ES2375863T3 - Prote�?na de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores. - Google Patents

Abstract

Molécula de ADN recombinante, codificante de una proteína de fusión quimérica, en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humana es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa), comprendiendo: a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.

Description

Proteína de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores

La presente invención se refiere a la clonación, expresión y usos de una proteína de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores comparado con las contrapartidas de origen natural.La presente invención se refiere a una proteína de fusión quimérica codificada por una molécula de ADN recombinante que comprende secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona de E. coli y a secuencias de nucleótidos codificantes de una proteína de unión a FK506 humana (FKBP)

o a un dominio de tipo proteína de unión a FK506 (dominio de tipo FKBP que es FKBP12), a métodos de producción de dichas proteínas de fusión quiméricas y a sus usos como adyuvantes de plegamiento en la producción de otras proteínas y para la inmunización de animales de laboratorio y en el procedimiento de producción de vacunas o de farmacéuticos, a su utilización como módulo de fusión en la tecnología de las proteínas recombinantes y como adyuvantes de plegamiento en la realización de inmunoensayos.

Antecedentes

En la actualidad, los chaperones moleculares desempeñan un importante papel en un amplio abanico de aplicaciones biotecnológicas (Mogk et al,. Chembiochem. 3:807-814, 2002). Existe un gran número de adyuvantes de plegamiento, que presentan propiedades de chaperón, así como enzimáticas. Por estos motivos, resultan útiles para una diversidad de aplicaciones prácticas en el campo del plegamiento de proteínas.

Los chaperones, conocidos como "adyuvantes de plegamiento" clásicos, son polipéptidos que ayudan en el plegamiento y mantenimiento de la integridad estructural de otras proteínas. Presentan la capacidad de estimular el plegamiento de un polipéptido tanto in vivo como in vitro. Generalmente los adyuvantes de plegamiento se subdividen en catalizadores y chaperones de plegamiento. Los catalizadores de plegamiento aceleran las etapas limitantes de la velocidad de plegamiento de la proteína debido a su función catalítica. Posteriormente se describen en mayor detalle ejemplos de catalizadores. Es conocido que los chaperones se unen a superficies desnaturalizadas, parcialmente desnaturalizadas o hidrofóbicas de polipéptidos y de esta manera ayudan a renaturalizar las proteínas o mantenerlas en solución. De esta manera, al contrario que los catalizadores de plegamiento, los chaperones meramente ejercen una función de unión (Buchner J., Faseb J. 10:10-19, 1996). Los chaperones son proteínas ubicuas inducidas por estrés implicadas en la maduración, plegamiento, traslocación y degradación de las proteínas (Gething M.J. y Sambrook J., Nature 355:33-45, 1992). Aunque también se encuentran presentes bajo condiciones de crecimiento normales, resultan abundantemente inducidas bajo condiciones de estrés. Lo anterior apoya adicionalmente la idea de que su función fisiológica es la adaptación bajo condiciones de estrés.

Hasta hoy se conocen varias familias diferentes de chaperones. Todos estos chaperones se caracterizan por su capacidad de unirse a proteínas desplegadas o parcialmente desplegadas y presentan una función fisiológica asociada al plegamiento correcto de las proteínas o a la eliminación de las proteínas desnaturalizadas o agregadas.

Son ejemplos bien caracterizados de chaperones los miembros de las familias de proteínas denominadas de choque térmico, que se denominan según su peso molecular relativo; por ejemplo hsp100, hsp90, hsp70 y hsp60, así como las denominadas shsps (proteínas de choque térmico pequeñas), tal como se describe en Buchner J., Faseb J. 10:10-19, 1996 y en Beissinger M. y Buchner J., Biol. Chem. 379:245-59, 1998.

Los catalizadores de plegamiento, al contrario que los chaperones, ayudan al plegamiento mediante la aceleración de etapas limitantes de la velocidad, reduciendo de esta manera la concentración de los intermediarios de plegamiento con tendencia a la agregación. Una clase de catalizadores, las proteína disulfuro isomerasas (alternativamente denominadas tiol-disulfuro-oxidorreductasas), cataliza la formación o la reorganización de enlaces disulfuro en las proteínas secretorias. En bacterias Gram-negativas, el plegamiento oxidativo de las proteínas secretorias en el periplasma es ajustado por una cascada de proteína disulfuro isomerasas denominadas DsbA, DsbB, DsbC y DsbD (Bardwell J.C., Mol. Microbiol. 14:199-205, 1994, y Missiakas D. et al., Embo J. 14:3415-24, 1995).

Otra clase importante de catalizadores de plegamiento denominada peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas (PPIs) comprende diferentes miembros, tales como CypA, PpiD (Dartigalongue C. y Raina S., Embo J. 17:3968-80, 1998), FkpA (Danese P.N. et al., Genes Dev. 9:387-98, 1995), factor inductor (Crooke E. y Wickner W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5216-20, 1987, y Stoller G. et al., Embo J. 14:4939-48, 1995) y SlyD (Hottenrott S. et al., J. Biol. Chem. 272:15697-701, 1997).

Debido a la similitud entre las secuencias y la topología de las proteínas, las prolil-isomerasas se clasifican en tres familias diferentes: las ciclofilinas, las proteínas de unión a FK506 (FKBPs) y las parvulinas. Las ciclofilinas se unen y resultan inhibidas por el inmunosupresor ciclosporina A. Las parvulinas son una familia de prolil-isomerasas que no resultan inhibidas por la ciclosporina A ni por FK506. Las FKBPs se unen y resultan inhibidas por FK506 y por la

rapamicina (el acrónimo FKBP se refiere a "proteína de unión a FK506"); FK506 es un macrólido que se utiliza como fármaco inmunosupresor). La primera estructura de rayos X de una FKBP que se determinó a alta resolución fue la de la FKBP 12 humana. Es una lámina � de cinco cadenas antiparalelas que se enrolla dextrógiramente en torno a una hélice a corta. La estructura de lámina � de cinco cadenas incluye los residuos 2 a 8, 21 a 30, 35 a 38 con 46 a 49, 71 a 76 y 97 a 106 (van Duyne et al., Science 252:839-842, 1991). La investigación posterior ha demostrado que las FKBPs, así como las ciclofilinas y las parvulinas, forman una familia altamente conservada de enzimas presente en una amplia diversidad de organismos procarióticos y eucarióticos (para una revisión ver John E. Kay, Biochem. J. 314:361-385, 1996). Por ejemplo, hasta hoy las prolil-isomerasas han sido identificadas en E. coli (2 parvulinas, 3 ciclofilinas y 5 FKBPs).

Habitualmente, las FKBPs se definen según el criterio de unión, es decir, reconocen y se unen a FK506 con alta afinidad en el intervalo nanomolar. Sin embargo, existen dominio de tipo FKBP que ya no son susceptibles a la inhibición de la prolil-isomerasa por parte de FK506. Estos dominios de tipo FKBP comparten una similitud de secuencia significativa con FKBP12, aunque algunos de los residuos aminoácidos que median en la unión de FK506 se encuentran mutados, y la afinidad se encuentra desplazada al intervalo micromolar. Por ejemplo, SlyD y el factor inductor (dos PPIasas citosólicas del citosol de E. coli) pueden contemplarse como proteínas de tipo FKBP. Ambas prolil-isomerasas incluyen dominios que comparten una homología de secuencias significativa con FKBP12, aunque su afinidad de unión a FK506 es bastante pobre y es del orden micromolar (Scholz et al., Biochemistry 45:20-33, 2006). Sin embargo, en términos de similitud de secuencias y topología de la proteína, tanto SlyD como el factor inductor indudablemente son miembros de la familia de FKBP (Wülfing et al., J. Biol. Chem. 269(4):2895-2901, 1994; Callebaut y Mornon, FEBS Lett. 374(2):211-215, 1995).

Los dominios de FKBP y los dominios de tipo FKBP podrían formar parte de moléculas de mayor tamaño con topologías complejas. En las células de mamífero, FKBP12, FKBP12A y FKBP13 contienen únicamente el dominio básico de FKBP, mientras que FKBP25 y FKBP52 presentan uno o más dominios de FKBP como parte de una molécula de mayor tamaño (para una revisión ver John E. Kay, Biochem. J. 314:361-385, 1996).

También se encuentran FKBPs construidos modularmente en las células procarióticas. Por ejemplo, el factor inductor anteriormente indicado consiste de tres dominios bien separados con funciones diferentes. El dominio N media en la unión a la subunidad 50S del ribosoma de E. coli (Hesterkamp et al., J. Biol. Chem. 272(35):21865-71, 29 de agosto de 1997). El dominio M (intermedio) incluye el sitio activo de la prolil-isomerasa (Stoller et al., FEBS Lett. 384(2):117-22, 15 de abril de 1996) y el dominio C comprende el sitio de unión de polipéptido que media en la unión de sustratos polipeptídicos extendidos (Merz et al., J. Biol. Chem. 281(42):31963-31971, 20 de octubre de 2006). Otro ejemplo de una peptidil-prolil isomerasa construida modularmente es el FkpA periplásmico, que consiste de un chaperón N-terminal y dominio de dimerización y un dominio de FKBP C-terminal (Saul et al., J. Mol. Biol. 335:595-608, 2004).

Algunos adyuvantes de plegamiento comprenden tanto un dominio catalíticamente activo como un dominio chaperón (o de unión a polipéptido). Por ejemplo, el factor inductor de las prolil-isomerasas (Scholz et al. Embo J. 16:54-58, 1997; Zarnt et al. JMB 271:827-837, 1997), FkpA (Saul et al. JMB 335:595-608, 2004) y SlyD pertenecen a dichos adyuvantes de plegamiento. Recientemente pudo demostrarse que FkpA y SlyD resultan notablemente adecuados como módulos de fusión para la producción de proteínas recombinantes. Ambos chaperones incrementan la velocidad de expresión de sus proteínas cliente, prestan apoyo al replegamiento correcto e incrementan la solubilidad de las proteínas con tendencia a la agregación, tales como las proteínas de superficie retrovíricas (Scholz et al. JMB 345:1229-1241, 2005; y la patente nº WO 03/000877).

FkpA, SlyD y SlpA son chaperones bacterianos que pertenecen a la familia de proteínas de unión a FK506 (FKBP). Tal como se ha indicado anteriormente, FK506 es un macrólido que se utiliza como fármaco inmunosupresor. Los receptores celulares de FK506 todavía son el objetivo de grupos de investigación en todo el mundo. Al inicio de los 90, pudo resolverse la estructura tridimensional de una FKBP humana, la FKBP12 (van Duyne et al. Science 252:839-842, 1991). En contraste con FkpA, SlyD y SlpA, la FKPB12 humana no presenta ninguna actividad de chaperón y únicamente presenta una actividad modesta de prolil-isomerasa.

La patente nº EP-A-1516928 da a conocer una FKBP12 humana similar a PPIasa quimérica en la que se introduce mediante ingeniería de proteínas un segmento de unión a polipéptido de una proteína de tipo FKBP arqueobacteriana. Esta PPIasa quimérica comprende además un polipéptido diana en el que la PPIasa quimérica actúa como adyuvante de plegamiento para el polipéptido diana. Sin embargo, la patente nº EP-A-1516928 es silenciosa con respecto a cualquier actividad adyuvante de plegamiento de la quimera recombinante.

En muchas aplicaciones diagnósticas se utilizan proteínas producidas recombinantemente, por ejemplo a modo de antígenos. Estos antígenos pueden producirse en forma de proteínas de fusión que contienen una parte que forma la parte antigénica o polipéptido diana que debe ser reconocido por una pareja de unión específica que se encuentra presente en la muestra o en la mezcla de ensayo. La otra parte de la proteína de fusión producida recombinantemente es una parte polipéptido que se fusiona con la parte antigénica con el fin de facilitar la clonación, expresión, plegamiento, solubilización o purificación del antígeno específico. La síntesis de las proteínas de fusión producidas recombinantemente se encuentra bien descrita en la técnica anterior. Es bastante común utilizar chaperones como aquella parte de la proteína de fusión que funciona como molécula adyuvante para la expresión, plegamiento, purificación y solubilización del polipéptido diana. Por ejemplo, la patente US nº 6.207.420 da a conocer un sistema de proteínas de fusión para la expresión de proteínas heterólogas, es decir, las secuencias de aminoácidos de la parte de polipéptidos diana y de la parte peptídica fusionada se originan a partir de organismos diferentes. La patente WO nº 03/000878 describe la utilización de los chaperones FKBP como herramientas para la expresión de glucoproteínas de superficie retrovíricas.

Aunque los métodos comunes de expresión, purificación, plegamiento y solubilización de las proteínas de fusión aparentemente funcionan fiablemente, en particular aquellos métodos en los que se utilizan adyuvantes de plegamiento, todavía no se han resuelto algunos problemas. Por ejemplo, en el caso de que se utilice una proteína de fusión que contenga secuencias de aminoácidos no humanas como pareja de unión en un ensayo diagnóstico humano, todavía se producen problemas de interferencias debidos a la utilización de dichas proteínas no humanas. Bastante frecuentemente, los anticuerpos presentes en abundancia en muestras de sangre humana reaccionan con proteínas bacterianas presentes en los reactivos de ensayo. Dichas interferencias pueden resultar en un nivel elevado de ruido de fondo o incluso pueden causar que el ensayo proporcione resultados erróneos. Otro problema común consiste en adaptar u optimizar la afinidad de la pareja de fusión a la proteína correspondiente del cliente. La afinidad de cualquier módulo de fusión para la parte diana debe equilibrarse bien. En el caso de que la afinidad sea excesivamente elevada, la proteína de fusión será perfectamente soluble, pero el complejo entre el módulo de fusión y la proteína del cliente seguirá encontrándose en una conformación cerrada y por lo tanto será inactiva en un ensayo inmunológico. En el caso de que la afinidad sea excesivamente baja, la proteína del cliente debería resultar accesible y ser activa en un inmunoensayo, pero no se encontrará suficientemente protegida frente a la agregación.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un sistema de expresión que resulte adecuado para producir proteínas de tipo chaperón que puedan utilizarse en un amplio abanico de aplicaciones biotecnológicas, y en particular diagnósticas y farmacéuticas, que causen pocas o ninguna interferencia con las moléculas y sustancias presentes en muestras humanas aisladas. La técnica anterior no da a conocer ningún adyuvante de plegamiento efectivo, es decir, un ayudante que ejerza actividades elevadas tanto catalíticas como de chaperón, que consista principalmente de secuencias de aminoácidos humanas.

Aunque existen varias alineaciones de secuencias de proteínas de chaperones humanos y bacterianos (Wülfing et al., JBC 269:2895-2901, 1994; Hottenrott et al. JBC 272:15697-15701, 1997; Suzuki et al. JMB 328:1149-1160, 2003), todavía no se ha demostrado cómo puede generarse un adyuvante de plegamiento humanizado eficiente que presente una doble función, es decir, función catalítica y función de tipo chaperón.

Descripción resumida de la invención

Inesperadamente, los presentes inventores han podido demostrar que mediante la fusión del segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona de E. coli a secuencias que se originan a partir de una proteína de unión a FK506 (FKBP) o a un dominio de tipo FKBP (dominio de tipo proteína de unión a FK506) que es FKBP12, pueden producirse moléculas con actividades de adyuvante de plegamiento superiores.

En particular, mediante la fusión del segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona no humana a secuencias que se originan a partir de una peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa (PPIasa) humana del tipo FKBP, puede generarse una molécula chaperona de PPIasa humanizada con actividades de adyuvante de plegamiento superiores a las de los adyuvantes de plegamiento de tipo salvaje. Estos adyuvantes de plegamiento humanizados quiméricos representan herramientas extremadamente prometedoras para producir reactivos proteicos plegados similares a los nativos para un amplio abanico de aplicaciones biotecnológicas, debido a que causarían pocas o ninguna interferencia al utilizarse en ensayos diagnósticos o en aplicaciones farmacéuticas, y debido a que sus propiedades chaperonas podrían diseñarse para la proteína respectiva.

También se dan a conocer maneras preferentes de diseñar moléculas de ADN recombinante codificantes de dicha proteína de fusión quimérica, así como la utilización de las mismas como parte de un vector de expresión, una célula huésped que comprende dicho vector de expresión, y en la producción de una proteína de fusión quimérica.

Además, las propias proteínas de fusión quiméricas producidas recombinantemente que muestran inesperadas y ventajosas propiedades, en particular con respecto a sus eficiencias catalíticas, forman parte de la invención.

En realizaciones adicionales, se dan a conocer usos de las proteínas de fusión producidas recombinantemente como adyuvantes de plegamiento de las proteínas diana, como adyuvante de plegamiento en el procedimiento de producción de las proteínas diana, como aditivo de una mezcla para inmunoensayo, en el procedimiento de producción de una vacuna, para la inmunización de animales de laboratorio y en el procedimiento de producción de farmacéuticos.

Además, se da a conocer una composición que comprende una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

FIGURA 1: Purificación de FKBP12-IF1 (con inserción de SlyD) tal como se documenta mediante SDS-PAGE. Carril 1, estándar de proteína Mark 12 no teñido, de Invitrogen; carril 3, lisado crudo caotrópico de la cepa sobreproductora de E. coli BL21/DE 3; carril 5, eluido de IMAC; carriles 7 a 11, fracciones de elución de imidazol. FKBP12-IF1 puede purificarse y replegarse con altos rendimientos en un protocolo simple de una etapa descrito en la sección de Ejemplos.

FIGURA 2: Espectros de CD de UV cercano de hFKBP12 de tipo salvaje (línea gris) y de hFKBP12-IF1 (línea negra) según la invención. El tampón era fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; la concentración de proteína era de 100 !M. Las señales de CD entre 250 y 310 nm informan del ambiente asimétrico de los residuos aminoácidos aromáticos. La elipticidad del peso medio de residuo de hFKBP12 se redujo tras la inserción del bucle de SlyD IF. Sin embargo, la menor elipticidad apunta a una conformación de tipo nativo compacta de la quimera FKBP12-IF1 (línea negra).

FIGURA 3: Espectros de CD de UV cercano de SlyD (1 a 165, SlyD*) con y sin la inserción en el dominio solapa. El tampón era fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; la concentración de proteína era de 200 !M de SlyD* y de 250 !M de SlyD* (�bucle IF). Los cuatro residuos de tirosina de SlyD* causan una elipticidad del peso medio de residuo de ~40º 50 cm2 dmol-1 a 278 nm (línea gris). Al eliminar la inserción en el dominio solapa, se conserva esencialmente la forma de la señal de CD de UV cercano, pero se incrementa su intensidad (línea negra). Lo anterior subraya que la integridad estructural de SlyD* se conserva mayoritariamente tras la deleción del dominio del bucle IF. En otras palabras, subraya el carácter de dominio del bucle IF.

FIGURA 4: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de SlyD* de E. coli (1 a 165) a 15ºC. (A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 3, 5, 8, 10, 15 y 20 nM de SlyD* de E. coli. (B) Dependencia de la concentración de SlyD* de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de SlyD*, se muestra como función de la concentración de SlyD*. Se obtuvo un valor de 0,68x106 M-1s-1 para kcat/KM a partir de la pendiente.

FIGURA 5: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de la variante por deleción de SlyD (�bucle IF) a 15ºC. (A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 1,0, 2,0 y 5,0 !M de SlyD (�bucle IF). (B) Dependencia de la concentración de SlyD (�bucle IF) de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de SlyD (�bucle IF), se muestra como función de la concentración de SlyD (�bucle IF). Se obtuvo un valor de ~500 M1s-1 a partir de la pendiente de la línea en (B). El replegamiento de RCM-T1 en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, se inició mediante la dilución a NaCl 2,0 M en el mismo tampón.

FIGURA 6: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de la prolilisomerasa FKBP12 humana a 15ºC. (A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 0,5, 0,8, 1,0, 1,5 y 2,0 !M de hFKBP12. (B) Dependencia respecto de la concentración de hFKBP12 de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de hFKBP12, se muestra como función de la concentración de hFKBP12. Se obtuvo un valor de ~0,014x106 M1s-1 para kcat/KM a partir de la pendiente de la línea en (B). El replegamiento de RCM-T1 en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, se inició mediante la dilución a NaCl 2,0 M en el mismo tampón.

FIGURA 7: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de la proteína quimérica hFKBP12-IF1 según la invención a 15ºC. (A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 3, 5, 8,10 y 20 nM de hFKBP12-IF1. (B) Dependencia respecto de la concentración de hFKBP12-IF1 de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de hFKBP12-IF1, se muestra como función de la concentración de hFKBP12-IF1. Se obtuvo un valor de 2,5x106 M-1s-1 para kcat/KM a partir de la pendiente de la línea en (B). El replegamiento de RCM-T1 en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, se inició mediante la dilución a NaCl 2,0 M en el mismo tampón.

FIGURA 8: Figura esquemática de las proteínas de fusión SlyD*-SlyD*-gp41 y hFKBP12-IF1-hFKBP12-IF1gp41. Se señalan tanto los módulos de fusión como gp41 con cajas. Los módulos chaperones SlyD* y hFKBP12-IF1 se conectan con la molécula diana respectiva mediante una molécula conectora flexible de 23 aminoácidos rica en residuos de glicina y de serina. La etiqueta hexahistidina se fusiona con el extremo Cterminal de la molécula diana mediante un segmento espaciador, que mejora la accesibilidad y facilita tanto la purificación como el replegamiento. La molécula conectora consiste de cinco elementos GGGS iterativos (G: glicina, S: serina); el espaciador comprende cuatro repeticiones HD (H: histidina, D: ácido aspártico) que se observan naturalmente en la cola C-terminal no estructurada de SlyD.

5 FIGURA 9: Espectro de UV de la proteína de fusión quimérica hFKBP12-IF1-gp41 según la invención. Tras el replegamiento acoplado a matriz y la elución con imidazol, la proteína era soluble en tampón acuoso. Con el fin de mantener la absorbancia dentro del intervalo de linealidad de Lambert-Beer, la solución madre de proteína se diluyó 20 veces hasta 5 !M en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1,5 mM a temperatura ambiente. Los agregados de proteínas o asociaciones de alto peso molecular son partículas dispersantes de la luz, que conducirían a una línea base con pendiente, en la región de longitudes de onda de entre 310 y 350 nm. La forma del espectro demuestra la ausencia de ningún agregado y subraya la solubilidad de hFKBP12-IF1-gp41.

FIGURA 10: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de la

15 proteína quimérica hFKBP12-IF4 (con inserción de SlpA) según la invención a 15ºC. (A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 3, 6, 10, 15 y 20 nM de hFKBP12-IF4. (B) Dependencia respecto de la concentración de hFKBP12-IF4 de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de hFKBP12-IF4, se muestra como función de la concentración de hFKBP12-IF4. Se obtuvo un valor de 850.000 M-1s-1 para kcat/KM a partir de la pendiente de la línea en (B). El replegamiento de RCM-T1 en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, se inició mediante la dilución a NaCl 2,0 M en el mismo tampón.

FIGURA 11: Cinética de replegamiento de RCM-T1 en presencia de concentraciones crecientes de la 25 proteína quimérica hFKBP12-IF5 (con inserción de FKBP18 de Thermococcus) según la invención a 15ºC.

(A) Se muestra la cinética de replegamiento de 100 nM de RCM-T1, seguida a partir del cambio de fluorescencia a 320 nm, en presencia de 0, 10, 25, 30, 35 y 40 nM de hFKBP12-IF5. (B) Dependencia respecto de la concentración de hFKBP12-IF5 de la velocidad de plegamiento lento. La proporción entre las constantes de velocidad observadas en presencia, kapp, y en ausencia, k0, de hFKBP12-IF5, se muestra como función de la concentración de hFKBP12-IF5. Se obtuvo un valor de 660000 M-1s-1 para kcat/KM a partir de la pendiente de la línea en (B). El replegamiento de RCM-T1 en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, se inició mediante la dilución a NaCl 2,0 M en el mismo tampón.

Breve descripción del listado de secuencias

35 El listado de secuencias adjunto contiene los SEC ID nº siguientes: SEC ID nº 1 representa la secuencia de aminoácidos de SlyD de E. coli según Suzukiet et al. JMB 328:1149-1160, 2003, que también es accesible como ID P0A9K9 de la base de datos SwissProt.

SEC ID nº 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la FKBP12 humana (Suzuki et al., supra), que también es accesible como ID P62942 de la base de datos SwissProt.

SEC ID nº 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la FKBP12 humana tal como se muestra en SEC ID nº 2, que incluye una mutación en la posición nº 22. Para alcanzar una mejor solubilidad, se ha cambiado la cisteína 22 por 45 alanina (C22A). Además, se ha añadido una etiqueta hexa-histidina C-terminal.

SEC ID nº 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica adyuvante del plegamiento preferente FKBP12-IF1 según la invención. Se ha subrayado la inserción SlyD. FKBP12 G1-G83 / SlyD Q70-N129 / FKBP12 L97-E107 SEC ID nº 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica adyuvante del plegamiento preferente FKBP12-IF1 según la invención. Se ha subrayado la inserción SlyD. La secuencia corresponde a SEC ID nº 4, pero la cisteína 22 ha sido sustituida por alanina. FKBP12 G1-G83 / SlyD Q70-N129 / FkBP12 L97-E107

SEC ID nº 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SlyD*-SlyD*-gp41 con un polipéptido gp41 de VIH-1 como polipéptido diana fusionado a dos unidades SlyD* (comparación con el estado de la técnica). Se muestra en la figura 8 un dibujo esquemático de las proteínas de fusión del tipo portador-portador-diana; ver también el Ejemplo 1. EcSlyD-[GGGS]5GGG-EcSIyD-[GGGS]5GGG-gp41(536-681; L555E, L566E, I573T, I580E)

10 HGHDHDHD-His6, pET24a

SEC ID nº 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión quimérica hFKBP12-IF1-hFKBP12-IF1gp41 con un polipéptido gp41 de VIH-1 como polipéptido diana fusionado con hFKBP12-IF1 según la invención (proteína de fusión en tándem). En la figura 8 se muestra un dibujo esquemático de dicha proteína; ver también el

15 Ejemplo 1.

SEC ID nº 8 muestra la secuencia de aminoácidos de SlyD* (SlyD 1 a 165), que corresponde a SEC ID nº 1, pero que se encuentra truncada C-terminalmente después del residuo nº D165 (ácido aspártico). Además, SEC ID nº 8

SEC ID nº 9 muestra la secuencia de aminoácidos de SlyD* (1 a 165) tal como se muestra en SEC ID nº 8 sin bucle IF. Esta variante también se denomina SlyD*-bucle IF. Para el replegamiento y la purificación, porta una etiqueta hexa-histidina en su extremo C-terminal.

SEC ID nº 10 muestra la secuencia de aminoácidos de un gen sintético codificante de la proteína FKBP12-IF1 con 10 una etiqueta hexa-histidina C-terminal para facilitar la purificación. La metionina N-terminal es eliminada tras la traducción por la N-metionil-aminopeptidasa bacteriana, de manera que el polipéptido maduro se inicia con la glicina

1. Al sustituir la cisteína 22 por alanina, la secuencia de aminoácidos resultante para FKBP12-IF1 corresponde a SEC ID nº 5.

SEC ID nº 12 muestra la secuencia de aminoácidos de SlpA de E. coli según Suzuki et al. JMB 328:1149-1160, 2003, que también es accesible como ID POAEMO de la base de datos SwissProt. El residuo Met N-terminal que se encuentra presente en la proteína no procesada (no mostrada en SEC ID nº 12) se elimina post-traduccionalmente. 20 Hasta el momento, la información sobre SlpA ha sido muy escasa. Aparte de una caracterización preliminar como prolil-isomerasa, con una actividad bastante baja hacia los sustratos peptídicos, hasta el momento prácticamente no

SEC ID nº 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica adyuvante del plegamiento preferente 25 FKBP12-IF4 según la invención. Se ha subrayado la inserción SlpA. Además, se ha añadido una etiqueta hexahistidina C-terminal. FKBP12 G1-G83 / SlpA V72-T132 / FKBP12 L97-E107

SEC ID nº 14 muestra la secuencia de aminoácidos de FKBP18 de Thermococcus que también es accesible como ID O93778 de la base de datos SwissProt.

SEC ID nº 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica adyuvante del plegamiento preferente FKBP12-IF5 según la invención. Se subraya la inserción FKBP18 de Thermococcus. Además, se ha añadido una

SEC ID nº 16 muestra la secuencia de aminoácidos del factor inductor de Escherichia coli que también es accesible 10 como ID P0A850 de la base de datos SwissProt.

SEC ID nº 17 muestra el dominio FKBP del factor inductor de E. coli según SEC ID nº 16. Los aminoácidos entre la

15 SEC ID nº 18 muestra la secuencia de aminoácidos de una realización adicional de la invención. En esta proteína quimérica adyuvante del plegamiento (factor inductor-IF/SlyD), el dominio IF originado a partir de SlyD se inserta en el dominio FKBP del factor inductor de E. coli. Se ha subrayado la inserción SlyD. Factor inductor de E. coli/dominio FKBP + IF

traducida porta una secuencia de señal N-terminal (Met 1-Ala 25) para la exportación al interior del periplasma. Tras cruzar la membrana interna, una peptidasa de señal elimina específicamente la secuencia de señal de manera que esta secuencia se encuentra ausente de la proteína funcional procesada. FkpA comprende un chaperón N-terminal y

25 dominio de dimerización y un dominio de isomerasa C-terminal (Gly 147-K249). En el ensayo de ARNasa-T1, FkpA muestra una eficiencia catalítica de aproximadamente 250.000 M-1s-1. La secuencia de FkpA también es accesible como ID P45523 de SwissProt.

SEC ID nº 20 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio FKBP de FkpA tal como se muestra en SEC ID nº 19 (G147-K249). La secuencia LE C-terminal se incluye como parte de la estrategia de clonación. Se ha añadido una etiqueta hexa-histidina C-terminal para facilitar la purificación. Este dominio FKBP se supone que presenta una actividad débil en el ensayo de plegamiento de ARNasa T1, observándose una actividad comprendida entre la de

SEC ID nº 21 muestra la secuencia de aminoácidos de una realización adicional según la invención. En la proteína quimérica adyuvante de plegamiento FkpA-IF/SlyD, el dominio IF originado a partir de SlyD se inserta en el dominio FKBP de FkpA (tal como se muestra en SEC ID nº 20). Se ha añadido una etiqueta hexa-histidina C-terminal para facilitar la purificación. Dicha proteína quimérica adyuvante de plegamiento se espera que muestra una actividad

Descripción detallada

La presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante, codificante de una proteína de fusión quimérica, en la que un dominio FKBP o de tipo FKBP humano es un andamiaje de plegamiento sobre el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa (PPIasa) de E. coli, comprendiendo: a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP, b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre el aminoácido nº 1 y 20 de la secuencia SEC ID nº 3, y C-terminalmente finalizando con cualquier aminoácido situado entre el aminoácido nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre el aminoácido nº 90 y nº 97 de la secuencia SEC ID nº 3, y C-terminalmente finalizando con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de la secuencia SEC ID nº 3.

La expresión "molécula de ADN recombinante" se refiere a una molécula de ADN que se construye mediante la combinación de dos segmentos de secuencia que de otra manera se encontrarían separados, lo que se lleva a cabo mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de polinucleótidos mediante técnicas de ingeniería genética o mediante síntesis química. Durante dicha combinación, pueden unirse entre segmentos polinucleótidos de funciones deseadas con el fin de generar una combinación deseada de funciones.

La expresión "proteína de fusión quimérica" se refiere a que el dominio de unión a polipéptido y el dominio FKBP (o de tipo FKBP) procedente de diferentes moléculas parentales. Los presentes inventores consideran que el dominio FKBP o de tipo FKBP son andamiajes de plegamiento sobre los que puede injertarse el dominio chaperón, rindiendo un super-chaperón con actividades superiores de adyuvante de plegamiento. En la presente invención, se fusiona un polipéptido no humano con secuencias polipeptídicas humanas. Una proteína quimérica también puede denominarse "proteína mosaico". Debido a que un objetivo de la presente invención es humanizar una proteína adyuvante de plegamiento de manera que la proteína resultante sea más tolerable en aplicaciones diagnósticas, el porcentaje de secuencias de aminoácidos no humanas preferentemente no excede el 50 por ciento comparado con la longitud de la proteína de fusión quimérica completa.

Preferentemente, las secuencias de nucleótidos según a), b) y c) no se encuentran separadas por secuencias conectoras adicionales, sino que son directamente contiguas.

El término "cadena arriba" se refiere a que el nucleótido se encuentra situado en dirección 5' del polinucleótido, es decir, hacia el primer nucleótido. En términos de la secuencia de aminoácidos, el término "cadena arriba" se refiere a que el aminoácido se encuentran situado en dirección N-terminal, es decir, hacia el inicio del polipéptido.

El término "cadena abajo" se refiere a que el nucleótido se encuentra situado en dirección 3' del polinucleótido, es decir, hacia el último nucleótido. En términos de la secuencia de aminoácidos, el término "cadena abajo" se refiere a que el aminoácido se encuentran situado en dirección C-terminal, es decir, hacia el final del polipéptido.

Se dice que un polinucleótido "codifica" o "es codificante" de un polipéptido si, en su estado nativo o tras la manipulación mediante métodos conocidos de la técnica, puede transcribirse y/o traducirse para producir el polipéptido o un fragmento del mismo.

Un "segmento de unión a polipéptido" de un chaperón se considera que es aquella parte de un chaperón que se une a la cadena polipeptídica, sosteniéndola durante el proceso de plegamiento tridimensional de una proteína. El "segmento de unión a polipéptido" del chaperón SlyD de E. coli, es decir sus propiedades de chaperón, se han situado en el denominado dominio IF (inserción en dominio solapa, aminoácidos ~76 a 122) en la presente solicitud. Como unidad de plegamiento autónoma, un dominio de proteína puede adoptar un plegamiento estable de tipo nativo en solución acuosa. Las expresiones "segmento de unión a polipéptido", "bucle IF", dominio IF o dominio chaperón pueden utilizarse sinónimamente.

Los chaperones no humanos preferentes son SlyD y SlpA de E. coli. También se han descrito chaperones FKBP de arqueobacterias, tales como FKBP17 de Methanococcus thermolithotrophicus, FKBP18 de Methanococcus jannaschii, FKBP18 de Thermococcus sp. KS1, FKBP29 de Pyrococcus horikoshii, FKBP26 de Methanococcus jannaschii y FKBP30 de Aeropyrumpernixas, listados por Suzuki et al. JMB 328:1149-1160, 2003.

En una realización preferente, la secuencia o secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona no humana contiene una secuencia codificante de una proteína de unión a FK506 (FKBP) no humana de E. coli, siendo las más preferentes las secuencias de SlyD y SlpA de E. coli.

En una realización particularmente preferente, la secuencia de SlyD de E. coli contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 56 y nº 75 de la secuencia SEC ID nº 1 y que finaliza C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 122 y nº 136 de la secuencia SEC ID nº 1. Resulta más preferente una secuencia codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con el aminoácido nº 70 y que finaliza C-terminalmente con el aminoácido nº 129 de la secuencia SEC ID nº 1.

En una realización preferente adicional, la secuencia de SlpA de E. coli contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 56 y nº 75 de la secuencia SEC ID nº 12 y que finaliza C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 122 y nº 136 de la secuencia SEC ID nº 12. Resulta más preferente una secuencia codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con el aminoácido nº 72 y que finaliza C-terminalmente con el aminoácido nº 132 de la secuencia SEC ID nº 12.

Respecto a las secuencias situadas cadena arriba y cadena abajo contiguas a las secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona no humana, dichas secuencias situadas cadena arriba y cadena abajo se originan en una proteína de unión a FK506 o en un dominio de tipo proteína de unión a FK506 (también denominado dominio de tipo FKBP).

Según la invención, una proteína de unión a FK506 (FKBP) es una proteína capaz de reconocer y unirse al inmunosupresor FK506 con alta afinidad en el intervalo nanomolar. Un dominio de tipo FKBP ("dominio de tipo proteína de unión a FK506") o proteína de tipo FKBP es una proteína o parte de una proteína que es poco o nada susceptible a la inhibición de la prolil-isomerasa por parte de FK506. Estos dominios de tipo FKBP comparten similitudes de secuencia y estructura significativas con proteínas de unión a FK506, tales como FKBP12, aunque algunos de los residuos aminoácidos que median en la unión de FK506 se encuentran mutados, y la afinidad se encuentra desplazada hacia el intervalo micromolar. Por ejemplo, SlyD y el factor inductor (dos PPIasas del citosol de E. coli) se contemplan como proteínas de tipo FKBP (Callebaut y Mornon, FEBS Lett. 374(2):211-215, 1995; Wülfing et al., J. Biol. Chem. 269(4):2895-2901, 1994)).

Con respecto a las secuencias cadena arriba y cadena abajo respecto a las secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona no humana como SlyD o SlpA de E. coli, la secuencia de nucleótidos situada cadena arriba y/o cadena abajo codificante de una peptidil-prolil-cis/transisomerasa humana de tipo FKBP contiene una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína de unión a FK506 (FKBP) o de un dominio de tipo FKBP, que es una secuencia codificante de la FKBP12 humana.

Además, la secuencia de nucleótidos situada cadena arriba codificante de FKBP12 contiene una secuencia codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de la secuencia SEC ID nº 3 y que finaliza C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de la secuencia SEC ID nº 3.

Además, la secuencia de nucleótidos situada cadena abajo codificante de FKBP12 contiene una secuencia codificante de un polipéptido que se inicia N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de la secuencia SEC ID nº 3 y que finaliza C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de la secuencia SEC ID nº 3.

Resulta más preferente una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido según la secuencia SEC ID nº 4. La secuencia SEC ID nº 4 muestra una secuencia de aminoácidos que se inicia N-terminalmente con la posición aminoácida glicina/G1 hasta la glicina/G83 de secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12), continúa con la posición aminoácida glutamina/Q70 hasta la asparagina/N129 de secuencia SEC ID nº 1 (SlyD) y finaliza con leucina/L97 a ácido glutámico/E107 de secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12). El polipéptido correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 4 también se denomina FKBP12-IF1.

En una realización preferente adicional de la invención, la molécula de ADN recombinante contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido según la secuencia SEC ID nº 13. La secuencia SEC ID nº 13 muestra una secuencia de aminoácidos que se inicia N-terminalmente con la posición aminoácida glicina/G1 hasta la glicina/G83 de secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12), continúa con la posición aminoácida valina/V72 hasta la treonina/T132 de secuencia SEC ID nº 12 (SlpA) y finaliza con leucina/L97 a ácido glutámico/E107 de secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12). El polipéptido correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 13 también se denomina FKBP12-IF4.

Se describe además una realización de molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido según la secuencia SEC ID nº 15.

La secuencia SEC ID nº 15 muestra una secuencia de aminoácidos que se inicia N-terminalmente con la posición aminoácida glicina/G1 hasta la glicina/G83 de la secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12), continúa con la posición aminoácida metionina/M84 hasta la treonina/T140 de la secuencia SEC ID nº 14 (FKBP18 de Thermococcus) y finaliza con leucina/L97 a ácido glutámico/E107 de la secuencia SEC ID nº 3 (FKBP12). El polipéptido correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 15 también se denomina FKBP12-IF5.

Resulta ventajoso seleccionar las secuencias de ADN que deben insertarse cadena arriba y cadena abajo de la secuencia codificante del segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona no humana de manera que los elementos estructuras bidimensionales como las hojas no resulten interrumpidas por elementos de secuencia heterólogos y que permanezcan intactos. Las alineaciones de secuencias conocidas comúnmente ayudan a seleccionar las secuencias situadas cadena arriba y cadena abajo adecuadas, tales como, por ejemplo, Suzuki et al. JMB 328:1149-1160, 2003.

Según la invención, la elección y organización de las secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona PPIasa de E. coli y las secuencias de nucleótidos situadas cadena arriba y cadena abajo, es decir, codificantes de una peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa humana de tipo FKBP (PPIasa que es FKBP12), se lleva a cabo de manera que la organización estructural global de la proteína de fusión quimérica resultante corresponda a la estructura de una chaperona de origen natural. En otras palabras, la estructura global preferentemente mantiene la organización de elementos estructurales secundarios tales como las hélices a y las hojas � tal como se indica en el estado de la técnica (por ejemplo Suzuki et al. JMB 328:1149-1160, 2003).

La invención se refiere particularmente a una proteína de fusión quimérica producida mediante la expresión de dichas moléculas de ADN recombinante.

Mediante la expresión de las moléculas de ADN recombinante anteriormente identificadas, los presentes inventores han podido proporcionar contrapartidas a las chaperonas PPIasa bacterianas SlyD, FkpA, factor inductor y SlpA, e incluso contrapartidas humanizadas de las chaperonas PPIasa bacterianas SlyD, factor inductor y SlpA. Estas chaperonas peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa humanizadas pueden funcionar como herramientas útiles en aplicaciones biotecnológicas y como aditivos en ensayos diagnósticos. Tal como puede observarse en la parte experimental de la presente solicitud, los presentes inventores han podido obtener una chaperona humanizada que presenta una eficiencia catalítica más alta que los adyuvantes de plegamiento de tipo salvaje, las secuencias de aminoácidos de los cuales se encuentran contenidas en la chaperona humanizada según la invención. Basándose en las observaciones de un sistema de ensayo de replegamiento de la ARNasa T1 que muestra las capacidades de plegamiento y replegamiento de una proteína, los presentes inventores han podido demostrar que la FKBP12 humana aislada presenta sólo una eficiencia catalítica pequeña, de aproximadamente 14.000 M-1s-1. La eficiencia catalítica de la SlyD de E. coli no modificada aislada alcanza 680.000 M-1s-1. Una variante por deleción de SlyD que carece del dominio de bucle IF muestra una eficiencia catalítica negligible, de ~500 M-1s-1 en el ensayo de plegamiento de la ARNasa T1. Inesperadamente, la eficiencia catalítica de la molécula quimérica FKBP12-IF1 (secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEC ID nº 4) excedía sustancialmente este valor. FKBP12-IF1 mostraba una eficiencia catalítica excelente, de aproximadamente 2.500.000 M-1s-1 (ver también la Tabla 1 en la sección de Ejemplos), que sobrepasa los valores de las prolil-isomerasas más eficiencias conocidas actualmente. Este valor incluso excede la eficiencia catalítica del factor inductor, que alcanza 1,2x106 M-1s-1 (Stoller et al. EMBO J. 14:4939-4984, 1995; Zarnt et al. J. Mol. Biol. 271:827-837, 1997; Scholz et al. EMBO J. 16:54-58, 1997).

Mediante la combinación del sitio activo del centro prolil-isomerasa de la proteína de unión a FK506 humana llamada FKBP12 con un dominio de unión a polipéptido, es decir el denominado bucle IF, de una proteína chaperona PPIasa de E. coli, los presentes inventores han generado un adyuvante de plegamiento con propiedades superiores de chaperón y enzimáticas. Los presentes inventores han podido proporcionar un adyuvante de plegamiento con una eficiencia catalítica más alta que la de las proteínas de tipo salvaje aisladas. Por lo tanto, el adyuvante de plegamiento según la invención también puede denominarse super-chaperón, en referencia a su superior eficiencia catalítica.

Por lo tanto, parte de la invención es una proteína de fusión producida recombinantemente que comprende una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente, en la que un dominio FKBP o de tipo FKBP humano es un andamiaje de plegamiento sobre el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolilcis/trans-isomerasa (PPIasa) de E. coli, comprendiendo: a) una secuencia polipeptídica que contiene un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli de tipo FKBP, b) una secuencia polipeptídica de la FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo N-terminal de la secuencia polipeptídica a), partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de la secuencia SEC ID nº 3, y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de la secuencia SEC ID nº 3, y c) una secuencia polipeptídica de una FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo C-terminal de la secuencia polipeptídica a) partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de la secuencia SEC ID nº 3, y C-terminalmente finalizando con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de la secuencia SEC ID nº 3.

Una realización preferente es una proteína de fusión quimérica que contiene un segmento de unión a polipéptido de una secuencia chaperona SlyD de E. coli y secuencias del polipéptido FKBP12 humano que se fusionan Nterminalmente y C-terminalmente con la secuencia de SlyD. Una de las realizaciones preferentes de la invención es una proteína de fusión quimérica que contiene una secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 4.

También resulta preferente una proteína de fusión quimérica que contiene un segmento de unión a polipéptido de una secuencia chaperona SlpA de E. coli y secuencias del polipéptido FKBP12 humano que se fusionan Nterminalmente y C-terminalmente con la secuencia de SlpA. Se proporcionan más detalles sobre una proteína de fusión quimérica que contiene un segmento de unión a polipéptido de una secuencia chaperona SlpA de E. coli en la sección de Ejemplos y en la Tabla 1.

Una de las realizaciones preferentes de la invención es una proteína de fusión quimérica que contiene una secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 13. Esta proteína se denomina FKPB12-IF4.

También se da a conocer una proteína de fusión que contiene un segmento de unión a polipéptido de una secuencia chaperona FKBP18 de Thermococcus y secuencias del polipéptido FKBP12 humano que se fusionan Nterminalmente y C-terminalmente con la secuencia de FKBP18 de Thermococcus. La FKBP18 de Thermococcus es un homólogo termoestable de SlyD que porta un dominio IF en la región solapa en proximidad al sitio activo de la prolil-isomerasa. La secuencia de aminoácidos de la FKBP18 de Thermococcus se muestra en la secuencia SEC ID nº 14. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión quimérica resultante en la que el dominio de bucle IF putativo de la FKBP18 de Thermococcus se injerta en el andamiaje de plegamiento de la hFKBP12, se muestra en SEC ID nº 15. Se proporcionan más detalles sobre esta proteína de fusión quimérica en la sección de Ejemplos y en la Tabla 1.

Se describe adicionalmente el dominio IF originado a partir de SlyD que se inserta en el dominio FKBP del factor inductor de E. coli. La secuencia SEC ID nº 18 muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína adyuvante de plegamiento quimérica (factor inductor-IF/SlyD). El dominio IF que origina a partir de SlyD se inserta en el dominio FKBP del factor inductor de E. coli. Se ha subrayado la inserción SlyD.

También se da a conocer el dominio IF originado a partir de SlyD que se inserta en el dominio FKBP de FkpA (se muestra como SEC ID nº 20). La proteína adyuvante de plegamiento quimérica resultante se denomina FkpAIF/SlyD. Dicha proteína quimérica adyuvante de plegamiento se espera que muestra una actividad elevada en el ensayo de plegamiento de la ARNasa T1. La secuencia SEC ID nº 21 muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína adyuvante de plegamiento quimérica.

A partir de los experimentos de los presentes inventores se infiere que la función de chaperón de SlyD, SlpA y TcFKBP18 se restringe al dominio denominado IF (solapa insertada). Los presentes inventores concluyen que los dominios IF de diferentes chaperones FKBP se encuentran relacionados estructuralmente y son funcionalmente equivalentes. De esta manera, los dominios IF de diferentes chaperones FKBP deberían ser mutuamente intercambiables. Los presentes inventores postulan que el dominio IF dentro de SlyD podría sustituirse por los dominios IF putativos de, por ejemplo, SlpA o TcFKBP18 sin comprometer las propiedades genuinas de adyuvante de plegamiento de SlyD. Este intercambio del dominio chaperón debería resultar posible de modo mutuo, es decir, los dominios IF putativos podrían injertarse en los dominios de tipo FKBP de SlpA o de TcFKBP18 con el fin de proporcionar módulos chaperones funcionales. El intercambio de dominios chaperones podría abrir el camino al diseño de adyuvantes de plegamiento con una afinidad de sustrato adaptada a la proteína diana correspondiente.

En las proteínas de fusión FKBP-X, en las que FKBP funciona como módulo portador y X se refiere a la proteína huésped o diana, el módulo portador y las proteínas huésped se mantienen en un equilibrio dinámico entre una forma cerrada y una forma abierta. En la forma cerrada, las regiones hidrofóbicas se encuentran protegidas y, de esta manera, la proteína de fusión sigue siendo soluble y no se agrega. En la forma abierta, los sitios antigénicos se encuentran expuestos, lo que permite que la proteína huésped sea funcional, por ejemplo en un inmunoensayo. De esta manera, la afinidad debe equilibrarse correctamente en las proteínas de fusión, y podría adaptarse a las necesidades del módulo diana mediante intercambio de los dominios IF de diferentes chaperones FKBP.

Opcionalmente, todas las proteínas de fusión quiméricas pueden fusionarse adicionalmente con una secuencia polipeptídica diana. Un polipéptido diana según la presente invención puede ser cualquier polipéptido necesario en mayores cantidades y, por lo tanto, difícil de aislar o purificar de otras fuentes no recombinantes.

Entre los ejemplos de proteínas diana producidas preferentemente mediante los presentes métodos se incluyen productos génicos de mamífero, tales como enzimas, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, vacunas, anticuerpos y similares. Más particularmente, entre los productos génicos sobreexpresados preferentes de la presente invención se incluyen productos génicos, tales como eritropoyetina, insulina, somatotropina, factor de liberación de hormona del crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento tarnsformante a, facotr de crecimiento transformante, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento nervioso, factor I de crecimiento similar a insulina, factor II de crecimiento similar a insulina, factor VIII de coagulación, superóxido dismutasa, interferón, interferón y, interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-3, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias multi-linaje, factor estimulante de granulocitos-macrófagos, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor de crecimiento de células T, linfotoxina y similares. Los productos génicos sobreexpresados preferentes son los productos génicos humanos.

Además, los presentes métodos pueden adaptarse fácilmente para incrementar la secreción de cualquier producto génico sobreexpresado que pueda utilizarse como vacuna. Entre los productos génicos sobreexpresados que pueden utilizarse como vacunas se incluyen cualquier producto génico estructural, asociado a membrana, unido a membrana o secretado de un patógeno de mamífero. Entre los patógenos de mamífero se incluyen virus, bacterias, parásitos unicelulares o multicelulares que pueden infectar o atacar a un mamífero. Por ejemplo, entre las vacunas víricas pueden incluirse vacunas contra virus tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), los virus Vaccinia, poliovirus, adenovirus, influenza, de la hepatitis A, de la hepatitis B, Dengue, de la encefalitis B japonesa, de la varicela zóster, citomegalovirus, de la hepatitis A, rotavirus, así como vacunas contra enfermedades víricas tales como el sarampión, la fiebre amarilla, la parotiditis, la rabia, el herpes, la influenza, la parainfluenza y similares. Entre las vacunas bacterianas pueden incluirse vacunas contra bacterias, tales como Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Bordetella pertussis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Clostridiumtetani, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium leprae, R. rickettsii, Shigella, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Coccidioides immitis, Borrelia burgdorferi y similares. Preferentemente, la proteína diana es un miembro de un grupo que consiste de proteínas retrovíricas, tales como gp41 y p17 del VIH-1; gp36 y p16 del VIH-2; gp21 del HTLV-I/II, que consiste de proteínas de cubierta vírica, tales como E1 y E2 del virus de la rubeola o que consiste de proteínas amiloidogénicas tales como �-AP42 (péptido del Alzheimer) o proteína prión.

Un polipéptido diana según la presente invención también puede comprender secuencias, por ejemplo epítopos relevantes para el diagnóstico, procedentes de varias proteínas diferentes construidas para expresarse en forma de un único polipéptido recombinante.

También es un objetivo de la invención una molécula de ADN recombinante codificante de una proteína de fusión quimérica, en la que un dominio FKBP o de tipo FKBP humano es un andamiaje de plegamiento sobre el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa (PPIasa) de E. coli, comprendiendo: a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP, b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y 20 de la secuencia SEC ID nº 3, y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de la secuencia SEC ID nº 3, y c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de la secuencia SEC ID nº 3, y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de la secuencia SEC ID nº 3, y d) por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido diana.

Resulta importante que las secuencias de nucleótidos codificantes de un polipéptido diana se inserten de manera que la secuencia codificante del super-chaperón quimérico según las etapas a), b y c) siga intacta, de manera que mantenga sus funciones catalíticas y de chaperón. Lo anterior implica que la secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido diana se inserta dentro del marco de lectura cadena arriba o cadena abajo de la secuencia codificante de la proteína de fusión quimérica. También puede insertarse cadena arriba y cadena abajo y también puede insertarse más de una copia.

El ADN recombinante codificante de una proteína de fusión quimérica y un polipéptido diana según la invención también puede comprender una secuencia conectora, resultando en un polipéptido conector tras la expresión de la proteína completa. Tal como apreciará el experto en la materia, dicho polipéptido conector está diseñado para ser el más apropiado para la aplicación pretendida, especialmente en términos de longitud, flexibilidad, carga y solubilidad.

También pueden utilizarse variantes de las proteínas de fusión quiméricas, que portan uno o varias sustituciones o deleciones de aminoácidos, con el fin de obtener un ADN recombinante o una proteína de fusión recombinante según la invención. El experto en la materia podrá determinar fácilmente si dichas variantes resultan apropiadas para un método de la invención mediante la utilización de los procedimientos descritos en la sección de Ejemplos.

Pueden producirse grandes cantidades de los polinucleótidos mediante replicación en una célula huésped adecuada. Los fragmentos de ADN natural o sintético codificantes de proteínas o de fragmentos de las mismas se incorporan en constructos polinucleótidos recombinantes, típicamente constructos de ADN, que pueden introducirse y replicarse en una célula procariótica o eucariótica.

Los polinucleótidos también pueden producirse mediante síntesis química, incluyendo, aunque sin limitación, el método de la fosforamidita descrito por Beaucage S.L. y Caruthers M.H., Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981, y el método del triéster según Matteucci M.D. y Caruthers M.H., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981. Puede obtenerse un fragmento de doble cadena a partir del producto monocatenario de síntesis química mediante la síntesis de la cadena complementaria e hibridando las cadenas entre sí bajo condiciones apropiadas o mediante la adición de la cadena complementaria utilizando ADN polimerasa con un secuencia de cebador apropiada.

Las secuencias polinucleótidas se encuentran operablemente ligadas al situarse en una relación funcional con otra secuencia polinucleótida. Por ejemplo, un promotor se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que el promotor afecte a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias ligadas son contiguas y, en el caso de que resulte necesario para unir dos regiones codificantes de proteína, a que son contiguas y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, es bien conocido que determinados elementos genéticos, tales como intensificadores, pueden ligarse operablemente incluso a cierta distancia, es decir, incluso si no son contiguos.

Los constructos de ADN preparados para la introducción en un huésped típicamente comprenden un sistema de replicación reconocido por el huésped, que incluye el fragmento de ADN objetivo codificante del péptido de fusión quimérico deseado y opcionalmente un polipéptido diana adicional, y preferentemente también incluyen secuencias reguladoras del inicio de la transcripción y de la traducción ligadas al segmento codificante del polipéptido. Entre los sistemas de expresión (vectores de expresión) pueden incluirse, por ejemplo, un origen de replicación o secuencia de replicación autónoma (ARS) y secuencias de control de la expresión, un promotor, un intensificador y sitios necesarios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión ribosómica, sitios de procesamiento del ARN, sitios de poliadenilación, secuencias terminadoras de la transcripción y secuencias estabilizadoras del ARNm.

Las secuencias de promotor apropiadas y otras secuencias del vector necesarias se seleccionan de manera que sean funcionales en el huésped. Entre los ejemplos de combinaciones trabajables de líneas celulares y vectores de expresión se incluyen, aunque sin limitación, las indicadas en Sambrook J. et al., en: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", editores J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989, o Ausubel F. et al., en: "Current protocols in molecular biology" (1987 y actualizaciones periódicas), editores F. Ausubel, R. Brent y K.R.E., Wiley & Sons Verlag, New York, y Metzger D. et al., Nature 334:31-6, 1988. Muchos vectores útiles para la expresión en bacterias, levaduras, células de mamífero, de insecto, vegetales u otras son conocidos de la técnica y pueden obtenerse de proveedores, incluyendo, aunque sin limitación, Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech, y otros. Además, el constructo puede unirse a un gen amplificable (por ejemplo DHFE), de manera que puedan obtenerse copias múltiples del gen.

Los vectores de expresión y clonación probablemente contendrán un marcador seleccionable, un gen codificante de una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula huésped transformada con el vector, aunque dicho gen marcador puede estar incluido en otra secuencia polinucleótida cointroducida en la célula huésped. Únicamente aquellas células huésped que expresan el gen marcador sobrevivirán y/o crecerán bajo condiciones selectivas. Entre los genes de selección típicos se incluyen, aunque sin limitación, aquellos codificantes de proteínas que: (a) proporcionan resistencia frente a antibióticos u otras sustancias tóxicas, por ejemplo ampicilina, tetraciclina, etc.; (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. La elección del marcador seleccionable correcto dependerá de la célula huésped, y son conocidos de la técnica los marcadores apropiados para diferentes huéspedes.

Según la invención, un vector de expresión que comprende operablemente ligado una molécula de ADN recombinante según la presente invención y opcionalmente por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido diana, ha demostrado ser muy ventajoso.

También es parte de la invención un vector de expresión que comprende operablemente ligado una molécula de ADN recombinante según la presente invención, es decir, que comprende: a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP, b) cadena arriba del mismo una secuencia de nucleótidos codificante de una FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de la secuencia SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de la secuencia SEC ID nº 3, y c) cadena abajo del mismo una secuencia de nucleótidos codificante de una FKBP12 humana según la secuencia SEC ID nº 3 partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de la secuencia SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de la secuencia SEC ID nº 3, y opcionalmente d) por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido diana.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquier método conocido de la técnica. Estos métodos varían dependiendo del tipo de huésped celular, incluyendo, aunque sin limitación, la transfección con cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAEdextrano, otras sustancias, y la infección por virus. Pueden prepararse grandes cantidades de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención mediante la expresión de los polinucleótidos de la presente invención en vectores o en otros vehículos de expresión en células huésped compatibles. Los huéspedes procarióticos utilizados más comúnmente son cepas de Escherichia coli, aunque también pueden utilizarse otros procariotas, tales como Bacillus subtilis. La expresión en Escherichia coli representa un modo preferente de llevar a cabo la presente invención.

La construcción de un vector según la presente invención utiliza técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos

o fragmentos de ADN aislados se cortan, recortan y religan en la forma deseada con el fin de generar los plásmidos requeridos. Si se desea, el análisis para confirmar que las secuencias en los plásmidos construidos son las correctas se lleva a cabo de un modo conocido. Los métodos adecuados para construir los vectores de expresión, la preparación de transcritos in vitro, la introducción de ADN en las células huésped, y la realización de análisis para evaluar la expresión y función son conocidos por el experto en la materia. La presencia, amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm, la transferencia de puntos (análisis de ADN o ARN) o la hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada que puede basarse en una secuencia proporcionada en la presente memoria. El experto en la materia podrá contemplar con facilidad cómo modificar dichos métodos, si se desea.

El vector de expresión que comprende un ADN recombinante según la presente invención puede utilizarse para expresar la proteína de fusión en un sistema de traducción libre de células o puede utilizarse para transformar una célula huésped. En una realización preferente, la presente invención se refiere a una célula huésped transformada con un vector de expresión según la presente invención.

En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a un método de producción de una proteína de fusión quimérica. Dicho método comprende las etapas de cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión según la presente invención, la expresión de dicha proteína de fusión quimérica en la célula huésped correspondiente y la purificación de dicha proteína de fusión quimérica.

Las proteínas de fusión quiméricas según la invención muestran una elevada solubilidad. Al sobreexpresarse en el citosol principalmente se acumulan en la fracción soluble. En menor grado, también se expresan en cuerpos de inclusión. Generalmente, las células se lisan bajo condiciones tamponadoras apropiadas tal como, por ejemplo, en sustancias caotrópicas. Al etiquetar las proteínas de fusión quiméricas con una fracción hexa-histidina, pueden unirse proteínas no plegadas a una columna que contiene níquel (Ni-NTA), en donde también se repliegan bajo condiciones de tamponamiento apropiadas. Dichos protocolos de purificación y replegamiento tal como se muestran en mayor detalle en la sección de Ejemplos, son bien conocidos por el experto en la materia. Debido a sus superiores propiedades de adyuvante de plegamiento, las proteínas de fusión quiméricas según la invención pueden aplicarse como adyuvantes de plegamiento para cualquier proteína diana que, de otro modo, no adoptaría su estructura tridimensional correcta, es decir, su conformación similar a la nativa. Según la invención, las proteínas de fusión quiméricas también pueden utilizarse como adyuvantes de plegamiento en el procedimiento de producción de las proteínas diana. Por ejemplo, tras la solubilización primaria de las célula huésped sobreproductora, una proteína diana sobreexpresada habitualmente todavía no adopta su estructura nativa debido a la presencia de sustancias caotrópicas o debido a la presencia de detergentes u otras condiciones de tamponamiento, que comprometen el estado conformacional nativo de la proteína diana. Las proteínas de fusión quiméricas seguidamente pueden añadirse durante el procedimiento de purificación y solubilización de la proteína diana y podrían ayudar durante el proceso de replegamiento y renaturalización.

Respecto a una aplicación en sistemas acoplados de transcripción/traducción, pueden añadirse lisados celulares que contengan el adyuvante de plegamiento quimérico sobreexpresado al vial en el que se lleva a cabo la traducción in vitro, de manera que se facilite el plegamiento conformacional correcto de la proteína traducida.

Las proteínas de fusión quiméricas según la invención pueden aplicarse en un inmunoensayo para ayudar en el proceso de unión inmunológica de antígenos y anticuerpos a sus parejas de unión sin alterar el inmunoensayo y sus resultados. Resulta ventajoso que las proteínas de fusión quiméricas según la invención se humanicen, es decir, que contengan principalmente secuencias de aminoácidos humanas, de manera que se minimice la probabilidad de interferencias debidas a la presencia de anticuerpos naturales en muestras humanas contra secuencias de proteína no humana. Preferentemente, el porcentaje de aminoácidos originados a partir de secuencias humanas es por lo menos 60% comparado con la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de fusión quimérica.

Los inmunoensayos son bien conocidos por el experto en la materia. Los métodos para llevar a cabo dichos ensayos, así como las aplicaciones y procedimientos prácticos, se resumen en libros de texto relacionados. Son ejemplos de libros de texto relacionados, Tijssen P., Preparation of enzyme-antibody or other enzymemacromolecule conjugates, en: "Practice and theory of enzyme immunoassays", 221-278, editores R.H. Burdon y

v.P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, 1990) y diversos volúmenes de Tijssen, en: "Methods in Enzymology", editores S.P. Colowick, N.O. Caplan y S.P., Academic Press, 1980), referidos a métodos de detección inmunológica, especialmente los volúmenes nº 70, 73, 74, 84, 92 y 121.

En realizaciones adicionales de la invención, las proteínas de fusión quiméricas pueden utilizarse como pareja de fusión en el procedimiento de producción de las proteínas diana, en la producción de una vacuna o en el procedimiento de producción de farmacéuticos, respectivamente.

En el caso de que se pretenda una aplicación terapéutica de las nuevas proteínas de fusión quiméricas, preferentemente se formulará una composición que comprenda una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención.

Ejemplos

Materiales y reactivos

Se obtuvo el cloruro de guanidinio (GdmCl, grado A) de NIGU (Waldkraiburg, Alemania). Las tabletas de inhibidor de proteasa sin EDTA Complete®, imidazol y EDTA se obtuvieron de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania); todos los demás compuestos químicos eran de grado analítico, de Merck (Darmstadt, Alemania). Se purificó la ARNasa T1-(S54G, P55N), se redujo y se carboximetiló tal como describen Mücke M. y Schmid F.X., J. Mol. Biol. 239:713-725, 1994. Las membranas de ultrafiltración (YM10, YM30) se obtuvieron de Amicon (Danvers, MA, USA), las membranas de microdiálisis (VS/0,025 !m) y las unidades ultrafiltración (dispositivo de filtro Biomax Ultrafree) se obtuvieron de Millipore (Bedford, MA, USA). Las membranas de nitrato de celulosa y de acetato de celulosa (1,2 !m/0,45 !m/0,2 !m) para la filtración de los lisados crudos se obtuvieron de Sartorius (Göttingen, Alemania).

Ejemplo 1

Producción de una proteína de fusión quimérica hFKBP12-IF1 que contenía secuencias de SlyD de E. coli y de FKBP12 humana

Clonación de casetes de expresión

Las secuencias de hFKBP12 y SlyD se recuperaron de la base de datos SwissProt. Los genes sintéticos codificantes de hFKBP12 y sus variantes por inserción se obtuvieron de Medigenomix (Martinsried, Alemania) y se clonaron en vectores de expresión pET24 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA). Se optimizó el uso de los codones para la expresión en células huésped de E. coli. El gen de SlyD se amplificó por PCR a partir de la cepa Bl21 de E. coli (DE3), se cortó y se ligó en el vector de expresión pET24a. Los casetes de expresión para las proteínas de fusión se diseñaron tal como se describe para el módulo de fusión SlyD* de E. coli, tal como describen Scholz et al. (J. Mol. Biol. 345:1229-1241, 2005).

Un gen sintético codificante de la proteína FKBP12-IF1 (también mostrado en la secuencia SEC ID nº 10 con etiqueta hexa-histidina)

se obtuvo de Medigenomix (Martinsried, Alemania) y se clonó en el vector de expresión pET24a (Novagen, Madison, WI). Se optimizó el uso de los codones para la expresión en células huésped de E. coli. Se utilizó QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) para generar la variante libre de cisteína (C22A). Se escindió la metionina N-terminal tras la traducción utilizando la N-metionil-aminopeptidasa bacteriana, de manera que el polipéptido maduro se inicia con la glicina 1.

los fragmentos de ADN codificantes de FKBP12-IF1-(GGGS)2GG flanqueado por NdeI/BamHI y (GGGS)2GG-gp41 flanqueado por BamHI/XhoI (residuos 536 a 681) se amplificaron por PCR y se insertaron en pET24a utilizando NdeI y XhoI. El gen sintético codificante de FKBP12-IF1(C22A) o el ARN purificado de un aislado de VIH-1 sirvió como molde de PCR-(RT-PCR). Se introdujeron las mutaciones puntuales L555E, L566E, 1573T y 1580E en el casete

15 gp41 utilizando QuikChange.

se generó cortando FKBP12-IF1(C22A)-gp41 con BamHI e insertando un fragmento de ADN codificante de 20 (GGGS)2GGG-F12IF1-(GGGS)2GG flanqueado por BamHI/BamHI, que se amplificó por PCR a partir del gen sintético codificante de FKBP12-IF1(C22A).

Se utilizó QuikChange de EcSlyD-[GGGS]5GGG-EcSlyD-[GGGS]5GGG-gp41(536-681; L555E, L566E, 1573T, I580E)-HGHDHDHD-His6, pET24a

(Stratagene, La Jolla, USA) y técnicas de PCR estándares para generar mutaciones puntuales, variantes por deleción e inserción o sitios de restricción. Todas las variantes recombinantes de FKBP12 contenían una etiqueta hexahistidina C-terminal para facilitar la purificación asistida por Ni-NTA y el replegamiento.

Expresión, purificación y replegamiento de variantes de hFKBP12

Se purificaron todas las variantes de hFKBP12, SlyD y SlpA, así como las proteínas de fusión, mediante la utilización de protocolos virtualmente idénticos. Se cultivaron a 37ºC en medio LB más canamicina (30 !g/ml) células de E. coli BL21 (DE3) que contenían el plásmido de expresión pET24a particular, hasta una DO600 de 1,5, y se indujo la sobreexpresión citosólica mediante la adición de isopropil-�-D-tiogalactósido 1 mM. Tres horas después de la inducción, las células se recolectaron mediante centrifugación (20 minutos a 5.000 g), se congelaron y se almacenaron a -20ºC. Para la lisis celular, el pellet congelado se resuspendió en fosfato sódico 50 mM refrigerado, pH 8,0, GdmCl 7,0 M e imidazol 5 mM, y la suspensión se agitó durante 2 horas sobre hielo para completar la lisis celular. Tras la centrifugación y filtración (membrana de nitrato de celulosa, 0,45 !m/0,2 !m), el lisado se aplicó en una columna de Ni-NTA equilibrada con el tampón de lisis que incluía TCEP 5,0 mM. La etapa de lavado posterior se ajustó a la proteína diana correspondiente y se realizó con imidazol 5 a 15 mM en fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, GdmCl 7,0 M, TCEP 5,0 mM. Se aplicaron por lo menos 10 a 15 volúmenes del tampón de lavado. A continuación, se sustituyó la solución de GdmCl por fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, imidazol 10 mM, TCEP 5,0 mM, para inducir el replegamiento conformacional de la proteína unida a matriz. Con el fin de evitar la reactivación de las proteasas copurificadas, se incluyó un cóctel de inhibidor de proteasa (sin EDTA, Complete®, Roche) en el tampón de replegamiento. Se aplicó un total de 15 a 20 volúmenes de columna de tampón de replegamiento en una reacción durante la noche. A continuación, se eliminó tanto TCEP como el cóctel de inhibidor sin EDTA Complete® mediante lavado con 3 a 5 volúmenes de columna de fosfato sódico 50 mM, pH 7,8, NaCl 100 mM e imidazol 10 mM. A continuación, se eluyó la proteína nativa con imidazol 250 mM en el mismo tampón. Las fracciones que contenían proteína se evaluaron para su pureza mediante tricina-SDS-PAGE y se agruparon. Finalmente, las proteínas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia) y se agruparon y se concentraron las fracciones que contenían proteínas en una celda Amicon (YM10).

Tras el protocolo de purificación y replegamiento acoplados, pudieron obtenerse más de 20 mg de proteína diana a partir de 1g de células de E. coli húmedas. Los presentes inventores incrementaron adicionalmente la solubilidad global de las diversas variantes de hFKBP12 sustituyendo la cisteína 22 por alanina. La sustitución de esta única cisteína anuló la tendencia de hFKBP12 a formar aductos disulfuro covalentes. Tampoco afectó al plegamiento de la proteína ni a su actividad de prolil-isomerasa. La sustitución de la cisteína 22 por una alanina también resultó ser ventajosa en el caso de la proteína quimérica FKBP12-IF1. La purificación de hFKBP12-IF11 (C22A) documentada mediante SDS-PAGE se muestra en la figura 1.

Ejemplo 2

Mediciones espectroscópicas

Se llevaron a cabo mediciones de la concentración de proteínas con un espectrofotómetro de doble haz Uvikon XL. Se determinaron los coeficientes de extinción molar (£280) mediante la utilización del procedimiento descrito por Pace, Protein Sci. 4, 2411-2423, 1995.

Se registraron los espectros de CD de UV cercano con un espectropolarímetro Jasco-720 con un soporte de cubetas termostatizado y se convirtieron a la elipticidad del peso medio de residuo. El tampón era fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM. El camino óptico era de 0,5 ó 1,0 cm; la concentración de proteína era de 20 a 500 !M. El ancho de banda era de 1 nm; la velocidad de escaneo era de 20 nm/minuto a una resolución de 0,5 nm y la respuesta era de 2 s. Con el fin de mejorar la razón de señal-ruido, los espectros se midieron nueve veces y se calcularon las medias.

Evaluación del plegamiento similar al nativo mediante CD de UV cercano

Con el fin de examinar si las proteínas de fusión quiméricas según la invención adoptaban una conformación plegada tras el protocolo de purificación y replegamiento acoplados, los presentes inventores midieron los espectros de CD en la región del UV cercano. El CD de UV cercano informa del ambiente asimétrico de los residuos aromáticos en una proteína y por lo tanto es un ensayo sensible para la estructura terciaria ordenada. La injertación de un dominio tal como el bucle IF de SlyD en el segmento solapa de hFKBP12 podría comprometer gravemente la estructura global de la proteína de andamiaje hFKBP12. La FKBP12 humana nativa presenta una firma de CD típica en la región del UV cercano (figura 2). De esta manera, las distorsiones o interferencias estructurales debidas a la inserción del bucle IF deberían resultar visibles en el espectro del CD de UV cercano. La figura 2 muestra una superposición de los espectros de hFKBP12 y hFKBP12-IF1, respectivamente. Inesperadamente, la inserción del dominio IF en la región solapa de hFKBP12 deja esencialmente intacta la estructura global de la proteína de andamiaje. La firma de los espectros es similar, aunque la elipticidad convertida se reduce significativamente con la inserción del bucle. Debido a que el desplegamiento global anularía cualquier señal de CD de UV cercano, este resultado es fuertemente indicativo de que se retiene esencialmente un plegamiento similar al nativo del constructo quimérico hFKBP12-IF1.

De manera similar, los presentes inventores registraron los espectros de CD de UV cercano para SlyD* (SlyD 1 a 165) y su variante por deleción SlyD* �bucle IF (SlyD* que no presenta los residuos aminoácidos nº 70 a nº 129). Se muestran los resultados en la figura 3. A partir de los espectros de CD de UV cercano, la estructura global de SlyD* sigue intacta al eliminar el dominio "solapa insertado" (IF) de gran tamaño. La elipticidad del peso medio de residuo convertida incluso se incrementa ligeramente al eliminar el bucle IF. De esta manera, existen pruebas convincentes de que SlyD sin su dominio IF todavía es una proteína plegada similar a la nativa.

Ejemplo 3

Experimentos de plegamiento

Para los estudios de plegamiento, se utilizó ARNasa T1 (RCM-T1) reducida y carboximetilada. Se desplegó la RCM-T1 mediante incubación de la proteína en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, a 15ºC durante por lo menos 1 hora. El replegamiento a 15ºC se inició con una dilución de 40 veces de la proteína no plegada hasta condiciones finales de NaCl 2,0 M y las concentraciones deseadas de SlyD, las variantes de FKBP12 y RCM-T1 en el mismo tampón. Se realizó un seguimiento de la reacción de plegamiento a partir del incremento de la fluorescencia de la proteína (es decir, la fluorescencia del triptófano) a 320 nm (ancho de banda: 10 nm) tras la excitación a 268 nm (ancho de banda: 1,5 nm). A 2,0 M de NaCl, el plegamiento lento de RCM-T1 era un proceso monoexponencial, y se determinó su constante de velocidad mediante la utilización del programa GraFit 3.0 (Erithacus Software, Staines, Reino Unido).

Actividad de plegamiento de las proteínas de fusión quiméricas

Los presentes inventores investigaron las eficiencias de las proteínas de fusión quiméricas según la invención en la catálisis de una reacción de plegamiento de proteína limitada por prolina. Se utilizó la ARNasa T1 (RCM-T1) reducida y carboximetilada como el sustrato modelo. Su reacción de replegamiento se vio acompañada de un fuerte incremento de la fluorescencia del triptófano y pudo inducirse mediante el incremento de la concentración del NaCl, tal como se describe en Schmid F.X., Curr. Opin. Struct. Biol. 1:36-41, 1991; Mayr et al. Biochemistry 35:5550-5561, 1996; y Mücke M. y Schmid F.X., Biochemistry 33:14608-14619, 1994.

SlyD* (1 a 165) de E. coli cataliza muy bien el replegamiento de RCM-T1.En presencia de tan sólo 2 nM de SlyD*, el replegamiento de RCM-T1 se acelera en un factor de dos (figura 4A). La constante de velocidad de primer orden aparente de la kapp de plegamiento se incrementa linealmente con la concentración de SlyD* (figura 4B). A partir de la pendiente de este gráfico se determinó una constante de especificidad kcat/KM de 0,68x106 M-1s-1. Éste es un valor extraordinariamente elevado, que prácticamente alcanza la eficiencia catalítica del factor inductor, el adyuvante de plegamiento más eficiente conocido actualmente (ver Stoller et al., EMBO J. 14:4939-4948, 1995; Scholz et al. EMBO J. 16:54-58, 1997; y Sholz et al. (J. Mol. Biol. 277:723-732, 1998).

En contraste, el mutante de SlyD que no presenta dominio IF es un catalizador muy pobre del replegamiento de RCM-T1. SlyD �IF representa el dominio FKBP de SlyD. Su constante de especificidad es del orden de aproximadamente 0,0005x106 M-1s-1 y, de esta manera, supone sólo el 0,07% de la de SlyD* (figura 5A/B). Lo anterior indica claramente que el dominio "solapa insertado presenta un papel crucial en la unión de los sustratos proteína no plegados. Debido a que los espectros del CD de UV cecano apuntan a un plegamiento global similar al nativo de la variante por deleción (figura 3), el dominio solapa insertado probablemente representa el dominio de unión de polipéptido, es decir, el dominio chaperón de SlyD.

La deleción del dominio IF putativo prácticamente anula la actividad de plegamiento de SlyD*. El mutante de SlyD que no presenta el dominio IF representa el dominio FKBP o de tipo FKBP de SlyD. ¿Cómo resulta afectada, en contraste, la actividad de plegamiento de hFKBP12 por la inserción de este mismo elemento IF en la región solapa? En concordancia con los datos publicados (Scholz et al. EMBO J. 16:54-58, 1997), la catálisis del replegamiento de RCM-T1 por parte de hFKBP12 es bastante modesta (figura 6A). El análisis de las constantes de velocidad de primer orden aparentes proporciona una constante de especificidad de 0,014x106 M-1s-1 (figura 6B). En contraste, la variante por inserción de bucle IF de FKBP12-IF1 según la invención cataliza el replegamiento de RCM-T1 extremadamente bien (figura 7A). Resulta suficiente menos de 1 nM de FKBP12-IF1 para doblar la velocidad de

M-1-1

plegamiento de RCM-T1. La constante de especificidad es superior a 2,5x106s (figura 7B y Tabla 1). Este excelente valor incluso excede la eficiencia catalítica del factor inductor, que alcanza 1,2x106 M-1s-1 (Stoller et al. EMBO J. 14:4939-4984, 1995; Zarnt et al. J. Mol. Biol. 271:827-837, 1997; Scholz et al., EMBO J. 16:54-58, 1997). De esta manera, mediante la construcción de una proteína de fusión quimérica según la invención, los presentes inventores convirtieron una prolil-isomerasa no humana modesta y un chaperón humano pobre en un excelente adyuvante de plegamiento con propiedades de prolil-isomerasa y de chaperón excepcionalmente buenas.

El principio de combinación de un dominio de unión a polipéptido de un chaperón no humano y un dominio PPIasa humana puede extenderse a otros ejemplos. Análogamente al patrón de construcción de FKBP12-IF1, los presentes inventores injertaron el dominio de bucle IF putativo de SlpA en el andamiaje de plegamiento de hFKBP12. SlpA (el acrónimo se refiere a proteína A similar a SlyD) es un pariente cercano de SlyD. La información sobre SlpA es escasa, aunque, debido a su homología con SlyD, se supone que presenta un papel como chaperón PPIasa en el citosol de E. coli. Los presentes inventores purificaron y caracterizaron una variante de SlpA etiquetada con hexahistidina de E. coli. Sin embargo, esta PPIasa putativa mostró una actividad muy pobre en el ensayo de replegamiento de RCM-T1 (Tabla 1). La quimera que comprendía elementos de FKBP12 y de SlpA se denominó hFKBP12-IF4. Comprende los módulos G1G83 de hFKBP12, V72-T132 de SlpA, y L97-E107 de hFKBP12 (para información de la secuencia, ver SEC ID nº 13). La expresión, purificación hasta la homogeneidad y replegamiento de la proteína etiquetada con hexa-histidina se llevaron a cabo esencialmente tal como se ha descrito para FKBP12-IF1. La evaluación mediante CD de UV cercano proporcionó un espectro que inequívocamente apuntaba a un plegamiento compacto de la proteína diseñada (espectro no mostrado).

Al evaluarse en el ensayo de replegamiento de RCM-T1, hFKBP12-IF4 mostró una actividad de plegamiento inesperadamente elevada (figura 10A). Su constante de especificidad (kcat/KM) era de 800.000 M-1s-1 (ver la Tabla 1) y su eficiencia catalítica era prácticamente igual a la de SlyD, el cual es un adyuvante de plegamiento muy potente (Scholz et al., Biochemistry 45:20-33, 2006). Nuevamente, la combinación de un dominio de unión a polipéptido putativo (de SlpA) con una prolil-isomerasa lenta (FKBP12) proporciona un adyuvante de plegamiento excelente con actividades elevadas tanto enzimática como de chaperón. Los presentes inventores concluyen que, mediante la combinación de hFKBP12 con dominios de bucle IF procedentes de diversos homólogos de SlyD, pueden obtenerse adyuvantes de plegamiento humanizados con actividades de plegamiento excepcionales.

Un ejemplo adicional del principio de combinación de un dominio de unión a polipéptido de un chaperón no humano y un dominio PPIasa humano es una proteína de fusión quimérica denominada hFKBP12-IF5. Siguiendo el patrón de construcción de FKBP12-IF1 y de FKBP12-IF4, los presentes inventores injertaron el dominio de bucle IF putativo de la FKBP18 de Thermococcus en el andamiaje de plegamiento de hFKBP12. La FKBP18 de Thermococcus es un homólogo termoestable de SlyD que porta un dominio IF putativo en la región solapa en proximidad al sitio activo de la prolil-isomerasa.

La quimera resultante se denominó hFKBP12-IF5. Comprendía los módulos G1 a G83 de hFKBP12, M84T140 de la FKBP18 de Thermococcus y L97-E107 de hFKBP12 (para información de secuencia, ver SEC ID nº 14 para la FKBP18 de Thermococcus y SEC ID nº 15 para hFKBP12-IF5). La expresión, purificación hasta la homogeneidad y replegamiento de la proteína etiquetada con hexa-histidina se llevaron a cabo esencialmente tal como se ha descrito para FKBP12-IF1.

Al evaluarse en el ensayo de replegamiento de RCM-T1, hFKBP12-IF5 mostró una actividad de plegamiento inesperadamente elevada (figura 11). Su constante de especificidad (kcat/KM) era de 660.000 M-1s-1 y su eficiencia catalítica era prácticamente igual a la de SlyD, el cual es un adyuvante de plegamiento muy potente según datos de la literatura reciente (Scholz et al., Biochemistry 45:20-33, 2006). Nuevamente, la combinación de un dominio de unión a polipéptido putativo (de la TcFKBP18 termoestable) con una prolil-isomerasa lenta (hFKBP12) proporciona un adyuvante de plegamiento excelente con actividades elevadas tanto enzimática como de chaperón. Los estudios de los presentes inventores muestran inequívocamente que la combinación de hFKBP12 con dominios de bucle IF procedentes de diversos homólogos de SlyD proporciona adyuvantes de plegamiento humanizados con excepcionales actividades de plegamiento.

El mismo principio también se aplica a dominios de tipo FKBP, que se encuentran presentes en muchas prolil

isomerasas procarióticas y eucarióticas. Por ejemplo, FkpA y el factor inductor son dos proteínas de E. coli que comprenden dominios de tipo FKBP. Se ha demostrado anteriormente que dichos dominios de tipo FKBP, al separarse del resto de la molécula, muestran una actividad de plegamiento muy modesta (Scholz et al., EMBO J. 16(1):54-5, 1997; Saul et al., J. Mol. Biol. 335:595-608, 2004). Lo anterior concuerda perfectamente con la FKBP12 humana, que es una prolil-isomerasa modesta que no presenta ninguna actividad de chaperón. Mediante la injertación de cualquier dominio IF de SlyD (también denominado segmento de unión a polipéptido) en un dominio de tipo FKBP como andamiaje de plegamiento, pueden obtenerse excelentes adyuvantes de plegamiento. Estas quimeras también pueden utilizarse como adyuvantes de plegamiento en la biotecnología de las proteínas recombinantes, por ejemplo a modo de proteínas de fusión, aditivos en tampones de replegamiento y similares.

El principio de injertación de dominios también se aplica a SlyD mismo. La variante por deleción de SlyD que no presenta el dominio IF (SlyD �IF) representa el dominio FKBP genuino, que puede combinarse con dominios IF de otros chaperones FKBP, proporcionando un adyuvante de plegamiento de excelente eficiencia catalítica. También se describe la utilización de SlyD, en particular de la variante de SlyD que no presenta el dominio IF, para producir adyuvante de plegamiento con una eficiencia catalítica que excede la eficiencia catalítica de las moléculas de tipo salvaje naturales con las que se prepara el adyuvante de plegamiento quimérico resultante.

La Tabla 1 resume los resultados obtenidos para todas las proteínas medidas en el ensayo de RCM-T1.

Variante de PPIasa

Constante de especificidad kcat/KM (M-1s-1)

hFKBP12

14,000

hFKBP12 (C22A)

14,000

SlyD* (SlyD 1-165)

680,000

SlyD* �bucle IF

500

hFKBP12-IF1 (C22A)/ invención

2,500,000

SlpA

< 1000

hFKBP12-IF4/invención

850,000

TcFKBP18

600,000

hFKBP12-IF5/invención

660,000

Ejemplo 4

Reactividad inmunológica de las proteínas de fusión FKBP12-IF1/VIHgp41

El presente ejemplo muestra la adición de una proteína de VIH, es decir la proteína de cubierta gp41, como proteína diana, a la proteína de fusión quimérica FKBP12-IF1 según la invención. El módulo de fusión en tándem FKBP12IF1-gp41 se purificó y se replegó tal como se ha descrito para las variantes de proteína SlyD y hFKBP12. Se utilizó para detectar los anticuerpos anti-gp41, que se observan en abundancia en los sueros positivos para VIH-1. Se retó la reactividad inmunológica en un analizado automático Elecsys® 2010 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) utilizando el formato de sándwich de doble antígeno.

La detección de señal en el inmunoensayo Elecsys® se basa en la electroquimioluminiscencia. Se inmovilizó el conjugado-biotina (es decir, el antígeno de captura) sobre la superficie de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, mientras que el antígeno de señalización portaba un catión rutenio acomplejado como la fracción luminiscente. En presencia de anticuerpos anti-gp41, se establecieron puentes entre el complejo cromogénico de rutenio y la fase sólida, emitiendo luz a 620 nm tras la excitación en un electrodo de platino. Los resultados de señal se proporcionan en unidades de luz arbitrarias.

Para su utilización como antígenos Elecsys®, las proteínas de fusión gp41 solubles a estudio se concentraron y se modificaron con fracciones de rutenio y biotina activadas con N-hidroxi-succinimida, tal como describen Scholz et al.

J. Mol. Biol. 345:1229-1241, 2005. La concentración de las variantes de gp41 en las mediciones de inmunoensayo era de aproximadamente 500 ng/ml. Se utilizaron por lo menos cinco sueros negativos a modo de controles. Con el fin de minimizar adicionalmente los resultados falsos positivos, se añadieron SlyD* de E. coli no marcado polimerizado a las muestras a modo de sustancia anti-interferencia.

Resultó que la fusión quimérica FKBP12-IF1 según la invención era perfectamente adecuada como pareja de fusión para las proteínas con tendencia a la agregación. Al fusionar la hFKBP12 de tipo salvaje con el fragmento ectodominio gp41, las proteínas de fusión resultantes se agregaron cuantitativamente tras el replegamiento acoplado por matriz y la elución con imidazol. Evidentemente, hFKBP12 no es capaz de proporcionar solubilidad a una diana

extremadamente hidrofóbica tal como el fragmento de ectodominio de gp41. En contraste, los presentes inventores encontraron que las proteínas de fusión quiméricas según la invención que comprendían FKBP12-IF1 y el fragmento 536 a 681 de ectodominio de gp41 de VIH-1 (figura esquemática 8) eran perfectamente solubles y no tendían a agregarse, según la espectroscopía de UV (figura 9). Al evaluarse en un analizador Elecsys® automático, resultaron ser perfectamente adecuadas para aplicaciones diagnósticas en la serología del VIH-1 (datos no mostrados). Lo anterior subraya adicionalmente las excelentes propiedades de las proteínas de fusión quiméricas según la invención.

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<110> Roche-Diagnostics GmbH; F. Hoffmann-La Roche AG 5 <120> Proteína de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores

<130> 23529 WO-IR

<160> 21

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 196 15 <212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 113

<212> PRT 5 <213> Artificial

<223> FKBP12 humana con mutación Cys22 por Ala22 y etiqueta His C-terminal

<400> 3

<210> 4

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial; hFKPB12-IF1 con inserción de SlyD

<400> 4 <210> 5

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial; hFKBP12-IF1 con mutación C22A de SlyD

<400> 5 <210> 6

<211> 535

<212> PRT

<213> Artificial; proteína de fusión SlyD*-SlyD*-gp41 de VIH

<400> 6

<210> 7

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial; proteína de fusión hFKBP12-IF1-hFKBP12-IF1-gp41

<400> 7

<210> 8

<211> 171

<212> PRT

<213> Artificial; SlyD* (SlyD 1-165) con etiqueta hexa-His

<400> 8 <210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial; SlyD* (SlyD 1-165) sin bucle IF

<400> 9 <210> 10

<211> 161

<212> PRT

<213> Artificial, hFKBP12-IF1 con etiqueta hexa-His

<400> 10 <210> 11

<211> 332

<212> PRT

<213> Artificial; proteína de fusión hFKBP12-IF1 (C22A)-gp41

<400> 11

<210> 12

<211> 148

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 12

<210> 13

<211> 161

<212> PRT

<213> Artificial, hFKBP12-IF1 (inserción de SlpA) con etiqueta hexa-His

<400> 13

<210> 14

<211> 159

<212> PRT

<213> Thermococcus sp.

<400> 14

<210> 15

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial; hFKBP12-IF5 inserción en Thermococcus

<400> 15

<210> 16

<211> 432

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 16

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 17

<210> 18

<211> 164

<212> PRT

<213> Artificial; factor inductor con inserción de IF en SlyD

<400> 18

<210> 19

<211> 270

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 19

<210> 20

<211> 114

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 20

<210> 21

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial; FkpA con inserción de IF de SlyD

<400> 21

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ADN recombinante, codificante de una proteína de fusión quimérica, en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humana es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa), comprendiendo:

   a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP

   b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y

   c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.

2. 2.

   Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además:

   d) por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido diana.

3. 3.

   Vector de expresión que comprende operablemente ligada una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1 ó 2.

4. 4.

   Célula huésped que comprende un vector de expresión según la reivindicación 3.

5. 5.

   Proteína de fusión quimérica producida recombinantemente, en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humano es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidilprolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa), comprendiendo:

   a) una secuencia polipeptídica que contiene un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP,

   b) una secuencia polipeptídica de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo N-terminal de la secuencia polipeptídica a), partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y

   c) una secuencia polipeptídica de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo C-terminal de la secuencia polipeptídica a), partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.
6. 6. Método para producir una proteína de fusión quimérica según la reivindicación 5, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

   a) cultivo de células huésped según la reivindicación 4,

   b) expresión de dicha proteína de fusión quimérica, y

   c) purificación de dicha proteína de fusión quimérica.

7. 7.

   Proteína de fusión quimérica producida recombinantemente, producida mediante un método según la reivindicación 6.

8. 8.

   Proteína de fusión producida recombinantemente según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además:

   d) por lo menos un polipéptido diana.

9. 9.

   Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de aditivo de un inmunoensayo o en una aplicación diagnóstica.

10. 10.

    Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de adyuvante de plegamiento para proteínas diana in vitro.

11. 11.

    Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de adyuvante de plegamiento en el procedimiento de producción de proteínas diana in vitro.

12. 12.

    Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de pareja de fusión en el procedimiento de producción de proteínas diana in vitro.

13. 13.

    Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 en un inmunoensayo.

14. 14.

    Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 en el procedimiento de producción de farmacéuticos.

15. 15.

    Composición que comprende una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.