w stanie wytwarzać, na przykład, rozpuszczalne kompleksy białka z białkiem opiekuńczym, np. obejmujące białko gp41 wirusa HIV-1 jako białko docelowe skłonne do agregacji i FkpA lub inne białko z rodziny FKBP, jako białko opiekuńcze nadające rozpuszczalność.

Stwierdziliśmy również, że pewne dobrze określone warianty gp41 HIV-1 lub gp36 HIV-2 są szczególnie odpowiednie do tworzenia rozpuszczalnych kompleksów z białkami opiekuńczymi z klasy PPI.

Na przykład, kompleksy gp41 i FkpA, lub też gp36 i FkpA, są łatwo rozpuszczalne, np. w warunkach fizjologicznych, mogą być łatwo wyznakowane w korzystnym zakresie pH, i mogą być też z wielkim sukcesem stosowane do wykrywania przeciwciał przeciwko gp41 lub gp36 (odpowiednio wirusów HIV-1 i HIV-2), a zatem do diagnostyki infekcji HIV.

PL 215 170 B1

Krótki opis figur.

Figury 1A i 1B. Wyniki dichroizmu kołowego (CD) w dalekim (1A) i bliskim (1B) UV dla ektodomeny gp41 (535-681)-His6 HIV-1

Sfałdowane gp41 (gruba linia): warunki buforowe (30 mM mrówczan sodu, pH 3,0) ustalono tak, aby zaindukować zbliżoną do natywnej helikalną konformację białka gp41; Zdenaturowane białko gp41 (cienka linia): warunki buforowe (50 mM fosforan sodu pH 3,0; 7 M GuHCl) ustalono tak, aby całkowicie zdenaturować (rozfałdować) gp41. Wskutek wysokiego stężenia soli chaotropowej, referencyjny sygnał dichroizmu kołowego CD na Fig. 1A (cienka linia) nie może być odpowiednio monitorowany przy długości fali poniżej 215 nm. Widma rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco-720 i uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia tła. Długość ścieżki wynosiła 0,2 cm dla CD w dalekim UV (Fig. 1A) oraz 0,5 cm dla CD w bliskim UV (Fig. 1B). Odpowiednie wartości stężenia białek wynosiły 1,5 μΜ i 29 μΜ. Jednostki na osi rzędnych odpowiadają średniej eliptyczności reszt i mają 2 -1 wielkość deg x cm² x dmol^-1.

Figura 2. Agregacja białka gp41 bez białka opiekuńczego w buforze fizjologicznym

Przedstawiono widma UV dla ektodomeny białka gp41 po upływie jednej minuty (dolna linia) i 10 minut (górna linia) od zmiany wartości pH z poziomu 3,0 do 7,5. Agregacja cząsteczek prowadzi do efektu rozproszenia światła oraz wyraźnej absorpcji poniżej 310 nm. Figura ta ma demonstrować wzmożoną skłonność do agregacji gp41; warto zauważyć, że proces agregacji nie zatrzymuje się na etapie wskazanym przez górną linię.

Figury 3A i 3B. FkpA solubilizuje ektodomenę gp41 w buforze o neutralnej wartości pH

Białko gp41 oraz dojrzałe FkpA inkubowano razem w buforze o niskim pH, a następnie zmieniono warunki buforowe na następujące: 20 mM fosforan sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA. Po upływie 1 lub 10 minut (dolna linia i górna linia, odpowiednio) rejestrowano widmo UV w celu oszacowania agregacji w próbkach. Figura 3A przedstawia supresję agregacji przy dwukrotnym nadmiarze stężenia molowego białka opiekuńczego. Figura 3B przedstawia efekt czterokrotnego nadmiaru. Końcowe stężenie gp41 wynosiło około 1 μΜ. Ponieważ rozproszenie światła (prowadzące do wyraźnej absorpcji poniżej 300 nm) uległo zmniejszeniu do minimum, otrzymano przekonujący spektroskopowy dowód, że FkpA wydajnie solubilizuje ektodomenę gp41 w sposób zależny od dawki.

Figura 4. Widmo UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5

Widmo UV dla polipeptydu fuzyjnego FkpA-gp41 po dializie wobec 50 mM fosforanu sodu, pH 2,5; 50 mM NaCl. Nieoczekiwanie, ten dwudomenowy konstrukt pozostaje całkowicie rozpuszczalny po usunięciu solubilizującego czynnika chaotropowego GuHCl. Brak jest dowodów na istnienie rozpraszających światło agregatów, które powinny powodować przesunięcie linii podstawowej i znaczącą absorpcję przy długościach fali poniżej 300 nm.

Figura 5. Widmo CD w bliskim UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5

Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH

2,5 oraz 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C. Uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia wartości tła. Stężenie białka wynosiło 2,5 μΜ a długość ścieżki 0,5 cm. Aromatyczna eliptyczność wykazuje typową sygnaturę gp41 (dla porównania patrz Fig. 1B). Przy pH 2,5 FkpA jest przeważnie nieustrukturyzowane i nie przyczynia się w ogóle do sygnału CD w bliskim UV.

Figura 6. Widmo CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5

Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 2,5; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C. Uśredniano dziewięć wyników w celu poprawienia stosunku sygnału do tła. Stężenie białka wynosiło 2,25 μΜ a długość ścieżki 0,2 cm. Minima przy wartościach 220 i 208 nm wskazują na głównie helikalną strukturę białka gp41 jako części białka fuzyjnego. Zwiększone wartości tła spektralnego poniżej 197 nm są wynikiem silnej absorpcji dla amidów i nie wskazują na żadne strukturalne cechy białka fuzyjnego. Niemniej jednak, można przypuszczać, że występuje w tym wypadku typowe maksimum helikalne przy długości fali 193 nm.

Figura 7. Widmo CD w bliskim UV dla FkpA-gp41 w buforze fizjologicznym

Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 7,4; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C. Uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia wartości tła. Stężenie białka wynosiło 15,5 μΜ a długość ścieżki 0,5 cm. Uderzające jest to, że aromatyczna eliptyczność kowalencyjnie sprzężonych domen białkowych gp41 i FkpA (ciągła linia) powstała przez zsumowanie wkładu helikalnego białka gp41 o strukturze przypominającej natywną przy pH 3,0 (dolna przerywana linia) i wkładu FkpA przy pH 7,4 (górna przerywana linia). To wskazuje, że zarówno no8

PL 215 170 B1 śnikowe FkpA, jak i docelowe gp41 (tj. dwie odrębne funkcjonalnie jednostki fałdowania) ulegają fałdowaniu w sposób odwracalny i quasi-niezależny, gdy połączone są ze sobą w białku fuzyjnym.

Figura 8. Widmo CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 w buforze fizjologicznym

Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 7,4; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C. Uśredniano dziewięć wyników w celu poprawienia stosunku sygnału do tła. Stężenie białka wynosiło 1,55 μΜ a długość ścieżki 0,2 cm. Silne sygnały dla wartości odpowiednio 222 nm i 208 nm wskazują na głównie helikalną strukturę białka gp41 jako części białka fuzyjnego. Wartości tła spektralnego poniżej 198 nm są wynikiem wysokiej absorpcji dla białek i nie wskazują na żadną drugorzędową cechę strukturalną białka fuzyjnego FkpA-gp41.

Figura 9. gp41 sprzężone z FkpA jest zarówno rozpuszczalne, jak i silnie immunoreaktywne w teście HIV

FkpA-gp41 wykazuje silne właściwości kompetycyjne w teście Combi COBAS CORE HIV. Przedstawiono potencjał inhibicyjny rozpuszczalnego polipeptydu FkpA-gp41 (wypełnione kółka) po wstępnym potraktowaniu buforem do rozcieńczania (zawierającym Triton X-100 jako pomocniczy detergent) w porównaniu z samą ektodomeną gp41 (puste kółka). Jest oczywiste, że ektodomeną gp41 (zawarta w wewnątrzcząsteczkowym kompleksie białka fuzyjnego) zachowuje swoją wysoką immunoreaktywność nawet w obecności detergentu, podczas gdy nieosłonięta ektodomena prawie całkowicie traci immunoreaktywność. Testowana HIV-dodatnia surowica była wewnętrzną surowicą numer 21284 w rozcieńczeniu 1:3000.

Figura 10. Widmo UV dla FF36 po renaturującej filtracji żelowej

Widmo dostarcza przekonującego dowodu na to, że peptyd fuzyjny gp36 jest rozpuszczalny i nie ulega agregacji po ponownym sfałdowaniu na kolumnie Sux 200 (zgodnie ze sposobem renaturującej filtracji żelowej, opisanej w sekcji Przykłady).

Figura 11 (1+2). FkpA-gp21 jest zarówno rozpuszczalnym, jak i immunologicznie reaktywnym polipeptydem fuzyjnym

Po renaturującej filtracji żelowej, ponownie sfałdowane białko fuzyjne FkpA-gp21 ulega elucji w postaci wysoce rozpuszczalnej i nie wykazuje skłonności do agregacji w widmie UV (11/1). Wynik testu kompetycyjnego COBAS CORE z HTLV-pozytywną surowicą 858893-00 (rozcieńczenie 1:10) wskazuje, że FkpA-gp21 posiada znakomite właściwości immunologiczne (11/2).

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu, zawierającego amyloidogenne białko docelowe oraz białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych obejmujące etap zmieszania wymienionych białek w buforze, w którym zarówno białko docelowe jak i białko opiekuńcze są solubilizowane, oraz etap dostosowania buforu do warunków fizjologicznych, w których utworzony kompleks białka docelowego z białkiem opiekuńczym jest rozpuszczalny.

Korzystnie bufor fizjologiczny obejmuje związek buforujący w stężeniu od 10 do 200 mM, a całkowite stężenie soli wynosi 20-500 mM.

Korzystnie białko docelowe wytwarzane jest przy użyciu technik rekombinacyjnych.

Korzystnie izomeraza peptydyloprolilowa wytwarzana jest przy użyciu technik rekombinacyjnych.

Korzystnie białko docelowe oraz izomeraza peptydyloprolilowa wytwarzane są przy użyciu technik rekombinacyjnych.

Korzystnie białko docelowe jest retrowirusową glikoproteiną powierzchniową.

Korzystnie białko docelowe jest glikoproteiną gp36 wirusa HIV-2, lub glikoproteiną gp41 wirusa

HIV-1.

Korzystnie izomeraza peptydyloprolilowa jest zachowującym zdolność do wiązania białek fragmentem izomerazy peptydyloprolilowej.

Korzystnie izomeraza peptydyloprolilowa jest białkiem opiekuńczym.

Korzystnie białko opiekuńcze FKBP jest wybrane z grupy składającej się z SlyD, FkpA i czynnika wzbudzającego.

„Białko docelowe w niniejszym wynalazku może być dowolnym białkiem, które jest zasadniczo nierozpuszczalne w zbuforowanym roztworze wodnym o pH 7,4, składającym się z 20 mM fosforanu sodu i 150 mM chlorku sodu. Korzystnymi białkami docelowymi są na przykład, białka amyloidogenne, glikoproteiny powierzchniowe amyloidogennych wirusów, retrowirusowe glikoproteiny powierzchniowe, zwłaszcza HIV-1 gp21, HIV-2 gp36 oraz HTLV gp21.

Grupa polipeptydów docelowych stanowi tak zwane białka lub polipeptydy amyloidogenne. Takie amyloidogenne białka znajdowano w postaci zagregowanej w płynach ciała lub kompartmentach.

PL 215 170 B1

Dobrze znanymi przykładami są amyloid surowicy A (sAA -), tak zwany β-Α4 lub Αβ (polipeptyd o długości 42 lub 43 aminokwasów, o którym wiadomo, że tworzy charakterystyczne złogi amyloidowe

Sc w mózgach z chorobą Alzheimera), tzw. białka prionowe (postać PrP^Sc akumuluje się w agregatach w BSE lub chorobie Creutzfeldta i Jacoba), oraz retrowirusowe glikoproteiny powierzchniowe, takie jak HIV-1 gp41, którą znajdowano w płytkach amyloido-podobnych w mózgach pacjentów cierpiących na demencję związaną z HIV (HAD). W wykonaniu niniejszego wynalazku wykorzystuje się białko opiekuńcze PPI, do tworzenia rozpuszczalnego kompleksu obejmującego białko amyloidogenne oraz białko opiekuńcze. Taki kompleks może być z sukcesem wykorzystany w rozmaitych testach immunologicznych. Korzystnie, kompleks taki wykorzystywany jest w teście immunologicznym, w którym stosowana jest zasada mostku antygenowego.

HIV oraz inne wirusy otoczkowe, takie jak HTLV, wirus grypy oraz wirus Ebola, wszystkie wyrażają glikoproteiny powierzchniowe, które pośredniczą zarówno w procesach przylegania do komórki jak i fuzji z błoną. Aby spełniać te funkcje, wszystkie te glikoproteiny powierzchniowe zawierają silnie hydrofobowe fragmenty, które sprawiają, że trudno jest pracować z nimi w warunkach in vitro (co obejmuje także próby doprowadzenia do ich ponownego sfałdowania), oraz że wykazują one skłonność do agregacji.

HAD jest dobrze znanym powikłaniem towarzyszącym zakażeniu HIV. Jak to opisali M. Caffrey i wsp. (patrz wyżej) w odniesieniu do objawów histologicznych, HAD przypomina bardzo encefalopatię gąbczastą zwaną chorobą Creutzfeldta i Jacoba. Uważa się, że etiologia choroby Creutzfeldta i Jacoba jest na ogół związana z akumulacją amyloidogennych płytek zawierających zmodyfikowane białko prionowe (Prusiner S.B., Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13363-13383). Analogiczna patogeneza dla HAD, obejmująca wysokocząsteczkowe agregaty białka e-gp41 wydaje się być prawdopodobna. Warto zauważyć, że zmiany neurologiczne w encefalopatii HIV wykazują cechy patologiczne i radiologiczne podobne do choroby Binswangera.

Korzystnie białkami amyloidogennymi są odpowiednio gp41, pochodzące z wirusa HIV-1, gp36 pochodzące z wirusa HIV-2, lub gp21 pochodzące z wirusa HTLV.

Białko jest uważane za „zasadniczo nierozpuszczalne, jeśli w buforze składającym się z 20 mM fosforanu sodu pH 7,4, 150 mM NaCl jest rozpuszczalne w stężeniu 50 nM lub mniejszym.

Kompleks jest wytwarzany sposobem według niniejszego wynalazku, obejmujący białko opiekuńcze PPI oraz białko docelowe, jest uważany za „rozpuszczalny, jeśli w warunkach buforu fizjologicznego, tj. w buforze składającym się z 20 mM fosforanu sodu pH 7,4, 150 mM NaCl, białko docelowe zawarte w kompleksie z białkiem opiekuńczym PPI jest rozpuszczalne w stężeniu 100 nM lub większym.

W sposobie wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu białko opiekuńcze - białko docelowe wychodzi się od buforu zapewniającego warunki umożliwiające solubilizację, tj. od buforu, w którym zarówno białko docelowe, jak i białko opiekuńcze są rozpuszczalne. Odpowiedni bufor, który możemy nazwać buforem „niefizjologicznym lub „solubilizującym, musi spełniać warunek, że zarówno białko docelowe jak i białko opiekuńcze nie ulegną w nim denaturacji, lub przynajmniej nie będzie to denaturacja nieodwracalna. Gdy wychodzi się od takich warunków buforowych, białko opiekuńcze wiąże się z białkiem docelowym, a zmiana buforu z niefizjologicznego na fizjologiczny jest możliwa bez wywoływania precypitacji białka docelowego.

Odpowiedni (niefizjologiczny) bufor, tj. bufor, w którym zarówno białko docelowe, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, jak i białko opiekuńcze PPI są rozpuszczalne albo wykorzystuje wysokie lub niskie pH, albo wysokie stężenie soli chaotropowej, lub też kombinacji obu tych czynników.

W przypadku wytwarzania międzycząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i białko docelowe, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, niefizjologiczny bufor jest korzystnie buforem o raczej niskim lub raczej wysokim pH. Korzystnie, bufor taki ma pH, w zakresie wysokiego pH, od 9 do 12 (lub białko opiekuńcze FKBP jest wybrane z grupy składającej się z SlyD, FkpA i czynnika wzbudzającego, zakresie niskiego pH od 2 do 4,5.

W sposobie wytwarzania wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI oraz białko docelowe, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, korzystnym buforem solubilizującym jest bufor o raczej wysokim stężeniu soli chaotropowej, np. 6,0 M chlorku guanidyniowego o pH około 6. Po renaturacji, białko docelowe przyjmuje swą zbliżoną do natywnej strukturę i tworzy się kompleks wewnątrzcząsteczkowy.

W kontekście niniejszego wynalazku, warunki buforu fizjologicznego są określone przez wartość pH w zakresie od 5 do 8,5 oraz całkowite stężenie soli poniżej 500 mM, niezależnie od innych

PL 215 170 B1 składników, które nie są solami, a które ewentualnie mogą być obecne w buforze (np. cukry, alkohole, detergenty), dopóki nie zaburzają rozpuszczalności kompleksu zawierającego białko docelowe i białko opiekuńcze.

Terminy „retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa lub „rsgp, używane w niniejszym wynalazku, obejmują gp41 wirusa HIV-1 i gp36 wirusa HIV-2, a także odpowiadające im glikoproteiny otoczki, pochodzące od innych ssaczych wirusów niedoboru odporności. Korzystnymi retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi są gp41 wirusa HIV-1, gp36 wirusa HIV-2 oraz gp21 wirusa HTLV. Szczególnie korzystnymi retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi są gp41 wirusa HIV-1 i gp36 wirusa HIV-2. Termin rsgp, objaśniony powyżej, odnosi się zarówno do występujących naturalnie, jak i syntetycznych wariantów rsgp.

Stwierdzono, że pewne dobrze określone podstawienia aminokwasowe w obrębie N-helikalnej domeny białka gp41 lub gp36 nadają tym cząsteczkom korzystne cechy, w porównaniu z polipeptydami o sekwencji typu dzikiego białek gp41 lub gp36, odpowiednio.. Przykładem jest wariant białka gp41 wirusa HIV-1, obejmujący przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe, a najwyżej cztery podstawienia aminokwasowe w jednej lub w większej liczbie pozycji, wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 555, Leu 566, He 573 i Ile 580, które to pozycje są pozycjami znanymi z sekwencji typu dzikiego białka gp41 wirusa HIV-1 (NR ID SEK:1) lub odpowiadają pozycjom znanym z tej sekwencji, które to podstawienia charakteryzują się tym, że podstawionym aminokwasem jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy, lub przykładem jest wariant białka gp36 wirusa HIV-2, obejmujący przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe, a najwyżej trzy podstawienia aminokwasowe w jednej lub w większej liczbie pozycji, wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 554, Leu 565 i Val 579, przy czym pozycje te są pozycjami znanymi z sekwencji typu dzikiego białka gp36 wirusa HIV-2 (NR ID SEK:2) lub odpowiadają pozycjom znanym z tej sekwencji, a podstawienia charakteryzują się tym, że podstawionym aminokwasem jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy, które to przykłady są odpowiednie, aby przynajmniej częściowo rozwiązać problemy znane ze stanu techniki.

Nowe warianty białek gp41 oraz gp36, odpowiednio, są mniej skłonne do agregacji, lepiej rozpuszczalne i łatwiejsze do manipulowania niż odpowiadające im polipeptydy o sekwencji typu dzikiego. Poprawiona rozpuszczalność staje się szczególnie oczywista podczas prób dostarczenia reagenta, który w warunkach fizjologicznego buforu zawiera gp41 lub gp36 w postaci rozpuszczalnej. Szczególnie korzystne okazało się połączenie czynnych właściwości nowych wariantów z efektami otrzymywanymi w wyniku zastosowania białek opiekuńczych, wybranych z klasy izomeraz peptydyloprolilowych (PPI).

Ponieważ nowe warianty gp41 lub gp36 są łatwiejsze do manipulowania niż polipeptydy typu dzikiego, są zatem idealne dla różnych celów, np. do wykorzystania jako immunogeny lub antygeny. go. Co najciekawsze, białko fuzyjne obejmujące retrowirusową glikoproteinę powierzchniową oraz białko opiekuńcze PPI może być solubilizowane i poddane renaturacji w odpowiednich warunkach i stwierdzono, że tworzy rozpuszczalny wewnątrzcząsteczkowy kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym, który umożliwia wygodne znakowanie i skuteczną detekcję w teście immunologicznym wykrywającym wirusa HIV.

Rozpuszczalny kompleks, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową oraz białko opiekuńcze, może być skutecznie wykorzystany w teście immunologicznym wykrywającym przeciwciała z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego.

Kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym, obejmujący gp41 wirusa HIV-1 lub gp36 wirusa HIV-2, odpowiednio, jest szczególnie korzystny w przypadku wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV we wczesnej fazie infekcji. Przy zastosowaniu rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp41, lub też rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp36, możliwe jest przeprowadzenie testu immunologicznego, korzystnie z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego, pozwalającego na wczesne i czułe wykrywanie przeciwciał przeciw HIV w próbce płynów ustrojowych.

Fakt, że białko opiekuńcze może tworzyć kompleksy z białkami nierozpuszczalnymi w innym przypadku, można także zastosować z dużą korzyścią w celu ulepszenia większości testów immunologicznych, korzystnie testów immunologicznych z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego. Zasada mostka antygenowego pozwala na wykorzystanie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem jako pierwszego antygenu (na ogół nazywanego antygenem wychwytującym na fazie stałej) oraz drugiego kompleksu białka opiekuńczego z antygenem (najczęściej jako antygenu detekcyjnego).

PL 215 170 B1

W celu zminimalizowania problemów z tłem reakcji, wywoływanych wiązaniem przeciwciał oddziałujących z białkiem opiekuńczym, taki test mostkowy może być korzystnie dalej modyfikowany przez zastosowanie pierwszego białka opiekuńczego po jednej stronie na fazie stałej, a drugiego białka opiekuńczego po drugiej stronie detekcyjnej, pochodzącej od różnych gatunków.

Możliwe jest obecnie przeprowadzenie testu immunologicznego według zasady mostka antygenowego z wykorzystaniem znakowanego kompleksu białka opiekuńczego z antygenem. Możliwe jest również wytworzenie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem, w którym to kompleksie wyznakowane jest jedynie białko opiekuńcze, co zapewnia, że antygen nie jest modyfikowany lub nie podlega negatywnym wpływom (np. w zakresie konformacji) takiego znakowania.

Sposób i strategia przeprowadzanego chemicznego sprzęgania mogą być wybrane według uznania. W przypadku polipeptydów, dostępne są chemiczne procedury umożliwiające sprzęganie reszt -SH2, -NH2 lub -COO^-, jak również grupy OH tyrozyny, grupy imidazolowej histydyny, lub też heterocyklicznych grup iminowych tryptofanu. Dla każdej z tych grup funkcjonalnych znanych jest kilka odpowiednich chemicznych procedur sprzęgania (M. Aslam i A. Dent, patrz wyżej). Rutynowe chemiczne procedury sprzęgania białek wymagają, aby białko było rozpuszczalne w warunkach buforu reakcyjnego, tj. w zakresie pH od około 5 do około 8,5. Ponieważ np. gp41 nie jest rozpuszczalne w tym zakresie pH, o ile nie poddane zostanie denaturacji, np. przy użyciu SDS, natywnie sfałdowane gp41 nie podlegałoby procesowi chemicznego sprzęgania. Opisywany tu kompleks białka gp41 z białkiem opiekuńczym dostarcza więc dogodnych sposobów wytwarzania rozpuszczalnych znakowanych białek otoczki HIV, do testów immunologicznych, bez względu na zastosowany format detekcji.

Białko opiekuńcze oraz retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa mogą być wykorzystane nie tylko jako oddzielne polipeptydy. Zauważyliśmy bowiem nieoczekiwanie, że korzystne jest kowalencyjne połączenie obu tych białek. Takie kowalencyjne połączenie może być przeprowadzone przy użyciu konwencjonalnych procedur chemicznego sieciowania.

Kowalencyjne wiązanie można uzyskać również przez wytworzenie rekombinowanego polipeptydu obejmującego retrowirusową glikoproteinę powierzchniową oraz białko opiekuńcze.

W sposobie według wynalazku stosuje się białka opiekuńcze pochodzące z klasy białek wspomagających proces fałdowania i określanych terminem izomeraz cis/trans peptydyloprolilowych (PPI) (patrz Dartigalongue C. oraz Raina, powyżej). Dobrze znanymi przykładami tej rodziny są białka określane jako CypA, PpiD (Dartigalongue C. oraz Raina S., Embo J 17 (1998) 3968-3980; Schmid F.X., Molecular chaperones in the life cycle of proteins (1998) 361-389, wyd. A. L. Fink oraz Y. Goto, Marcel Decker In., Nowy Jork, USA), FkpA (Danese P.N. i wsp., Genes Dev 9 (1995) 387-398) oraz „czynnik wyzwalający (Crooke E. oraz Wickner W., Proc Natl Acad Sci USA 84 (1987) 5216-5220; Stoller G. i wsp., Embo J 14 (1995) 4939-4948).

Izomerazy peptydyloprolilowe podzielone są na trzy rodziny: parwuliny (Schmid F.X., powyżej; Rahfeld J.U. i wsp. FEBS Lett 352 (1994) 180-184), cyklofiliny (Fisher G. i wsp., Nature 337 (1989) 476-478) i rodzina FKBP (Lane W.S. i wsp., J Protein Chem 10 (1991) 151-160). Rodzina FKBP wykazuje ciekawą właściwość biochemiczną, ponieważ jej członkowie byli początkowo identyfikowani na podstawie ich zdolności do wiązania się z makrolidami, np. FK 506 i rapamycyną (Kay J.E., Biochem J 314 (1996) 361-385).

Izomerazy prolilowe mogą zawierać różne podjednostki lub moduły o różnych funkcjach, np. moduł wykazujący aktywność katalityczną oraz moduł wykazujący aktywność białka opiekuńczego lub wiążącego. Takimi modułowymi członkami rodziny FKBP są FkpA (Ramm K. oraz Pluckthun A., J Biol Chem 275 (2000) 17106-17113), SlyD (Hottenrott S. i wsp., J Biol Chem 272 (1997) 15697-15701) i „czynnik wyzwalający (Scholz C. i wsp., Embo J 16 (1997) 54-58).

Niniejszy wynalazek nie jest oczywiście ograniczony do wykorzystywania jedynie wymienionych tu z nazwy członków klasy izomeraz peptydyloprolilowych, lecz może także być przeprowadzony z zastosowaniem białek opiekuńczych pochodzących z tej samej klasy, ale uzyskanych z innych gatunków bakterii. Korzystnie, wykorzystywane są białka z rodziny FKBP w obrębie klasy PPI białek opiekuńczych.

W kolejnym wykonaniu, korzystne jest wykorzystanie homologów pochodzących z organizmów eukariotycznych, a jeszcze korzystniejsze jest wykorzystanie ludzkich izomeraz PPI, ponieważ izomerazy te nie powinny być rozpoznawane przez przeciwciała z ludzkich surowic, a więc nie powinny interferować z testami serologicznymi (tj . testami opartymi na detekcji ludzkich przeciwciał).

PL 215 170 B1

Powszechnie wiadomym i docenianym faktem jest możliwość wykorzystywania niekompletnych sekwencji białek opiekuńczych. Wykorzystywane mogą być też funkcjonalne fragmenty białek opiekuńczych (tzw. moduły), które wciąż posiadają wymagane zdolności i funkcje (patrz WO 98/13496).

Przykładowo, FkpA jest periplazmatyczną izomerazą PPI, która syntetyzowana jest jako nieaktywna cząsteczka prekursorowa w cytozolu bakteryjnym, a następnie poddawana jest translokacji przez błonę cytoplazmatyczną. Aktywnej postaci FkpA (dojrzałe lub periplazmatyczne białko FkpA) brakuje sekwencji sygnałowej (aminokwasy 1-25) i dlatego obejmuje jedynie aminokwasy 26-270 cząsteczki prekursorowej. Odpowiednie informacje o sekwencji FkpA można łatwo uzyskać z publicznych baz danych, np. z bazy SWISS-PROT pod numerem dostępu P 45523.

Białko SlyD, blisko spokrewnione z FkpA, składa się z ustrukturyzowanej domeny N-końcowej, odpowiedzialnej za funkcje katalityczne i opiekuńcze oraz w dużym stopniu nieustrukturyzowanego C-końca, wyjątkowo bogatego w reszty histydynowe i cysteinowe (Hottenrott S. i wsp., J Biol Chem 272 (1997) 15697-157 01). Stwierdziliśmy, że skrócony na C-końcu wariant białka SlyD, obejmujący aminokwasy 1-165, skutecznie spełnia swoją funkcję solubilizującą wobec gp41 i gp36. W przeciwieństwie do białka SlyD typu dzikiego, zastosowanie tego skróconego wariantu SlyD (1-165) skutecznie omija niebezpieczeństwo związane z upośledzeniem procesu „tasowania mostków disulfidowych.

Warianty omawianych powyżej białek opiekuńczych, zawierające jedno lub kilka podstawień lub delecji aminokwasowych mogą być również wykorzystane do przeprowadzenia sposobu według wynalazku.

Odpowiednie białka opiekuńcze pochodzące z alternatywnych źródeł, a także odpowiednie mutanty lub fragmenty białek opiekuńczych, mogą być łatwo wyselekcjonowane przy użyciu procedur opisanych w Przykładach. Mogą być one wykorzystane, w postaci wolnej lub kowalencyjnie związanej z retrowirusową glikoproteiną powierzchniową, w celu wytworzenia rozpuszczalnego kompleksu rsgp z białkiem opiekuńczym.

Kompetentne do wiązania białko opiekuńcze PPI obejmuje przynajmniej funkcjonalną jednostkę pośredniczącą w wiązaniu wydłużonych substratów polipeptydowych (tj. motyw wiązania substratu lub motyw białka opiekuńczego), bez względu na katalityczną aktywność izomerazy PPI.

Zaobserwowaliśmy również, że niektóre białka opiekuńcze nie należące do klasy PPI katalizatorów procesu fałdowania mogą tworzyć rozpuszczalny kompleks z retrowirusową glikoproteiną powierzchniową.

Wiadomo, iż modułowe izomerazy PPI wiążą się preferencyjnie ze zdenaturowanymi lub częściowo zdenaturowanymi białkami (np. Scholz i wsp., jak wyżej). Okazało się teraz również, że izomerazy PPI mają właściwość nie tylko katalizowania procesu fałdowania białek, ale także tworzenia stabilnych kompleksów z takimi białkami, przez co nadają im rozpuszczalność. Nieoczekiwanie badane izomerazy PPI (takie jak TF, SlyD oraz FkpA) wiążą się z retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi, przez co także solubilizują postaci o strukturze podobnej do natywnej. „Podobna do natywnej struktura białka gp41 charakteryzuje się wysoką zawartością struktur helikalnych w strukturze drugorzędowej (co można ocenić przez CD w dalekim UV) i przez kontakty trzeciorzędowe (oceniane przez CD w bliskim UV), co znajduje odzwierciedlenie w typowej „sygnaturze gp41, jak przedstawiono odpowiednio na Fig. 1B i Fig. 5. Ponadto, widmo UV dla „podobnej do natywnej struktury gp41nie wykazuje znaczącej absorpcji przy długościach fali wyższej niż 320 nm (która wskazywałaby na cząstki rozpraszające światło, takie jak agregaty).

Dostępne są liczne informacje na temat tworzenia kompleksów między modelowymi cząsteczkami biologicznymi, np. między przeciwciałem i antygenem (omówione w pracy przeglądowej: Braden B. oraz Poljak R.J., Faseb J 9 (1995) 9-16). Zazwyczaj, tworzenie kompleksu i jego dysocjacja zachodzą równolegle, a więc kompleks i jego partnerzy wiązania występują w stanie swobodnej równowagi. Podobnie to samo dotyczy kompleksów tworzonych między białkami opiekuńczymi PPI i białkami amyloidogennymi, opisanych w niniejszym wynalazku.

Tworzenie kompleksu, jak opisane w niniejszym wynalazku, jest szczególnie ważną właściwością, ponieważ kompleksy między białkiem opiekuńczym PPI a białkiem, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, np. w warunkach buforu fizjologicznego, okazały się być łatwo rozpuszczalne, (np. w buforze fizjologicznym). Antygeny, które są rozpuszczalne w warunkach fizjologicznych, mają ogromne znaczenie w zastosowaniach diagnostycznych. Mogą być one wykorzystane bezpośrednio np. jako materiał standardowy. Ponadto, mogą być sprzężone z odpowiednimi markerami lub odpowiednimi grupami wiążącymi.

PL 215 170 B1

Jak omówiono powyżej, białko gp36 wirusa HIV-2 spełnia podobne funkcje (tj. uczestniczy w fuzji z błoną i wniknięciu wirusa) i ma podobne znaczenie diagnostyczne jak gp41 wirusa HIV-1. Wiele technicznych problemów omówionych jest w niniejszym zgłoszeniu z zastosowaniem białka gp41 HIV-1 jako prototypowego przykładu retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej. Skupienie się głównie na białku gp41 wirusa HIV-1 miało na celu zachowanie jasności opisu i omówienia. Jednak podobne uwagi mają też zastosowanie wobec innych retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych, zwłaszcza gp36 wirusa HIV-2 oraz gp21 wirusa HTLV.

Wiadomo, że naturalnie występujące wirusy HIV-1 oraz HIV-2 mogą obejmować warianty oryginalnie wyizolowanych i opisanych sekwencji aminokwasowych. Takie występujące naturalnie lub wytworzone warianty retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych związane są z występowaniem niedoboru odporności u ssaków.

Takie warianty dotyczą wariantów rsgp lub przezbłonowych glikoprotein ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Warianty takie obejmują specyficzne podstawienia aminokwasowe w domenie N-helikalnej białka gp41 wirusa HIV-1 lub białka gp36 wirusa HIV-2.

Pozycje aminokwasowe zarówno domen N-helikalnych jak i C-helikalnych, uczestniczących w kontakcie między helisami, znane są z piśmiennictwa na temat białka gp41 wirusa HIV-1 i mogą być ekstrapolowane na homologiczne białko gp36 wirusa HIV-2. Stwierdzono, że wprowadzanie mutacji w tych pozycjach wpływa na właściwości białka gp41 oraz białka gp36, zwłaszcza w przypadku białka fuzyjnego, zawierającego taki wariant wraz z odpowiednią domeną białka opiekuńczego PPI.

Pozycje aminokwasowe odpowiadające pozycjom „a i „d w modelu kołowym helisy leucynowego „zamka błyskawicznego gp41są preferowanymi celami do wytworzenia wariantu. Reszty aminokwasowe w pozycji „a (numeracja wg Chan D. i wsp., Cell 89 (1997) 262-273) są to Q552, 1559, L566, I573 oraz I580; natomiast pozycji „d odpowiadają reszty I548, L555, Q562, T569 oraz L576.

W celu polepszenia rozpuszczalności bez zaburzania helikalnej integralności motywu „zamka błyskawicznego, korzystne jest zachowanie odstępów między pozycjami mutacji o długości przekraczającej jeden obrót helisy. Warunek ten jest spełniony np. w przypadku podstawień w kolejnych pozycjach „a, odpowiadających resztom Q552, I559, L566 oraz I573, a także np. w przypadku kolejnych reszt „d - I548, L555, Q562 oraz T569. Inaczej mówiąc, zmutowane reszty oddzielone są od siebie co najmniej sześcioma resztami aminokwasowymi typu dzikiego, co odpowiada dokładnie motywowi heptadowemu. Możliwe jest także zmutowanie zarówno reszt w pozycji „a, jak i w pozycji „d, w tym samym wariancie, pod powyższym warunkiem, że podstawione pozycje oddalone są od siebie o więcej niż jeden obrót helisy.

Podobnie, stwierdzono, że zmiany w ektodomenie białka gp36 wirusa HIV-2 nieoczekiwanie prowadziły do otrzymania łatwo rozpuszczalnego rekombinowanego białka, gdy uległy fuzji z SlyD lub FkpA. W tej sytuacji pozycjom „a odpowiadają reszty Q551, V558, L565, T572 i V579, a pozycjom „d reszty I547, L554, Q561, T568 i L575.

Korzystnie, od 1 do 6 aminokwasów wybranych z grupy obejmującej pozycje Q552, I559, L566, I573, I580, I548, L555, Q562, T569 i L576 w przypadku białka gp41 wirusa HIV-1, lub Q551, V558, L565, T572, V579, I547, L554, Q561, T568 i L575 w przypadku białka gp36 wirusa HIV-2, odpowiednio, są zastąpione przez mniejszy lub bardziej hydrofilowy aminokwas.

Korzystnie, pozycje aminokwasowe, które mają być podstawione, wybrane są z grupy obejmującej Q552, I559, L566, I573 i I580 wirusa HIV-1, i z grupy L554, Q561, T568 i L575 wirusa HIV-2, odpowiednio.

W korzystnym wykonaniu wariantem gp41 HIV-1 jest wariant obejmujący przynajmniej jedno, a najwyżej cztery podstawienia aminokwasowe w pozycjach wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 555, Leu 566, Ile 573 i Ile 580, przy czym pozycje te są znane z sekwencji typu dzikiego gp41, opisanej w NR ID SEK:1, lub też odpowiadają tym pozycjom, przy czym wprowadzane aminokwasy wybrane są (niezależnie od siebie) z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy.

Dokonano zaskakującej obserwacji, że otrzymać można warianty gp41 typu dzikiego, które stanowią znaczne udoskonalenie w porównaniu z odpowiadającym im polipeptydem gp41 o sekwencji typu dzikiego. Podstawienia aminokwasowe prowadzące do otrzymania wariantów opisane są na podstawie numeracji i składu aminokwasowego sekwencji typu dzikiego białka gp41, znanej z publikacji D.C. Chana i wsp. (Cell 89 (1997) 263-273) i przedstawionej tu jako NR ID SEK:1.

Opisane powyżej podstawienia aminokwasowe mogą być oczywiście wprowadzone w odpowiadające pozycje sekwencji białka gp41, jak i innych znanych lub jeszcze nie zidentyfikowanych izo14

PL 215 170 B1 latów HIV-1. Termin „odpowiadająca pozycja wprowadzono w celu wskazania, że znalezione lub utworzone mogą być także izolaty HIV-1 oraz ich warianty, które obejmować mogą dodatkowe lub brakujące aminokwasy, co z kolei mogłoby powodować, że w porównaniu z sekwencją NR ID SEK:1 dawałoby różną całkowitą liczbę dla odpowiednich pozycji sekwencji lub motywów.

Porównywano sekwencję białka gp41 z sekwencją typu dzikiego (NR ID SEK:1) przy użyciu oprogramowania PileUp z pakietu GCG Package Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc). Program PileUp tworzy dopasowania liniowe wielu sekwencji, wykorzystując do tego uproszczoną wersję sposobu dopasowywania postępującego (Feng D.F. oraz Doolittle R.F., J Mol Evol 25 (1987) 351-360). Określane są macierze wyników dla identycznych, podobnych lub różnych reszt aminokwasowych. Proces ten zaczyna się od dopasowania (par sekwencji) dwóch najbardziej podobnych sekwencji, co prowadzi do wytworzenia zestawu dwóch dopasowanych sekwencji. Do tego zestawu może być następnie dopasowywana następna pod względem bliskości pokrewieństwa sekwencja lub zestaw dopasowanych sekwencji. Dwa zestawy dopasowanych sekwencji mogą być do siebie dopasowane w sposób analogiczny do dopasowywania dwóch pojedynczych sekwencji. Ostateczne dopasowanie osiągane jest przez przeprowadzenie serii postępujących dopasowań par, obejmujących coraz mniej podobne sekwencje i zestawy, aż wszystkie sekwencje zostaną włączone do końcowego dopasowania. Można łatwo zlokalizować te pozycje aminokwasowe w nowym izolacie wirusa HIV-1 lub w sztucznie wytworzonej cząsteczce gp41, które odpowiadają pozycjom 555, 566, 573, 580 w sekwencji typu dzikiego.

Korzystny wariant polipeptydu gp41 HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 555, gdzie Leu 555 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Kolejny korzystny wariant polipeptydu gp41 HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 566, gdzie Leu 566 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Kolejny korzystny wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 573, gdzie Ile 573 jest podstawiona przez serynę lub treoninę, przy czym podstawienie przez serynę jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Kolejny korzystny wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 580, gdzie Ile 580 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Wariant gp36 HIV-2 może obejmować przynajmniej jedno, a najwyżej trzy podstawienia aminokwasowe w pozycjach wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 554, Leu 565 oraz Val 579, które to pozycje znane są z sekwencji typu dzikiego białka gp36 HIV-2, opisanej w NR ID SEK:2, lub też które odpowiadają tym pozycjom, przy czym wprowadzane aminokwasy wybrane są kolejno lub niezależnie z grupy składającej się z seryny, treoniny, asparaginy, glutaminy, kwasu asparaginowego oraz kwasu glutaminowego.

Numeracja odpowiada sekwencji typu dzikiego (NR ID SEK:2) opublikowanej przez M. Guyadera i wsp. (Nature 326 (1987) 662-669). Pozycje aminokwasowe w obrębie sekwencji gp36, które odpowiadają pozycjom znanym z przedstawionej powyżej sekwencji, określane są w sposób opisany powyżej dla gp41.

Korzystny wariant polipeptydu gp36 HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 554, gdzie Leu 554 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Korzystny wariant polipeptydu gp36 HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 565, gdzie Leu 565 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.

Korzystny wariant polipeptydu gp36 HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 579, gdzie Val 579 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem. Korzystnie, wariant białka gp41 lub wariant białka gp36 zawierają podstawienia w dwóch spośród pozycjach aminokwasowych opisanych powyżej. Warianty zawierające trzy podstawienia aminokwasowe są również korzystne. Kolejny korzystny wariant białka gp41 zawiera podstawienia w czterech pozycjach aminokwasowych, omawianych szczegółowo powyżej.

Korzystnie do stosowania kompleksu z białkiem opiekuńczym PPI stosowana jest całkowita sekwencja gp41 lub gp36 (tj. ektodomeny, bez peptydu fuzyjnego i fragmentu przezbłonowego), albo też

PL 215 170 B1 odpowiadającego im białka otoczki ssaczego wirusa niedoboru odporności (np. gp21 z HTLV). Dopuszczalne jest również użycie fragmentów retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, jak np. opisanego przez Lu i wsp. (patrz wyżej) fragmentu gp41 z HIV-1. Fragmenty takie zawierają korzystnie C-końcową oraz N-końcową helisę zewnątrzkomórkowej części gp41.

Ważne diagnostycznie gp41, obejmujące pozycje aminokwasowe 535-681 (nomenklatura wg Chan D.C. i wsp., Cell 89 (1997) 263-273), może być wytworzone przy użyciu technik rekombinacyjnych, zgodnie ze standardowymi procedurami. Inna interesująca cząsteczka gp41 obejmuje aminokwasy 540-669 cząsteczki prekursorowej gp160, którą opisał Lu i wsp. (wyżej) na Figurze 1.

Jako typowy przykład retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, małe białko otoczki HIV jest niezmiernie trudne do manipulowania i wykazuje całkiem niezwykłe właściwości. Jak już wspomniano, jedną z najistotniejszych cech cząsteczki e-gp41 jest jej nierozpuszczalność w buforze fizjologicznym. Wyprodukowane sposobem rekombinacji gp41 jest zarówno rozpuszczalne jak i zachowuje zbliżoną do natywnej strukturę przy pH 3,0 niskiej sile jonowej. Jednak nawet przy tym pH pozostaje wrażliwe na stężenie soli w buforze. W zależności od użytej soli, gp41 precypituje w obecności soli o stężeniu przekraczającym 100-500 mM. Jak zostanie szczegółowo omówione poniżej, białko to może być (znów) solubilizowane (w zdenaturowanej postaci) przez czynniki chaotropowe.

Przez warunki buforu fizjologicznego rozumie się najczęściej warunki odpowiadające stężeniu soli i wartości pH, jakie występują w osoczu lub w surowicy zwierząt i są one określone jako pH wynoszące około 7,4 oraz stężenie soli wynoszące około 150 mM. Kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym wytwarzany sposobem według wynalazku jest łatwo rozpuszczalny w tych warunkach buforowych. Obecne tam rsgp jest aktywne immunologicznie, co wskazuje na jego zbliżoną do natywnej strukturę. Podczas gdy gp41 pod nieobecność odpowiedniego detergentu, lub bez wstępnego potraktowania takim detergentem, jest w zasadzie nierozpuszczalne w warunkach buforu fizjologicznego (tj. 20 mM fosforan sodu pH 7,4; 150 mM NaCl), opisany tu kompleks staje się łatwo rozpuszczalny po ponownym sfałdowaniu w wyniku zastosowania odpowiedniego protokołu. Ektodomena gp41, zawarta w tym kompleksie jest rozpuszczalna przynajmniej w stężeniu 100 mM, korzystnie w stężeniu 1 μΜ lub wyższym, najkorzystniej w stężeniu 10 μΜ lub wyższym. Zatem, rozpuszczalność ulega znacznemu poprawieniu, od wyjściowego zakresu stężeń niższych niż nanomolowe do osiągnięcia stężeń około mikromolowych.

W celu lepszego zrozumienia zakresu niniejszego wynalazku, należy zaznaczyć, że warunki buforowe stosowane do solubilizacji i renaturacji mogą być modyfikowane według potrzeb (co może obejmować bardzo szeroki zakres warunków buforowych) i nie należy ich rozumieć jako nadmiernych ograniczeń wynalazku.

Ogólne stężenie soli w buforze fizjologicznym nie stanowi wartości krytycznej, o ile zadba się o to, aby kompleks białko opiekuńcze-gp41 nie uległ dysocjacji, a gp41 pozostawało w roztworze. Korzystnie, bufor fizjologiczny powinien zawierać przynajmniej 10 mM, ale nie więcej niż 200 mM układu buforującego. Pozostałe składniki buforu, jeśli takie występują, mogą być solami bez istotnej zdolności buforującej, np. chlorek sodu. Bufor fizjologiczny zawiera korzystnie sól w stężeniu 20-500 mM, korzystniej w stężeniu 50-300 mM, najkorzystniej w stężeniu 100-200 mM.

W sposobie według niniejszego wynalazku wartość pH w buforze fizjologicznym może wahać się w zakresie od 5,0 do 8,5, korzystniej od 5,5 do 8,3. Jeszcze korzystniej, warunki buforu fizjologicznego powinny być zdefiniowane przez stężenie soli w podanym powyżej zakresie oraz wartość pH w zakresie od 6,0 do 8,0, a najkorzystniej wartość pH powinna mieścić się w zakresie od 6,5 do 7,8.

Zgodnie ze sposobem opisanym w niniejszym wynalazku, retrowirusową glikoproteinę powierzchniową solubilizuje się w warunkach buforu niefizjologicznego, dodaje się białko opiekuńcze (lub jest już obecne jako związana kowalencyjnie domena białka) i mieszaninę zawierającą solubilizowaną retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze, doprowadza się do warunków buforu fizjologicznego. Podczas gdy sama retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa uległaby spontanicznie precypitacji, to w tym sposobie nieoczekiwanie pozostaje w roztworze. To ważne stwierdzenie związane jest najprawdopodobniej z tworzeniem się kompleksu między retrowirusową glikoproteiną powierzchniową a białkiem opiekuńczym.

W przypadku wytwarzania rekombinowanego gp41 w bakteriach E. coli, rekombinowane gp41 otrzymywane jest w postaci ciał inkluzyjnych. Materiał ten jest solubilizowany z zastosowaniem silnie chaotropowego odczynnika, np. 7,0 M tiocyjanianu guanidyniowego. W tych warunkach polipeptyd gp41 pozostaje przeważnie nieustrukturyzowany. Przez zmianę buforu w odpowiednich etapach na 30 mM kwas mrówkowy przy pH 3,0 gp41 w roztworze przybiera helikalną strukturę, postrzeganą jako

PL 215 170 B1 zbliżona do natywnej. Jednym z prostych sposobów monitorowania statusu prawidłowego lub nieprawidłowego fałdowania białka jest analizowanie odpowiadającego temu białku widma CD (dichroizmu kołowego) w regionie amidowym (185-250 nm) i aromatycznym (260-320 nm). Ponadto, ze standardowego widma UV uzyskać można łatwo informacje o cząstkach rozpraszających światło (agregaty).

Ważne jest podkreślenie faktu, że retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa w kompleksie z białkiem opiekuńczym przybiera strukturę, która uważana jest za zbliżoną do natywnego sfałdowania. Natomiast, retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa, która została solubilizowana w neutralnym pH przez czynniki chaotropowe, jest przeważnie nieustrukturyzowana, tracąc w ten sposób epitopy o uporządkowanej konformacji. Możliwy jest także alternatywny sposób zwiększania rozpuszczalności retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej przy użyciu detergentów. Przykładowo, dodecylosiarczan sodu (SDS) był pomyślnie używany do solubilizacji gp41. Jednak materiał uzyskany w wyniku solubilizacji przy użyciu SDS nie jest materiałem z wyboru wykorzystywanym np. do zastosowania w testach immunologicznych do wykrywania przeciwciał przeciwko gp41. Ponadto (jak omówiono powyżej), takie testy immunologiczne korzystnie wykrywają także przeciwciała przeciwko epitopom konformacyjnym gp41 i nie można wykluczyć, że detergenty częściowo niszczą epitopy konformacyjne.

Wytwarzanie rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp41 rozpoczyna się w warunkach buforu niefizjologicznego. W przypadku wytwarzania kompleksu między wolnym białkiem opiekuńczym a wolnym białkiem docelowym (np. gp41 wirusa HIV-1), ten bufor „niefizjologiczny musi spełniać dwa warunki: (a) gp41 obecny jest w postaci, którą określa się jako podobną do natywnej; (b) białko opiekuńcze PPI jest przynajmniej częściowo funkcjonalne (tj. zdolne do wiązania). W takich warunkach wyjściowych białko opiekuńcze wiąże się z białkiem amyloidogennym, a zmiana warunków buforowych z niefizjologicznych na fizjologiczne jest możliwa bez precypitacji białka amyloidogennego.

Podczas gdy białka opiekuńcze zwykle wiążą się ze zdenaturowanymi białkami i oddziałują na nie, ułatwiając w ten sposób ich prawidłowe (ponowne) sfałdowanie, sytuacja na której oparty jest niniejszy wynalazek jest zdecydowanie odmienna. Białko gp41, solubilizowane w odpowiednich warunkach buforu niefizjologicznego, wydaje się być obecne w postaci podobnej do natywnej (patrz Fig. 1A i 1B, oraz Fig. 5). Niezgodnie z powszechnymi opiniami na temat funkcji białka opiekuńczego, w sposobie według wynalazku białko opiekuńcze wydaje się wiązać prawidłowo sfałdowane białko i stabilizować je w takich warunkach buforowych, w których gp41 w przeciwnym wypadku jest nierozpuszczalne i uległoby precypitacji.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, białko opiekuńcze PPI jest wybrane z grupy obejmującej FkpA, SlyD oraz „czynnik wyzwalający.

Stwierdzono, że zwłaszcza FkpA lub SlyD poprawiają solubilizację gp41 i tworzą z nim dość stabilny kompleks. Zatem kolejne korzystne wykonanie wynalazku obejmuje białko opiekuńcze wybrane z grupy obejmującej FkpA oraz SlyD. Najkorzystniejszym białkiem opiekuńczym jest FkpA.

Jak opisano powyżej, także fragmenty białek opiekuńczych mogą być wykorzystane do uzyskania żądanej funkcji. W przypadku białek opiekuńczych o budowie modułowej, takich jak np. białka FKBP zawierające moduł katalityczny oraz moduł wiążący, korzystne jest, aby takie fragmenty zawierały przynajmniej domenę wiążącą, lub aby te fragmenty wykazywały przynajmniej funkcję porównywalną z tą, jaką spełnia ta domena.

FKBP12 jest ludzkim białkiem należącym do rodziny FKBP, i zasadniczo obejmuje jedynie kataliczną domenę izomerazy PPI. Ponieważ nie posiada domeny wiążącej polipeptydy, wykazuje obniżone powinowactwo wobec niesfałdowanych lub częściowo sfałdowanych substratów białkowych, w porównaniu z innymi białkami z rodziny FKBP. Wykazano, że rozfałdowanie i ponowne sfałdowanie FKBP12 jest procesem odwracalnym (Egan D.A. i wsp., Biochemistry 32 (1993) 1920-1927); Scholz C. i wsp., J Biol Chem 271 (1996) 12703-12707). My stwierdziliśmy, że ponowne fałdowanie i rozfałdowanie białek FkpA (25-270) oraz SlyD (1-165) jest również odwracalne, co spełnia warunek istotny dla opisanego tu sposobu.

Jak opisano powyżej, takie rozpuszczalne kompleksy, zawierające białko gp41 wirusa HIV-1, lub jego homolog pochodzący z innego ssaczego wirusa niedoboru odporności, mogą być łatwo wytworzone przez zmieszanie białka opiekuńczego PPI (np. wytworzonego technikami rekombinacji) oraz rekombinowanego białka gp41. Tworzy się wówczas kompleks pomiędzy dwoma niezależnymi cząsteczkami. Jest to więc kompleks międzycząsteczkowy.

Tworzenie kompleksu jest procesem dynamicznym, w którym dysocjacja i ponowna asocjacja zachodzą równolegle. Tak jest w przypadku zarówno między- jak i wewnątrzcząsteczkowej asocjacji

PL 215 170 B1 między np. FkpA i gp41. Ponieważ gp41 ulega natychmiastowej i ilościowej precypitacji z roztworu buforu fizjologicznego, należy tak dobrać stężenia obu partnerów, które zapewniają, że nie występuje krytyczne (lub wywołujące agregację) stężenie wolnej postaci gp41, oraz że zdecydowana większość gp41 jest związana i stabilizowana w postaci kompleksu gp41 - białko opiekuńcze.

W zależności od zastosowanego białka opiekuńczego, konieczne jest zmieszanie przynajmniej dwukrotnego nadmiaru (na podstawie molowej) białek opiekuńczych w stosunku do cząsteczek gp41. Korzystnie białkiem opiekuńczym jest FkpA w molowym nadmiarze w stosunku do gp41. Korzystnie, mieszanina taka zawiera FkpA w molowym nadmiarze w stosunku do gp41. Korzystnie, stosuje się 3 do 10 razy więcej białka FkpA. Najkorzystniejszy stosunek molowy FkpA do gp41 wynosi od 4 do 6.

Można też wytworzyć wewnątrzcząsteczkowy kompleks, np. między różnymi domenami białka zawierającego kowalencyjnie związaną przynajmniej jedną domenę białka rsgp oraz przynajmniej jedną domenę białka opiekuńczego PPI, co prowadzi do uzyskania dodatkowych korzystnych efektów, np. w odniesieniu do stabilności i łatwości wytwarzania. Na przykład, że stosunek 1:1 (rsgp do białka opiekuńczego) wystarcza do utworzenia rozpuszczalnego kompleksu, jeśli obie domeny są kowalencyjnie związane.

Najkorzystniejszymi cząsteczkami rsgp zawartymi w takim rekombinowanym polipeptydzie są gp41 z wirusa HIV-1 oraz gp36 z wirusa HIV-2.

Dla rekombinowanego białka zawierającego przynajmniej jedną domenę rsgp oraz przynajmniej jedną domenę białka opiekuńczego PPI, przeniesienie z warunków niefizjologicznych do fizjologicznych może się odbywać różnymi sposobami. Rozpuszczalne wewnątrzcząsteczkowe kompleksy między gp41 a FkpA są łatwo otrzymywane przez doprowadzanie buforu do fizjologicznych warunków przy użyciu dializy, szybkiego rozcieńczenia, lub ponownego fałdowania na nośniku (macierzy). Mieszanina zawierająca rozpuszczalny kompleks gp41 z białkiem opiekuńczym może być użyta bezpośrednio do modyfikacji.

Kompleks rozpuszczalny, zawierający np. gp41 oraz PPI, można również wytworzyć wychodząc od polipeptydu zawierającego obie domeny (gp41 i białko opiekuńcze), otrzymanego technikami rekombinacji. Kompleks gp41 - białko opiekuńcze ma więc wówczas naturę wewnątrzcząsteczkową. Korzystnie, rekombinowany polipeptyd obejmuje gp41 i białko opiekuńcze, lub też gp36 i białko opiekuńcze.

Ekspresję rekombinowanego polipeptydu, wykorzystywanego do otrzymywania rozpuszczalnych kompleksów gp41 z białkiem opiekuńczym uzyskuje się przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Korzystnie, gen białka opiekuńczego umieszcza się (zgodnie z ramką odczytu) w pozycji 5' od genu białka docelowego w wektorze ekspresyjnym, zawierającym w ten sposób informację genetyczną zarówno dla gp41, jak i dla białka opiekuńczego, a ewentualnie także dla odpowiedniego łącznika peptydowego. Korzystnym gospodarzem przy wytwarzaniu takiego rekombinowanego białka fuzyjnego na dużą skalę jest bakteria E. coli.

Rozpuszczalny kompleks jest kompleksem wewnątrzcząsteczkowym, korzystnie kompleksem wewnątrzcząsteczkowym w obrębie rekombinowanego polipeptydu zawierającego gp41 lub gp36, oraz białko opiekuńcze PPI. Najkorzystniej, białko opiekuńcze PPI, stanowiące część rekombinowanego polipeptydu, nie posiada żadnego eksportowego peptydu sygnałowego (obecnego w odpowiedniej cząsteczce prekursorowej) i odpowiada dojrzałemu białku opiekuńczemu PPI. Ponieważ rekombinowane białko nie zawiera funkcjonalnej sekwencji sygnałowej, produkt genu akumuluje się w cytozolu bakteryjnym.

Uderzającą cechą gp41 zawartego w rekombinowanej cząsteczce FkpA-gp41 jest jego wyjątkowo dobra rozpuszczalność w porównaniu z niezwiązaną z białkiem opiekuńczym (nieosłoniętą) ektodomeną gp41. Ciekawe jest, że „materiał chaotropowy (tj. FkpA-gp41 w 6,0-7,0 M GuHCl) może być poddany ponownemu sfałdowaniu na różne sposoby, z których wszystkie prowadzą do otrzymania stabilnej termodynamicznie i rozpuszczalnej postaci, przypominającej postać natywną. Ponowne fałdowanie przeprowadzane jest z dużą wydajnością, zarówno w przypadku dializy, jak i szybkiego rozcieńczania, a także przy użyciu chromatografii wykluczania ze względu na wielkości oraz fałdowania na matrycy. Obserwacje te wskazują na to, że polipeptyd fuzyjny gp41-FkpA, w postaci związanej kowalencyjnie, jest raczej białkiem stabilnym termodynamicznie, niż metastabilnym.

Rekombinowany polipeptyd FkpA-gp41 zawiera dwie domeny białkowe, mające różne wymagania wobec procesu fałdowania. Ponieważ protokół oczyszczania obejmuje etap wstępnej denaturacji, konieczne jest, aby proces fałdowania białka opiekuńczego był procesem odwracalnym. Rzeczywiście istnieje przekonujący dowód spektroskopowy na odwracalne i niezależne fałdowanie FkpA oraz

PL 215 170 B1 gp41 w obrębie związanego kowalencyjnie kompleksu białkowego. Fałdowanie skróconego od strony C-końca białka SlyD okazało się również odwracalne.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że białko gp41, jako fragment wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego gp41 i białko opiekuńcze PPI, jest zarówno rozpuszczalne, jak i stabilne. To samo odnosi się do wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI oraz gp36, lub też białko opiekuńcze PPI i gp21 z wirusa HTLV. Poprawiona stabilność gp41 w takim kompleksie wiąże się z uzyskaniem dodatkowych korzyści. Na przykład, umożliwia to stosunkowo łatwe uzyskanie całkowicie renaturowanej rekombinowanej cząsteczki zawierającej gp41 oraz białko opiekuńcze. Rekombinowane białko jest początkowo solubilizowane przez traktowanie czynnikiem chaotropowym (np. chlorkiem guanidyniowym). Całkowicie renaturowane białko zawierające kowalencyjnie połączone domeny białkowe można następnie otrzymać przepuszczając ten solubilizowany materiał przez żelową kolumnę filtracyjną, w której wartość pH jest równoważona przy użyciu odpowiedniego buforu fizjologicznego (patrz Przykład 2.3 oraz Figury 7 i 8).

Rozpuszczalny kompleks wewnątrzcząsteczkowy białka gp41 z białkiem opiekuńczym wykazuje jeszcze jedną korzystną cechę: jest stosunkowo stabilny wobec denaturującego działania detergentów. Ten efekt staje się jeszcze bardziej wyraźny, jeśli białko fuzyjne zawiera dwa białka opiekuńcze i jedną glikoproteinę powierzchniową (odpowiednio gp41 lub gp36). Większość testów immunologicznych przeprowadza się w obecności detergentów w celu zmniejszenia lub przynajmniej częściowego uniknięcia problemów związanych z nieswoistym wiązaniem przeciwciał. W przypadku rozpoznania HIV, stosuje się dość silne detergenty, co oprócz wymienionego powyżej powodu ma również prowadzić do dezintegracji i rozbicia cząstek wirusowych, tak aby ułatwiało to wykrywanie antygenów wirusowych, takich jak gp24.

Rekombinowana ektodomena gp41 solubilizowana przez SDS (siarczanu dodecylu sodu) nie wykazuje immunoreaktywności w używanym rutynowo buforze testowym, np. w testach wykrywającym przeciwciała przeciwko HIV lub antygen p24 (patrz Figura 9). Jednak w buforze o tych samych warunkach, białko gp41, które jest częścią wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego gp41 oraz białko opiekuńcze PPI według wynalazku, wykazuje silną immunoreaktywność. Jak widać to na Figurze 9 w tych samych warunkach testu i tej samej surowicy pacjenta, materiał ten uzyskuje doskonałe krzywe kompetycji, co może być wyjaśnione jedynie obecnością rozpuszczalnego białka gp41, o właściwościach podobnych do białka natywnego, które w dodatku jest stabilne w obecności detergentu użytego w teście.

Istotną właściwością kompleksu wytwarzanego sposobem według niniejszego wynalazku jest to, że rsgp stanowiąca część rozpuszczalnego kompleksu rsgp-białko opiekuńcze jest sfałdowana w natywny sposób, w buforze o warunkach fizjologicznych (np. 20 mM fosforan, 150 mM chlorek sodu, pH 7,4). Stanowi to ogromną zaletę, istotną w przypadku zastosowań leczniczych jak również diagnostycznych. Zarówno wewnątrz- jak i międzycząsteczkowy kompleks, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową oraz białko opiekuńcze wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych mogą stanowić składnik kompozycji, która jest rozpuszczalna w warunkach buforu fizjologicznego i zawierać dopuszczalną fizjologicznie zaróbkę, a także, jeśli jest to korzystne, odpowiednie dodatki i/lub konwencjonalne substancje wspomagające.

W odniesieniu do leczenia, oczywisty jest postęp, jaki oznacza dostarczenie „rozpuszczalnej i natywnie sfałdowanej gp41 lub gp36. Na przykład, po raz pierwszy stała się możliwa iniekcja gp41 przy zachowaniu warunków buforu fizjologicznego.

Wiadomo, że peptydy pochodzące z regionu powtórzeń heptadowych (siódemkowych) gp41, lub z regionu C-końcowej helisy gp41, posiadają aktywność przeciwwirusową (Wild C. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 10537-10541). Powstrzymują one wnikanie wirusa do komórek przez swoiste oddziaływanie z tzw. „produktem pośrednim o strukturze spinki do włosów gp41 (patrz opracowanie przeglądowe Doms R.W. oraz Moore J.P., J Cell Biol 151 (2000) F9-14). Stwierdziliśmy, że kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym wykazuje aktywność przeciwwirusową. Skuteczna leczniczo dawka kompozycji zawierającej kompleks gp41 z białkiem opiekuńczym, lub też kompleks gp36 z białkiem opiekuńczym, albo oba te kompleksy, wykorzystana jest do zapobiegania wnikaniu wirusa HIV oraz rozsiewaniu HIV w obrębie organizmu gospodarza („zahamowanie wejścia wirusa).

Kolejnym korzystnym leczniczym zastosowaniem kompozycji zawierającej kompleks gp41 białko opiekuńcze jest wykorzystanie jej do wywołania odpowiedzi immunologicznej u ssaka. Opisany kompleks umożliwia udostępnienie znacznie większej liczby epitopów gp41, niż jakikolwiek inny znany

PL 215 170 B1 immunogen HIV (patrz np. Root i wsp., wyżej). Należy się więc spodziewać, że ten nowy immunogen wywoływać będzie znacznie szerszą odpowiedź immunologiczną.

W odniesieniu do procedur diagnostycznych, oczywistymi zaletami rozpuszczalnego kompleksu, obejmującego rsgp oraz białko opiekuńcze, są np. zwiększona stabilność retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej (takiej jak np. gp41) w warunkach buforu fizjologicznego i/lub zwiększenie czułości testu diagnostycznego, i/lub zwiększenie liczby udostępnionych epitopów konformacyjnych, i/lub możliwość łatwego znakowania prawidłowo sfałdowanego białka rsgp, takiego jak gp41.

Dobrze znanymi znacznikami są grupy znacznikowe lub efektorowe, takie jak grupy wiążące się z nośnikami fazy stałej. Grupy znacznikowe mogą być wybrane z dowolnej znanej grupy wykrywalnych znaczników, takich jak barwniki, luminescencyjne grupy znacznikowe, takie jak grupy chemiluminescencyjne, np. estry akrydynowe lub dioksetany, lub barwniki fluoroscencyjne, np. fluoresceina, kumaryna, rodamina, oksazyna, rezorufina, cyjanina, oraz ich pochodne. Innymi przykładami grup znacznikowych są luminescencyjne kompleksy metali, takie jak kompleksy rutenu lub europu, enzymy, np. enzymy wykorzystywane w testach ELISA lub CEDIA (ang. Cloned Enzyme Donor Immunoassay, np. EP-A-0 061 888), oraz radioizotopy.

Grupy efektorowe obejmują np. jednego partnera z pary wykazującej powinowactwo biologiczne. Podczas przeprowadzania testu, grupa efektorowa oddziałuje swoiście i korzystnie niekowalencyjnie z innym partnerem takiej pary. Przykładami takich par mogą być hapten lub antygen/przeciwciało, biotyna lub analog biotyny, taki jak aminobiotyna, iminobiotyna lub desthiobiotyna/awidyna lub streptawidyna, cukier/lektyna, kwas nukleinowy lub jego analog/komplementarny kwas nukleinowy, a także receptor/ligand np. receptor hormonu sterydowego/hormon sterydowy. Korzystne elementy takich par obejmują hapten, antygen oraz hormon. Szczególnie korzystne są hapteny, takie jak digoksyna i biotyna, lub ich analogi.

Kompleks rozpuszczalny, zawierający rsgp oraz białko opiekuńcze PPI, jest korzystnie stosowany w testach immunologicznych, wykrywających przeciwciała skierowane przeciwko rsgp. Korzystnie, stosowane są kompleksy, zawierające gp41 lub gp36 oraz białko opiekuńcze. W bardzo korzystnym wykonaniu, znakowany rozpuszczalny kompleks obejmujący gp41 i białko opiekuńcze PPI jest stosowany w testach immunologicznych do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciw gp41. W najkorzystniejszym wykonaniu znakowany kompleks jest kompleksem wewnątrzcząsteczkowym w obrębie rekombinowanego polipeptydu zawierającego białko opiekuńcze PPI i gp41.

Testy immunologiczne są testami znanymi specjalistom z tej dziedziny. Sposoby przeprowadzania takich testów, a także praktyczne zastosowania i procedury, są opisane w odpowiednich podręcznikach. Przykładem może być opracowanie P. Tijssena „Preparation of enzyme-antibody or other enzymemacromolecule conjugates (w podręczniku „Practice and theory of enzyme immunoassays (1990) 221-278, wyd. R.H. Burdon i P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, Holandia) oraz rozmaite opracowania Tijssena w „Methods in Enzymology (1980) wyd. S.P. Colowick, N.O. Caplan oraz S.P., Academic Press), dotyczące sposobów immunologicznej detekcji, zwłaszcza w tomach 70, 73, 74, 84, 92 i 121.

Nowy rozpuszczalny kompleks rsgp-białko opiekuńcze może być stosowany do poprawy testów służących do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV, niezależnie od zastosowanego sposobu detekcji (np. testu radioizotopowego, enzymatycznego testu immunologicznego, testu z wykorzystaniem elektrochemiluminescencji, itp.) lub zasady działania (np. testu paskowego, testu „kanapkowego, testu homogennego, itp.).

Dla niezawodnego i czułego wczesnego wykrywania infekcji wirusem HIV istotne jest dokonywanie pomiaru zarówno antygenu wirusowego, jak i przeciwciała przeciwko wirusowi w próbkach płynów ciała. Kompleks rozpuszczalny umożliwia wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciwko gp41 i/lub gp36 w warunkach buforu fizjologicznego. Wykrywanie przeciwciał przeciwko gp41 i/lub gp36 jest cenną częścią takich łączonych systemów detekcji HIV. W korzystnym zastosowaniu dotyczy on więc systemów detekcji wirusa HIV, obejmującego wykrywanie przeciwciał przeciwko gp41 i/lub gp36 w oparciu o wykorzystanie kompleksu zawierającego gp41 i/lub gp36 oraz białko opiekuńcze. Najkorzystniej, detekcja przeciwciał skierowanych przeciwko gp41 i/lub gp36, oparta na wykorzystaniu takiego kompleksu, przeprowadzana jest wraz z detekcją antygenu wirusa HIV, korzystnie antygenu gp24.

Jak wiadomo w tej dziedzinie, przeciwciała skierowane przeciwko czynnikom infekcyjnym, takim jak bakterie, grzyby lub wirusy, są korzystnie wykrywane testem przeprowadzonym zgodnie z zasadą mostku antygenowego (czasami zasada ta nazywana jest też zasadą podwójnego mostku antygenowego, gdyż za pośrednictwem przeciwciała łączone są dwa antygeny). W takim teście wymagana jest

PL 215 170 B1 i wykorzystana zdolność przeciwciała do wiązania przynajmniej dwóch różnych cząsteczek danego antygenu przy pomocy swoich dwóch (IgG, IgA, IgE) lub 10 (IgM) paratopów.

Wykrywanie przeciwciał w płynach ustrojowych przy zastosowaniu koncepcji mostku może być przeprowadzone w różnych układach testowych. Prosty układ obejmuje bezpośrednie pokrycie antygenem fazy stałej oraz stosowanie tego samego antygenu w postaci znakowanej. Przy zaistnieniu odpowiednich warunków testu, przeciwciało w próbce tworzy mostek między antygenem związanym na fazie stałej a znakowanym antygenem. Dlatego też, mostek tworzony jest jedynie wtedy, jeśli w badanej próbce obecne jest badane przeciwciało, co prowadzi do wykrycia sygnału.

Zasadnicze struktury obu antygenów, czyli „antygenu na fazie stałej oraz „antygenu detekcyjnego, są korzystnie takie same. Na przykład, polipeptyd zawierający jeden lub kilka epitopów, może być pośrednio lub bezpośrednio naniesiony na fazę stałą i ten sam syntetyczny polipeptyd może być również związany ze znacznikiem lub markerem i zastosowany jako antygen detekcyjny. Możliwe jest też wykorzystanie podobnych, lecz odmiennych antygenów, które wykazują reaktywność krzyżową w teście opartym na mostku antygenowym. Zasadniczym warunkiem przeprowadzenia takiego testu jest obecność odpowiedniego epitopu lub epitopów na obu antygenach. Oczywiście są liczne warianty układu testowego opartego na podwójnym mostku antygenowym. Takie warianty obejmują na przykład opłaszczenie antygenem fazy stałej w sposób pośredni. Korzystnie, swoiście wiążąca się para, najkorzystniej system biotyna i streptawidyna (lub awidyna), jest stosowana do pośredniego wiązania antygenu z fazą stałą. Z drugiej strony, antygen stosowany do detekcji w takim systemie nie musi być bezpośrednio związany ze znacznikiem (np. radioizotopem, enzymem, cząsteczką fluoroscencyjną, itp.), lecz może być też wykrywany pośrednio, gdy np. połączony jest z haptenem (takim jak przykładowo digoksygenina). Taki pośredni sposób detekcji może być przeprowadzany np. przez wyznakowane przeciwciało skierowane przeciwko digoksygeninie.

Taki sposób detekcji jest wykorzystywany w teście immunologicznym opartym na zasadzie podwójnego mostka antygenowego i obejmującym: pierwszy antygen, obejmujący pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem, oraz drugi antygen, obejmujący drugi kompleks białka opiekuńczego z antygenem.

W teście immunologicznym opartym na zasadzie mostka antygenowego, pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem może być zastosowany jako antygen wychwytujący, a drugi kompleks białka opiekuńczego z antygenem zastosowany jest jako antygen detekcyjny.

Opisane kompleksy białka opiekuńczego z antygenem nie tylko powodują rozpuszczalność rożnych polipeptydów, które w przeciwnym wypadku byłyby trudne do zastosowania, ale też umożliwiają przeprowadzenie bardzo korzystnego testu immunologicznego, opartego na koncepcji podwójnego mostka antygenowego.

Szczególnie atrakcyjną cechą takiego testu immunologicznego opartego na koncepcji podwójnego mostka antygenowego jest możliwość zastosowania różnych białek opiekuńczych odpowiednio do wytwarzania kompleksu z antygenem związanym z fazą stałą i do wytwarzania kompleksu z antygenem detekcyjnym. Taka modyfikacja testu poprawia dalej problem nieswoistego wiązania. Przeciwciała obecne w próbce, które byłyby reaktywne wobec białka opiekuńczego i w ten sposób wywoływałyby sygnał fałszywie dodatni, nie będą tworzyły mostka, jeśli do tworzenia kompleksu z antygenem fazy stałej i kompleksu z antygenem detekcyjnym użyte zostaną różne białka opiekuńcze. Zatem, przy zastosowaniu tego układu, prawdopodobieństwo otrzymania pozytywnego sygnału wskutek nieswoistego wiązania jest znacznie zmniejszone. Korzystnie, test immunologiczny, oparty na koncepcji podwójnego mostka antygenowego, charakteryzuje się tym, że pierwsze białko opiekuńcze i drugie białko opiekuńcze, obecne odpowiednio w pierwszym i drugim kompleksie białka opiekuńczego z antygenem, różnią się od siebie.

Większość najlepiej scharakteryzowanych białek opiekuńczych wyizolowano z bakterii Escherichia coli, które są powszechnie wykorzystywane w naukach biotechnologicznych. Ponieważ Escherichia coli jest szeroko rozpowszechnionym gatunkiem bakterii, wiele ssaków wykształciło przeciwciała przeciwko białkom pochodzącym z tej bakterii. W celu zmniejszenia prawdopodobieństwa otrzymania wyniku fałszywie dodatniego na skutek występowania takich przeciwciał, korzystnie stosuje się przynajmniej jedno białko opiekuńcze PPI pochodzące z odmiennego gatunku bakterii, korzystnie gatunku ciepłolubnego. Korzystnie, białko opiekuńcze pochodzi od bakterii żyjących w ekstremalnych środowiskach, zwłaszcza z grupy bakterii obejmującej Thermatoga maritima, Aquifex aeolicus i Thermus thermophilus.

PL 215 170 B1

Wykorzystanie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem w teście immunologicznym, a korzystnie w teście immunologicznym opartym na koncepcji mostka antygenowego, dostarcza także możliwości modyfikowania białka opiekuńczego w takim kompleksie, usuwając w ten sposób konieczność modyfikowania samego antygenu. Powszechnie przyjęte jest, że modyfikowanie polipeptydu przez dodanie drugiej chemicznej reszty(grupy), np. przez sprzężenie takiej cząsteczki ze znacznikiem, obejmuje ryzyko negatywnego wpływu na właściwości danego polipeptydu. Na przykład, badany epitop może zostać uszkodzony, lub przez takie znakowanie może być spowodowane nieswoiste wiązanie.

Test immunologiczny oparty na koncepcji podwójnego mostka antygenowego charakteryzuje się dodatkowo tym, że pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem, wykorzystywany jako antygen wychwytujący, obejmuje grupę wiążącą się z fazą stałą.

Korzystnie test immunologiczny oparty na koncepcji mostka antygenowego charakteryzuje się dodatkowo tym, że drugi kompleks białko opiekuńcze - antygen stosowany jako antygen detekcyjny, obejmuje grupę znacznikową (markerową).

Rozpuszczalny kompleks obejmujący rsgp i białko opiekuńcze PPI, taki jak kompleksy gp41 lub gp36 z białkiem opiekuńczym, może być również stosowany do wywoływania odpowiedzi immunologicznej, np. u człowieka lub zwierzęcia. Rozpuszczalne kompleksy mogą być podawane osobnikowi w postaci kompozycji, zawierającej np. zaróbkę lub nośnik. Kompozycje takie mogą również obejmować adiuwant. Przykłady konwencjonalnie stosowanych adiuwantów obejmują, ale nie wyłącznie, niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, Merck 65, AS-2, ałun, fosforan glinu, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, oraz powierzchniowo czynne substancje, takie jak lizolecytyna, poliole Pluronic, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa oraz dinitrofenol. Inne użyteczne adiuwanty obejmują, ale nie wyłącznie, bakteryjne polisacharydy otoczkowe, dekstran, IL-12, GM-CSF, ligand CD40, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-13, IL-18 lub inne cytokiny lub fragmenty bakteryjnego DNA.

Kompozycje zawierające rozpuszczalny kompleks mogą być podawane w jednej dawce. Po podaniu pierwszej dawki można podać dawkę przypominającą jeden raz, dwa, trzy lub więcej razy. Liczba podanych dawek zależy częściowo od odpowiedzi osobnika na kompozycję z rozpuszczalnym kompleksem. Odpowiednia liczba dawek obejmuje dowolną liczbę dawek wymaganą do przeprowadzenia skutecznej immunizacji zwierzęcia przy użyciu rozpuszczalnego kompleksu.

Podanie drugiej (przypominającej) dawki kompozycji rozpuszczalnego kompleksu może nastąpić w terminie od około 7 dni do 1 roku od podania pierwszej dawki. Czas upływający pomiędzy podaniem pierwszej i drugiej dawki może wynosić od 14 dni do 6 miesięcy, od 21 dni do 3 miesięcy, a często od 28 dni do 2 miesięcy. Trzecie podanie (druga dawka przypominająca) może nastąpić w terminie od około 14 dni do 3 lat od podania pierwszej dawki. Czas upływający pomiędzy podaniem drugiej i trzeciej dawki może wynosić od 14 dni do 3 lat, od 21 dni do 1 roku, a często od 28 dni do 6 miesięcy. Kolejne dawki przypominające mogą być podawane w odstępach 2 tygodni lub 1 miesiąca, 3 miesięcy albo od 6 miesięcy do 10 lat.

Zazwyczaj, osobnikowi będzie podawana taka ilość rozpuszczalnego kompleksu, która jest wystarczającą do immunizacji zwierzęcia przeciw antygenowi (tj. będzie to „dawka skuteczna immunologicznie lub „dawka skuteczna terapeutycznie). Ilość odpowiadająca „dawce skutecznej immunologicznie zależeć będzie częściowo od masy ciała i ogólnego stanu zdrowia osobnika, a także od oceny przepisującego tę dawkę lekarza lub innego wykwalifikowanego członka personelu.

Skuteczna dawka rozpuszczalnego kompleksu może być przygotowana na modelu zwierzęcym, tak aby wywoływała odpowiedź immunologiczną, a następnie wyniki te mogą być wykorzystane do optymalizacji podawania u ludzi w oparciu o dane uzyskane u zwierząt. Dawka taka będzie zazwyczaj wynosić od około 1 μg do około 100 μg, często od około 1 μg do około 100 μg, jeszcze częściej od około 1 ng do około 50 μg, a najczęściej od około 100 ng do około 50 μg. W przeliczeniu na 1 kg masy ciała osobnika, dawka wynosi od około 1 μg do około 100 μg, często od około 1 μg do około 100 μg, jeszcze częściej od około 1 ng do około 50 μg, a najczęściej od około 100 ng do około 50 μg na 1 kg masy ciała.

Kompozycje zawierające rozpuszczalny kompleks wytwarzany sposobem według wynalazku mogą być podawane przy użyciu różnych sposobów i w różnej postaci. Kompozycje z rozpuszczalnym kompleksem mogą obejmować nośniki i zaróbki, takie jak bufory, węglowodany, mannitol, białka, polipeptydy, lub aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, bakteriostatyki, czynniki chelatujące, czynniki zawieszające, czynniki zagęszczające i/lub konserwanty; wodę, oleje, roztwory solne, wodne

PL 215 170 B1 roztwory dekstrozy i glicerolu, inne farmaceutycznie dopuszczalne substancje wspomagające wymagane do utrzymania warunków fizjologicznych, a więc takie jak czynniki buforujące, czynniki tonizujące, czynniki nawilżające, itp. Do kompozycji można również włączyć konwencjonalny adiuwant.

Choć do podawania kompozycji może być wykorzystany dowolny nośnik, jego rodzaj będzie zależał od sposobu podawania. Podawane związki mogą być również poddane enakpsulacji w liposomach. W niektórych przypadkach, np. tych opisanych przez Tice i wsp. (opis patentowy USA 5,942,252, 1999), dogodne może być zastosowanie jako nośników degradowanych biologicznie mikrosfer.

Pożądana jest sterylizacja kompozycji, np. przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak sterylne filtrowanie. Otrzymane roztwory wodne mogą być pakowane w tej postaci lub liofilizowane.

Kompozycje z rozpuszczalnymi kompleksami mogą być podawane różnymi drogami, włącznie z iniekcją (np. śródskórną, podskórną, domięśniową, dootrzewnową, itp.) inhalacją, podawaniem miejscowym, czopkami, plastrami do podawania przezskórnego, lub podawaniem doustnym.

Gdy podawanie odbywa się przez iniekcję, kompozycja może być przygotowana w roztworze wodnym, korzystnie w buforze fizjologicznym, takim jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera, buforze zawierającym 20 mM fosforan i 150 mM chlorek sodu (pH 7,4), lub roztworze soli fizjologicznej. Roztwór ten zawierać może czynniki formułujące, takie jak czynniki zawieszające, stabilizujące lub rozpraszające. Alternatywnie, kompozycja może występować w postaci proszku, mieszanego przed użyciem z odpowiednią zaróbką, np. sterylną, wolną od pirogenów wodą. Kompozycje podawane przez inhalację mogą mieć postać aerozolu rozpylanego z pojemnika pod ciśnieniem lub nebulizera z odpowiednim propelentem, np. dichlorodifluorometanem, trichlorofluorometanem, ditlenkiem węgla, lub innym odpowiednim gazem. W przypadku aerozolu ciśnieniowego, jednostkę dawkowania można określić wprowadzając zawór, pozwalający dostarczyć odmierzoną ilość. Można formułować kapsułki lub wkłady, np. z żelatyny, do inhalatora lub insuflatora, które mogą zawierać w postaci proszku mieszaninę białek i odpowiedniej substancji stanowiącej podstawę proszku, np. laktozy lub skrobi. W przypadku podawania miejscowego, kompozycje mogą być formułowane jako roztwory, żele, maści, kremy, zawiesiny, itp., które są doskonale znane specjalistom. Można też stosować plastry do podawania przezskórnego. Kompozycje w czopkach mogą być tak przygotowywane, aby zawierały konwencjonalne podstawy czopkowe.

Przy podawaniu doustnym, kompozycja musi być łatwo formułowana przez połączenie kompozycji z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Stałe nośniki obejmują mannitol, laktozę, stearynian magnezu, itp. Nośniki takie umożliwiają formułowanie tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żeli, syropów, papek, zawiesin, itp., do przyjmowania doustnego. Takie formulacje mogą być w postaci proszku, kapsułek i tabletek, a odpowiednie zaróbki obejmują wypełniacze, takie jak cukry, preparaty celulozy, czynniki granulujące oraz czynniki wiążące.

Sposoby wytwarzania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał, obejmujących fragmenty wiążące (np. F(ab)2) oraz warianty jednołańcuchowe, są dobrze znane. Wiele antygenów nie jest jednak zdolnych do wywoływania wystarczającej odpowiedzi przeciwciał. W jednym z wykonań, zwierzęciu podaje się kompozycję zawierającą rozpuszczalny kompleks wywołując u niego w ten sposób odpowiedź odpornościową. Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała są następnie wytwarzane standardowymi technikami.

Rozpuszczalny kompleks zawierający rsgp oraz białko opiekuńcze PPI (np. kompleks gp41 lub gp36 z białkiem opiekuńczym), może być również stosowany do hamowania procesu wnikania wirusa do komórki, np. przez zahamowanie fuzji z błoną komórkową. Dotyczy to komórek in vitro, in vivo, lub ex vivo. Kompozycje i sposoby podawania są podobne do tych, jakie opisano dla kompozycji i sposobów stosowanych do wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Jeśli zahamowanie procesu wnikania wirusa do komórki dokonane jest przez szczepienie, wtedy można zastosować adiuwanty. Przy podawaniu in vitro bądź ex vivo, odpowiedni sposób, zależny częściowo od rodzaju komórek, warunków hodowli oraz ograniczeń czasowych (jeśli takie występują), powinien być wybrany przez specjalistę. Na przykład, jednym z użytecznym sposobów byłoby zastosowanie liposomów, przenoszą rozpuszczalne kompleksy.

Przedstawione poniżej przykłady, odnośniki oraz figury mają pomóc w zrozumieniu prezentowanego wynalazku, którego rzeczywisty zakres przedstawiony jest w załączonych zastrzeżeniach. Jest zrozumiałe, że do przedstawionych procedur wprowadzać można liczne modyfikacje, bez odchodzenia od ducha wynalazku.

PL 215 170 B1

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie rozpuszczalnego międzycząsteczkowego kompleksu obejmującego gp41 i białko opiekuńcze PPI

1.1 Produkcja FkpA E. coli

FkpA sklonowano, poddano ekspresji i oczyszczono zgodnie z opisem H. Bothmana i A.J. Pluckthuna (J Biol Chem 275 (2000) 17100-17105), z wprowadzeniem niewielkich modyfikacji. Dla celów przechowywania, roztwór białka poddawano dializie wobec 20 mM NaH2PO4/NaOH (pH 6,0), 100 mM NaCl, i zagęszczono do stężenia 26 mg/ml (1 mM).

Dla celów ekspresji w cytozolu, sekwencję kodującą FkpA powyższego wektora ekspresyjnego tak zmodyfikowano, aby brakowało części sekwencji kodującej peptyd sygnałowy, i aby zawierała zamiast tego jedynie region kodujący dojrzałe FkpA.

1.2 Wytwarzanie gp41 (535-681)-His6

Sekwencję gp41 (535-681)-His6 sklonowano i poddano ekspresji przy użyciu systemu ekspresyjnego opartego na promotorze T7. Produkowane białko ulegało akumulacji w ciałach inkluzyjnych w komórkach gospodarza. Izolowane ciała inkluzyjne rozpuszczano w 6M chlorku guanidyniowym. Znakowane epitopem polihistydynowym białko oczyszczono na kolumnie Nichelate column z późniejszą filtracją żelową w 6M guanidynium na Sephacryl 100. Białko poddawano ponownemu fałdowaniu przez gwałtowne rozcieńczenie, jak opisano przez P.T. Wingfielda i wsp. (Protein Sci. 6 (1997) 1653-1660). Końcowe warunki buforowe były następujące: 30 mM mrówczan sodu, pH 3,0. Stan fałdowania oceniano przy pomocy CD w bliskim i dalekim UV, dla obu warunków buforu. Jak widać na Figurach 1A i 1B, zarówno widmo CD w dalekim, jak i bliskim UV, sugeruje, że gp41 przybiera pofałdowanie podobne do natywnego tylko przy pH 3,0, pod nieobecność czynnika chaotropowego.

1.3 Zmiana wartości pH z 3,0 do pH fizjologicznego dla ektodomeny gp41 (HIV) w obecności FkpA E. coli.

1.3.1 Doświadczenie kontrolne

W doświadczeniu kontrolnym, rozpuszczalną ektodomenę e-gp41 (w 30 mM mrówczanie, pH 3,0) rozcieńczono 100-krotnie w buforze końcowym (20 mM fosforan sodu, pH 7,5; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA). Ostateczne stężenie białka wynosiło około 1 μΜ. Rejestrowano widmo UV po upływie 1 minuty oraz 10 minut. Z widm przedstawionych na Figurze 2 wynika w sposób oczywisty, że ektodomena, niezwiązana z białkiem opiekuńczym ulega spontanicznej agregacji po zmianie wartości pH na obojętne. Figura 2 ma na celu podkreślenie wyjątkowej skłonności do agregacji białka gp41. Proces spontanicznej agregacji tej cząsteczki przekracza zasięg oznaczony górną linią.

1.3.2 Preinkubacja gp41 z FkpA przy pH 3,0 umożliwia zmianę wartości pH na obojętną

W celu przebadania potencjału cząsteczkowego białka opiekuńczego FkpA w zakresie ułatwiania rozpuszczalności, zmieszano ektodomenę gp41 i FkpA w stosunku molowym 1:2 i 1:4 (w 30 mM mrówczanie przy pH wynoszącym około 3,5) i inkubowano razem przez 1 minutę. Powstający kompleks umieszczano następnie w buforze o obojętnym pH, przez 12-krotne rozcieńczenie w buforze 20 mM fosforan sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA. Końcowe stężenia obu partnerów wiążących w probówce testowej wynosiły odpowiednio 1 μΜ dla gp41 oraz 2 μΜ lub 4 μΜ dla FkpA. Wszystkie reakcje przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Po upływie 1 minuty i 10 minut rejestrowano widmo UV w celu sprawdzenia obecności agregatów w próbkach gp41. Z Figur 3A i 3B wynika w sposób oczywisty, że FkpA znacznie zmniejsza agregację gp41 w sposób zależny od dawki. Porównywalne wyniki otrzymano także dla czynnika wyzwalającego z Thermatoga maritima i dla skróconego C-końcowo białka SlyD z E. coli.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie rekombinowanej cząsteczki kowalencyjnie połączonych gp41 - FkpA

2.1 Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego zawierającego FkpA i gp41

W pierwszym etapie, z plazmidu przedstawionego w Przykładzie 1.1 usunięto miejsce restrykcyjne BamHI w regionie kodującym dojrzałe białko FkpA E. coli, stosując zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wraz z następującymi starterami:

5'-gcgggtgttccgggtatcccaccgaattc-3' (NR ID SEK:3)

5'-gaattcggtgggatacccggaacacccgc-3' (NR ID SEK:4)

Konstrukt nazwano EcFkpA (Δ BamHI)[GGGS]3

W drugim etapie, przy użyciu PCR amplifikowano fragment genu, kodujący aminokwasy 535-681 białka otoczki HIV-1, z konstruktu przedstawionego w Przykładzie 1.2, stosując do tego następujące startery:

PL 215 170 B1

5'-cgggatccggtggcggttcaggcggtggctctggtggcggtacgctgacggtacaggccag-3' (NR ID SEK:5)

5'-ccgctcgaggtaccacagccaatttgttat-3' (NR ID SEK:6)

Uzyskany fragment wstawiono do EcFkpA (Δ BamHI)[GGGS]3, wykorzystując miejsca restrykcyjne BamHI i XhoI.

Kodony odpowiadające łącznikowi glicynowo-serynowemu między FkpA i e-gp41 wstawiono stosując prawy (reverse) starter dla klonowania FkpA oraz lewy (forward) starter dla klonowania e-gp41.

Otrzymany konstrukt poddano sekwencjonowaniu i stwierdzono, że koduje on żądane białko.

2.2 Oczyszczanie białka fuzyjnego

Komórki szczepu bakteryjnego BL21 E. coli, zawierające plazmid ekspresyjny, hodowano do osiągnięcia OD600=0,7 i indukowano cytozolową nadekspresję przez dodanie 1 mM IPTG w temperaturze wzrostu 37°C. Cztery godziny po indukcji zebrano komórki przez wirowanie (20 minut przy 5000 g). Osad bakteryjny zawieszono w 50 mM fosforanu sodu, pH 7,8; 6,0 M GuHCl (chlorek guanidiniowy), 5 mM imidazol i mieszano w temperaturze pokojowej (przez 10 minut) do całkowitej lizy. Po powtórnym odwirowaniu (Sorvall SS34, 2000 obr./min., 4°C) przefiltrowano supernatant (0,8/0,2 μm) naniesino na kolumnę Ni-NTA (NTA: nitrylooctan, Qiagen, Germantown, MD, USA) zrównoważoną uprzednio buforem do lizy. Nieswoiście związane białka usunięto w etapie płukania przez naniesienie dziesięciu objętości kolumny buforu do lizy. Na koniec związane białko eluowano 50 mM fosforanem sodu, pH 2,5; 6,0 M GuHCl i zbierano we frakcje o objętości 4 ml. Mierzono absorbancję przy długości fali 280 nm.

Otrzymany kwaśny i chaotropowy roztwór może być przetrzymywany w temperaturze 4°C do dalszych etapów oczyszczania lub do doświadczeń nad fałdowaniem in vitro.

Wychodząc od tego niesfałdowanego materiału można zastosować różne sposoby prowadzące do fałdowania, takie jak dializa, gwałtowne rozcieńczenie, chromatografia wykluczania, lub fałdowanie na matrycy i przeprowadzić je skutecznie otrzymując w każdym przypadku natywnie sfałdowane i rozpuszczalne białko.

2.3 Renaturacja przez dializę i gwałtowne rozcieńczenie

Materiał solubilizowany jak opisano powyżej przenoszono do warunków buforu fizjologicznego stosując dializę. Wybrana wartość odcięcia dla procesu dializy wynosiła 4000-6000 daltonów.

W celu zaindukowania procesu fałdowania ektodomeny (fragment odpowiadający gp41 w związanych kowalencyjnie domenach białkowych gp41 i FkpA), usuwano GuHCl z wyeluowanego białka przez dializę wobec roztworu zawierającego 50 mM fosforan sodu (pH 2,5) oraz 50 mM NaCl (chlorek sodu). Wiadomo dobrze, że przy tym ekstremalnym pH izolowana ektodomena przybiera strukturę helikalną i tworzy kontakty trzeciorzędowe. Podczas analizowania widma CD w bliskim UV dla rekombinowanego białka FkpA stwierdzono, że w tych samych warunkach białko to jest zasadniczo nieustrukturyzowane. Nieoczekiwane jest, że fałdowanie gp41-FkpA przez dializę daje łatwo rozpuszczalny kompleks białkowy, zawierający związane kowalencyjnie domeny białkowe gp41 i FkpA. W widmie UV (Figura 4) brak światła rozproszonego tj. wyraźnej absorpcji poniżej 300 nm. Takie rozproszone światło wskazywałoby na obecność agregatów, zatem widmo przedstawione na Figurze 4 wskazuje, że sfałdowany materiał nie zawiera znaczących ilości agregatów.

Dichroizm kołowy (CD) jest sposobem z wyboru oceniania zarówno drugorzędowej jak i trzeciorzędowej struktury białek. Eliptyczność w regionie aromatycznym (260-320 nm) wskazuje na trzeciorzędowe oddziaływania (kontakty) w obrębie białka (tj. globularnej struktury regularnie sfałdowanego białka), podczas gdy eliptyczność w regionie amidowym odpowiada regularnie powtarzanym elementom w szkielecie peptydowym, tj. strukturze drugorzędowej.

Widmo CD w bliskim UV, przedstawione na Figurze 5, dostarcza przekonującego dowodu, że ektodomena (stanowiąca część białka fuzyjnego) wykazuje obecność natywnych oddziaływań trzeciorzędowych przy pH 2,5. Widmo dla kowalencyjnie związanych domen białkowych gp41/FkpA odpowiada niemal dokładnie widmu otrzymanemu dla izolowanej ektodomeny w tych samych warunkach (wyniki nie przedstawione). Stwierdzono występowanie typowej sygnatury gp41: maksimum eliptyczności przy 290 nm, charakterystyczne obniżenie (siodło) przy 285 nm oraz kolejne maksimum przy 260 nm, odpowiadające aktywnemu optycznie mostkowi disiarczkowemu. Należy zaznaczyć, że FkpA nie wpływa na sygnał uzyskany w bliskim UV w badanych warunkach. W rzeczywistości, aromatyczna eliptyczność FkpA przy pH 2,5 odpowiada w zasadzie linii podstawowej (wyniki nie przedstawione).

W zgodności z wynikami uzyskanymi w bliskim regionie UV, wyniki CD w dalekim UV dla konstruktu fuzyjnego przy pH 2,5 wskazują na obecność w zasadzie ustrukturyzowanej cząsteczki gp41.

PL 215 170 B1

Pojawiają się dwa maksima, przy 220 i 280 nm, które odpowiadają typowej sygnaturze helikalnej ektodomeny (Figura 6). Ze wskazanych warunków (50 mM fosforan sodu, pH 2,5; 50 mM NaCl), polipeptyd fuzyjny FkpA-gp41 może być łatwo przeniesiony do warunków fizjologicznych przez gwałtowne rozcieńczenie. W konkluzji, zarówno widmo CD w bliskim, jak i dalekim UV, wskazują, że możliwe jest, w stosunkowo łatwy sposób, otrzymanie podobnej do natywnej struktury białka gp41 (stanowiącego część białka fuzyjnego, zawierającego również FkpA). Co ciekawe, stwierdziliśmy, że podobną do natywnej strukturę polipeptydu fuzyjnego typu SlyD(1-165)-gp41 można uzyskać w jeszcze łatwiejszy sposób przez dializę chaotropowego materiału (rozpuszczonego np. w 7,0 M GuHCl) wobec 50 mM fosforanie sodu (pH 7,4) i 150 mM NaCl w temperaturze pokojowej. Sekwencje nukleotydowe dwóch konstruktów fuzyjnych białko opiekuńcze-gp41, które to konstrukty wykazały się wyjątkowo użyteczne, przedstawiono odpowiednio w NR ID SEK:7 i NR ID SEK:8.

2.4 Renaturacja przy użyciu chromatografii wykluczenia według wielkości (SEC)

Niesfałdowany polipeptyd gp41-FkpA (rozpuszczony w 50 mM fosforanie sodu, pH 7,8/7,0 M GuHCl) naniesiono na żelową kolumnę filtracyjną (Superdex 200) zrównoważoną 20 mM fosforanem sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). FkpA-gp41 eluuje zasadniczo w trzech głównych frakcjach: jako wysokocząsteczkowy kompleks, jako heksamer, oraz jako trymer. Frakcja odpowiadająca trymerom została zatężona i oceniona pod kątem struktury trzeciorzędowej przy użyciu CD w bliskim UV (Figura 7).

Otrzymany wykres jest w zasadzie sumaryczną krzywą, w której zarówno białko nośnikowe FkpA, jak i białko docelowe gp41, mają równy udział (1:1). Na szczęście, białko gp41 wykazuje obecność struktury trzeciorzędowej przy obojętnym pH i jest ewidentnie solubilizowane przez kowalencyjnie związane białka opiekuńcze. Inaczej mówiąc, białko opiekuńcze FkpA wydaje się uznawać ektodomenę gp41 o podobnej do natywnej strukturze jako substrat i solubilizować to trudno fałdujące białko przy obojętnym pH. Spełniono w ten sposób istotny warunek wytwarzania dużych ilości rozpuszczalnego antygenu gp41 dla celów diagnostycznych.

Wyniki CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 przy pH 7,4 (Figura 6) potwierdzają wyniki otrzymane w bliskim UV i wykazują addytywność udziałów FkpA i gp41 w otrzymanym końcowym sygnale. Jak oczekiwano, widmo jest zdominowane przez zdecydowanie helikalną ektodomenę gp41 (maksymalna eliptyczność przy 220 i 280 nm).

Wyniki uzyskane dla kowalencyjnie związanych domen białkowych gp41/FkpA, solubilizowanych przy pH 7,4 po zastosowaniu opisanych tu warunków, wskazują, że FkpA oraz gp41 zachowują się w procesie fałdowania jak niezależne jednostki w obrębie konstruktu polipeptydowego.

P r z y k ł a d 3

Wpływ różnych detergentów na rekombinowane białko gp41 i rekombinowany kompleks FkpA-gp41, stosowany jako antygen w teście immunologicznym

3.1 Kompetycyjny test immunologiczny

Test COBAS CORE HIV Combi (Roche Diagnostics GmbH, Niemcy) jest wygodnym narzędziem do testowania immunoreaktywności rekombinowanego białka gp41. Zasadniczo, test ten służy do wykrywania przeciwciał przeciwko gp41 wirusa HIV i oparty jest na koncepcji podwójnego mostka antygenowego. Antygen fazy stałej jest bezpośrednio opłaszczony. Antygenem detekcyjnym jest znakowane peroksydazą gp41, zawierające jednak materiał (gp41) solubilizowany przy użyciu SDS.

W testach immunologicznych wykrywających HIV jest wysoce pożądane, aby stosowane reagenty były łatwo rozpuszczalne i stabilne w buforze inkubacyjnym, zawierającym dość wysokie stężenia detergentu. Takie detergenty, np. Triton X-100® lub Nonidet P-40®, stosowane są w stężeniu od 0,1% do 0,2% w celu dysrupcji cząstek wirusowych.

Zarówno białko gp41, solubilizowane SDS, jak i białko fuzyjne FkpA-gp41, wytworzone jak opisano w Przykładzie 1, testowano jako antygeny kompetycyjne w teście COBAS CORE HIV Combi. W tym celu zastąpiono komercyjny bufor inkubacyjny buforem inkubacyjnym zawierającym 0,1% Triton X-100® w buforze matrycowym wolnym od ludzkiej surowicy. Testowany antygen jest inkubowany z surowicą ludzką, o której wiadomo, że jest reaktywna wobec gp41.

Antygen gp41-FkpA silnie tłumi sygnał w teście kompetycyjnym (w sposób zależny od dawki), podczas gdy białko gp41 solubilizowane SDS jest w zasadzie niereaktywne (Figura 9). Inhibicję 50% uzyskano przy stężeniu antygenu FkpA-gp41 wynoszącym 0,1 μg/ml, co odpowiada stężeniu molowemu 2,2 nM.

Godny uwagi jest fakt, że FkpA-gp41 zachowuje doskonałą immunoreaktywność po uprzednim potraktowaniu buforem do rozcieńczania, zawierającym 0,1% Triton X-100 jako detergent (detergent

PL 215 170 B1 pomocniczy) dezintegrujący nienaruszone błony wirusowe. Stanowi to znaczący kontrast wobec samej ektodomeny gp41 (gp41 w SDS), która w obecności detergentu pomocniczego niemal całkowicie traci immunoreaktywność (Figura 9).

Główne obawy towarzyszące opracowaniu kowalencyjnie związanego konstruktu gp41-FkpA dotyczyły tego, że albo białko FkpA mogłoby maskować kluczowe epitopy wskutek niewystarczającej dynamiki wiązania, albo też detergent Triton X-100 (stanowiący ważny element testu) zaburzy przebieg testu przez wywoływanie agregacji antygenu gp41. Doświadczalne wyniki wielu testów kompetycyjnych, przeprowadzonych z wykorzystaniem platformy COBAS CORE, dostarczają przekonującego dowodu na to, że kluczowe epitopy gp41 są łatwo dostępne w kompleksie obejmującym związane kowalencyjnie domeny białek. Co więcej, immunoreaktywność gp41, wchodzącego w skład wewnątrzcząsteczkowego kompleksu białko opiekuńcze-gp41, jest zachowana w obecności detergentów pomocniczych, takich jak Triton X-100.

3.2 Test elektrochemiluminescencyjny

Testy immunologiczne oparte na koncepcji podwójnego mostka antygenowego stanowią ważne narzędzie w diagnostyce serologicznej czynników infekcyjnych. Ponieważ kompleks FkpA-gp41 jest rozpuszczalny w buforze o warunkach fizjologicznych, możliwe było zbadanie, czy materiał ten może mieć zastosowanie w teście opartym na podwójnym mostku antygenowym i detekcji elektrochemiluminescencyjnej.

Próby znakowania rutenem białka gp41 solubilizowanego SDS zakończyły się niepowodzeniem. Natomiast ponieważ kompleks FkpA-gp41 jest łatwo rozpuszczalny w warunkach fizjologicznych, jego sprzężenie z hydrofobowym znacznikiem rutenowym okazało się stosunkowo prostym zadaniem. Warto zauważyć, że nawet powstały w ten sposób zmodyfikowany kompleks białko opiekuńcze-białko docelowe pozostaje rozpuszczalny. W celu wykonania analizy z użyciem systemu testowego Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Niemcy), kompleks FkpA-gp41 poddano odpowiednio biotynylacji i rutenylacji, i testowano pod kątem immunoreaktywności w teście mostkowym.

Kilka reprezentatywnych surowic przeciwko wirusowi HIV, zawierających głównie przeciwciała z klasy IgG (immunoglobuliny G), dały wynik pozytywny dla kowalencyjnie związanych domen białkowych FkpA-gp41. Stwierdzono również, że sygnał tła jest zbliżony do wewnętrznego tła testu, nawet przy stężeniach antygenu sięgających 500 ng/ml. Stosunek sygnału do tła okazał się więc być doskonały. Ponadto, nic nie wskazywało na to, że białko nośnikowe, czyli białko opiekuńcze FkpA z E. coli, spowoduje nieswoiste wiązanie przeciwciał, zawartych w tych ludzkich surowicach.

Jak to omówiono powyżej, wczesne wykrywanie fazy serokonwersji jest kluczowe dla skutecznej diagnozy HIV. Podczas infekcji pierwsze pojawiają się przeciwciała klasy IgM. W celu skutecznego wykrywania bardzo wczesnej fazy infekcji wirusem HIV, konieczne jest zaprojektowanie takiego modułu antygenowego, który posiadałby duże zagęszczenie epitopów rozpoznawanych i wiązanych przez IgM. Kompleks FkpA-gp41 jest właśnie dobrze rozpoznawany przez typowe surowice typu IgM, skierowane przeciwko wirusowi HIV. Jeszcze istotniejszy jest fakt, że próbki, dla których trudno było uzyskać wynik pozytywny, jak np. surowice B i C z paneli serokonwersyjnych 9003 i 4009 (dostarczonych przez NABI, Miami, Floryda, USA), dały wynik pozytywny dla konstruktu fuzyjnego wytworzonego sposobem według niniejszego wynalazku. Jest to duże osiągnięcie, gdyż antygeny gp41 (w postaci izolowanych peptydów) nie wykazują żadnej reaktywności w testach z tymi surowicami IgM.

P r z y k ł a d 4

Rozpuszczalne kompleksy białko opiekuńcze-gp41 hamują wnikanie wirusa

Testowano różne białko fuzyjne, białko opiekuńcze-gp41 pod względem ich zdolności do hamowania fuzji wirusa HIV-1 z błoną komórkową w warunkach in vitro. W skrócie, reporterową linię komórkową MAGI P4-CCR5, wykazującą ekspresję CD4, CCR5 i CXCR4, infekowano szczepem NL4-3 wirusa HIV-1 i testowano pod kątem aktywności β-galaktozydazy zależnej od Tat (wg Meister i wsp., Virology (2001) 284(2), 287-296). Stwierdzono znaczną inhibicję infekcji, z wartościami IC50 w zakresie nM. Przykładowo, kompleks SlyD-gp41 hamował bardzo skutecznie proces wnikania wirusa, co odpowiadało IC50<70 nM.

Podsumowując, rozpuszczalny wewnątrzkomórkowy kompleks, zawierający odpowiednio gp41 HIV-1 lub gp36 HIV-2 i białko opiekuńcze izomerazę peptydyloprolilową, posiada znakomite właściwości w odniesieniu do rozpuszczalności i integralności konformacyjnej, co pozwala na zaprojektowanie udoskonalonych testów wykrywających przeciwciała przeciwko HIV oraz innych komercyjnych aplikacji.

PL 215 170 B1

P r z y k ł a d 5

Fuzja białka opiekuńczego FkpA z ektodomeną gp36 daje polipeptyd cytozolowy, który można łatwo fałdować in vitro

W celu otrzymania gp36 homologu gp41, występującego w wirusie HIV-2 w rozpuszczalnej i aktywnej immunologicznie postaci, sklonowaliśmy konstrukt nazwany FF36. Ten fuzyjny polipeptyd zawiera dwie jednostki FkpA oraz jednostkę gp36, połączone ze sobą elastycznymi odcinkami bogatymi w glicynę. W celu ułatwienia oczyszczania, konstrukt fuzyjny oznakowano epitopem His6 na jego C-końcu. Białko oczyszczano wg protokołu zasadniczo zgodnego z wcześniej przedstawionym opisem: Po lizie chaotropowej białko wiązano na kolumnie Ni-NTA, a po intensywnym płukaniu (50 mM fosforanem sodu pH 7,8; 7,0 M GuHCl) eluowano je obniżając pH. Eluowane białko następnie fałdowano przez przepuszczanie przez żelową kolumnę filtracyjną, zrównoważoną 50 mM fosforanem sodu pH 7,8, 100 mM chlorkiem sodu i 1 mM EDTA. Natywne białko, otrzymane tym sposobem renaturującej filtracji żelowej, wykazywało zadawalające właściwości immunologiczne i spektroskopowe (patrz Figura 10), porównywalne z właściwościami konstruktów F41 i FF41, odpowiadających białku gp41. Opisany tu protokół oczyszczania i fałdowania przeprowadzano wobec FF36 zawierającego trzy mutacje punktowe w N-końcowym regionie powtórzeń heptadowych białka gp36 (patrz sekwencja w NR ID SEK:9). Ten sam protokół stosowano też z sukcesem wobec konstruktu fuzyjnego zawierającego ektodomenę gp36, uzyskując jednak niższe wydajności rozpuszczalnego białka.

P r z y k ł a d 6

Rozpuszczalne, immunoreaktywne FkpA-gp21 można otrzymać przy użyciu wygodnego i powtarzalnego sposobu

Komórki bakterii E. coli, wykazujące nadekspresję FkpA-gp21, hodowano, indukowano i zbierano według wcześniejszego opisu. W celu osiągnięcia całkowitej lizy, osad bakteryjny zawieszano w 59 mM fosforanie sodu (pH 7,8), 7,0 M GuHCl, i mieszano w temperaturze pokojowej przez godzinę. Chaotropowy lizat komórkowy nanoszono następnie na kolumnę Ni-NTA, równoważoną uprzednio buforem do lizy. Po etapie płukania, eluowano białko docelowe (zawierające C-końcowy znacznik sześciohistydynowy) poprzez obniżenie pH. W celu zainicjowania procesu fałdowania przepuszczano białko FkpA-gp21 (przechowywane w 50 mM fosforanie sodu (pH 6,0), 7,0 M GuHCl w temperaturze 4°C) przez żelową kolumnę filtracyjną (Superdex 200), równoważoną buforem zawierającym 50 mM fosforan sodu (pH 7,8) i 100 mM chlorek sodu. Analiza widma UV wykazała, że otrzymane w ten sposób białko FkpA-gp21 jest białkiem rozpuszczalnym, które, w przeciwieństwie do gp21 bez białka opiekuńczego, nie wykazuje już skłonności do agregacji (Fig. 11/1). Ponadto, otrzymane białko FkpA-gp21 wykazuje znakomitą aktywność immunologiczną w teście kompetycyjnym COBAS COBE (Fig. 11/2).

P r z y k ł a d 7

Fuzja dodatkowej podjednostki FkpA z białkiem FkpA-gp41 polepsza właściwości immunologiczne ektodomeny gp41

Próbowaliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy dodatkowa podjednostka PPI dodana do polipeptydu fuzyjnego może jeszcze poprawić właściwości kompleksu ektodomeny gp41 z białkiem opiekuńczym. W tym celu wyprodukowaliśmy zarówno konstrukt F41 (jedna domena FkpA z dołączonym C-końcowo białkiem gp41), jak i konstrukt FF41 (dwie domeny FkpA z białkiem gp41 dołączonym do C-końca jednej z nich), stosując opisany powyżej protokół. Biotynylowane i rutenylowane białka fuzyjne były następnie analizowane przy użyciu systemu Elecsys® E2010. Wyniki zdecydowanie wskazywały na polepszone właściwości konstruktu FF41, zawierającego dodatkową domenę białka opiekuńczego.

Sygnał tła uzyskiwany dla negatywnej surowicy, który to sygnał decyduje o wartości otrzymywanego stosunku sygnału do tła i możliwości dokonywania miarodajnych pomiarów przy niskim mianie surowic, okazał się być niższy o ponad 50% w przypadku FF41 (około 1600 zliczeń), w porównaniu do F41 (około 3800 zliczeń).

T a b e l a 1. Porównanie F41 i FF41

	F41	FF41
R1:	EMHR220	EMHR221
ESS w R1	F-41-Bi (UE) 25	FF-41-Bi-UEEK
β (AL)	500 ng/ml	750 ng/ml

PL 215 170 B1 cd. tabeli 1

R2	EMHR221	EMHR222
ESS w R2	F-41-Ru (UE) 25	FF41-2Ru-SK (4)
β (AL)	500 ng/ml	750 ng/ml
Średnia liczba zliczeń dla 7 negatywnych surowic	3768	1589

Podobne pozytywne wyniki otrzymane dla białka fuzyjnego SS41, tj. białka fuzyjnego zawierającego dwie domeny SlyD i jedną domenę gp41, przyłączoną na C-końcu białka fuzyjnego.

Piśmiennictwo

Aslam M. oraz Dent A., The preparation of protein-protein conjugates; w „Bioconjugation (1998) 216-363, wyd. M. Aslam oraz A. Dent, McMillan Reference, Londyn, W. Brytania

Bardwell J.C., Mol Microbiol 14 (1994) 199-205 Beissinger M. oraz Buchner J., Biol Chem 379 (1998) 245-259 Bothmann H. oraz Pluckthun A., J Biol Chem 275 (2000) 17100-17105 Braden B.C. oraz Poljak R.J., Faseb J 9 (1995) 9-16

Buchner J., Faseb J 10 (1996) 10-19 Butler J.E. i wsp., J Immunol Methods 150 (1992) 77-90 Caffrey M i wsp., J Biol Chem 275 (2000) 19877-19882 Chan D.C. i wsp., Cell 89 (1997) 263-273

Crooke E. oraz Wickner W., Proc Natl Acad Sci USA 84 (1987) 5216-5220

Danese P.N. i wsp. Genes Dev 9 (1995) 387-398

Dartigalongue C. oraz Raina S., Embo J 17 (1998) 3968-3980

Doms R.W. oraz Moore J.P., J Cell Biol 151 (2000) F9-14

Egan D.A. i wsp., Biochemistry 32 (1993) 1920-1927

Fischer G. i wsp., Nature 337 (1989) 476-478

Frech C. i wsp., Embo J 15 (1996) 392-398

Gething M.J. oraz Sambrook J., Nature 355 (1992) 33-45

Guyader M i wsp., Nature 326 (1987) 662-669

Hottenrott S. i wsp, J Biol Chem 272 (1997) 15697-15701

Kay J.E., Biochem J 314 (1996) 361-385

Lane W.S. i wsp., J Protein Chem 10 (1991) 151-160

Lu M. i wsp., Nat Struct Biol 2 (1995) 1075-1082

Meister S. i wsp., Virology 284 (2001) 287-296

Missiakas D. i wsp., Embo J 14 (1995) 3415-3424

Missiakas D. i wsp., Mol Microbiol 21 (1996) 871-874

Prusiner S.B., Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13363-13383

Rahfeld J.U. i wsp., FEBS Lett 352 (1994) 180-184

Ramm K oraz Pluckthun A., J Biol Chem 275 (2000) 17106-17113

Ratner L. i wsp., Nature 313 (1985) 277-284

Root M.J. i wsp., Science 291 (2001) 884-888

Schmid F.X., Molecular chaperones in the life cycle of proteins (1998) 361-389, wyd. A.L. Fink oraz Y. Goto, Marcel

Decker In., Nowy Jork, USA

Scholz C. i wsp., Embo J 16 (1997) 54-58

Scholz C i wsp., J Biol Chem 271 (1996) 12703-12707

Stoller G. i wsp. Embo J 14 (1995) 4939-4948

Tijssen w „Methods in Enzymology (1980), wyd. S.P. Colwick, N.O. Caplan oraz S.P., Academic

Press

Tijssen P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, w „Practice and theory of enzyme immunoassays (1990) 221-278, wyd. R.H. Burdon oraz P.H.

Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, Holandia

Wang C.C. oraz Tsou C.L., Faseb J 7 (1993) 1515-1517

Wild C. i wsp., proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 10537-10541

Wingfield P.T. i wsp., Protein Sci 6 (1997) 1653-1660

PL 215 170 B1

Winter J. i wsp., Journal of Biotechnology 84 (2000) 175-185 Zarnt T. i wsp., J Mol Biol 271 (1997) 827-837 AU 597884

EP 0280211

EP 396 559

US 4,735,896

US 4,879,212

WO 92/22573

WO 93/21346

WO 94/08012

PL 215 170 B1

Lista sekwencji <110> Roch® Diagnaatics GmbH P. Hoffmann-La Roche AG <120> Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową <13 0> 19290WO-WN <140>

<141>

<150> EP01115225.3 <151> 2001-06-22 <150> SP01120939.2 <151> 2001-08-31 <160> 10 <170 Patent w wersji 2.1 <210> 1 <211> 147 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji odpowiada pozycjom 535-681 białka otoczki wirusa HIV-1 <400> 1

Met 1

Thr

Leu

Thr

val 5

Gin

Ala

Arg

Gin

Leu 10

Leu

Ser

Gly

Ile

Val 15

Gin

Gin

Gin

Asn

Asn 20

Leu

Leu

Arg

Ala

Ile 25

Glu

Ala

Gin

Gin

His 30

Leu

Leu

Gin

Leu

Thr 35

Val

Trp

Gly

Ile

Lys 40

Gin

Leu

Gin

Ala

Arg 45

Ile

Leu

Ala

Val

Glu 50

Arg

Tyr

Leu

Lys

Asp 55

Gin

Gin

Leu

Len

Gly 60

Ile

Trp Gly

Cys

Ser 65

Gly

Lys

Leu

Ile

Cys 70

Thr

Thr

Ala

Val

Pro 75

Trp

Asn

Ala

Ser

Trp 80

Ser

Asn

Lys

Ser

Leu 35

Glu

Gin

Ile

Trp

Asn 90

Asn

Met

Thr

Trp

Met 95

Glu

Trp

Asp

Arg

Glu 100

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr 105

Ser

Leu

Ile

His

Ser 110

Leu

Ile

Glu

Glu

Ser 115

Gin

Asn

Gin

Gin

Glu 1 0 0

Lys

Asn

Glu

Gin

Glu

Leu

Leu

Glu

PL 215 170 B1

Łeu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp 130 135 140

Leu Trp Tyr 145 <210> 2 10 <211> 143 <212» P&T <213» Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji odpowiada pozycjom 534-676 białka otoczki wirusa HIV-ł <400» 2

20

Leu 1 Gin

Thr Val Ser

Ala Gin Ser Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile val Gin

Gin Gin

Gin 20

5 Leu Leu

10

15

Asp

Val Val 25

Lys

Arg

Gin

Gin

Glu 30

Leu Leu

25

Arg

Leu

Thr

Val

Trp

Gly

Thr

Lys

Asn

Leu

Gin

Ala

Arg

Val

Thr

Ala

35

40

45

He

Glu

Lys

Tyr

Leu

Gin

Asp

Gin

Ala

Arg

Leu

Asn

Ser

Trp Gly Cys

50

55

60

.30

Ala

Phe

Arg

Gin

Val

Cys

His

Thr

Thr

Val

Pro

Trp

Val

Asn

Asp

Ser

65

70

75

80

Leu

Ala

Pro

Asp

Trp

Asp

Asn

Met

Thr

Trp

Gin

Glu

Trp

Glu

Lys

Gin

35

85

90

95

val

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ala

Asn

ile

Ser

Lys

Ser

Leu

Glu

Gin

Ala

Gin

100

105

110

40

Ile

Gin

Gin

Glu

Lys

Asn

Met

Tyr

Glu

Leu

Gin

Lys

Leu

Asn

Ser

Trp

115

120

125

Asp

Ile

Phe

Gly

Asn

Trp

Phe

Asp

Leu

Thr

Ser

Trp

Val

Lys

Tyr

130

135

140

<210> 3 <211> 29 <212» DNA <213> ^tuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer 1 55 <400> 3 gcgggtgttc cgggtatccc accgaattc

PL 215 170 B1 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primet 2 <400> 4 gaattcggtg ggatacecgg aacacccgc 29 <210> 5 15 <211> 61 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primei 3 <4Q0> 5 cgggatccgg tggcggttca ggcggtggct ctggtggcgg tacgctgacg gtacaggcca 60 g 61 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> _Sztac2na sekwencja <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: primet 4 ' <400> 6 ccgctcgagg taccacagcc aatttgttat 30 <210> 7 <211 > 1269 <212 > DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>

Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca dla białka fezyjnego FkpA-gp41 <400> 7 atggctgaag ctgcaaaacc tgctacaact gctgacagca aagcagcgtt caaaaatgac 60 50 gatcagaaat cagcttatgc actgggtgct tcgctgggtc gttacatgga aaactctctt 120 aaagaacaag aaaaactggg catcaaactg gataaagatc agctgatcgc tggtgttcag 180 gatgcatttg ctgataagag caaactctcc gaccaagaga tcgaacagac tctgcaagca 240 ttcgaagctc gcgtgaagtc ttctgctcag gcgaagatgg aaaaagacgc ggctgataac 300 gaagcasaag gtaaagagta ccgcgagaaa tttgccaaag agaaaggcgt gaaaacctct 360 tcaactggtc tggtttatca ggtagtagaa gccggtaaag gcgaagcacc gaaagacagc 420 gatactgttg fcagtgaacta caaaggtacg ctgatcgacg gtaaagagtt cgacasctct 480

PL 215 170 B1 tacacccgtg gtgaaccgct ctctttccgt ctggacggtg ttatcccggg ttggacagaa 540 ggtctgaaga acatcaagaa aggcggtaag atcaaactgg ttattccacc agaactggct 600 tacggcaaag egggtgttcc gggtatccca ccgaattcta ccctggtgtt fcgacgtagag 660 ctgctggatg tgaaaccagc gccgaaggct gatgcaaagc cggaagctga tgcgaaagcc 720 gcagattctg ctaaaaaagg tggcggttcc ggcggtggct ctggtggcgg atccggtggc 780 ggtfcccggcg gtggctctgg tggcggtacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 840 ggtatagtgc agcagcagaa caatgagctg agggctattg aggcgcaaca gcatctggag 300 caactcacag tctggggcac caagcagctc caggcaagag aactggctgt ggaaagatac 960 ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 1020 gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaataacatg 1080 acctggafcgg agtgggacag agaaafcfcaac aattacacaa gcttaataca ttccttaatt

1140 gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaafcgg 1200 gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtacctcga gcaccaccac 1260 caccaccac 1269 <210» 8 <211» 1026 <212» ΠΝΑ <213» Sztuczna sekwencja <220» <223»

Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca dla białka fuzyjnego SłyD-gp41 <400» 8 atgaaagtag caaaagacct ggtggtcagc ctggcctatc aggtacgtac agaagacggt 60 gtgttggttg atgagtctcc ggtgagtgcg ccgctggact acctgcatgg tcacggttcc 120 ctgatctctg gcctggaaac ggcgctggaa ggtcatgaag ttggcgacaa atttgatgtc 180 gctgttggcg cgaacgacgc ttacggtcag tacgacgaaa acctggtgca aęgtgttcct 240 aaagacgtat ttatgggcgt tgatgaactg caggtaggta tgcgtttcct ggctgaaacc 300 gaccagggtc cggtaccggt tgaaatcact gcggttgaag acgatcacgt cgtggttgat 360 ggtaaccaca tgctggccgg tcagaacctg aaattcaacg ttgaagttgt ggcgattcgc 420 gaagcgactg aagaagaact ggctcatggt cacgttcacg gcgcgcacga tcaccaccac 480 gatcacgacc acgacggtgg cggttccggc ggtggctctg gtggcggatc cggtggcggt 540 tccggcggtg gctctggtgg cggtacgctg acggtacagg ccagacaatt attgtcfcggt 600 atagtgcagc agcagaacaa tgagctgagg gctattgagg cgcaacagca tctggagcaa 660 ctcacagtct ggggcaccaa gcagctccag gcaagagaac tggctgtgga aagataccta 720 aaggatcaac agctcctggg gatttggggt tgcfcctggaa aactcattfcg caccactgct 780 gfcgccttgga afcgctagfctg gagtaataaa tctctggaac agatttggaa taacatgacc 340 tggatggagt gggacagaga aattaacaat fcacacaagct taatacattc cttaattgaa 900 gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca 360 agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt acctcgagca ccaccaccac 1020 caccac 1026 <210» 9

PL 215 170 B1 <211> 688 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 5 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji; białko fuzyjne FkpAFkpAgp36 (3 raut) <4Q0> 9

10	Met Ala Glu 1	Ala Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala
5	10	15
	Phe Lya Asn	Asp Asp Gin Lys 20	Ser Ala Tyr Ala 25 .	Leu Gly Ala Ser Leu 30
15
	Gly Arg Tyr 35	Met Glu Asn Ser	Leu Lys Glu Gin 40	Glu Lys Leu Gly Ile 45
20	Lys Leu Asp 50	Lys Asp Gin Leu 55	ile Ala Gly val	Gin Asp Ala Phe Ala 60
	Asp Lys Ser 65	Lys Leu Ser Asp 70	Gin Glu Ile Glu 75	Gin Thr Leu Gin Ala 80
25	Phe Glu Ala	Arg Val Lys Ser 85	Ser Ala Gin Ala 90	Lys Met Glu Lys Asp 95
	Ala Ala Asp	Asn Glu Ala Lys 100	Gly Lys Glu Tyr 105	Arg Glu Lys Phe Ala 110
50
	Lys Glu Lys 115	Gly Val Lys Thr	Ser Ser Thr Gly 120	Leu Val Tyr Gin Val 125
35	Val Glu Ala 130	Gly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp 135	Ser Asp Thr Val Val 140
	Val Asn Tyr 145	Lys Gly Thr Leu 150	Ile Asp Gly Lys 155	Glu Phe Asp Asn Ser 160
40	Tyr Thr Arg	Gly Glu Pro Leu 165	Ser Phe Arg Leu 170	Asp Gly Val Ile Pro 175 .
45	Gly Trp Thr	Glu Gly Leu Lys 180	Asn ile Lys Lys 185	Gly Gly Lys Ile Lys 190
Leu Val Ile 195	Pro Pro Glu Leu	Ala Tyr Gly Lys 200	Ala Gly Val Pro Gly 205
50	Ile Pro Pro 210	Asn Ser Thr Leu 215	Val Phe Asp Val	Glu Leu Leu Asp Val 220
	Lys Pro Ala 225	Pro Lys Ala Asp 230	Ala Lys Pro Gib 235	Ala Asp Ala Lys Ala 240
55	Ala Asp Ser	Ala Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly 245 250	Gly Gly Ser Gly Gly 255

PL 215 170 B1

Gly Ser	Gly	Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Glu	Ala
260	265	270
Ala Lys	Pro 275	Ala Thr Thr	Ala Asp Ser Lys 280	Ala Ala Phe Lys Asn 285	Asp
Asp Gin 290	Lys	Ser Ala Tyr	Ala Leu Gly Ala 295	Ser Leu Gly Arg Tyr 300	Met
Glu Asn 305	Ser	Leu Lys Glu 310	Gin Glu Lys Leu	Gly Ile Lys Leu Asp	Lys 320
Asp Gin	Leu	Ile Ala Gly 325	Val Gin Asp Ala 330	Phe Ala Asp Lys Ser 335	Lys
Leu Ser	Asp	Gin Glu Ile 340	Glu Gin Thr Leu 345	Gin Ala Phe Glu Ala 350	Arg
Val Lys	Ser 355	Ser Ala Gin	Ala Lys Met Glu 360	Lys Asp Ala Ala Asp 365	Asn
Glu Ala 370	Lys	Gly Lys Glu	Tyr Arg Glu Lys 375	Phe Ala Lys Glu Lys 380	Gly
Val Lys 385	Thr	Ser Ser Thr 390	Gly Leu Val Tyr	Gin Val Val Glu Ala 395	Gly 400
Lys Gly	Glu	Ala Pro Lys 405	Asp Ser Asp Thr 410	Val Val Val Asn Tyr 415	Lys
Gly Thr	Leu	Ile Asp Gly 420	Lys Glu Phe Asp 425	Asn Ser Tyr Thr Arg 430	Gly
Glu Pro	Leu 435	Ser Phe Arg	Leu Asp Gly Val 440	Ile Pro Gly Trp Thr 445	Glu
Gly Leu 450	Lys	Asn Ile Lys	Lys Gly Gly Lys 455	Ile Lys Leu Val Ile 460	Pro
Pro Glu 465	Leu	Ala Tyr Gly Lys Ala Gly Val 470	Pro Gly He Pro Pro 475	Asn 480
Ser Thr	Leu	Val Phe Asp 485	Val Glu Leu Leu 490	Asp Val Lys Pro Ala 495	Pro
Lys Ala	Asp	Ala Lys Pro 500	Glu Ala Aso Ala 505	Lys Ala Ala Asp Ser 510	Ala
Lys Lys	Gly 515	Gly Gly Ser	Gly Gly Gly Ser 520	Gly Gly Gly Ser Gly Gly 525
Gly Ser 530	Gly	Gly Gly Ser 1	Gly Gly Gly Leu ' 535	Thr Val Ser Ala Gin Ser 540
Arg Thr	Leu	Leu Ala Gly	Ile Vał Gin Gin i	31n Gin Gin Glu Leu Asp

PL 215 170 B1

	545	550	555	560
	Val Val Lys	Arg Gin Gin Glu Leu Glu Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr
5		565	570	575
	Lys Asn Leu	Gin Ala Arg Glu Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp
		590	585	590
	Gin Ala Arg	Leu Asn Ser Trp Gly	Cys Ala Phe Arg Gin Val cys His
10	595	600	605
	Thr Thr Val	Pro Trp Val Asn Asp	Ser Leu Ala Pro Asp	Trp Asp Asn
	610	615	620
15	Met Thr Trp	Gin Glu Trp Glu Lys	Gin Val Arg Tyr Leu	Glu Ala Asn
	625	630	635	640
	Ile Ser Lys	Ser Leu Glu Gin Ala	Gin Ile Gin Gin Glu	Lys Asn Met
		645	650	655
20
	Tyr Glu Leu	Gin Lys Leu Asn Ser	Trp Asp Ile Phe Gly	Asn Trp Phe
		660	665 '	670
	Asp Leu Thr	Ser Trp val Lys Tyr	Leu Glu His His His	His His His
25	675	680	685
30
	<210> 10
	<211> 385
	<212 > PRT
35	<213 > Sztuczna sekwencja
	<220>
	< > Opis sztucznej sekwencji: białko fuzyjne FkpA-gp2 i
40	<400> 10
	Met Ala Glu	Ala Ala Lys Pro Ala	Thr Thr Ala Asp Ser	Lys Ala Ala
	1	5	10	15
	Phe Lys Asn	Asp Asp Gin Lys Ser	Ala Tyr Ala Leu Gly	Ala Ser Leu
45		20	25	30
	Gly Arg Tyr	Met Glu Asn Ser Leu	Lys Glu Gin Glu Lys	Leu Gly Ile
	.35	40	45
50	Lys Leu Asp	Lys Asp Gin Leu Ile	Ala Gly Val Gin Asp	Ala Phe Ala
	50	55	60
	Asp Lys Ser	Lys Leu Ser Asp Gin	Glu Ile Glu Gin Thr	Leu Gin Ala
	65	70	75	80
55
	Phe Glu Ala	Arg Val Lys Ser Ser	Ala Gin Ala Lys Met i	Glu Lys Asp

PL 215 170 B1

90 95

Ala Ala Asp Asn	Glu	Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala
	100	105	110
Lys Glu	Lys Gly 115	Val	Lys Thr Ser Ser 120	Thr Gly Leu Val Tyr Sin Yal 125
Yal Glu 130	Ala Gly	Lye	Gly Glu Ala Pro 135	Lys Asp Ser Asp Thr Val Val 140
Yal Asn 145	Tyr Lys	Gly	Thr Leu Ile Asp 150	Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser 155 160
Tyr Thr	Arg Gly	Glu 165	Pro Leu Ser Phe	Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro 170 175
Gly Trp	Thr Glu 180	Gly	Leu Lys Asn Ile 185	Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys 190
Leu Val	ile Pro 195	Pro	Glu Leu Ala Tyr 200	Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly 205
Ile Pro 210	Pro Asn	Ser	Thr Leu val Phe 215	Asp Val Glu Leu Leu Asp Yal 220
Lys Pro 225	Ala Pro	Lys	Ala Asp Ala Lys 230	Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala 235 240
Ala Asp	ser Ala	Lys 245	Lys Gly Gly Gly	Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 250 255
Gly Ser	Gly Gly Gly 260	Ser Gly Gly Gly 265	Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala 270
Ser Sly	Lys Ser 275	Leu	Leu His Glu Yal 280	Asp Lys Asp Ile Sar Gin Leu 285
Thr Sin 290	Ala Ile	Val	Lys Asn His Lys 295	Asn Leu Leu Lys Ile Ala Gin 300
Tyr Ala 305	Ala Gin	Asn	Arg Arg Gly Leu 310	Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gin 315 320
Gly Gly	Leu Cys	Lys 325	Ala Leu Gin Glu	Gin cys cys Phe Leu Asn Ile 330 335
Thr Asn	Ser His 340	Val	Ser Ile Leu Gin 345	Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn 350
Arg Val	Leu Thr 355	Gly	Trp Gly Leu Asn 360	Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gin 365
Trp Ala 370 His 385	Arg Glu	Ala	Leu Gin Thr Gly 375	Leu Glu His His His His His 380

PL 215 170 B1

Claims (10)

1. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu, zawierającego amyloidogenne białko docelowe oraz białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych, znamienny tym, że obejmuje etap zmieszania wymienionych białek w buforze, w którym zarówno białko docelowe jak i białko opiekuńcze są solubilizowane, oraz etap dostosowania buforu do warunków fizjologicznych, w których utworzony kompleks białka docelowego z białkiem opiekuńczym jest rozpuszczalny.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bufor fizjologiczny obejmuje związek buforujący w stężeniu od 10 do 200 mM, a całkowite stężenie soli wynosi 20-500 mM.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko docelowe wytwarzane jest przy użyciu technik rekombinacyjnych.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izomeraza peptydyloprolilowa wytwarzana jest przy użyciu technik rekombinacyjnych.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko docelowe oraz izomeraza peptydyloprolilowa wytwarzane są przy użyciu technik rekombinacyjnych.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko docelowe jest retrowirusową glikoproteiną powierzchniową.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko docelowe jest glikoproteiną gp36 wirusa HIV-2, lub glikoproteiną gp41 wirusa HIV-1.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izomeraza peptydyloprolilowa jest fragmentem izomerazy peptydyloprolilowej zachowującym zdolność do wiązania innych białek.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izomeraza peptydyloprolilowa jest białkiem opiekuńczym.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko opiekuńcze FKBP jest wybrane z grupy składającej się z SlyD, FkpA i czynnika wzbudzającego.