JP2009534024A - パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質−対象タンパク質の融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、場合により、溶解性Nタンパク質-対象タンパク質/Pタンパク質複合体の形態の、Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質であって、Nタンパク質及びPタンパク質は、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのタンパク質である、前記融合タンパク質に関する。対象タンパク質が抗原である時、本発明は、Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質又はNタンパク質-抗原/Pタンパク質複合体を含む、ワクチン組成物及び診断試薬にも関する。Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質は、抗ウイルス薬又は抗癌剤のような対象の治療的分子を細胞に移送するための「ベクター」としても使用されることもできる。
【選択図】なし
Description
パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーは、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)及びニューモウイルス(Pneumoviridae)サブファミリーを包含する。パラミクソウイルス科は、センダイウイルスのプロトタイプであるレスピロウイルス(Respirovirus)属、ルブラウイルス(Rubulavirus)(特におたふく風邪ウイルス)、モルビリウイルス(Morbilivirus)、例えば麻疹ウイルスを含む。レスピロウイルス及びルブラウイルス属の各々は、共にパラインフルエンザウイルスの株に分類される。ニューモウイルス・サブファミリーは、2つの属、ニューモウイルスとメタニューモウイルス(Metapneumoviridae)に分類され、後者はヒトメタニューモウイルスを含む。ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、ニューモウイルス・サブファミリーに属するニューモウイルス属のプロトタイプウイルスを構成する。ニューモウイルスは、RSVのウシ及びネズミ株をも含む。
本発明は、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのNタンパク質、及び該Nタンパク質のC-末端のインフレームに融合された対象タンパク質を含む、Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質に関する。
本発明者らは、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのNタンパク質がパラミクソウイルス科ファミリーの同一のウイルスのPタンパク質との共発現系で産生され得る、ことを先に示している。同一の系は、Pタンパク質との複合体の形態でのNタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質を発現し、次いで場合によりその複合体から融合タンパク質を精製するために使用され得る。
a) パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのNタンパク質を共発現し、該対象タンパク質は、パラミクソウイルス科ファミリーの同一のウイルスのPタンパク質で、Nタンパク質のC-末端のインフレームに融合され;
b) そのように形成されたNタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体を回収すること、
を含む、前記方法に関する。
a) パラミクソウイルス科ファミリーの同一のウイルスのPタンパク質と、対象タンパク質のC-末端のインフレームに融合された、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのNタンパク質を共発現し、ここで、該Pタンパク質のC-末端断片はオリゴマー化ドメインPを含まず、Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質と相互作用できる;
b) そのように形成された溶解性N-PI/PΔN複合体を回収すること、
を含む、前記方法に関する。
a) 配列番号1で示されるヒトRSVロング株のPタンパク質のアミノ酸配列233〜241を含み、そして配列番号1で示されるRSV Pタンパク質の配列の位置233と120、好ましくは150、より好ましくは161との間に位置するアミノ酸残基である限り、N-末端方向に伸びる、RSV Pタンパク質のC-末端断片;又は
b) C-末端断片、すなわち、異なったヒトRSV株由来又はウシRSV株から得られたPタンパク質の、a) で定義された断片の相同体。
Pタンパク質が切断され、特にPタンパク質のC-末端断片で切断される、Nタンパク質-対象タンパク質/Pタンパク質複合体を調製する方法は、上記のように、Nタンパク質-対象タンパク質/Pタンパク質複合体を、単離された又は精製された形態で容易に取得させる。
a) 上で定義された方法によってNタンパク質-対象タンパク質/Pタンパク質の複合体を調製し;及び
b) Nタンパク質-対象タンパク質/Pタンパク質の複合体から、Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質を分離すること、
を含む、前記方法に更に関する。
a)上で定義された方法によって溶解性Nタンパク質-対象タンパク質/P-タンパク質のC-末端の複合体(N-PI/PΔN複合体)を調製し;及び
b) 溶解性N-PI/PΔN複合体から、Nタンパク質-対象タンパク質の融合タンパク質を分離すること、を含む、前記方法に関する。
本発明は、単離された、又はPタンパク質複合体のNタンパク質/C-末端断片(N-PΔN)の形態での、環状構造を有するRSVNタンパク質が、高度に免疫原性であり、特に例えば気管支粘膜での局所反応の刺激を許容する、ことを先に明らかにしてきた。
パラミクソウイルス科ウイルスのNタンパク質と、少なくとも1つのエピトープを含む抗原との融合は、更に、融合タンパク質によって運ばれるエピトープの少なくとも1つに対する抗体を検出するための診断的適用で使用される可能性のある試薬を構築する。
a) 該生物試料を、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルスのNタンパク質のC-末端のフレームに融合された抗原を含むN-抗原融合タンパク質と接触させ;
b) 得られたN-抗原融合タンパク質/抗体複合体を検出すること、
を含む、前記方法にも関する。
RSV長鎖のPタンパク質は、241アミノ酸残基からなる。
以下の条件下で、pGEX-Pプラスミドから、PのC-末端領域(アミノ酸161〜241)を増幅した。
PCRプライマー:P16B+及びロング-P- 各100 ng(各1μl)
DNAテンプレートpGEX-P:10 ng(1μl)
酵素:Pfu Turbo(商標)Strategene(2.5 U/μl):1μl
dATP:最終0.2 mM
dGTP:最終0.2 mM
dCTP:最終0.2 mM
dTTP:最終0.2 mM
Pfu緩衝液 最終1X(Strategene)
最終容積:100μl
5サイクル:94℃で15秒間、40℃で2分間、72℃で1分間;
25サイクル:94℃で15秒間、55℃で1分間、72℃で1分間。
pGEX-4T-3 DNA:100 ng
P161-241 DNA:100 ng
リガーゼ緩衝液 最終1X
リガーゼ(5 U/μl):1μl
最終容積20μl。
アミノ酸180〜241、200〜241、220〜241の部分に対応するPの断片は、以下のプライマー:
P180-241:プライマーP180B+及びロング-P
P201-241:プライマーP201B+及びロング-P-
P220-241:プライマーP221B+及びロング-P-
ウイルスによって感染されたHep-2細胞からRT-PCRによってヒトRSVロング鎖のNタンパク質をコードする遺伝子を得た。使用したプライマーは以下のとおりである。
以下のオリゴヌクレオチドを用いて指定の突然変異誘発によってヒトRSV(長鎖)のNタンパク質の停止コドンの直ぐ前に、SaI制限部位を導入した。
GFPを制限酵素EagIによる消化によってpEGFPN1プラスミドから除き、次いでDNA上に平滑末端を得るために、ヌクレオチドの存在下でクレノウ処理を行い、次いで、SacIにより消化した。プラスミドpET-N-Sacを酵素XhoIによって消化し、ヌクレオチドの存在下でクレノウ処理し、次いでSaIで消化した。従って、GFPはpET-N-Sacプラスミドに挿入し、pET-N-GFPプラスミドを得た。
RSVのFタンパク質の「ミモトープ」及び「ヘプタッド」エピトープを、二重鎖オリゴヌクレオチドの挿入により、Nタンパク質のC-末端にクローン化した。
以下のオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズした。
以下のプライマーを94℃で5分間加熱することによって変性し、次いで室温まで冷却した。
コンピテントBL21(DE3)細菌(Novagen)を1μgのpGEX-PΔ DNA、及び1μgのpET-N DNAで形質転換し、次いで、100μg/ml終濃度のアンピシリン及び50μg/ml終濃度のカナマイシンで補充されたLB-アガー培地を含むペトリ皿に拡げた。コロニーを選択し、それぞれ100μg/ml及び50μg/mlの濃度のアンピシリン及びカナマイシンを含む2 mlのLB培地で、37℃で終夜培養した。翌日、抗体で補充された1リットルのLB培地を接種するために1 mlの飽和培養液を用い、夜になるまで培養した。夜に、160μg/mlの(タンパク質発現を誘導する)IPTGを含む新鮮LB培地の1容を、培養物に加え、全体を28℃で終夜培養した。翌日、細菌を5000 rpmで15分間遠心し、ペレットを100 mlの以下の緩衝剤:
50 mM トリス pH 708
60 mM NaCl
2 mM DTT
1 mM EDTA
4 mM ベンザミジン
1X 抗蛋白質分解酵素(完全なEDTA-無しのプロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche番号11 873 580 001参照)、すなわち、50 mlの溶解緩衝剤につき、1錠
0.1% トリトン-X100
に再懸濁した。
上清に存在するタンパク質は、1XPBS中でサイズ排除クロマトグラフィー(ゲルろ過)によって分離され得る。
I.材料及び方法
I.1 細胞株及び食作用試験:
−HEp-2:EMEM(イーグル最小必須培地)+10% FCS+L-グルタミン+PS(ペニシリン、ストレプトマイシン)中の単層で培養した、ヒト喉頭上皮株(Cancer Res 1955; 15: 598)。
−RAW:DMEM(ダルベッコ最小必須培地)+10% FCS+L-グルタミン+PS中の単層で培養した、ネズミ腹膜単球-マクロファージ(J. Immunol 1977; 119: 950)。
−20μg/mlのP161-241+N-GFP(N-GF-PΔN)
−6.5μg/mlのGFP
−1 mg/mlのデキストラン-FITC(DX-FITC)(参照:D-1844,Molecular Probes)
の存在下で5 mlの丸底チューブ内で、緩やかに攪拌しながらインキュベートした。
37℃で4℃で蛍光分子(DX-FITC又はN-GFP-PΔN)でインキュベートされた細胞(HEP-2,RAW)と関連する蛍光(FL1)は、フローサイトメトリー(FACSCalibur, Becton)によって比較した。該細胞の自己蛍光のレベルは、蛍光分子の非存在下で、37℃で2時間、インキュベートされた細胞によって得た。
インキュベーションの後、105細胞をスーパーフロスト(Superfrost)付きスライド(SFPLUS-42, Milian)での細胞遠心によって沈殿させた。スライドは、15分間乾燥し、PERTEX(参照:00814,Histolab)でマウントした。
目的は、Nタンパク質の免疫検出によって、非-浸透細胞(細胞外N-GFP-PΔN複合体)で検出されたシグナルと、浸透細胞(細胞内又は細胞外N-GFP-PΔN複合体)で検出されたシグナルを比較することである。
II-1 N-GFP-PΔN複合体と、RAW細胞(マクロファージ)及びHEp2細胞(上皮)との相互作用の分析
RAW細胞は単球/マクロファージの株である。該細胞は、蛍光ポリマー、DX-FITC、と該細胞を接触させることによって観察され得る食作用能力を有する。DX-FITCの捕獲は、4℃と比べると、37℃では顕著に増加した(図1B)。HEp-2株は、上皮株である。それは、食作用能力を有さない。そのようなわけで、DX-FITCと該細胞との相互作用に関連した蛍光が4℃と37℃でのインキュベーションでほとんど差がない(図1A)。
37℃対4℃でのRAW細胞におけるN-GFP-PΔN複合体の最終結果を理解するために、細胞を透過させ、Nタンパク質の存在を免疫標識及びフローサイトメトリーによる分析によって明らかにした(図2)。透過の非存在下では、N保護(蛍光シグナル)の量は、4℃よりも37℃において少なかった(図2A)。一方、透過後、シグナルレベルは、37℃及び4℃のインキュベーション条件で同一となった(図2B)。従って、N-GFP-PΔN複合体は、37℃でのインキュベーションで内在化された。
I.材料及び方法
I.1 マウス:
Unite Experimentale Animalerie Rongeur(INRA, Jouy-en-Josas)で飼育された、雄性BALB/c、8〜10週齢。
−0.1064μg/μlのP161-241+N-GFP(N-GFP-PΔN)濃度。
−0.5μg/μlのGFP濃度。
−1μg/μlのP161-241+N-PΔN濃度。
−E.コリのLT(R192G)解毒リンホトキシン、1 mg/ml (John Clements; Choi et al ., 2004, Protein Expression and Purification 38, pp.205によって送られたバッチ)。
アベルチン麻酔(300 li.p.)下で、以下の混合物(60μl/マウス):
−5μgのLT(R192G)
−5μGのN-GFP-PΔN
又は、1.7μgの溶解性GFP、又は3.3μgのN-PΔN(5μgのN-GFP-PΔN中に存在するものに対応するGFP量又はN-PΔN量)
−非発熱性の生理的血清を有するgsp 60μl
の鼻腔内経路(i.n.)による投与。
ELISAによって、血清及びBAW中の抗-N-PΔN又は抗-GFP抗体(IgH+L及びIgA)を検索した。
−血清を血液試料から集め(4℃での1晩exsudation)、次いで-20℃で冷凍した。
−BAWを1700 rpmで5分間遠心し、上清を集め(約1 ml)、-20℃で冷凍した。
脾臓、及び気道(顔の、首の及び縦隔の気道)をドレインするガングリオンを、同一のプロトコールに従って処理した。脾臓を個々に処理し、ガングリオンを試験群によって分類した。
−PMA(ホルボール 12-ミリスチン酸エステル 13-酢酸エステル,Sigma)10 ng/ml、及びイオノマイシン(Sigma)1μg/ml(陽性対照、ポリクローナル活性化)
−完全RPMI(陰性対照)
−N-PΔN 10μg/ml
-GFP 10μg/ml。
−IFN-γ:捕獲抗体:クローンR4-6A2(BD Bioscience,551216)
−検出抗体:クローンXMG1.2(BD Bioscience,参照554410)
−組換えmIFN-γ:R&D装置485-MI
−IL-5:捕獲抗体:クローンTRFK5(BD Bioscience,554393)
−検出抗体:クローンTRFK4(BD Bioscience,参照554397
−組換えmIL-5:BD Bioscience 554581
−IL-10:捕獲抗体:クローンJES5-2A5(BD Bioscience,551215
−検出抗体:クローンSXC-1(BD Bioscience,参照554423)
−組換えmIL-10:BD Bioscience 550070
−ストレプトアビジンペルオキシダーゼImmunopure(Pierce21126)。
マン-ホイットニーU試験を行うことによって群を対で比較した(http://eatworms.swmed.edu/〜leon/stats/utest.html)。p<0.05の値が有意であると考えられた。
ワクチンベクターとしてN-PΔN複合体によって形成される環の効力を評価するために、RSVのN核タンパク質との融合タンパク質の形態のGFP(モデル抗原)で、BALB/cマウスを免疫した。N-GFP融合タンパク質は、先に記載の方法(特許第FR0504426号)によって精製され得る溶解性環構造を形成する。このようにしてNGFP-PΔNタンパク質複合体は得られた。ワクチン用途については、N-GFP及びPタンパク質が分離できるが、その操作は必ずしも必要でなく、N環の免疫原性についての発明者の先の結果は、PΔNの存在が負の効果を有さないことを示している。
N-PΔN複合体は、全身的経路及び粘膜経路によって免疫原性が非常に高い(特許第FR0504426)。GFPとNタンパク質との融合体は、血清レベル(図3B)又は粘膜レベル(図3C)の抗-N-PΔN Ac反応の強度を変更しない:すなわち、群N-GFP-PΔNと群N-PΔNとには有意な差はない。
抗体反応を刺激するその強い能力に加えて、N-PΔNは、全身的レベルの抗原依存的IFN-γの合成によって証明される記憶T反応を効果的に刺激するが(特許第FR0504426及び図4、N-PΔN脾臓対対照、P=0.01)、局所レベルの抗原依存的IFN-γの合成によって証明される記憶T反応を効果的に刺激しない(図5、局所的ガングリオン)。GFPのような外来抗原のNへの融合は、脾臓レベル(N-GFP-PΔN対N-PΔN、差はない)又はガングリオンのレベルで(図4)、そのT反応の確立を妨害するものではない。
N-GFP融合タンパク質の精製は、GSTに融合されたタンパク質P(断片161〜241)を用いる親和性によって行った。実施例1に従って構築されたタンパク質N-GFP(配列番号33)は、タンパク質Nの収量よりも10倍低い収量で精製された。加えて、約43 kDaの見掛け質量で移動する2つのポリペプチドの存在が依然として観察された。これらのバンドは、質量分析(MALDI-TOF)によって分析した。それらは、(i) Nタンパク質のC-末端の追加の11残基を生じる、(アルギニンのレベルでの)GFPからNを分離するリンカー配列において、及び (ii) 最後の6残基を除くことによって(リジンのレベルでの)Nタンパク質のC-末端において、起こった開裂に相当する。C-末端の6、12及び27残基が削除されたNタンパク質の構築は、NΔ5C及びNΔ12Cのタンパク質が依然としてPと相互作用し、切断された形態NΔ27Cとは異なる、ことを示している。
Claims (27)
- Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質であって、該Nタンパク質がパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのタンパク質であり、該対象タンパク質がNタンパク質のC-末端のインフレームに融合される、前記融合タンパク質。
- 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスが、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス(Metapneumovirus)、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスからなる群より選ばれる、請求項1記載の融合タンパク質。
- 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスが、ヒト又はウシ呼吸器合胞体ウイルスである、請求項1又は2記載の融合タンパク質。
- 前記の対象タンパク質が、マーカータンパク質、又は治療的もしくはワクチン的関心のタンパク質である、請求項1〜3のいずれか1項記載の融合タンパク質。
- 前記のワクチン的関心のタンパク質が、病原性微生物から得られる抗原である、請求項4記載の融合タンパク質。
- 前記の対象タンパク質が、そのC-末端のインフレームに融合されたGFPを、治療的又はワクチンタンパク質と共に含む構造である、請求項4記載の融合タンパク質。
- 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質が、天然タンパク質である、請求項1〜6のいずれか1項記載の融合タンパク質。
- 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質が、最後の25個のC-末端アミノ酸によって定義される領域で修飾されたNタンパク質であり、該修飾されたNタンパク質は、Pタンパク質と相互作用する能力を保持する、請求項1〜6のいずれか1項記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項9記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項10記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質の製造法であって、該Nタンパク質は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質であり、該対象タンパク質は、Nタンパク質のC-末端のインフレームに融合され、以下:
Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質の発現を許容する条件下での請求項11記載の宿主細胞の培養、及び
場合により発現されたNタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質の生成、
を含む、前記方法。 - Nタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体の製造法であって、該Nタンパク質及びPタンパク質は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのタンパク質であり、以下のステップ:
a) パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質を共発現し、該対象タンパク質は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーと同一のウイルスのPタンパク質で、Nタンパク質のC-末端のインフレームに融合され;
b) そのように形成されたNタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体を回収すること、
を含む、前記方法。 - 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質が、天然タンパク質である、請求項13記載の方法。
- 前記のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質が、最後の25個のC-末端アミノ酸によって定義される領域で修飾されたNタンパク質であり、該修飾されたNタンパク質は、Pタンパク質と相互作用する能力を保持する、請求項13記載の方法。
- 請求項13〜15のいずれか1項記載の方法によって得られる、Nタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体。
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質の製造法であって、そのC-末端のインフレームに対象タンパク質と融合され、以下:
請求項16記載のNタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体から、Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質の分離、を含む、前記方法。 - Nタンパク質と対象タンパク質との融合タンパク質であって、該Nタンパク質は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質であり、該対象タンパク質は、Nタンパク質のC-末端のインフレームに融合され、請求項13〜15のいずれか1項記載の方法によって得られる、前記融合タンパク質。
- 薬学的に許容される担体中、請求項1〜8又は18で定義された対象タンパク質と融合された、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質を含む、医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体中、請求項16で定義されたNタンパク質と対象タンパク質/Pタンパク質との複合体を含む、請求項19記載の医薬組成物。
- 免疫原性の又はワクチン組成物である、請求項19又は20記載の組成物。
- 治療的もしくはワクチン的関心の分子又はタンパク質のためのベクターの製造における、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質の使用。
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスが、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスからなる群より選ばれる、請求項22記載の使用。
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質に化学的に結合された、治療的又はワクチン的関心の分子を含む複合物。
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質のC-末端のインフレームに融合された抗原を含む融合タンパク質を含む診断試薬。
- パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質のC-末端のインフレームに融合された抗原を含む融合タンパク質の、融合タンパク質の抗原に対する抗体のin vitro検出における使用。
- 生物試料中の抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、以下のステップ:
a) 該生物試料を、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ファミリーのウイルスのNタンパク質のC-末端のインフレームに融合された抗原を含む融合タンパク質と接触させ、
b) 得られたN-抗原融合タンパク質/抗体複合体を検出すること、
を含み、
かかる複合体の存在は、抗原特異的抗体の生物試料中の存在を示唆する、前記方法。
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