JP5611540B2 - 組換えタンパク質および酵素技術のためのツールとしてのSlpA - Google Patents
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Description
本発明は、SlpAシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換えDNA分子、および該融合タンパク質をコードする対応する発現ベクター、ならびに該発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の別の態様は、該融合タンパク質の製造方法、ならびに、SlpAシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質である。本発明のさらなる態様は、イムノアッセイでの結合パートナー(例えば抗原、酵素または組換え較正物質)としての、または干渉を低減するための手段としての組換え的に製造された融合タンパク質の使用である。さらに本発明は、標的ポリペプチドに対する抗体を製造するための免疫原としての該組換え的に製造された融合タンパク質の使用、およびワクチン製造での該組換え的に製造された融合タンパク質の使用に関する。また別の態様は、組換え的に製造された融合タンパク質を用いたイムノアッセイでのアナライトの検出方法、ならびにSlpAシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質を含有する試薬キットである。さらなる態様は、イムノアッセイにおける干渉および交差反応の低減のためのSlpAの使用に関する。本発明のさらなる態様は、バイオテクノロジー用途のための、SlpAおよび標的タンパク質を含む可溶性であり機能性である複合体の使用に関し、このとき該標的タンパク質は治療または診断上価値のあるタンパク質であり得る。
本発明の一態様は、融合タンパク質をコードする組換えDNA分子であって、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、その上流または下流にある、SlpAシャペロン単位をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列とを含む、組換えDNA分子である。
(a)標的ポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列、およびその上流または下流にあるSlpAシャペロンをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養するステップ、
(b)該融合タンパク質を発現させるステップ、
(c)該融合タンパク質を精製するステップ、および
(d)該融合タンパク質を可溶性かつネイティブ様のまたは免疫反応性(すなわち抗原性)のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む方法である。この方法により製造される融合タンパク質も本発明の一態様である。
(a)体液サンプルを、SlpAシャペロンに対応する少なくとも1つのポリペプチドおよび標的ポリペプチドに対応する少なくとも1つのポリペプチドを含む融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
(b)該体液サンプル中に存在するアナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、ならびに
(c)該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む方法である。
SlpAおよびSlyD融合ポリペプチドのクローニングと精製
発現カセットのクローニング
Novagen社(Madison, WI, USA)のpET24a発現プラスミドをもとに、SlyDまたはSlpA融合ポリペプチドをコードする発現カセットを得た。gp41エクトドメインの配列はSwissProtデータベースから取得した。gp41(aa536−681)をそのN末端にインフレームで融合されたグリシンリッチなリンカー領域と共にコードする合成遺伝子を、Medigenomix社(Martinsried, Germany)から購入した。コード領域の5’末端および3’末端にはそれぞれBamHIおよびXhoI制限部位がある。グリシンリッチなリンカー領域により連結され、そのC末端にさらなるリンカー領域の一部分を有する2つのSlpA単位(配列番号1、SwissProt登録番号P0AEM0の残基1−146および2−149)をコードするさらなる合成遺伝子も同様にMedigenomix社から購入した。このカセットの5’末端および3’末端にはそれぞれNdeIおよびBamHI制限部位がある。これらの遺伝子および制限部位は、単純なライゲーションによりSlpA−SlpAとgp41エクトドメイン断片をインフレームで融合できるように設計してあった。意図しない組換え反応を回避するため、および大腸菌(E. coli)宿主内での発現カセットの遺伝的安定性を向上させるために、SlpA単位をコードするヌクレオチド配列ならびに伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列を縮重させた。すなわち、同一のアミノ酸配列をコードするに当たって、異なるコドンの組み合わせを使用した。
SlyD、SlpA、および全ての融合タンパク質変異体は、実質的に同じプロトコルを用いて精製した。特定のpET24a発現プラスミドを担持する大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞を37℃にてカナマイシン(30μg/mL)を添加したLB培地でOD6001.5まで増殖させ、1mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを添加することにより細胞質過剰発現を誘導した。誘導から3時間後に、細胞を遠心分離(5000gにて20分)により回収し、凍結し、−20℃にて保存した。細胞を溶解させるために、凍結したペレットを氷冷50mMリン酸カリウムpH8.0、7.0M GdmCl、5mMイミダゾールに再懸濁し、この懸濁物を2時間、氷上で攪拌し、細胞を完全に溶解させた。遠心分離と濾過(硝酸セルロースメンブレン、0.45μm/0.2μm)の後に、溶解物を、5.0mM TCEPを含む溶解バッファーで平衡化したNi−NTAカラムに加えた。その後の洗浄ステップは、それぞれの標的タンパク質に合わせ、50mMリン酸カリウムpH8.0、7.0M GdmCl、5.0mM TCEP中の5〜15mMイミダゾールとした。少なくとも10〜15容の洗浄バッファーを加えた。次いで、GdmCl溶液を50mMリン酸カリウムpH7.8、100mM KCl、10mMイミダゾール、5.0mM TCEPで置換し、マトリックス結合タンパク質の立体構造的再フォールディングを誘導した。共に精製されるプロテアーゼの再活性化を避けるために、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete(登録商標)EDTAフリー、Roche社)を再フォールディングバッファーに追加した。合計15〜20カラム容量の再フォールディングバッファーを一晩かけて添加した。次いでTCEPおよびComplete(登録商標)EDTAフリー阻害剤カクテルの両方を、3〜5カラム容量の50mMリン酸カリウムpH7.8、100mM KCl、10mMイミダゾールを用いた洗浄により除去した。次いでネイティブなタンパク質を同じバッファー中の250mMイミダゾールにより溶出させた。タンパク質含有画分はトリシン−SDS−PAGEを用いて純度を評価し、プールした。最後に前記タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex HiLoad、Amersham Pharmacia社)に供し、タンパク質含有画分をプールしAmicon cell(YM10)で濃縮した。
分光学的測定
タンパク質の二次および三次構造の両方を評価するためにここで選択した方法は、円偏光二色性分光法(CD)である。芳香族領域(260〜320nm)における楕円率はタンパク質内の三次的接触(すなわち規則的にフォールディングされたタンパク質の球状構造)を反映するのに対して、アミド領域(190〜250nm)における楕円率は、タンパク質骨格における規則的な繰り返しエレメント、すなわち二次構造を反映する。
ビオチンおよびルテニウム部分の融合タンパク質へのカップリング
融合ポリペプチドのリシンε−アミノ基を、10〜20mg/mLのタンパク質濃度にて、N−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識でそれぞれ修飾した。標識/タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、2:1〜5:1(モル:モル)とした。反応バッファーは150mMリン酸カリウムpH8.0、100mM KCl、1mM EDTAとした。反応は室温で15分間行い、緩衝化L−リシンを最終濃度10mMまで添加することにより停止させた。標識の加水分解による不活性化を回避するために、それぞれのストック溶液は乾燥DMSO(seccosolv(登録商標)等級、Merck社、Germany)中で調製した。調べた全ての融合タンパク質は、反応バッファー中の最大15%までのDMSO濃度を許容した。カップリング反応後に、未反応の遊離標識は、粗製のタンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム(Superdex 200 HiLoad)に通すことにより除去した。
ポリペプチド融合タンパク質の免疫学的反応性
種々の融合タンパク質の免疫学的反応性(すなわち抗原性)を、自動化されたElecsys(登録商標)2010分析器(Roche Diagnostics GmbH社)で評価した。Elecsys(登録商標)はRocheグループの登録商標である。測定は二重抗原サンドイッチフォーマットで行った。
Claims (15)
- 融合タンパク質をコードする組換えDNA分子であって、標的ポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、その上流または下流に、配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するSlpAシャペロンをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列とを含み、ここで、FK506結合タンパク質(FKBP)は標的ポリペプチドから除かれる、上記組換えDNA分子。
- 機能的に連結された、請求項1に記載の組換えDNA分子を含む発現ベクター。
- 請求項2に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 以下のステップ:
(a)請求項3に記載の宿主細胞を培養するステップ、
(b)前記融合タンパク質を発現させるステップ、
(c)該融合タンパク質を精製するステップ、および
(d)該融合タンパク質を可溶性かつ免疫反応性のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む、融合タンパク質の製造方法。 - 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するSlpAシャペロンに対応する少なくとも1つのポリペプチドと、標的ポリペプチドに対応する少なくとも1つのポリペプチドとを含む、組換え的に製造された融合タンパク質であって、ここで、FK506結合タンパク質(FKBP)は標的ポリペプチドから除かれる、上記融合タンパク質。
- イムノアッセイでの結合パートナーとしての、請求項5に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
- イムノアッセイでの干渉の低減のための手段としての、請求項5に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
- 前記標的ポリペプチドに対する抗体の製造のための免疫原としての、請求項5に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
- ワクチン製造での、請求項5に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
- 請求項5に記載の組換え的に製造された融合タンパク質および製薬上許容される賦形剤を含む組成物。
- 単離されたサンプル中のアナライトに特異的な抗体の検出方法であって、以下のステップ:
(a)体液サンプルを請求項5に記載の融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
(b)該体液サンプル中に存在する該アナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、および
(c)該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む、上記方法。 - 単離されたサンプル中のアナライトに対する抗体の検出方法での、請求項5に記載の融合タンパク質の使用。
- 請求項5に記載の融合タンパク質を含有する、アナライトに対する抗体の検出のための試薬キット。
- 干渉および免疫学的交差反応の低減のための、イムノアッセイでの添加剤としての請求項5に記載の融合タンパク質の使用。
- 標的タンパク質の溶解性を改善し、凝集を防止するための添加剤としての請求項5に記載の融合タンパク質の使用。
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