ES2612741T3 - Proteínas de fusión proteína n de un virus de la familia paramyxoviridae-proteína de interés - Google Patents

Proteínas de fusión proteína n de un virus de la familia paramyxoviridae-proteína de interés Download PDF

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Abstract

Procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, en el que las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial (RSV), dicho procedimiento consta de las siguientes etapas: a) coexpresar una proteína de fusión proteína N de un virus respiratorio sincicial -proteína de interés, con una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial, en la que la proteína de interés N se fusiona en fases con el extremo C-terminal de la proteína N, donde la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, y la proteína P truncada no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de enlace a la proteína N; b) recoger los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P que se formen de este modo.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión proteína N de un virus de la familia Paramyxoviridae-proteína de interés.
[0001] La presente solicitud describe proteínas de fusión proteína N-proteína de interés, eventualmente en 5 forma de complejos solubles proteína N-proteína de interés/proteína P, donde las proteínas N y P son proteínas de un virus de la familia de los Paramyxoviridae. Cuando la proteína de interés es un antígeno, la solicitud describe igualmente las composiciones vacunales y de los reactivos de diagnóstico que contienen esas proteínas de fusión proteína N-antígeno o esos complejos proteína N-antígeno/proteína P. La fusión proteína N-proteína de interés también puede utilizarse como «vector» para transportar moléculas de interés terapéutico en las células, como 10 antivirícos anticancerígenos.
[0002] El virus respiratorio sincicial (RSV según la denominación internacional) es responsable de la bronquiolitis del lactante (500 000 niños afectados cada año en Francia). No existe ningún tratamiento preventivo (vacuna) ni ningún antivírico realmente eficaz contra esta enfermedad. Esta misma enfermedad existe en los 15 bóvidos, afecta al 70 % de los terneros durante el primer año y la mortalidad puede llegar al 20 %. El RSV bovino es el principal agente responsable de enfermedades respiratorias graves de los terneros. El cuadro clínico es idéntico al de los humanos. Este virus pertenece al orden de los Mononegavirale, de la familia de los Paramyxoviridae. Las partículas víricas están revestidas de una envoltura lipídica que contiene dos proteínas principales, la proteína de fusión (F) y la glicoproteína (G). En el interior de las partículas se encuentra un ARN monocatenario de polaridad 20 negativa de aproximadamente 15 kb, asociado a la proteína de nucleocápside (N). Este complejo ARN-N constituye la matriz del complejo polimerasa constituido por la proteína L (large fragment) que es el ARN polimerasa ARN-dependiente, y su cofactor P (fosfoproteína) igualmente presentes en los viriones.
[0003] Hasta ahora no era posible purificar la proteína N de forma soluble, porque al expresarse de forma 25 recombinante, se asocia espontáneamente y de forma no específica a los ARN celulares, formando estructuras de peso molecular muy elevado y no solubles (Méric et al. 1994 Virus Res. 31(2):187-201; Bhella et al., 2002 Journal of General Virology; 83, 1831-1839). Los inventores han desarrollado un procedimiento de obtención de la proteína de nucleocápside (N) del virus respiratorio sincicial (RSV) en forma recombinante soluble con una estructura de anillos y su uso como vacuna. La proteína N se presenta en forma de anillos muy regulares de 7 nm de diámetro 30 aproximadamente, que contienen 10 moléculas de proteína N y un ARN de origen bacteriano de 70 bases aproximadamente. La proteína N se coxpresa en el E. coli con la fosfoproteína (P) del RSV, más concretamente su extremo C-terminal, fusionada con la glutatión-S-transferasa (GST), que permite purificar los complejos por afinidad con las microesferas de sefarosa glutatión. Estas estructuras de anillos inducen una alta respuesta inmunitaria en el ratón, en concreto por administración intranasal, incluso en ausencia de adyuvante. Este procedimiento se ha 35 presentado en la solicitud de patente FR 2885139.
[0004] Ahora los Inventores han demostrado que es posible utilizar estas estructuras de anillos como vector vacunal. La viabilidad de esta tecnología se ha demostrado fusionando la proteína N con otra proteína, la GFP (green fluorescent protein) por construcción plasmídica. Se ha coexpresado en el E. coli con la parte C-terminal de la 40 proteína P (aminoácidos 161-241) fusionada en la GST. El análisis de las estructuras purificadas con el microscopio electrónico ha demostrado que el injerto de la GFP en C-terminal de la proteína N sigue permitiendo a la proteína N producirse en forma de anillos con un diámetro de 10 nm aproximadamente. Las proteínas de fusión N-GFP son fluorescentes.
45
[0005] Dado que los anillos N-ARN son extremadamente inmunógenos, los Inventores han inyectado estas estructuras a ratones para ver si podían inducir una alta respuesta de anticuerpos, concretamente contra la GFP. Las respuestas se han comparado con las obtenidas con la proteína GFP «normal», también purificada en forma recombinante a partir de E. coli. Los resultados obtenidos han mostrado una respuesta contra la GFP claramente más fuerte (alrededor de unas 40 veces en el primer experimento) cuando se utilizan las estructuras de anillos. 50
[0006] La posibilidad de fusionar una proteína de interés con la proteína N y de purificar los complejos en forma de anillos solubles a escala industrial con un coste moderado (concretamente en el E. coli) podrá permitir desarrollar vacunas contra cualquier tipo de epítopo poco o nada inmunógeno cuando se inyecta solo.
55
[0007] Además, los Inventores han demostrado que estas estructuras proteína N-GFP/proteína P son adsorbidas y e interiorizadas eficazmente por diferentes tipos celulares. Estos resultados demuestran el interés de estas fusiones proteína N-proteína de interés, eventualmente en forma de complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, como vector de antígeno en vacunación, o más generalmente de moléculas de interés terapéutico. 60
[0008] La invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína
de interés/proteína P, las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial (RSV), dicho procedimiento consta de los siguientes pasos:
a) coexpresar una proteína de fusión proteína N de un virus respiratorio sincicial -proteína de interés, con una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial, en la que la proteína de interés se fusiona en fase al 5 extremo C-terminal de la proteína N, la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, y la proteína P truncada no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de unión a la proteína N;
b) recoger los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P que se formen de este modo. 10
[0009] La invención también se refiere a un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P en forma de anillos solubles que contienen la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial, en el que la proteína de interés se fusiona en fase al extremo C-terminal de la proteína N, la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por 15 los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, la proteína P es una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial que no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de unión a la proteína N.
[0010] La invención se refiere además a un procedimiento de preparación de una proteína N de un virus 20 respiratorio sincicial, fusionado en fase a su extremo C-terminal con una proteína de interés, dicho procedimiento consta de la separación de la proteína de fusión proteína N-proteína de interés a partir del complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la invención.
[0011] La invención se refiere igualmente a una proteína de fusión proteína N-proteína de interés, aislada, 25 estructurada en anillos solubles que contienen la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, que puede obtenerse por el procedimiento de preparación según la invención, donde la proteína N es una proteína N de un virus respiratorio sincicial y la proteína de interés se fusiona en fase, al extremo C-terminal de la proteína N.
[0012] La invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una proteína N de un virus 30 respiratorio sincicial fusionado con una proteína de interés o un complejo de proteína N-proteína de interés/proteína P según la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0013] La invención se refiere a un reactivo diagnóstico que contiene una proteína de fusión según la invención, en la que la proteína de interés es un antígeno. 35
[0014] La invención se refiere igualmente a la utilización de una proteína de fusión según la invención que contiene un antígeno fusionado en fase al extremo C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial para la detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno de la proteína de fusión.
40
[0015] La invención se refiere además a un procedimiento de detección de anticuerpos específicos de un antígeno, en una muestra biológica, que consta de los siguientes pasos:
a) poner en contacto dicha muestra biológica con una proteína de fusión según la invención que contiene un antígeno fusionado en fase en C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial; 45
b) detectar los complejos de proteína de fusión N-antígeno/anticuerpo formados, porque la presencia de dichos complejos revela la presencia de anticuerpos específicos del antígeno en la muestra biológica.
Definiciones
50
[0016] La familia de los virus «Paramyxoviridae» agrupa a las subfamilias de los Paramyxovirinae y de los Pneumovirinae. Dentro de los Paramyxovirinae se encuentran los géneros Respirovirus, cuyo virus prototípico es el virus de Sendai, Rubulavirus (en concreto el virus de las paperas), y Morbilivirus, como el virus del sarampión. Dentro de cada uno de los géneros Respirovirus y Rubulavirus se encuentran cepas del virus paragripal. Dentro de la subfamilia de los Pneumovirinae se encuentran dos géneros, los Pneumovirus y los Metapneumovirus, y dentro de 55 este último se encuentra el Metapneumovirus humano. El virus respiratorio sincicial (RSV) humano es el virus prototípico del género Pneumovirus que pertenece a la subfamilia de los Pneumovirinae. Dentro de los Pneumovirus se encuentran igualmente las cepas bovina y murina del RSV.
[0017] Sin más precisiones, por «virus respiratorio sincicial» se entiende, de forma general, el RSV, sea cual 60 sea su forma (humana, bovina...), subgrupo (por ejemplo los subgrupos A, B y S identificados en el RSV humano) o cepa considerada.
[0018] «Proteína N» designa la proteína de nucleocápside de los Paramyxoviridae que forma estructuras helicoidales para rodear al genoma viral. La proteína N del RSV humano cepa Long presenta una secuencia de 391 aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 1. La proteína N del RSV bovino presenta igualmente 391 aminoácidos (ver SEQ ID NO: 2). Asimismo, se encuentran descritas una proteína N del virus de Sendai (cepa Hamamatsu), del virus 5 del sarampión (cepa Edmonston B), del virus de las paperas (cepa SBL-1) y del Metapneumovirus humano (cepa 00-1) en la base de datos Swissprot con los números de acceso Q9DUE3 (SEQ ID NO:3), Q89933 (SEQ ID NO:4), P21277 (SEQ ID NO:5), y Q91 F57 (SEQ ID NO:6), respectivamente.
[0019] La expresión «proteína P» designa la Fosfoproteína o proteína P que forma parte del complejo 10 Polimerasa de un virus de la familia de los Paramyxoviridae. La proteína P es un cofactor de la polimerasa (replicasa/transcriptasa) vírica y puede estar fosforilada. Los expertos en la materia conocen las secuencias de proteínas P de los Paramyxoviridae. Por ejemplo, la proteína P del RVS humano cepa Long presenta una secuencia de 241 aminoácidos que se ha registrado en la base de datos Swissprot con el número de acceso P12579. Esta secuencia se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 7. La proteína P del RSV bovino también consta de 241 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 8). Asimismo, se encuentran descritas una proteína P del virus de Sendai (cepa Harris), del virus del sarampión (cepa Edmonston B), del virus de las paperas (cepa SBL-1), y del Metapneumovirus humano (cepa 00-1) en la base de datos Swissprot con los números de acceso P04859 (SEQ ID NO:9), CAA91364 (SEQ ID NO:10), P19717 (SEQ ID NO:11), y Q91KZ5 (SEQ ID NO:12), respectivamente. La expresión «proteína P» puede designar una proteína P entera, una proteína P truncada o un fragmento de la proteína P. 20
[0020] La proteína P de los Paramyxoviridae forma homo-oligómeros, en concreto homo-tetrámeros, por ejemplo en el virus de Sendai o el RSV. En cuanto al RSV, se ha cartografiado un dominio de la proteína P capaz de oligomerizarse (oligomerización P-P) a nivel de los aminoácidos 120 a 150 de esta proteína (Castagné et al., 2004; Journal of General Virology; 85: 1643-1653). Así, por ejemplo, el fragmento formado por los aminoácidos 161 a 241 25 de la proteína P del RSV no forma oligómeros. El dominio de oligomerización de la proteína P del virus de Sendai ha sido descrito por Tarbouriech et al. (2000; Nature Structural Biology; 7, 777-781) como estando constituido por los residuos 320 a 446 de la proteína P. Por otro lado, la región de oligomerización P se ha identificado a nivel de los aminoácidos 304-376 para la proteína P del virus del sarampión (Johansson et al., 2003; Journal of Biological Chemistry; 278, p 44567-44573). 30
[0021] Las secuencias de las proteínas P y N descritas anteriormente tienen un carácter ilustrativo, y son susceptibles de presentar variaciones en función de la cepa particular considerada para un virus determinado. Así, las posiciones de los aminoácidos mencionados a continuación en la demanda se indican en relación a estas secuencias de referencia. El experto en la materia puede identificar los dominios correspondientes en otras cepas de 35 virus diferentes a las ejemplificadas, en concreto con ayuda de alineamientos de secuencia realizados con programas como Clustalw, por ejemplo.
[0022] Las secuencias codificantes de estas proteínas N y P de virus de la familia de los Paramyxoviridae también son conocidas para el experto en la materia. 40
[0023] «Proteína marcador», también llamada «proteine tag», designa una proteína que se utiliza en fusión con una proteína de interés para facilitar la purificación. Las proteínas marcador son conocidas para los expertos en la materia. Algunos ejemplos de proteínas marcador son la glutatión-S-transferasa (GST) o los marcadores que son secuencias que contienen generalmente un encadenamiento de 4 a 10 residuos de histidina. 45
[0024] Una «proteína de interés» designa una proteína, un polipéptido o un péptido (uno u otro término se emplean indiferentemente) cualquiera, como por ejemplo, una proteína marcador o una proteína de interés terapéutico o vacunal.
50
[0025] Una proteína de interés puede ser por ejemplo la proteína GFP («Green Fluorescent Protein»), codificada por el gen indicador gfp.
[0026] Una proteína de interés terapéutico puede, por ejemplo, ser un polipéptido antiangiogénico, por ejemplo RGD o una secuencia que incluya RGD, endostatina o un polipéptido proapoptótico como la «apoptosis 55 inducing factor» (AIF), que pueden utilizarse como agentes anticancerígenos, un polipéptido capaz de interactuar específicamente con proteínas víricas e interferir con los mecanismos que permiten la replicación de un virus, o una toxina.
[0027] La proteína de interés heteróloga puede ser un antígeno, en concreto, una proteína antigénica de 60 interés vacunal. Por «antígeno» o «Ag» se entiende una secuencia de naturaleza peptídica o glicopeptídica susceptible de inducir una respuesta inmunitaria en un anfitrión al que se le ha administrado. Así, un antígeno puede
ser una proteína o una parte de proteína (polipéptido) o incluso un pequeño péptido que corresponda potencialmente a un epítopo.
[0028] Un «epítopo» es la parte de un antígeno reconocida por un anticuerpo o un receptor linfocitario. Un epítopo (linear) está formado generalmente por una secuencia de 7 a 15 aminoácidos. Un antígeno en el sentido de 5 la invención puede estar formado por un epítopo, contener un epítopo o ser una proteína antigénica.
[0029] Preferentemente, el antígeno es un antígeno derivado de un microorganismo patógeno, como un virus, una bacteria, un hongo o un organismo metazoico o protozoico parásito.
10
[0030] Algunos ejemplos de virus incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), de la hepatitis B (HBV), de la hepatitis C (HCV), del herpes (Herpes simplex), de la gripe (o de la gripe aviar), del Nilo Occidental, de la fiebre amarilla, el citomegalovirus, el papilomavirus, (HPV), el virus de Epstein-Barr (EBV), el RSV, el virus del Dengue y el virus chikungunya.
15
[0031] Algunos ejemplos de parásitos incluyen los parásitos responsables de la malaria (Plasmodium, en particular P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae), y de la tripanosomiasis (en concreto, enfermedad el sueño (T. brucei) y enfermedad de Chagas (T. cruzi)).
[0032] El patógeno también puede ser un hongo como el Candida albicans, responsable de la candidosis. 20
[0033] Las bacterias pueden ser, por ejemplo, Helicobacter pylori, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, o Mycobacterium bovis.
[0034] Por ejemplo, un antígeno puede ser la GFP, una glicoproteína vírica como la proteína de fusión (F) del 25 RSV, la hemaglutinina del virus de la gripe, o la proteína gp120 del HIV, un toxoide bacteriano como el toxoide tetánico, o un epítopo de estos.
Proteínas de fusión proteína N-proteína de interés y su preparación
30
[0035] La solicitud describe una proteína de fusión proteína N-proteína de interés, que contiene una proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae y una proteína de interés fusionada en fase, en C-terminal de la proteína N.
[0036] En el contexto de la presente invención, la proteína de interés está fusionada específicamente en C-35 terminal de la proteína N. Esta construcción permite que la proteína N se incorpore en estructuras de anillos de 10 nm de diámetro aproximadamente cuando se usa en un procedimiento de producción de la proteína como el que se describe más adelante.
[0037] Dicho virus de la familia de los Paramyxoviridae puede ser un Paramyxovirinae o un Pneumovirinae. 40 En concreto, el virus puede seleccionarse en el grupo formado por el virus de las paperas, el virus del sarampión, el Metapneumovirus humano, y el virus paragripal. Preferentemente, el virus es un Pneumovirus, en concreto, el virus respiratorio sincicial (RSV), humano o bovino.
[0038] La proteína N presente en la proteína de fusión aquí descrita generalmente tiene la secuencia de 45 aminoácidos de una proteína N nativa, es decir, naturalmente presente en un virus Paramyxoviridae.
[0039] Sin embargo, por necesidades de expresión de la proteína de fusión, se pueden realizar modificaciones de secuencia a nivel del extremo C-terminal de la proteína N, a condición de que la proteína N conserve su capacidad de interactuar con la proteína P. En concreto, una proteína N nativa de un virus 50 Paramyxoviridae puede haber sido modificada en la región definida por los 25, preferentemente los 20, 15, 10 o 5, últimos aminoácidos C-terminales.
[0040] Estas modificaciones consisten típicamente en una supresión, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos (por ejemplo de 1 a 25, o 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o incluso 1 a 5 aminoácidos contiguos o no) en la 55 secuencia C-terminal de la proteína N.
[0041] Un ejemplo de modificación de secuencia de la proteína N puede consistir en una supresión de los 6 o 12 aminoácidos C-terminales, dichas proteínas N truncadas (NΔ6C y NΔ12C) siguen siendo todavía capaces de interactuar con la proteína P. 60
[0042] La proteína de interés puede ser una proteína marcador, una proteína de interés terapéutico o de
interés vacunal, sin limitarse a estos tipos. Preferentemente, la proteína de interés es una proteína antigénica.
[0043] Además, la proteína de interés puede ser una proteína de fusión. Por ejemplo, puede tratarse de una construcción que contenga la GFP fusionada en fase, a su extremo C-terminal, con una proteína de interés, en la que la GFP esté fusionada a su vez en fase C-terminal de la proteína N (es decir, una proteína de fusión proteína N-5 GFP-proteína de interés).
[0044] Preferentemente, la construcción N-GFP-proteína de interés puede incluir una secuencia de unión entre las proteínas N y GFP con la secuencia KLRILQSTVPSERPQASGVYMGNLTTRGPVAT (SEQ ID NO: 32) lo que permite una optimización del rendimiento de producción de la proteína de fusión N-GFP (ver ejemplo 6) y por 10 tanto de la proteína de fusión N-GFP-proteína de interés.
[0045] La proteína de interés puede ser en concreto una proteína de fusión GFP-proteína antigénica o GFP-proteína de interés terapéutico. También puede tratarse igualmente de una proteína quimera que contenga una «secuencia de unión» fusionada con la proteína de interés. La secuencia de unión es un polipéptido que contiene 15 típicamente hasta 30 aminoácidos, preferentemente hasta 20 aminoácidos, más preferentemente aún hasta 10 aminoácidos, y que tiene una función de espaciador entre la proteína N y la proteína de interés, lo que permite que cada una de esas proteínas se multiplique correctamente.
[0046] Así, según un modo de realización, la proteína de interés es un antígeno y la proteína de fusión según 20 la invención es una fusión proteína N-antígeno («N-Ag»). Preferentemente, se trata de una proteína de fusión de la proteína N del RSV humano o bovino con una proteína antigénica.
[0047] Como se ha descrito aquí, la proteína de interés puede ser una proteína de interés terapéutico y la proteína de fusión descrita aquí puede ser una fusión proteína N-proteína de interés terapéutico. Preferentemente, 25 se trata de una proteína de fusión de la proteína N del RSV humano o bovino con una proteína de interés terapéutico.
[0048] Ventajosamente, se puede fusionar un marcador (como un marcador histidina) al extremo N-terminal de la proteína N de forma que facilite la purificación de las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés. 30
[0049] Alternativamente, la purificación de las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés puede realizarse coexpresando dicha proteína de fusión con una proteína P del virus Paramyxoviridae, en concreto una proteína P fusionada con la GST, como se explicará más adelante.
35
[0050] Para producir las proteínas de fusión según la invención se puede usar cualquier técnica convencional de biología molecular, de microbiología o de ADN recombinado. Dichas técnicas están al alcance del experto en la materia, y aparecen descritas en concreto en Sambrook, Fritsch&Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York («Sambrook et al., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis 40 (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994).
45
[0051] La solicitud describe asimismo los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión proteína N-proteína de interés mencionada anteriormente.
[0052] Una «secuencia codificadora» indica una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, da como resultado la producción de un ARN, de un polipéptido, de una proteína, etc. Una secuencia codificadora de una 50 proteína contiene generalmente un codón iniciador (ATG) y un codón finalizador.
[0053] «Expresar» o «expresión» significa permitir o conseguir que se manifieste la información contenida en un gen o una secuencia de ADN, por ejemplo, produciendo una proteína por activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y la traducción de la secuencia genética o de ADN correspondiente. Se habla de 55 «coexpresión» cuando la información contenida en dos genes o secuencias de ADN está expresada en una misma célula anfitriona celular.
[0054] La solicitud describe por tanto ácidos nucleicos (ADNc, ADN genómico, sintético, o ARN) que codifican las proteínas de fusión proteína de N-proteína de interés. El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario 60 (es decir una hebra codificante o no codificante). Los ácidos nucleicos no se limitan a la secuencia que codifica la proteína de fusión y pueden incluir secuencias codificantes o no codificantes antes o después de la secuencia que
codifica la proteína de fusión.
[0055] La secuencia codificante de la proteína de fusión aquí descrita es una secuencia híbrida o quimera que contenga al menos dos partes, consecutivamente en el sentido 5’-3’, una parte que codifica la proteína N y una parte del lado 3’ que codifica la proteína de interés. Cuando la proteína de interés es a su vez una fusión o cuando 5 un marcador está unido a la proteína N, la secuencia codificante contiene el número adecuado de partes. Entre cada una de las partes, los codones pueden codificar una secuencia de unión.
[0056] La solicitud describe asimismo los vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión proteína N-proteína de interés. Dichos vectores pueden contener un elemento 10 regulador de la transcripción funcionalmente unido con el ADN.
[0057] Una secuencia codificante está «funcionalmente unida con» secuencias de control de transcripción y de traducción cuando un ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARN, en concreto en ARNm, que después se puede cortar y empalmar si contiene intrones, y se traduce en la proteína codificada por la secuencia 15 codificante.
[0058] Las expresiones «vector», «vector de clonación» y «vector de expresión» designan el vehículo por el cual una secuencia de ADN o de ARN (por ejemplo un gen heterólogo) puede introducirse en una célula anfitriona de forma que transforme la célula anfitriona y facilite la expresión de la secuencia introducida. Algunos ejemplos de 20 vectores incluyen los plásmidos, los fagos, los virus. Los vectores más comunes son los plásmidos, que son unidades de multiplicación autónomas, en general de origen bacteriano, y que pueden tener forma de ADN bicatenario. Los plásmidos pueden integrar fácilmente una secuencia de ADN exógena, que entonces puede introducirse fácilmente en un anfitrión apropiado. Un vector plasmídico contiene generalmente una secuencia de ADN codificante, una secuencia de ADN promotora y presenta una o varias secuencias de restricción que permiten 25 introducir un ADN exógeno. Algunos ejemplos no limitativos de plásmidos incluyen los plásmidos pKK (Clonetech), pUC y pET (Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), o pGEX-4T-3 (Pharmacia).
[0059] Asimismo, se describen células anfitrionas que contienen los vectores de expresión. Estas células 30 anfitrionas se «transforman» con dichos vectores.
[0060] Por «célula anfitriona» se entiende cualquier célula que se seleccione, modifique, cultive o manipule, para la producción de una sustancia a través de la célula, por ejemplo la expresión a través de la célula de un gen, de una secuencia de ADN o de ARN, de una proteína o de una enzima. 35
[0061] Un «sistema de expresión» designa una célula anfitriona y un vector compatible utilizados en condiciones apropiadas para producir una proteína codificada por un ADN exógeno transportado por el vector e introducido en la célula anfitriona. Los sistemas de expresión habituales incluyen células anfitrionas E. coli y vectores plasmídicos, células de insecto y vectores Baculovirus o incluso células de mamífero y vectores con activadores 40 fuertes de origen vírico (por ejemplo citomegalovirus).
[0062] Ventajosamente, el sistema de expresión que se describe aquí es un sistema de expresión bacteriano, en particular en el E. coli, con un vector pGEX-4T-3, por ejemplo. Los sistemas bacterianos son sistemas de expresión que permiten generalmente obtener los rendimientos de producción más elevados. 45
[0063] Por tanto, la solicitud describe igualmente un procedimiento de producción de una proteína de fusión proteína N-proteína de interés como la que se ha definido más arriba que consiste, eventualmente, en la transformación de una célula anfitriona y a continuación del cultivo de la célula anfitriona transformada con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión proteína N-proteína de interés en condiciones que 50 permiten la expresión de proteínas de fusión proteína N-proteína de interés, y eventualmente, la purificación de las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés expresadas. Las condiciones de cultivo dependen del sistema de expresión elegido, (es decir, célula anfitriona y vector) y la determinación de dichas condiciones está al alcance del experto en la materia.
55
[0064] Procedimiento de preparación del complejo proteína N-proteína de interés/proteína P Los Inventores han demostrado anteriormente que la proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae puede producirse en un sistema de coexpresión con la proteína P del mismo virus de la familia de los Paramyxoviridae. Este mismo sistema puede utilizarse para expresar la proteína de fusión proteína N-proteína de interés en forma de un complejo con la proteína P, y después, eventualmente, purificar la proteína de fusión a partir de este complejo. 60
[0065] La solicitud describe un procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína de
interés/proteína P, las proteínas N y P son proteínas de un virus de la familia de los Paramyxoviridae, dicho procedimiento consta de los siguientes pasos:
a) coexpresar una proteína de fusión proteína N de un virus de la familia Paramyxoviridae-proteína de interés, en la que la proteína de interés está fusionada en fase al extremo C-terminal de la proteína N, con una proteína P del 5 mismo virus de la familia Paramyxoviridae;
b) recoger los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P que se formen de este modo.
[0066] Como se ha especificado anteriormente, la proteína N puede llevar, en su extremo N-terminal un marcador como un marcador histidina. Además, la proteína de interés puede ser a su vez una construcción de 10 fusión.
[0067] Además, como se ha descrito más arriba, la proteína N puede ser una proteína N nativa, o, haber sido modificada en la región definida por los 25, preferentemente los 20, 15, 10 o 5 últimos aminoácidos C-terminales, a condición de que la proteína N modificada conserve la capacidad de interactuar con la proteína P. Estas 15 modificaciones consisten típicamente en una supresión, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos (por ejemplo de 1 a 25, o 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o incluso 1 a 5 aminoácidos contiguos o no) en la secuencia C-terminal de la proteína N. Un ejemplo de modificación de secuencia de la proteína N puede consistir en una supresión de los 6 o 12 aminoácidos C-terminales, donde dichas proteínas N truncadas (NΔ6C y NΔ12C) siguen siendo capaces de interactuar con la proteína P. 20
[0068] Preferentemente, dicha proteína P es una proteína P truncada («PΔ») que no contiene el dominio de oligomerización P y que presenta un dominio de unión con la proteína N. Los Inventores han demostrado anteriormente que esta forma de realización permitía expresar una gran cantidad de complejos N-P en forma soluble (solicitud de patente FR 2885139). La solubilidad se determina por centrifugado durante 30 minutos a 10 000 x g en 25 un medio acuoso, sin detergentes, por ejemplo, una solución salina como PBS 1X (NaCl 140 mM, KCI 27 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1,5 mM, pH 7,4) o una solución amortiguadora Tris 10 mM pH 7,4, 150 mM NaCl.
[0069] La expresión «proteína P truncada» designa una proteína P en la que una o varias secuencias de aminoácidos contiguos se han suprimido. Se puede tratar del truncamiento de una secuencia C-terminal, de una 30 secuencia N-terminal, de una secuencia «interna» respecto de la estructura primaria de la proteína P, o de una combinación de esos truncamientos.
[0070] La invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial (RSV), dicho procedimiento 35 consta de los siguientes pasos:
a) coexpresar una proteína de fusión proteína N de un virus respiratorio sincicial -proteína de interés, con una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial, en la que la proteína de interés N se fusiona en fase al extremo C-terminal de la proteína N, donde la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la 40 región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, y donde la proteína P truncada no contiene el dominio de oligomerización y contiene un dominio de unión a la proteína N;
b) recoger los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P que se formen de este modo.
45
[0071] Las proteínas P truncadas según la invención no contienen el dominio de oligomerización P y son capaces de interactuar con la proteína N, es decir, que presentan un dominio de unión a la proteína N. Como el dominio de interacción de la proteína P de los Paramyxoviridae con la proteína N se ha cartografiado en el extremo C-terminal, algunos ejemplos de proteína P truncada incluyen preferentemente un fragmento C-terminal de la proteína P, o una proteína P «quimera» formada por la fusión de un fragmento C-terminal de la proteína P (capaz de 50 interactuar con la proteína N) con al menos otra secuencia de aminoácidos contiguos de la proteína P. Este fragmento C-terminal y esta otra secuencia de la proteína P no son naturalmente contiguos, y no presentan ensamblaje de secuencia entre ellos. Por ejemplo, una proteína P truncada del RSV puede tener la secuencia formada por los aminoácidos 1 a 121 y 161 a 241 de la proteína P nativa. Un «fragmento» de un polipéptido de referencia designa cualquier secuencia de aminoácidos contiguos que se encuentren en la secuencia del polipéptido 55 de referencia.
[0072] Por «fragmento C-terminal de la proteína P» o «PΔN» se entiende una proteína P en la que uno o varios aminoácidos consecutivos se han suprimido a partir del extremo N-terminal. Preferentemente, un fragmento C-terminal de la proteína P designa un encadenamiento de aminoácidos posicionados en la mitad C-terminal de la 60 estructura primaria de la proteína P (cuando el número de aminoácidos de la secuencia es impar, se puede atribuir arbitrariamente un aminoácido adicional a la mitad C-terminal de la proteína respecto de la mitad N-terminal). Por
ejemplo, en la proteína P del RSV que contiene 241 aminoácidos, PΔ161N designa un fragmento C-terminal constituido por los aminoácidos 161 a 241 de la proteína P. Asimismo, por ejemplo, en la proteína P del virus del sarampión (cepa Edmonston B) que contiene 507 aminoácidos, PΔ386N designa un fragmento C-terminal formado por los aminoácidos 386 a 507 de la proteína P.
5
[0073] Cuando la proteína P truncada es un fragmento C-terminal de la proteína P, se describe un procedimiento de preparación de un complejo soluble proteína N-proteína de interés/fragmento C-terminal de la proteína P («complejo NPI/PΔN») de un virus de la familia de losParamyxoviridae, dicho procedimiento consta de los siguientes pasos:
10
a) coexpresar una proteína N de un virus de la familia Paramyxoviridae, fusionada en fase a su extremo C-terminal con una proteína de interés, con un fragmento C-terminal de la proteína P del mismo virus de la familia de los Paramyxoviridae, dicho fragmento C-terminal de la proteína P no contiene el dominio de oligomerización P y es capaz de interactuar con la proteína de fusión N-proteína de interés;
b) recoger los complejos solubles N-PI/PΔN que se formen de este modo. 15
[0074] Dicho virus de la familia de los Paramyxoviridae puede ser un Paramyxovirinae o un Pneumovirinae. En concreto, el virus puede seleccionarse dentro del grupo formado por el virus de las paperas, el virus del sarampión, el Metapneumovirus humano, el virus paragripal y el virus respiratorio sincicial. Preferentemente, el virus es un Pneumovirus, como el virus respiratorio sincicial (RSV), humano o bovino. Según la invención, el virus es un 20 virus respiratorio sincicial (RSV), humano o bovino.
[0075] El experto en la materia conoce o es capaz de determinar las proteínas P truncadas, o más concretamente los fragmentos C-terminales de la proteína P, que son capaces de interactuar con la proteína de fusión antígeno-proteína N. 25
[0076] Por ejemplo, la estrategia de coexpresión de las proteínas N y P en el E. coli descrita por Castagné et al. (2004, Journal of General Virology; 85: 1643-1653) se puede utilizar para cartografiar el dominio de interacción entre P y N. Los Inventores han demostrado así que los fragmentos C-terminales de la proteína P del RSV que contienen un oligopéptido formado por los 9 aminoácidos C-terminales de la proteína P (aminoácidos 233 a 241), 30 son capaces de interactuar con la proteína N.
[0077] Por otro lado se ha descrito, por ejemplo, que el dominio de interacción de la proteína P del virus de Sendai, con la proteína N en forma de complejo ARN-N o ribonucleoproteína (RNP), llamado «X-domain» o XD está definido por los aminoácidos 473 a 568 (Kolakofsky et al., 2004; Virology; 318(2):463-73). 35
[0078] Los Inventores han demostrado, asimismo, que ciertos fragmentos C-terminales de la proteína P del RSV, en concreto el fragmento PΔ161N (aminoácidos 161 a 241), permitían preparar grandes cantidades de proteína N, comparativamente con la proteína P entera que, en la práctica, no permite obtener rendimientos suficientes a escala industrial. Los mutantes de eliminación más pequeños, hasta PΔ233N (aminoácidos 233 a 241) 40 que no contienen más de 9 aminoácidos, permiten obtener rendimientos comparables a los de PΔ161 N.
[0079] Estos fragmentos más pequeños que PΔ161N corresponden a fragmentos de la proteína del RSV capaces de interactuar con la proteína N y que ya no tienen capacidad de oligomerización, y por tanto, ya no contienen el dominio de oligomerización P. El dominio mínimo de oligomerización P del RSV se define por los 45 aminoácidos 120 a 150 de la proteína P.
[0080] Esta misma estrategia ha permitido a los inventores demostrar que un fragmento C-terminal de la proteína P del virus del sarampión, formado por los residuos de aminoácidos 386-507 (PΔ386N), interactuaba con la proteína N de dicho virus y permitía su purificación. Sin embargo, una eliminación de la parte N-terminal de la 50 proteína P, hasta el residuo 456 (incluido; fragmento PΔ457N), no permite purificar la proteína N. La estructura de la región C-terminal de la proteína P que interactúa con la ribonucleocápside ha sido determinada por Johansson et al. (2003 Journal of Biological Chemistry vol. 278 p 44567-44573). La región de oligomerización P ha sido determinada por eliminación y predicción como está definida por los aminoácidos 304-376.
55
[0081] El uso de fragmentos C-terminales de la proteína P que contienen el dominio de interacción con la proteína N en forma de RNP pero en los que el dominio de oligomerización P se ha eliminado permite por tanto la interacción de los fragmentos de la proteína P con la proteína N, la formación de complejos solubles N-PΔN, y la producción de estos complejos con un rendimiento elevado. Sin querer limitarse a un mecanismo particular, se supone que la ausencia del dominio de oligomerización P evita problemas de insolubilidad de los complejos N-ΔPN 60 vinculados a las interacciones entre las proteína P de esos complejos.
[0082] Así, como se ha descrito aquí, el procedimiento de preparación del complejo N-PI-PΔN implica la expresión de un fragmento C-terminal de la proteína P del RSV que comprende los 9 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína P del RSV y que está desprovisto al menos de los 119, preferentemente, de los 149, y más preferentemente todavía de los 160 aminoácidos N-terminales de la proteína P del RSV.
5
[0083] Más específicamente, en el procedimiento descrito se puede coexpresar con la proteína de fusión proteína N-proteína de interés del RSV:
a) un fragmento C-terminal de la proteína P del RSV que presenta la secuencia de aminoácidos 233 a 241 de la proteína P del RSV humano cepa LONG como se ha mostrado en la SEQ ID NO: 1, y que se extiende en dirección 10 N-terminal hasta un residuo de aminoácido comprendido entre las posiciones 233 y 120, preferentemente 150, más preferentemente todavía 161, de la secuencia de la proteína P del RSV como se muestra en SEQ ID NO: 1, o
b) un fragmento C-terminal, homólogo del fragmento definido en a), de una proteína P derivada de otra cepa del RSV humano o de una cepa del RSV bovino.
15
[0084] El fragmento C-terminal de la proteína P del RSV puede, por ejemplo, seleccionarse dentro del grupo constituido por PΔ120N (aminoácidos 120 a 241 de P), PΔ150N (aminoácidos 150 a 241 de P), PΔ161N (aminoácidos 161 a 241 de P), PΔ180N (aminoácidos 180 a 241 de P), PΔ200N (aminoácidos 200 a 241 de P), PΔ220N (aminoácidos 220 a 241 de P), PΔ230N (aminoácidos 230 a 241 de P) y PΔ233N (aminoácidos 233 a 241 de P). 20
[0085] La descripción se refiere igualmente a un procedimiento en el que se coexpresa, con la proteína de fusión proteína N-proteína de interés del RSV, una proteína P truncada que contiene un fragmento C-terminal de la proteína P del RSV como se ha descrito anteriormente, que contiene los 9 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína del RSV y que está desprovisto al menos de los 119, preferentemente de los 149, más preferentemente 25 todavía de los 160 aminoácidos N-terminales de la proteína P del RSV.
[0086] Por ejemplo, la proteína P truncada que consta de un fragmento C-terminal de la proteína P puede estar formada por la fusión de los 122 últimos aminoácidos N-terminales con los 80 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína P del RSV; por ejemplo, puede estar formada por el encadenamiento de los aminoácidos 1 30 a 121 y 161 a 241 de la proteína P del RSV humano cepa LONG como se ha mostrado en la SEQ ID NO: 7.
[0087] Como se ha descrito aquí, el Paramyxoviridae puede ser el virus del sarampión, y el procedimiento de preparación del complejo N-PI-PΔN puede implicar la expresión de un fragmento C-terminal de la proteína P del virus del sarampión que contenga como máximo los 122 últimos aminoácidos C-terminales de la proteína P o que 35 esté constituido por estos. En concreto, puede tratarse de un fragmento C-terminal constituido por los ácidos 386 a 507 de la proteína P (PΔ386N) del virus del sarampión cepa Edmonston B, como se muestra en la SEQ ID NO: 10, o de un fragmento C-terminal, homólogo al definido para la proteína P de la cepa Edmonston, de una proteína P salida de otra cepa del virus del sarampión.
40
[0088] En el contexto de la invención, el término «homólogo» se refiere a la relación existente entre proteínas que poseen un mismo origen evolutivo, por ejemplo, proteínas homólogas que pertenezcan a diferentes especies, o en el caso de los virus, cepas víricas. Dichas proteínas (y sus genes codificantes), presentan homologías de secuencia, reflejadas por la similitud de secuencias, ya sea en términos de porcentaje o de similitud o en términos de presencia de residuos o de motivos específicos a nivel de posiciones conservadas. 45
[0089] La expresión «similitud de secuencias» designa el grado de semejanza entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de proteínas que pueden compartir o no un mismo origen evolutivo. Habitualmente, se utilizan indistintamente los términos homología o similitud. Dos secuencias de aminoácidos son «esencialmente homólogas» cuando sus aminoácidos son idénticos en al menos un 80 %, o similares (es decir, funcionalmente 50 idénticos) en al menos un 90 %. Se pueden identificar secuencias similares u homólogas por alineación, utilizando por ejemplo los programa BLAST o FASTA.
[0090] Como se ha descrito aquí, la proteína P, por ejemplo la proteína P truncada y en concreto el fragmento C-terminal de la proteína P, puede expresarse en forma de fusión con una proteína que facilite la 55 purificación de los complejos N-proteína de interés/proteína P, en concreto, una proteína utilizable en cromatografía de afinidad. Puede tratarse de una proteína marcador como la glutatión-S-transferasa (GST), en cuyo caso la proteína de fusión proteína P-GST puede ser aislada por cromatografía sobre un soporte sólido acoplado a la glutatión. Se pueden utilizar otros marcadores o «Tag» como la polihistidina o «His-Tag».
60
[0091] Ventajosamente, según el procedimiento de preparación de la invención, la proteína P truncada se expresa en forma de fusión con una proteína que facilite la purificación de los complejos N-proteína de
interés/proteína P.
[0092] Así se obtienen complejos de proteína N-proteína de interés/proteína P-proteína marcador (GST u otra proteína marcador en fusión con la proteína P), en los que la proteína marcador puede eliminarse por descomposición enzimática. Por ejemplo, la GST se puede eliminar por descomposición con trombina o con 5 cualquier otra enzima apropiada cuando la fusión contiene una proteína diferente a la GST.
[0093] A continuación se describen ejemplos específicos de construcción de vectores que permiten utilizar el procedimiento según la invención.
10
[0094] Según un modelo descrito aquí, la proteína de interés es un antígeno y el procedimiento según la invención conduce a la formación de complejos solubles proteína N-antígeno/proteína P (complejo N-Ag/P), preferentemente proteína N-antígeno/proteína P truncada (complejo N-Ag/PΔ) y más preferentemente aún proteína N-antígeno/fragmento C-terminal de la proteína P (NAg/PΔN).
15
Separación de las proteína de fusión a partir de complejos proteína N-proteína de interés/proteína P
[0095] El procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, en el que la proteína P puede estar truncada y ser en concreto un fragmento C-terminal de la proteína P, como se ha descrito anteriormente, permite obtener fácilmente complejos de proteína N-proteína de interés/proteína P en forma aislada o 20 purificada.
[0096] La demanda describe igualmente un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, en el que las proteínas N y P son proteínas de un virus de la familia Paramyxoviridae, susceptibles de ser obtenidas por un procedimiento de preparación como el que se ha descrito más arriba. 25
[0097] La invención se refiere a un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P en forma de anillos solubles que contienen la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial, en el que la proteína de interés se fusiona en fase al extremo C-terminal de la proteína N, donde la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por 30 los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, y la proteína P es una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial que no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de unión a la proteína N. En un modo concreto, la proteína de interés del complejo según la invención es una proteína marcador, o una proteína de interés vacunal. La proteína de interés vacunal puede ser un antígeno derivado de un microorganismo patógeno. En una variante, la proteína de interés es 35 una construcción que contiene la GFP (Green Fluorescent Protein) fusionada en fase, en su extremo C-terminal, con una proteína vacunal.
[0098] En concreto, la invención se refiere a un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P como el que se ha descrito anteriormente, en el que la proteína de fusión proteína N-proteína de interés es una proteína de 40 fusión N-GFP-proteína de interés que contiene la GFP (Green Fluorescent Protein) fusionada en fase al extremo C-terminal de la proteína N, que incluye una secuencia de unión entre las proteína N y GFP que tiene la secuencia SED ID NO: 32.
[0099] En concreto, se describe un complejo soluble proteína N-proteína de interés/proteína P truncada 45 (complejo NPI/PΔ), y más específicamente un complejo soluble proteína N-proteína de interés/fragmento C-terminal de la proteína P (complejo NPI/PΔN), donde las proteínas N y P son proteínas de un virus de la familia de los Paramyxoviridae.
[0100] A partir de estos complejos proteína N-proteína de interés/proteína P, o más específicamente N-PI/PΔ 50 o N-PI/PΔN, la proteína de fusión proteína N-proteína de interés puede aislarse fácilmente en forma de anillos, con su ARN, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño (gel filtration). Esta separación puede llevarse a cabo, en su caso, después de la separación, por descomposición enzimática de la proteína P y de la proteína marcador a la que la proteína P se fusiona eventualmente.
55
[0101] Además, se describe un procedimiento de preparación de proteínas de fusión N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae - proteína de interés, dicho procedimiento consta de los siguientes pasos:
a) preparar un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P por un procedimiento como el que se ha definido más arriba; y 60
b) separar las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés de los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P.
[0102] Por tanto, la invención se refiere además a un procedimiento de preparación de una proteína N de un virus respiratorio sincicial, fusionado en fase a su extremo C-terminal con una proteína de interés, dicho procedimiento consiste en la separación de la proteína de fusión proteína N-proteína de interés a partir del complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la invención. 5
[0103] La proteína P es una proteína truncada, preferentemente un fragmento C-terminal de la proteína P.
[0104] Más concretamente se describe un procedimiento de preparación de proteínas de fusión solubles proteína N-proteína de interés de un virus de la familia de los Paramyxoviridae, dicho procedimiento consta de los 10 siguientes pasos:
a) preparar un complejo soluble proteína N-proteína de interés/fragmento C-terminal de la proteína P (complejo NPI/PΔN) por un procedimiento como el que se ha definido más arriba; y
b) separar las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés de los complejos solubles N-PI/PΔN. 15
[0105] Como se ha descrito más arriba, la proteína N puede ser una proteína N nativa, o, haber sido modificada en la región definida por los 25, preferentemente los 20, 15, 10 o 5 últimos aminoácidos C-terminales, a condición de que la proteína N modificada conserve la capacidad de interactuar con la proteína P. Estas modificaciones consisten típicamente en una supresión, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos (por 20 ejemplo de 1 a 25, o 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o incluso 1 a 5 aminoácidos contiguos o no) en la secuencia C-terminal de la proteína N. Un ejemplo de modificación de secuencia de la proteína N puede consistir en una supresión de los 6 o 12 aminoácidos C-terminales, dichas proteínas truncadas (NΔ6C y NΔ12C) siguen siendo todavía capaces de interactuar con la proteína P.
25
[0106] Se describen igualmente las proteínas de fusión proteína N-proteína de interés susceptibles de ser obtenidas por el procedimiento anterior.
[0107] La invención se refiere a una proteína de fusión proteína N-proteína de interés aislada, estructurada en anillos solubles formada por la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, que puede 30 obtenerse por el procedimiento de preparación de una proteína N de un virus respiratorio sincicial según la invención, donde la proteína N es una proteína N de un virus respiratorio sincicial nativa o modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, y la proteína de interés se fusiona en fase, en C-terminal de la proteína N.
35
[0108] La proteína de interés puede ser una proteína de interés terapéutico o vacunal. Preferentemente, la proteína de interés es un antígeno.
Composiciones inmunógenas, vacunales o terapéuticas
40
[0109] Anteriormente, los Inventores han mostrado que la proteína N del RSV estructurada en anillos, aislada o en forma de complejo proteína N-fragmento C-terminal de la proteína P (N-PΔN), es altamente inmunógena, y que permite, en concreto, estimular una respuesta local, por ejemplo, a nivel de la mucosa respiratoria.
[0110] Ahora, los Inventores han demostrado que estas estructuras en anillos pueden utilizarse como vector 45 de proteínas terapéuticas o vacunales.
[0111] El uso de una proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae como vector de moléculas o proteínas de interés terapéutico o vacunal está descrito.
50
[0112] Como se describe aquí, una proteína terapéutica o vacunal se fusiona con la proteína N, como se ha descrito más arriba.
[0113] Como se describe aquí, una molécula terapéutica o vacunal puede acoplarse químicamente a la proteína N. Así, añadiendo una cisteína a C-terminal de la proteína N, se crea una secuencia que permite acoplar 55 químicamente diversas moléculas de naturaleza proteínica o no proteínica (orgánica o mineral). Se puede injertar una proteína que también transporte una cisteína por puente disulfuro. De este modo, la maleimida acoplada a diversas moléculas injertarse en esta cisteína por unión covalente. La maleimida puede acoplarse a cualquier tipo de molécula orgánica, como el dextrón, la biotina, el oro o cualquier proteína.
60
[0114] Por ello, también se describe un conjugado de la proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae con una molécula de interés, en concreto una molécula terapéutica o vacunal.
[0115] Asimismo se ha descrito un procedimiento de administración de una molécula o proteína terapéutica o vacunal a un sujeto, que consta de la administración de dicha molécula terapéutica o vacunal unida de forma covalente a una proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae con dicho sujeto, o que conste de la administración de dicha proteína en forma de una proteína de fusión con la proteína N de un virus de la familia de los 5 Paramyxoviridae, estando la proteína terapéutica o vacunal fusionada en fase, en C-terminal de proteína N.
[0116] Igualmente se describe una composición farmacéutica, que contiene una proteína de fusión proteína N-proteína de interés, eventualmente en forma de complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, donde las proteínas N y P son proteínas de un mismo virus de la familia de losParamyxoviridae, en un vehículo 10 farmacéuticamente aceptable.
[0117] La invención propone una composición farmacéutica que presenta una proteína N de un virus respiratorio sincicial fusionado con una proteína de interés según la invención o un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 15
[0118] Dicho virus de la familia de los Paramyxoviridae puede ser un Paramyxovirinae o un Pneumovirinae. En concreto, el virus puede seleccionarse dentro del grupo formado por el virus de las paperas, el virus del sarampión y el virus paragripal. Preferentemente, el virus es un Pneumovirus, en concreto, el virus respiratorio sincicial (RSV), por ejemplo humano o bovino. 20
[0119] La proteína de interés puede ser una proteína de interés terapéutico o vacunal.
[0120] Como se ha descrito aquí, la composición farmacéutica está adaptada a un uso terapéutico. Según este ejemplo ajeno a la invención, la proteína de interés es una proteína de interés terapéutico. Efectivamente, los 25 Inventores han determinado que la proteína de fusión proteína N-proteína de interés penetra en las células y que la proteína N constituye por tanto a estos efectos un vector potencial para las moléculas o proteínas de interés terapéutico, como por ejemplo un polipéptido antiangiogénico o proapoptótico.
[0121] Según un modo de realización, la composición farmacéutica está adaptada a un uso inmunógeno o 30 vacunal. Según este modo de realización, la proteína de interés es una proteína antigénica, preferentemente un antígeno derivado de un microorganismo patógeno, como un virus, una bacteria, un hongo o un organismo metazoico o protozoico parásito.
[0122] Efectivamente, los Inventores han mostrado que la respuesta de un anfitrión ante un antígeno 35 aumenta muy significativamente cuando este antígeno se presenta en forma de proteína de fusión con la proteína N. Las proteínas de fusión proteína N-antígeno son capaces de estimular la respuesta inmunitaria tanto por vía celular o como humoral.
[0123] Las proteínas de fusión solubles proteína N-antígeno pueden utilizarse para la vacunación en forma de 40 complejo con la proteína P sin efecto desfavorable. Consecuentemente, una composición inmunógena o vacunal según la invención puede contener un complejo soluble proteína N-antígeno/proteína P, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0124] Por «vehículo farmacéuticamente aceptable» se entiende cualquier disolvente, medio de dispersión, 45 agentes retardantes de la absorción, etc que no produzca efectos secundarios, por ejemplo, alérgicos en los humanos o animales.
[0125] El experto en la materia conoce ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables. Algunos ejemplos de vehículos líquidos incluyen soluciones acuosas estériles que no contienen ningún otro material más que los 50 activos y agua, o que contienen una solución amortiguadora como el fosfato de sodio con un valor de pH fisiológico, con una salinidad fisiológica, o con los dos como una solución salina amortiguada con fostato (PBS). Los vehículos acuosos pueden contener más de una sal amortiguadora, incluso sales como el cloruro de sodio o potasio, dextrosa, polietilenglicol y otras soluciones.
55
[0126] Las composiciones se administran de forma compatible con la formulación galénica y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que se debe administrar depende del sujeto que se va a tratar, de la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el principio activo, y del grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de proteína de fusión necesarias para la administración dependen de la elección del sanitario y de las particularidades de cada individuo. 60
[0127] Ventajosamente, cuando la composición farmacéutica es una composición inmunógena o vacunal,
puede incluir un adyuvante. Un «adyuvante» designa un producto que aumenta, estimula, activa, refuerza o modula la reacción inmunitaria a nivel celular o humoral dirigida contra un antígeno administrado simultáneamente. Algunos ejemplos de adyuvantes clásicos incluyen adyuvantes que contienen antígenos bacterianos, como el adyuvante completo de Freund, el LPS y sus derivados, las toxinas bacterianas (toxina colérica y enterotoxina) y sus mutantes destoxificados (por ejemplo LT(R192G)), secuencias oligonucleótidas que contienen motivos CpG, adyuvantes 5 minerales como el hidróxido de aluminio (Alum), el fosfato de calcio o el fosfato de potasio, emulsiones aceitosas y agentes emulsionantes (saponinas, por ejemplo QS21), citocinas.
[0128] Las composiciones inmunógenas según la invención permiten inducir una respuesta inmunitaria contra el antígeno en el sujeto vacunado, o más específicamente contra el patógeno del que se deriva el antígeno. 10
[0129] Las composiciones vacunales según la invención permiten conferir una protección ante una infección por un patógeno que contenga el antígeno, es decir, una reducción de la gravedad de los efectos de esa infección respecto de un sujeto no inmunizado con la composición vacunal.
15
[0130] Se describe igualmente el uso de una composición vacunal, como la que se ha definido más arriba, en un procedimiento de vacunación contra el patógeno del que deriva el antígeno.
[0131] La demanda describe igualmente un procedimiento de vacunación que contiene al menos una administración de una composición vacunal a un sujeto. Preferentemente, el procedimiento de vacunación presenta 20 una primera administración a un sujeto de una composición vacunal, y al menos una administración de recuerdo de dicha composición vacunal al mismo sujeto. Las administraciones de recuerdo, que vuelven a exponer al paciente al antígeno, inducen una respuesta inmunitaria secundaria más fuerte.
[0132] La composición vacunal se administra ventajosamente en una cantidad eficaz para inducir una 25 respuesta inmunitaria protectora o terapéutica ante una infección por el patógeno del que deriva el antígeno. Naturalmente, la posología depende del activo considerado, del modo de administración, de la edad del sujeto y de su estado. La cantidad de complejo N-Ag-P, N-Ag-PΔ, o N-Ag-PΔN, o de proteína de fusión N-Ag por dosis puede encontrarse entre 0,1 y 200 μg, y preferentemente entre 10 y 100 μg por dosis vacunal.
30
[0133] La composición farmacéutica, inmunógena o vacunal puede administrarse por cualquier vía, en concreto por vía mucosa (por ejemplo ocular, intranasal u oral), o por vía parenteral (por ejemplo subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal).
[0134] La expresión «sujeto» designa un humano o un animal no humano, por ejemplo un pájaro o un 35 mamífero como un bóvido, un óvido, un roedor, un cánido en concreto un perro, un félido en concreto un gato, un cerdo, un mono expuesto o susceptible de estar expuesto a una infección por un virus Paramyxoviridae o por cualquier otra patología. Preferentemente, el sujeto en el sentido de la invención es un humano o un bóvido.
[0135] Para cada uno de estos aspectos, y como se ha descrito más arriba, la proteína N puede ser una 40 proteína N nativa, o, haber sido modificada en la región definida por los 25, preferentemente los 20, 15, 10 o 5 últimos aminoácidos C-terminales, a condición de que la proteína N modificada conserve la capacidad de interactuar con la proteína P. Estas modificaciones consisten típicamente en una supresión, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos (por ejemplo de 1 a 25, o 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o incluso 1 a 5 aminoácidos contiguos o no) en la secuencia C-terminal de la proteína N. Un ejemplo de modificación de secuencia de la proteína N puede consistir 45 en una supresión de los 6 o 12 aminoácidos C-terminales, dichas proteínas truncadas (NΔ6C y NΔ12C) siguen siendo todavía capaces de interactuar con la proteína P.
Aplicaciones diagnósticas
50
[0136] La fusión de un antígeno que presente al menos un epítopo con la proteína N de un virus de la familia Paramyxoviridae constituye además un reactivo susceptible de ser utilizado en aplicaciones diagnósticas para la detección de anticuerpos dirigidos contra al menos uno de dichos epítopos transportados por la proteína de fusión.
[0137] Se describe un reactivo diagnóstico que contiene una proteína de fusión proteína N-antígeno que 55 contiene un antígeno fusionado en fase C-terminal de una proteína N de un virus de la familia Paramyxoviridae como la que se ha descrito más arriba.
[0138] Por tanto, la invención se refiere además a un reactivo diagnóstico que contiene una proteína de fusión según la invención, en la que la proteína de interés es un antígeno. 60
[0139] Se describe igualmente un equipo diagnóstico que contiene dicho reactivo y los medios de detección
apropiados.
[0140] Dicho antígeno presenta al menos un epítopo, y puede comprender igualmente dos o más de dos epítopos idénticos o diferentes.
5
[0141] También se describe el uso de una proteína de fusión proteína N-antígeno para la detección, in vitro o in vivo, de anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno de la proteína de fusión.
[0142] La invención propone igualmente la utilización de una proteína de fusión según la invención que contiene un antígeno fusionado en fase en C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial para la 10 detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno de la proteína de fusión.
[0143] Cuando el antígeno contiene un único epítopo, los anticuerpos detectados son entonces específicos de dicho epítopo.
15
[0144] Cuando el antígeno contiene dos o más de dos epítopos diferentes, los anticuerpos detectados pueden ser específicos de uno, dos o más de dos epítopos de dicho antígeno.
[0145] Se describe un procedimiento de detección de anticuerpos específicos de un antígeno, en una muestra biológica, que consta de los siguientes pasos: 20
a) poner en contacto dicha muestra biológica con una proteína de fusión N-antígeno que contiene un antígeno fusionado en fase en C-terminal de una proteína N de un virus de la familia de los Paramyxoviridae;
b) detectar los complejos de proteína de fusión N-antígeno/anticuerpo formados,
25
[0146] la presencia de dichos complejos revela la presencia de anticuerpos específicos del antígeno en la muestra biológica
[0147] La invención se refiere a un procedimiento de detección de anticuerpos específicos de un antígeno, en una muestra biológica, que consta de los siguientes pasos: 30
a) poner en contacto dicha muestra biológica con una proteína de fusión según la invención que contiene un antígeno fusionado en fase en C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial;
b) detectar los complejos de proteína de fusión N-antígeno/anticuerpo formados, porque la presencia de dichos complejos revela la presencia de anticuerpos específicos del antígeno en la muestra biológica. 35
[0148] La muestra biológica puede ser una muestra de tejido obtenido por ejemplo por biopsia muscular, hepática, cardíaca, cerebral, etc o una muestra líquida, por ejemplo, un líquido biológico como la sangre, el plasma, o el líquido cefalorraquídeo.
40
[0149] La detección de los complejos puede realizarse por los medios habituales con los que el experto en la materia está muy familiarizado, como la cromatografía (de exclusión por tamaño, de afinidad, etc) o la electroforesis en condiciones no desnaturalizadoras.
[0150] La detección de los complejos N-antígeno/anticuerpos puede facilitarse marcando las proteínas N de 45 forma detectable.
[0151] Para cada uno de estos aspectos, la proteína N puede ser una proteína N nativa, o, haber sido modificada en la región definida por los 25, preferentemente los 20, 15, 10 o 5 últimos aminoácidos C-terminales, a condición de que la proteína N modificada conserve la capacidad de interactuar con la proteína P. Estas 50 modificaciones consisten típicamente en una supresión, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos (por ejemplo de 1 a 25, o 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o incluso 1 a 5 aminoácidos contiguos o no) en la secuencia C-terminal de la proteína N. Un ejemplo de modificación de secuencia de la proteína N puede consistir en una supresión de los 6 o 12 aminoácidos C-terminales, dichas proteínas truncadas (NΔ6C y NΔ12C) siguen siendo todavía capaces de interactuar con la proteína P. 55
[0152] Los ejemplos y figuras siguientes ilustran la invención de forma no limitativa.
FIGURAS
60
[0153]
La figura 1 muestra la captura de los complejos N-GFP-PΔN por células HEp2 o RAW. Las células HEp-2 (A; C) o
RAW (B; D) se incuban en presencia de DX-FITC (A; B) o N-GFP-PΔN (C; D). La incubación dura una hora a 4°C (curvas dibujadas con línea de puntos) o dos horas a 4 ºC (curvas dibujadas con línea continua gruesa), o una hora a 37 ºC (curvas dibujadas con línea continua) o dos horas a 37 ºC (curvas dibujadas con línea de puntos gruesa). La fluorescencia (FITC o GFP) se analiza en citometría de flujo sobre 100 000 eventos.
La figura 2 muestra que los complejos N-GFP-PΔN son interiorizados en las células RAW. Las células RAW se 5 incuban durante una hora en presencia de N-GFP-PΔN a 4°C (curvas dibujadas con línea continua gruesa) o a 37 ºC (curvas dibujadas con línea de puntos). La proteína N es detectada por inmunomarcado indirecto en citometría de flujo en células no permeabilizadas (A) o células permeabilizadas (B). La autofluorescencia de las células viene dada por la señal de las células incubadas a 37 ºC en PBS (curvas dibujadas con línea continua).
La figura 3 muestra el aumento de la respuesta anticuerpo por la vectorización de la GFP en los complejos N-PΔN. 10 Se inmuniza a los ratones BALB/c el D0 por vía nasal, con el adyuvante solo (testigo), el complejo N-GFP-PΔN, N-PΔN o la GFP, siempre en presencia del adyuvante. Se aplica una dosis de recuerdo tras dos semanas (D14). Se realiza una eutanasia a los animales dos semanas después de la dosis de recuerdo (D28). Se recoge el suero el D0, D14 y D28 (A y B). Se realizan lavados broncoalveolares el D28 (C). La valoración de anticuerpos anti N-PΔN (B y C) y anti-GFP (A y C) se determina con ELISA. Los datos se expresan como la media 6 error estándar de la media 15 (n=8 para los grupos testigo y GFP, n=6 para el grupo N-GFP-PΔ, n=4 para el grupo N-PΔ) y se representan según una escala logarítmica.
La figura 4 ilustra la falta de respuesta T memoria ante la GFP, incluso en su forma vectorizada por N-PΔN. Se inmuniza a los ratones BALB/c el D0 por vía nasal, con el adyuvante solo (testigo), el complejo N-GFP-PΔN, N-PΔN o la GFP, siempre en presencia del adyuvante. Se aplica una dosis de recuerdo tras dos semanas (D14). Se realiza 20 una autopsia a los animales dos semanas después de la dosis de recuerdo (D28) para extraer los bazos y los ganglios locorregionales. Las suspensiones celulares se tratan individualmente en el caso de los bazos (rombos) y en conjunto por grupo en el caso de los ganglios (círculos). Las células vuelven a ser estimuladas durante 72 h con GFP (rombos y círculos blancos) o N-PΔN (rombos y círculos negros). La secreción de IFN-γ se mide con ELISA. Cuando las células se cultivan en el medio solo, el nivel basal de IFN-γ es inferior a 15 pg/ml. 25
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Construcción de los plásmidos que contienen la región C-terminal de la fosfoproteína del RSV y la proteína N del RSV fusionada con la GFP. 30
[0154] La proteína P del RSV cepa Long está compuesta por 241 residuos de aminoácidos.
[0155] Se utilizan secuencias de cebadores oligonucleidíticos (de 5’ hacia 3’) para amplificar la parte C-terminal de la proteína P del RSV (están subrayadas las secuencias de restricción BamHI; el codón iniciador («start») ATG del gen P está indicado en negrita): 35
LONG-PBam+: GAGGGATCCATCATGGAAAAGTTTGCTCCTG (SEQ ID NO: 13)
LONG-P-: CTGTTGGTGTTGTGTGTTGAAGTGCAG (SEQ ID NO: 14)
P161B+: GAGGGATCCTCTGCTAGGGATGGTATAAGAG (SEQ ID NO: 15)
P180B+: GAGGGATCCAAAATCAGAACTGAAGCATTAATGACC (SEQ ID NO: 16) 40
P201 B+: GAGGGATCCGAGGAAAGTGAAAAGATGGCAAAAG (SEQ ID NO: 17)
P221 B+: GAGGGATCCGAGAAATTGAACAACCTGTTGG (SEQ ID NO: 18)
P230NB+: GATCCAATGATAGTGACAATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGA (SEQ ID NO: 19)
P230N-: TCAGAAATCTTCAAGTGATAGATCATTGTCACTATCATTG (SEQ ID NO: 20)
45
[0156] El ADNc del gen P del RSV cepa Long se ha amplificado por RT-PCR a partir de células Hep-2 infectadas por la cepa Long del RSV humano, utilizando los cebadores LONG-PBam+ y LONG-P- (Castagné et al., 2004; Journal of General Virology; 85: 1643-1653). El producto de PCR ha sido digerido por la enzima de restricción BamHI y clonado en el plásmido pGEX-4T-3 (Pharmacia) en las secuencias BamHI-SmaI en fase con el gen codificador para la Glutatión-S-Transferasa o GST. El plásmido se llama pGEX-P. 50
• Clonación de P161-241 (PΔ161N)
[0157] La región C-terminal de P (aminoácidos 161-241) ha sido amplificada por PCR a partir del plásmido pGEX-P en las siguientes condiciones: 55
Cebadores de PCR: P161 B+ y LONG-P-100 ng cada (1μl cada)
ADN matriz pGEX-P: 10 ng (1μl)
Enzima: Pfu Turbo marca Stratagene (2,5 U por μl): 1 μl
dATP: 0.2 mM final 60
dGTP: 0.2 mM final
dCTP: 0.2 mM final
dTTP: 0.2 mM final
Solución amortiguadora Pfu 1 X final (Stratagene)
Volumen final: 100 μl
[0158] La PCR se ha realizado en las siguientes condiciones: 5
5 ciclos: 15 segundos a 94 ºC, 2 minutos a 40 ºC, 1 minuto a 72 ºC;
25 ciclos: 15 segundos a 94 ºC, 1 minuto a 55 ºC, 1 minuto a 72 ºC
[0159] El ADN amplificado se ha extraído con un volumen (100 μl) de fenol/cloroformo (1vol/1vol), y después 10 con un volumen de cloroformo, y después se ha precipitado por adición de una décima de volumen de NaCl 5M (10 ml) y dos volúmenes de etanol al 100 % (200 ml). El ADN se ha centrifugado 20 minutos a 13000 g, lavado con un volumen de etanol al 70 %, secado, resuspendido en un volumen de agua de 90 ml. Después de añadir 10 ml de solución amortiguadora 10X para la enzima BamHI, el ADN ha sido digerido 2 horas a 37 ºC en presencia de 10 unidades de enzima BamHI. El ADN digerido se ha depositado sobre un gel de agarosa al 1,5 % en una solución 15 amortiguadora Tri-Borate-EDTA (TBE) 1X en presencia de bromuro de etidio y se ha dejado migrar por electroforesis. La banda que corresponde al ADN de P161-241 se ha cortado y el ADN se ha extraído por electroelución. De nuevo, se ha extraído con un volumen de fenol-cloroformo, un volumen de cloroformo y se ha precipitado con etanol. Se ha fijado con el vector pGEX-4T-3 digerido por BamHI y SmaI después de la purificación con gel de agarosa al 1 %: 20
ADN pGEX4T-3: 100ng ADN P161-241: 100 ng
Solución amortiguadora de ligasa 1X final
Ligasa (5U/ml): 1 ml
Volumen final 20 ml 25
[0160] El conjunto se ha incubado una noche a 14 ºC. Al día siguiente las bacterias DH5-alpha TM (Life Technologies) competentes se han transformado con 10 ml de producto de unión y se han colocado en una placa de Petri que contiene un medio LB-agar suplementado con 100 mg/ml de ampicilina final. Las colonias de bacterias recombinadas se han cribado con una minipreparación de plásmido y digestión por las enzimas de restricción BamHI 30 y XhoI. Los plásmidos recombinados muestran entonces dos bandas de gel de agarosa, una que corresponde al vector (4,9 kb) y la segunda que corresponde a la parte C-terminal de P (246 pb). Los plásmidos recombinados se han secuenciado completamente.
• Clonación de P180-241, P201-241, P221-241 35
[0161] Los fragmentos de P correspondientes a las partes de aminoácidos 180-241, 200-241, 220-241 se han obtenido por PCR a partir del plásmido pGEX-P utilizando los siguientes cebadores:
P180-241: cebadores P180B+ y LONG-P 40
P200-241: cebadores P201 B+ y LONG-P
P220-241: cebadores P221 B+ y LONG-P
Se han amplificado y clonado de la misma manera que P161-241 (ver más arriba).
• Clonación del gen codificante de la proteína de nucleocápside del RSV cepa Long. 45
[0162] El gen codificante de la proteína N del RSV humano cepa Long ha sido obtenido por RT-PCR a partir de células Hep-2 infectadas por ese virus. Los cebadores utilizados fueron:
LONG-NBam+: GAGGGATCCATGGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTG (SEQ ID NO: 21) 50
LONG-N-: TTAACTCAAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG (SEQ ID NO: 22)
[0163] Los productos de PCR han sido digeridos por BamHI y clonados en el plásmido pGEX-4T-3 en las secuencias BamHI-SmaI. La región codificante de N ha sido subclonada por digestión del plásmido pGEX-N por BamHI-XhoI y subclonada en el plásmido pET28a+ (Novagen). 55
• Mutagénesis del plásmido pET-N y creación de una secuencia de restricción única Sal antes del codón STOP
[0164] Se ha introducido una secuencia de restricción SacI justo antes del codón finalizador de la proteína N 60 del RSV humano (cepa Long) por mutagénesis dirigida utilizando los oligonucleótidos:
Nfinsac+ CCAAAAGATAATGATGTAGAGCTCTGACTCGAGCACCACCACC (SEQ ID NO: 23)
Nfinsac- GGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGCTCTACATCATTATCTTTTGG (SEQ ID NO: 24)
[0165] Esto ha permitido obtener el plásmido pET-N-Sac.
5
• Obtención de la proteína N fusionada con la GFP
[0166] La GFP se ha extraído del plásmido pEGFPN1 por digestión por la enzima de restricción Eagl, y después por el tratamiento Klenow en presencia de nucleótidos para obtener hebras de misma longitud en el ADN, y después digerido por SacI. El plásmido pET-NSac ha sido digerido por la enzima XhoI, tratado por tratamiento 10 Klenow en presencia de nucleótidos y después digerido por Sal. La GFP se ha insertado en el plásmido pET-N-Sac y ha permitido obtener el plásmido pET-N-Sac.
• Obtención de la proteína N-epítopos F
15
[0167] Los epítopos «mimótopo» y «heptad» de la proteína F del RSV han sido clonados en C-terminal de la proteína N por inserción de oligonucleótidos bicatenarios.
Epítopo Mimótopo:
20
[0168]
F-Flag-HWSISKPO+: CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACTGGTCTATCTCTAAACCGCAGTAG (SEQ ID NO: 25) F-Flag-HWSISKPQ-:
25
TCGACTACTGCGGTTTAGAGATAGACCAGTGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGAGCT (SEQ ID: NO: 26)
[0169] Estos oligonucleótidos hibridados entre ellos y se han insertado en los las secuencias SacI SalI en el plásmido pET-N-GFP.
30
Epítopo Heptad.
[0170] Los siguientes oligonucleótidos se han hibridado entre ellos:
FheptadAge-: CCGGTCTCTACTAACAAAGCTGTTGTTTCTCTGAGCTAGT (SEQ ID NO: 27) (STNKAVVSLS) (SEQ 35 ID NO: 28)
FheptadAge-: CCGGACTAGCTCAGAGAAACAACAGCTTTGTTAGTAGAGA (SEQ ID NO: 29)
Se han clonado en el sitio Agel en el plásmido pET-N-GFP 40
• Clonación de P231-241
[0171] Los siguientes cebadores se han desnaturalizado por calentamiento a 94 ºC, durante 5 minutos, y después se han enfriado a temperatura ambiente:
45
P231NB+: GATCCGATAGTGACAATGATCTATCACTTGAAGATTTCTGA (SEQ ID NO: 30)
P231 N-: TCAGAAATCTTCAAGTGATAGATCATTGTCACTATCG (SEQ ID NO: 31)
[0172] Después de la hibridación, se han unido 10 ng de oligonucleótidos de bicatenarios con 100 ng de ADN 50 de plásmido pGEX4T-3 digerido por las enzimas BamHI y Smal y purificado por electroforesis con gel de agarosa. Los plásmidos recombinados se han comprobado por secuenciación a nivel del gen N.
Ejemplo 2: Expresión y purificación de los complejos
55
[0173] Se han transformado las bacterias BL21 (DE3) (Novagen) competentes con 1 mg de ADN pGEX-PΔ y 1 μg de ADN pET-N y después se han colocado en una placa de Petri con un medio LB-agar suplementado con 100 μg/ml final de ampicilina y 50 μg/ml final de kanamicina. Se ha cultivado una colonia y se ha dejado una noche a 37 ºC en 2 ml de medio LB con ampicilina y kanamicina a 100 μg/ml y 50 μg/ml respectivamente. Al día siguiente por la mañana, se ha utilizado 1 ml de cultivo saturado para sembrar 1 litro de medio LB con antibióticos y se ha dejado 60 hasta la tarde. Por la tarde, se ha añadido al cultivo un volumen de medio fresco LB que contiene IPTG (que induce la expresión de las proteínas) a una concentración de 160 μg/ml y se ha dejado una noche a 28 ºC. Al día siguiente
se centrifugan las bacterias durante 15 min a 5000 tpm y el residuo se retoma en 100 ml de la siguiente solución amortiguadora:
50 mM Tris pH 7,8
60 mM NaCl 5
2 mM DTT
1 mM EDTA
4 mM Benzamidina
Antiproteasas 1X (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, ref. Roche n° 11 873 580 001), es decir, una tableta para 50 ml de solución amortiguadora de lisis 10
0,1 % Triton-X100
[0174] se añaden 10 ml de la misma solución amortiguadora al que se añade Lisozima a 10mg/ml (1mg/ml final). Las bacterias se incuban 1 hora en hielo (lisis). Cuando la mezcla se vuelve viscosa, se aplican los ultrasonidos 3 veces durante 1 minuto utilizando una sonda introducida en la mezcla, sobre el hielo, y dejándolo 15 reposar 5 minutos entre cada aplicación. Se centrifuga la mezcla 30 minutos a 10 000 g a 4 ºC y se coge el sobrenadante. Se centrifuga el sobrenadante 30 minutos a 10 000 g a 4 ºC y se coge el nuevo sobrenadante. 4 ml de microesferas de sefarosa 4B-glutatión (AmershamPharmacia) se lavan extrayendo 8 ml de mezcla de microesferas solución amortiguadora /vol/vol) con la solución amortiguadora de lisis. Se dejan en un volumen equivalente de solución amortiguadora, añadidas al lisado bacteriano clarificado, y se dejan rotando a 4 ºC toda la 20 noche. Al día siguiente se centrifugan las microesferas a 2000 rpm durante 3 minutos, se elimina el sobrenadante, y se lavan las microesferas tres veces con la solución amortiguadora de lisis sin antiproteasas, tres veces en solución amortiguadora PBS 1X.
[0175] Se separan en capas las esferas en la secuencia de la trombina utilizando trombina biotinilada 25 (Novagen) a razón de 1 ml (1 U) de trombina («Thrombin Cleavage Capture Kit», Novagen N° 69022-3FRZ) para 1 ml de microesferas. Se incuban las microesferas durante la noche a 20 ºC y, al día siguiente, se centrifugan 3 minutos a 2000 rpm, se dejan sedimentar 15 minutos para recoger el sobrenadante. Se añade un volumen equivalente de PBS 1X a las esferas; se agita la mezcla y se deja sedimentar. Se vuelve a recoger el sobrenadante y se añade al sobrenadante que se ha retirado anteriormente. Al sobrenadante que se ha recogido se le añaden 30 esferas de agarosa Streptavidine (Novagen ref. 69203) a razón de 16 ml de resina (es decir 32 ml de mezcla de resina/amortiguador (vol/vol). Se deja la mezcla en agitación durante una hora, y se centrifuga 3 minutos a 2000 rpm, y se recoge el sobrenadante. Se obtiene una concentración de proteínas de 2 mg/ml.
[0176] Se desnaturalizan 10 ml del sobrenadante que contiene los productos de separación en una solución 35 amortiguadora de Laemmli 1X, se ponen a hervir y se depositan en un gel de poliacrilamida al 12 % en solución amortiguadora Tris-Glycine SDS 0,1 %, y se tiñen con color azul de Coomassie tras la electroforesis para visualizar las proteínas.
Ejemplo 3: Separación de N-GFP y PΔ161N (P161-241) y purificación de los anillos de N-GFP 40
[0177] Las proteínas presentes en el sobrenadante pueden separarse por cromatografía de exclusión por tamaño (gel filtration) en PBS 1X.
Ejemplo 4: Captura de los complejos N-PΔN por diferentes estirpes celulares: estudio con ayuda de la 45 proteína de fusión N-Green Fluorescent Protein (GFP).
I. Material y métodos
I.1 Líneas celulares y pruebas de fagocitosis:
50
[0178]
HEp-2: estirpe epitelial humana de laringe (Cancer Res 1955;15:598), cultivada en monocapa en EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) + 10 % SVF+ L-glutamina+ PS (penicilina, estreptomicina).
55
RAW: estirpe de monocitos-macrófagos peritoneales murinos (J. Immunol 1977;119:950) cultivada en monocapa en DMEM (Dulbecco’s Minimum Essential Medium) + 10 % SVF + L-glutamina + PS.
[0179] Las estirpes celulares se disocian en D-PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) + 0,33 % lidocaína + 5 mM EDTA. Se lavan las células aisladas, se añaden a una concentración de 107 células/ml en 60 PBS/2 %SVF y se incuban en agitación suave en tubos de 5 ml de fondo redondo en presencia de:
- P161-241 + N-GFP (N-GFP-PΔN) a 20 μg/ml
- GFP a 6,5 μg/ml -
- Dextran-FITC (DX-FITC) a 1 mg/ml (Ref: D-1844, Molecular Probes).
[0180] Las incubaciones se hacen paralelamente a 4 ºC, temperatura a la cual los mecanismos de 5 endocitosis se inhiben y a 37 ºC, temperatura permisiva para la interiorización. Después de una o dos horas de incubación, se lavan las células tres veces y se añaden a PBS + 2 %SVF.
I.2 Análisis de la adsorción/interiorización por citometría de flujo
10
[0181] Se compara, por citrometría de flujo (FACSCalibur, Becton), la fluorescencia (FL1) asociada a las células (HEp2, RAW) incubadas con moléculas fluorescentes (DX-FITC o N-GFP-PΔN) a 4 ºC o 37 ºC. El nivel de autofluorescencia de las células viene dado por las células incubadas dos horas a 37 ºC en ausencia de moléculas fluorescentes.
15
I.3 Análisis de la adsorción/interiorización en microscopio de fluorescencia
[0182] Después de la incubación, se colocan 105 células por citocentrifugado en láminas superfrost plus (SFPLUS42, Milian). Se secan las láminas 15 minutos y se montan utilizando PERTEX (Ref: 00814, Histolab).
20
[0183] Se observa el nivel de fluorescencia en el microscopio (Axiovert200M, Zeiss). La toma de vistas se realiza con una cámara (Coolsnap HQ) y con el programa Metavue.
I.4 Inmunodetección de la proteína N tras la permeabilización de las células.
25
[0184] El objetivo es comparar, por inmunodetección de la proteína N, la señal que se detecta en las células no permeabilizadas (complejo N-GFP-PΔN extracelular), con la señal que se detecta en las células permeabilizadas (complejo N-GFPPΔN intra y extracelular).
[0185] Se fijan las células durante 15 minutos en solución amortiguadora A (Ref: GAS-003, Caltag) y se 30 lavan.
[0186] En el caso de las células no permeabilizadas, el marcado se hace en solución amortiguadora Cell Wash (Becton) +5 %SVF. Para permeabilizar las células durante el marcado, se utiliza la solución amortiguadora B (Ref: RGAS-003, Caltag). Se saturan los receptores Fc durante 20 minutos con un anticuerpo anti-CD16/CD32 (Ref: 35 553141, Becton) diluido al 1/100. Después, se incuban las células durante 30 minutos con un suero de conejo dirigido contra la proteína N, diluido al 1/1000. La detección de los Ig de conejos se hace con una incubación de 30 minutos con un anticuerpo biotinilado (Ref: BA-1000, Vector) diluido al 1/200. El uso de estreptavidina acoplada al APC (554067, Becton) al 1/500 permite la detección indirecta en el canal Fl4 de la proteína N en citometría de flujo (FACSCalibur, Becton). 40
II. Resultados:
II-1 Análisis de la interacción de los complejos N-GFP-PΔN con las células RAW (macrófagas) y HEp2 (epiteliales):
45
[0187] Las células RAW son una estirpe de monocitos-macrófagos. Tienen una capacidad de fagocitosis que se puede observar poniendo en contacto con ellas un polímero fluorescente, el DX-FITC. La captura del DX-FITC aumenta fuertemente a 37 ºC frente a 4 ºC (fig. 1B). La estirpe HEp-2 es una estirpe epitelial. No tiene capacidad de fagocitosis, por lo que la fluorescencia vinculada con la interacción entre el DX-FITC y sus células no es muy diferente entre las incubaciones a 4 ºC y a 37 ºC (fig. 1 A). 50
[0188] Cuando los complejos N-GFP-PΔN se ponen en contacto con las células RAW y HEp-2 se observa un fuerte aumento del nivel de fluorescencia respecto del nivel basal (PBS) (fig. 1, C, D). Esto indica una adsorción eficaz en la membrana de las células. Tras la incubación a 37 ºC, la fluorescencia detectada en presencia de N-GFP-PΔN disminuye en los dos tipos celulares, pero sin embargo sigue siendo superior al nivel basal (fig. 1 C, D). 55 Cuando las células se incuban con la GFP recombinante, la señal de fluorescencia se mantiene al nivel basal (datos no mostrados). Esto indica que los fenómenos de captura observados están relacionados con los anillos de N-PΔN y no con la GFP.
[0189] La captura de los anillos de N-GFP-PΔNh en las estirpes RAW y HEp-2 se ha confirmado con el 60 microscopio.
[0190] La fluorescencia específica de la GFP fusionada con la proteína N se encuentra en forma de gránulos en el interior de las células HEp-2 o RAW. Esta fluorescencia no se encuentra en caso de que la incubación se haga con la GFP recombinante. Los complejos N-GFP-PΔN se absorben o se interiorizan en la estirpe macrofágica RAW y en la estirpe epitelial HEp-2.
5
II.2 Interiorización de los complejos N-GFP-PΔN por las células RAW
[0191] Para entender la evolución de los complejos N-GFP-PΔN en las células RAW a 37 ºC frente a 4 ºC, se permeabilizan las células y la presencia de la proteína N se revela por inmunomarcado y análisis de citometría de flujo (fig. 2). Si no se produce permeabilización, la cantidad de N detectada (señal de fluorescencia) es más débil a 10 37 ºC que a 4 ºC (fig. 2A). En cambio, tras la permeabilización, el nivel de la señal vuelve a ser idéntico entre las condiciones de incubación 37°C y 4°C (fig. 2B). Los complejos N-GFP-PΔN se interiorizan entonces durante la incubación a 37 ºC.
[0192] En conclusión, el conjunto de experimentos realizados con los complejos N-GFP-PΔN, en citometría 15 de flujo y con microscopio, ha permitido poner de relieve las propiedades originales de estas estructuras proteicas. Las combinaciones en anillos de la nucleoproteína tienen la capacidad de adsorber y de ser interiorizadas eficazmente por tipos celulares variados como los macrófagos, las células epiteliales y las células dendríticas (datos no mostrados). Estas propiedades son particularmente interesantes para el uso de esas estructuras como vector de antígeno en vacunación. 20
Ejemplo 5: Evaluación de las propiedades del vector antígeno de la proteína N en anillo respecto de la Green Fluorescent Protein (GFP) expresada en fusión
I. Material y métodos 25
I.1 Ratón:
[0193] BALB/c hembras de 8-10 semanas, criadas en la Unidad Experimental Animalario Roedor (Unité Expérimentale Animalerie Rongeur, INRA, Jouy-enJosas). 30
I.2 Antígenos:
[0194]
35
- P161-241 + N-GFP (N-GFP-PΔN) concentración a 0,1064 μg/μl
- GFP concentración a 0,5 μg/μl -
- P161-241+N (N-PΔN) concentración a 1 μg/μl
I.3 Adyuvante: 40
[0195]
- LT(R192G) linfotoxina destoxificada de E. coli, 1 mg/ml (lote enviado por John Clements; Choi et al., 2004, Protein Expression and Purification 38, pp 205) 45
I.4 Inmunización:
[0196] Administración por vía intranasal (i.n) con anestesia avertina (300 hl i.p.) de la siguiente mezcla (60 μl / ratón): 50
- 5 μg de LT(R192G)
- 5 μg N-GFP-PΔN
o 1.7 μg de GFP soluble
o 3.3 μg N-PΔN 55
(cantidades de GFP o de N-PΔN correspondientes a las presentes en 5 μg de N-GFP-PΔN)
- qsp 60 μl con suero fisiológico apirógeno
[0197] Todas las soluciones se pasan por un filtro 0,22 μm antes de la inyección.
60
Grupos
D0 Primera inyección D14 recuerdo D32 autopsia
testigo
LT(R192G) i.n. suero LT(R192G) i.n. suero Suero Bazo LBA gg drenantes
GFP GFP Suero
GFP
+LT(R192G) i.n. suero + LT(R192G) i.n. suero Bazo LBA gg drenantes
N-PΔN
N-PΔN +LT(R192G) i.n. suero N-PΔN + LT(R192G) i.n. suero Suero Bazo LBA gg drenantes
N-GFP-PΔN
N-GFP-PΔN +LT(R192G) i.n. suero N-GFP-PΔN + LT(R192G) i.n. suero Suero
LBA: lavado broncoalverolar (con 1 ml de PBS 1 mM EDTA) gg: ganglios
I.5 Producción de anticuerpos anti N-PΔN y anti GFP:
[0198] Los anticuerpos anti-N-PΔN o anti-GFP (IgH+L y IgA) se buscan en los sueros y los LBA por ELISA: 5
- Los sueros se recogen a partir de extracciones de sangre (1 noche de exudación a 4 ºC) y a continuación se congelan a -20 ºC.
- Los LBA se centrifugan 5 min a 1700 rpm, los sobrenadantes se recogen (1 ml aproximadamente) y se congelan a -20 ºC. 10
[0199] Se sensibilizan placas de 96 pocillos (Immulon 2HB, ThermoLabsystems) durante una noche a 4 ºC con el complejo N-PΔN o la proteína GFP recombinante (200 ng por pocillo, 100 μl por pocillo) en solución amortiguadora de bicarbonato 0,1 M pH 9,5. Se lavan las placas 5 veces con 200 μl por pocillo de PBS 0,05% tween 20 (utilizando un analizador automático Wellwash, Labsystems). A continuación, se saturan las placas durante 1 h a 15 37 ºC con 150 μl por pocillo de solución amortiguadora PBS 0,05 % tween 20 y 5 % de suero fetal bovino (utilizando un analizador automático Wellwash, Labsystems). Después de 5 lavados, las muestras que se van a titular se diluyen en PBS-T-SVF (siete disoluciones sucesivas de razón 3 partiendo de una primera disolución al 30º para los sueros y al tercio para los LBA). Se incuban las placas durante 2h a 37 ºC. Después de 5 lavados, el anticuerpo secundario diluido en PBS-T-SVF se distribuye a razón de 100 ml por pocillo. Se utilizan los anticuerpos secundarios 20 conjuntamente con la peroxidasa y se dirigen contra las inmunoglobulinas de ratón: Ig(H+L) (4000o, P.A.R.I.S.) o IgA (1000o, Caltag). Se incuban las placas durante 2h a 37 ºC y se lavan 5 veces. Seguidamente, se incuban las placas con el sustrato de la peroxidasa (TMB, 100 ml por pocillo) durante 10 min a oscuras. La reacción enzimática se para al añadir 50 ml de H3PO4 2M. Se leen las densidades ópticas (DO) a 450 nm (lector Dynex). La curva D0450=f(disolución) está modelizada por la curva de regresión y=(b+cx)/(1+ax) con ayuda del programa Origin. El 25 título del anticuerpo se determina como el valor de disolución que da dos veces la D0450 de una muestra testigo (D0) en su mayor disolución.
I.6 Producción de IFN-y/IL-40 por linfocitos T específicos de N-PΔN o de GFP
30
[0200] El bazo y los ganglios que drenan el tracto respiratorio (faciales, cervicales y mediastínicos) se tratan siguiendo el mismo procedimiento. Los bazos se tratan individualmente y los ganglios se agrupan por lote experimental.
[0201] Los órganos linfáticos se cortan y se pasan delicadamente por un filtro (tamiz celular 100 μm, BD 35 Falcon) en un medio RMPI y PS. La suspensión celular se centrifuga a 1700 rpm durante 10 min a 4 ºC. Las células se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de solución amortiguadora de lisis de los eritrocitos (solución salina hipotónica) y se incuban durante 5 min a temperatura ambiente. Se para la reacción de lisis añadiendo 10 ml de RPMI completo (PS, 2 mM L-glutamina y 10 % SVF). Los restos membranosos se decantan y las células se lavan tres veces por centrifugado (1700 rpm durante 10 min a 4 ºC). Las suspensiones celulares se recuentan con ayuda 40 de una célula de Malassez.
[0202] Las células se ponen en un cultivo en microplacas de 96 pocillos tratadas para el cultivo celular
(Falcon) a razón de 400 000 células por pocillo en 200 μl de medio RPMI completo. Se prueban cuatro condiciones de cultivo por triplicado en cada suspensión celular:
- PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato, Sigma)10 ng/ml y ionomicina (Sigma) 1 μg/ml (testigo positivo, activación policlonal) 5
- RPMI completo (testigo negativo)
- N-PΔN 10 μg/ml
- GFP 10 μg/ml.
[0203] Después de 48 h (IL-5 e IL-10) o 72 h (IFN-γ) de cultivo a 37 ºC con el 5 % de CO2, se recogen los 10 sobrenadantes del cultivo y se congelan a -20 ºC hasta la titulación de las citocinas por ELISA:
Se sensibilizan placas de 96 pocillos (Immulon 2HB, ThermoLabsystems) una noche a 4 ºC con el anticuerpo de captura anticitocina de ratón a 4 μg/ml (IFN-γ) o 2 μg/ml (IL-5/IL-10) en solución amortiguadora de bicarbonato 0,1 M pH 9,5 (100 μl/pocillo). Se lavan las placas 5 veces con 200 μl por pocillo de PBS 0,05% tween 20 (utilizando un 15 analizador automático Wellwash, Labsystems). A continuación se saturan las placas durante 2 h a 37 ºC con 150 μl por pocillo de solución amortiguadora PBS 0,05% tween 20 y un 2 % de albúmina de suero bovina (PBS-T-BSA). Tras 5 lavados, la referencia citocina de ratón recombinada y las muestras para titular se diluyen en PBS-T-BSA por diluciones sucesivas a la mitad. Se realizan cuatro diluciones sucesivas a la mitad en las muestras puras. Entonces se incuba la placa durante una noche a 4 ºC. Después de 5 lavados, el anticuerpo de detección biotinilado se 20 distribuye (1 μg/ml para IFN-γ/IL-10 o 0,5 μg/ml para IL-5 en PBS-T-BSA, 100 μl/pocillo) y se incuba 3 h a 4 ºC. Después de 5 lavados, el conjugado estreptavidina-peroxidasa (Pierce) se distribuye (1μg/ml en PBS-T-BSA, 100 μl/pocillo) y se incuba 1 h a 4 ºC. Después de 5 lavados, el sustrato de la peroxidasa (ABTS+H2O2) se distribuye en los pocillos. Después de 5 minutos de incubación, se leen las densidades ópticas a 405 nm (lector ELISA Dynex). El cálculo de la concentración en IFN-γ/IL-5/IL-10 en las muestras se hace respecto de la gama de muestra utilizando 25 el programa de análisis «Révélation» acoplado al lector.
[0204] Referencias de anticuerpos (BD Bioscience):
- IFNγ: anticuerpos de captura: clon R4-6A2 (BD Bioscience, 551216) 30
- Anticuerpos de detección: clon XMG1.2 (BD Bioscience, ref 554410)
- mIFN-γ recombinante: R&D systems 485-MI - IL-5: anticuerpos de captura: clon TRFK5 (BD Bioscience, 554393)
- Anticuerpos de detección: clon TRFK4 (BD Bioscience, ref 554397)
- mIL-5 recombinante: BD Bioscience 554581
- IL-10: anticuerpos de captura: clon JES5-2A5 (BD Bioscience, 551215) 35
- Anticuerpos de detección: clon SXC-1 (BD Bioscience, ref 554423)
- mIL-10 recombinante: BD Bioscience 550070
- Estreptavidina peroxidasa Immunopure (Pierce 21126)
I.7 Análisis estadísticos: 40
[0205] Los grupos se comparan de dos en dos haciendo una prueba U de Mann-Whitney (http://eatworms.swmed.edu/∼leon/stats/utest.html). Un valor p<0,05 se considera significativo.
II. Resultados: 45
[0206] Para evaluar las potencialidades de los anillos formados por el complejo N-PΔN como vector vacunal, se han inmunizado ratones BALB/c contra la GFP (antígeno modelo) en forma de una proteína de fusión con la nucleoproteína N del RSV. La proteína de fusión N-GFP forma estructuras de anillos solubles que se pueden purificar según el procedimiento descrito anteriormente (patente FR0504426). Así se obtienen los complejos 50 proteícos NGFP-PΔN. Para un uso vacunal, las proteínas N-GFP y P se pueden separar, pero esta operación no es necesaria, puesto que los resultados anteriores de los Inventores sobre la inmunogenidad de los anillos de N han demostrado que la presencia de PΔN no tiene efecto negativo.
[0207] Habida cuenta de los trabajos orientados a los patógenos que atacan las vías respiratorias y de la 55 inmunogenia demostrada de los complejos N-PΔN administrados por vía nasal, esta vía de administración se privilegia para demostrar las propiedades vectoras de estos complejos. Asimismo, se han inmunizado lotes de ratones contra la proteína GFP en su forma recombinante nativa y contra los complejos N-PΔN. La linfotoxina destofixicada de E. coli, LT(R192G) cuyas proteínas adyuvantes por vía mucosa se han descrito suficientemente (McNeal et al. 2002, Freytag et Clements 2005) se utiliza como adyuvante para todos los grupos de animales de 60 este ejemplo.
[0208] Los parámetros de la respuesta inmunitaria dirigida contra la GFP y contra N-PΔN que se han analizado son (i) la producción de anticuerpos séricos y mucosos (por lavados broncoalverolares) y (ii) la respuesta celular a través de la producción de citocinas (IFN-γ, IL-5 e IL-10) por linfocitos T de memoria aislados del bazo o de los ganglios que drenan el tracto respiratorio.
5
II-1 Los anillos de N son un vector eficaz que pueden dirigirse a los anticuerpos contra un antígeno exógeno, ejemplo de la GFP
[0209] Los complejos N-PΔN son altamente inmunógenos por vía sistémica y por vía mucosa (patente FR0504426). La fusión de la GFP con la proteína N no altera la intensidad de la respuesta Ac anti N-PΔN, ya sea a 10 nivel sérico (fig. 3B) y mucoso (fig. 3C): no hay diferencia significativa entre los grupos N-GFP-PΔN y N-PΔN.
[0210] La GFP administrada por vía nasal induce una respuesta Ac sistémica (fig. 3A; GFP frente al testigo, p=0,003) pero no una respuesta local (fig. 3C; GFP frente al testigo, no significativo).
15
[0211] En cambio, la asociación de la GFP a los complejos N-PΔN aumenta fuertemente la tasa de anticuerpos anti-GFP respecto de la GFP sola. El nivel de los anticuerpos anti-GFP se multiplica por un factor 4 a nivel sérico (N-GFPPΔN frente a GFP, p=0,039) y por un factor 100 a nivel de los LBA (N-GFP-PΔN frente a GFP, p=0,014).
20
II-2 La vectorización de la GFP sobre los anillos de N no aumenta la respuesta T específica:
[0212] Además de su gran capacidad para estimular la respuesta de los anticuerpos, los N-PΔN estimulan eficazmente la respuesta T de memoria mostrada por una síntesis de IFN-γ antígeno-dependiente a nivel sistémico (patente FR0504426 y Figura 4, bazos N-PΔN frente a testigo, p=0,01) pero también local (fig. 4 ganglios 25 locorregionales). La fusión de un antígeno exógeno como la GFP sobre la N no perturba el establecimiento de estas respuestas T, ya sea a nivel del bazo (N-GFP-PΔN frente a N-PΔN, sin diferencia) o a nivel de los ganglios (figura 4).
[0213] Sin embargo, sea cual sea el modo de presentación de la GFP (sola o fusionada con N), no se observa ninguna respuesta T específica de la GFP, medida por la producción de IFN-γ (Fig. 4) o de IL-5/IL-10 (no 30 mostrada): no hay diferencia significativa entre los grupos testigo, N-GFP-PΔN y GFP.
[0214] En conclusión, el ejemplo de la GFP ha permitido mostrar que los complejos N-PΔN son vectores de antígeno muy poderosos para estimular respuestas de anticuerpos, en concreto a nivel mucoso. Sin embargo, han demostrado ser poco eficaces para estimular una respuesta T de memoria contra esos mismos antígenos. Es 35 importante señalar que la fusión de un antígeno exógeno no ha alterado la inmunogenia propia de los complejos N-PΔN.
[0215] Estos resultados permiten plantearse la utilización de los complejos N-PΔN como vector de antígeno con el objetivo de estimular altas respuestas de los anticuerpos. En el marco de la vacunación contra el RSV, los 40 resultados obtenidos muestran que se puede sacar provecho a la vez de la respuesta celular contra la nucleoproteína y una respuesta de anticuerpo contra los antígenos/epítopos del RSV conocidos por ser el objetivo de los anticuerpos neutralizantes. Estas dos facetas de las defensas inmunitarias son críticas para obtener una inmunidad esterilizadora contra el RSV.
45
[0216] De forma general, para muchos patógenos (en concreto los virus), los epítopes o antígenos objetivo de los anticuerpos neutralizantes están suficientemente descritos en la literatura y participan en el control eficaz de la infección. Por ello, en el ámbito de la vacunación hay una gran búsqueda de nuevos vectores para estimular eficazmente estas respuestas. Los complejos N-PΔN presentan además la ventaja de ser estructuras inertes que no se reproducen y por tanto sin riesgos para el anfitrión y el entorno. 50
Ejemplo 6: Optimización de la secuencia de unión entre la proteína N y la proteína GFP
[0217] La purificación de las proteínas de fusión N-GFP se realiza por afinidad con la proteína P (fragmento 161-241) fusionada con la GST. La proteína N-GFP construida de conformidad con el ejemplo 1 (SEQ ID NO: 33) se 55 purifica con un rendimiento diez veces más débil que la proteína N. Además, se sigue observando la presencia de dos polipéptidos migrantes con una masa aparente de 43 kDa aproximadamente. Estas bandas se han analizado por espectrometría de masa (MALDI-TOF). Corresponden a una descomposición que se produce (i) en la secuencia de unión que separa N de GFP (a nivel de una arginina) y que resulta en la adición de 11 residuos en C-terminal de la proteína N, y (ii) en la parte C-terminal de la proteína N (a nivel de una lisina) retirando los 6 últimos residuos. La 60 construcción de una proteína N eliminada de 6, 12 y 27 residuos en C-terminal ha mostrado que las proteínas NΔ6C y NΔ12C interactúan siempre con P, contrariamente a la forma truncada NΔ27C.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de preparación de un complejo proteína N-proteína de interés/proteína P, en el que las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial (RSV), dicho procedimiento consta de las siguientes etapas: 5
    a) coexpresar una proteína de fusión proteína N de un virus respiratorio sincicial -proteína de interés, con una proteína P truncada del mismo virus respiratorio sincicial, en la que la proteína de interés N se fusiona en fases con el extremo C-terminal de la proteína N, donde la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de 10 interactuar con la proteína P, y la proteína P truncada no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de enlace a la proteína N;
    b) recoger los complejos proteína N-proteína de interés/proteína P que se formen de este modo.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el virus respiratorio sincicial es el virus respiratorio 15 sincicial humano.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína P truncada se expresa en forma de una proteína de fusión con una proteína que facilita la purificación de los complejos N-proteína de interés/proteína P.
    20
  4. 4. Complejo proteína N-proteína de interés/proteína P en forma de anillos solubles que contienen la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, las proteínas N y P son proteínas de un virus respiratorio sincicial, en el que la proteína de interés se fusiona en fase al extremo C-terminal de la proteína N, donde la proteína N es una proteína nativa o una proteína N modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, dicha proteína N conserva la capacidad de interactuar con la proteína P, y la proteína P 25 es una proteína truncada del mismo virus respiratorio sincicial que no contiene el dominio de oligomerización P y contiene un dominio de enlace a la proteína N.
  5. 5. Complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la reivindicación 4, en el que la proteína de interés es una proteína marcador, o una proteína de interés vacunal. 30
  6. 6. Complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la reivindicación 5, en el que la proteína de interés vacunal es un antígeno derivado de un microorganismo patógeno.
  7. 7. Complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la reivindicación 5, en el que la proteína de 35 interés es una construcción que contiene la GFP fusionada en fase, en su extremo C-terminal, con una proteína vacunal.
  8. 8. Complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según la reivindicación 4, en el que la proteína de fusión proteína N-proteína de interés es una proteína de fusión N-GFP-proteína de interés que contiene la GFP (Green 40 Fluorescent Protein) fusionada en fase al extremo C-terminal de la proteína N, que incluye una secuencia de unión entre las proteínas N y GFP con la secuencia SEQ ID NO: 32.
  9. 9. Procedimiento de preparación de una proteína N de un virus respiratorio sincicial, fusionada en fase con su extremo C-terminal con una proteína de interés, dicho procedimiento consta de la separación de la proteína 45 de fusión proteína N-proteína de interés a partir del complejo proteína N-proteína de interés/proteína P según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.
  10. 10. Proteína de fusión proteína N-proteína de interés, aislada, estructurada en anillos solubles formada por la proteína de fusión proteína N-proteína de interés con su ARN, que puede obtenerse por el procedimiento 50 según la reivindicación 9, donde la proteína N es una proteína N de un virus respiratorio sincicial nativa o modificada en la región definida por los 25 últimos aminoácidos C-terminales, y la proteína de interés se fusiona en fase, con el extremo C-terminal de la proteína N.
  11. 11. Composición farmacéutica que presenta una proteína N de un virus respiratorio sincicial fusionado con 55 una proteína de interés como la que se define en la reivindicación 10 o un complejo de proteína N-proteína de interés/proteína P según se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  12. 12. Composición según la reivindicación 11 que es una composición inmunógena o vacunal. 60
  13. 13. Reactivo diagnóstico que presenta una proteína de fusión según la reivindicación 10, en la que la proteína de
    interés es un antígeno.
  14. 14. Utilización de una proteína de fusión según la invención 10 que contiene un antígeno fusionado en fase al extremo C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial para la detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno de la proteína de fusión. 5
  15. 15. Procedimiento de detección de anticuerpos específicos de un antígeno, en una muestra biológica, que consta de los siguientes pasos:
    a) poner en contacto dicha muestra biológica con una proteína de fusión según la reivindicación 10, que contiene 10 un antígeno fusionado en fase al extremo C-terminal de una proteína N de un virus respiratorio sincicial;
    b) detectar los complejos de proteína de fusión N-antígeno/anticuerpo formados, siendo reveladora la presencia de dichos complejos de la presencia de anticuerpos específicos del antígeno en la muestra biológica.
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