PL218245B1 - Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks - Google Patents

Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks

Info

Publication number
PL218245B1
PL218245B1 PL397776A PL39777602A PL218245B1 PL 218245 B1 PL218245 B1 PL 218245B1 PL 397776 A PL397776 A PL 397776A PL 39777602 A PL39777602 A PL 39777602A PL 218245 B1 PL218245 B1 PL 218245B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
hiv
chaperone
complex
leu
Prior art date
Application number
PL397776A
Other languages
English (en)
Other versions
PL397776A1 (pl
Inventor
Christian Scholz
Herbert Andres
Elke Faatz
Alfred Engel
Dorothea Sizmann
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of PL397776A1 publication Critical patent/PL397776A1/pl
Publication of PL218245B1 publication Critical patent/PL218245B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks.
Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem wywołującym chorobę określaną jako nabyty zespół niedoboru odporności (AIDS). Dwa główne szczepy tego wirusa oznaczone zostały jako HIV-1 oraz HIV-2. Wirus HIV jest obecnie dość szeroko rozpowszechniony i stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia i dobrobytu ludzi na całym świecie, co zmusza publiczne systemy opieki zdrowotnej do wydawania ogromnych sum pieniędzy na cele diagnostyki HIV i leczenia AIDS.
Jedną z dróg rozpowszechniania wirusa HIV jest przetaczanie zakażonej krwi lub preparatów krwiopochodnych. Wszystkie uprzemysłowione kraje, podobnie jak wiele krajów rozwijających się, wymagają więc obecnie wykonywania obowiązkowych testów u dawców krwi w celu zapobieżenia dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusa. Zadaniem wszystkich stosowanych w tym celu metod diagnostycznych jest wykrywanie infekcji wirusowej HIV we krwi tak szybko i skutecznie, jak to jest tylko możliwe.
Zasadniczo wyróżnić można trzy dostępne obecnie sposoby diagnozowania:
(1) wykrywanie obecności genomu wirusa we krwi przez czułe procedury diagnostyczne kwasu nukleinowego, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), (2) wykrywanie obecności antygenów wirusowych we krwi; i (3) wykrywanie w płynach ustrojowych przeciwciał skierowanych przeciwko HIV.
W przebiegu zakażenia wirusem HIV wyróżnia się kilka faz o różnym znaczeniu diagnostycznym. We wczesnej fazie zakażenia („faza wiremii”) wykrywa się jedynie białka i peptydy pochodzące od wirusa HIV, podczas gdy nie obserwuje się jeszcze przeciwciał przeciwko HIV. W kolejnej fazie, określanej terminem serokonwersji, pojawiają się przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi HIV, podczas gdy ilość antygenów wirusowych (czyli tzw. obciążenie wirusem) spada. Większość przeciwciał wytwarzanych we wczesnej fazie serokonwersji należy do klasy immunoglobulin M (IgM). W późniejszym okresie infekcji, odpowiedź odpornościowa na zakażenie HIV przestawia się na produkcję immunoglobulin klasy G (IgG), które stanowią wtedy większość przeciwciał skierowanych przeciwko HIV. Podczas dalszego przebiegu zakażenia poziom przeciwciał przeciwko HIV może się obniżyć, podczas gdy obciążenie wirusem (obecność cząstek lub antygenów wirusowych) w płynach ustrojowych może ponownie ulec podwyższeniu. Przeszukiwanie na obecność wirusa HIV jest korzystnie wykonywane przy użyciu testów serologicznych wykrywających przeciwciała przeciwko HIV, czasami w połączeniu z wykrywaniem antygenów wirusa HIV, ponieważ odpowiedź odpornościowa zmienia się w trakcie przebiegu zakażenia u pacjenta, a także wykazuje zróżnicowany przebieg u poszczególnych pacjentów, bardzo ważnym czynnikiem jest dysponowanie wyjątkowo czułym i niezawodnym testem immunologicznym, wykrywającym przeciwciała klasy IgM i IgG skierowane przeciwko HIV. Opisano wiele różnych podejść metodycznych do problemu wykrywania infekcji HIV. Sposoby wczesnego, niezawodnego i czułego wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko białkom wirusowym odgrywają w tym względzie kluczową rolę.
Białka wirusowe, określane często jako antygeny wirusowe, mogą być wykrywane jedynie w momencie rozpoczęcia infekcji i w bardzo późnym stadium choroby. Testy wykrywające antygeny wirusowe, np. testy, w których oznacza się p24 (wirusa HIV-1) lub p26 (wirusa HIV-2), z których oba są białkami rdzenia wirusa, mogą być więc stosowane tylko w kombinacji z innymi środkami diagnostycznymi, aby zapewnić skuteczne wykrywanie infekcji wirusem HIV.
Istnieją trzy grupy antygenów wirusowych, które są teoretycznie dostępne i które mogą indukować tworzenie się przeciwciał u gospodarza, a zatem mogą być wykorzystane jako antygeny w procedurach diagnostycznych. Są to białka otoczki wirusa (kodowane przez geny z regionu env), enzymy wirusowe lub wirusowe białka regulatorowe wirusa, takie jak odwrotna transkryptaza lub integraza (kodowane przez geny z regionu pol) oraz strukturalne białka rdzenia (kodowane przez geny z regionu gag). Białka otoczki wirusów HIV-1 i HIV-2 są glikoproteinami, syntetyzowanymi jako polipeptydowe prekursory białek (gp160 w przypadku HIV-1 oraz gp140 w przypadku HIV-2). Po syntezie wysokocząsteczkowych prekursorów są one cięte, co prowadzi do powstania odpowiednio gp120 i gp41 (w przypadku HIV-1) oraz gp110 i gp36 (w przypadku HIV-2). Większe z tych polipeptydów (odpowiednio gp120 i gp110) tworzą podjednostkę powierzchniową, która jest związana z mniejszymi błonowymi polipeptydami (odpowiednio gp41 i gp36) przez luźny kontakt. U wielu gospodarzy (pacjenPL 218 245 B1 tów) glikoproteiny otoczki są korzystnymi celami przeciwwirusowej odpowiedzi odpornościowej. Ratner L. i wsp., Nature 313 (1985) 277-84 wykazali, że zwłaszcza błona obejmująca te białka otoczki, tj. odpowiednio gp41 lub gp36, niesie największy potencjał immunogenny wśród białek wirusowych.
Testy immunologiczne, takie jak np. ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), wykorzystujące polipeptydy kodowane przez wirusa HIV, są szeroko wykorzystywane w diagnostyce i badaniach przesiewowych. Polipeptydy wirusowe są bezpośrednio wytwarzane z materiału wirusowego, lub też uzyskiwane są przy użyciu technologii rekombinacji DNA w systemach ekspresji in vitro lub in vivo. Obydwa te sposoby otrzymywania antygenów cechują poważne ograniczenia. Polipeptydy pochodzące z preparatów wirusowych mogą być zanieczyszczone żywymi wirusami lub zakaźnym materiałem genetycznym, co stanowi zagrożenie dla personelu stosującego taki materiał. Z kolei materiał uzyskany dzięki technikom rekombinacji może być zanieczyszczony innymi białkami, które nie pochodzą od gospodarza HIV, co może prowadzić do zmniejszenia swoistości lub zmniejszenia czułości takiego testu.
W sposobie wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom patogennym, takim jak patogeny wirusowe, bardzo często i z dużym sukcesem wykorzystuje się systemy oparte na podwójnym mostku antygenowym, opisane w opisie patentowym USA nr 4 945 042. Testy immunologiczne oparte na idei mostka wymagają zastosowania antygenu bezpośrednio lub pośrednio związanego z fazą stałą oraz tego samego lub wykazującego reaktywność krzyżową antygenu w postaci łatwo rozpuszczalnej, który wykrywany może być w sposób pośredni lub bezpośredni. Badane przeciwciała, jeśli są obecne w testowanym materiale, tworzą mostek pomiędzy antygenem związanym z fazą stałą a wyznakowanym wykrywanym antygenem. Tylko w przypadku połączenia obu antygenów mostkiem tworzonym przez swoiste przeciwciała otrzymuje się pozytywny sygnał.
Opisano szereg prób wykorzystania wyprodukowanego technikami rekombinacyjnymi białka gp41 jako antygenu do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV. Do detekcji przeciwciał przeciwko HIV może być stosowane, z pewnymi ograniczeniami, rekombinowane białko gp41 wytwarzane techniką rekombinacji. Takie gp41 może być użyte samo lub w kombinacji z innymi antygenami HIV do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV. Znane są też obecnie testy, które w sposób niezależny wykrywają obecność zarówno antygenów HIV i/lub przeciwciał przeciw HIV. W WO 93/21346 opisano taki „kombinowany test” do jednoczesnego wykrywania antygenu gp24 oraz przeciwciał skierowanych przeciwko HIV-1 gp41 i HIV-2 gp36. W teście tym zastosowano fazę stałą, którą bezpośrednio opłaszcza się gp41 wytworzonym techniką rekombinacji.
Stwierdzono także, że jednym ze sposobów na utrzymanie gp41 (lub gp36) w roztworze jest zastosowanie wyjątkowo wysokiej lub niskiej wartości pH. Wiadomo, że wytwarzane metodami rekombinacji gp41 zachowuje rozpuszczalność przy wartości pH zbliżonej do 3,0 i niższej lub też przy wartości pH zbliżonej do 11,0 i wyższej. Jednak niestety, HIV-lgp41 i HIV-2 gp36 odpowiednio są w zasadzie nierozpuszczalne w fizjologicznym zakresie pH. Testy immunologiczne są na ogół przeprowadzane przy fizjologicznym pH. Z powodu nierozpuszczalności przy fizjologicznym pH retrowirusowe glikoproteinowe antygeny powierzchniowe stosowane w licznych testach immunologicznych są stosowane w postaci bezpośrednio naniesionej na materiał fazy stałej. Bezpośrednie opłaszczenie materiałów fazy stałej antygenami jest jednak w wielu przypadkach niekorzystne, i prowadzi do niepożądanych zmian, jak zmiany konformacyjne, rozfałdowanie cząsteczkowe, zmiana w antygenowości, zwiększona niestabilność i problemy z sygnałem tłem (patrz Butler J. E. i wsp., J. Immunol. Methods 150 (1992) 77-90).
Choć możliwa jest solubilizacja retro wirusowych glikoprotein powierzchniowych (rsgp) za pomocą silnie chaotropowych odczynników lub odpowiednich detergentów, to jednak solubilizowany w ten sposób materiał ma ograniczone zastosowanie jako narzędzie diagnostyczne.
Nierozpuszczalność retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych w fizjologicznych warunkach pH sprawia, że te białka są trudnym celem w rutynowych procedurach (bio)chemicznych. Zdecydowana większość procedur „znakowania związków chemicznych”, tj. chemicznych procedur wykorzystanych do związania znacznika np. grupy znacznikowej z polipeptydem, opiera się na chemii nukleofilowej i jest skuteczna w dość wąskim zakresie pH, między wartością pH od około 6 do około 8, a zatem stosowana jest tylko w warunkach mniej lub bardziej fizjologicznej wartości pH. Takie rutynowe procedury, np. jak opisane w Aslam M., Dent A., „Bioconjugation”, rozdz. „The preparation of protein-protein conjugates” (1998) 216-363, wyd. M. Aslam i A. Dent, McMillan Reference, Londyn) albo nie działają skutecznie, albo są trudne do przeprowadzenia przy skrajnych wartościach pH (lub w obec4
PL 218 245 B1 ności detergentów takich jak SDS) wymaganych do solubilizacji retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych.
Jak wspomniano powyżej, zastosowanie testów immunologicznych opartych na koncepcji mostka okazało się korzystne w przypadku szerokiego zakresu testów mających na celu wykrycie przeciwciał reaktywnych wobec organizmów patogennych. Jednak z powodu jej niskiej rozpuszczalności, nie było np. możliwe wykorzystanie cząsteczki e-gp41 (tj. ektodomeny glikoproteiny 41) HIV-1 lub odpowiednio e-gp36 w takim układzie testowym.
W celu skompensowania wad związanych z bezpośrednim spłaszczaniem zaprojektowano szereg testów, w których zamiast antygenu e-gp41 zastosowano syntetyczne lub wyprodukowane drogą rekombinacji częściowe sekwencje tego antygenu, pokrywające się w większym lub mniejszym stopniu z immunodominującym regionem tzw. pętli. Przykłady takich testów są wskazane w literaturze patentowej podanej poniżej.
Region pętli w zewnątrzkomórkowej części gp41 jest nie helikalnym fragmentem o wierzchołkowej strukturze spinki do włosów, który łączy N-końcową domenę helikalną z C-końcową domeną helikalną. Znaczna część surowic odpornościowych reagujących z gp41 zawiera przeciwciała przeciwko temu wierzchołkowemu motywowi pętli. Zatem struktura „spinki do włosów” lub „pętli”, utrzymywana mostkiem disulfidowym, stanowi immunodominujący region gp41. Jednym ze sposobów na ominięcie problemu związanego ze stosowaniem rekombinowanego gp41 jest więc chemiczne wytwarzanie peptydow przedstawiających częściowe sekwencje gp41.
Należy zauważyć, że gp41 lub gp36, odpowiednio, są określane tutaj jako tzw. ektodomeny obejmujące połączone pętlą N-końcowe i C-końcowe helisy, lecz pozbawione N-końcowego peptydu fuzyjnego oraz C-końcowej części przezbłonowej.
Fragmenty peptydowe wielu antygenów HIV ujawnione zostały w dotyczącej tego zagadnienia literaturze patentowej (australijskie zgłoszenie patentowe nr 597 884 (57733/86) oraz zgłoszenia patentowe USA nr 4 735 896 i 4 879 212). W szczególności, te trzy opisy ujawniają konserwowany region immunodominujący glikoproteiny gp41, region pętli w głównym białku otoczki wirusa HIV-1. Zsyntetyzowano również analogiczny region immunodominujący białka gp36 z HIV-2. Peptydy odpowiadające tym regionom pętli, tworzącym wierzchołek ektodomeny, umożliwiają wczesną diagnostykę HIV-1 i HIV-2 oraz dostarczają testów o wystarczającej, choć nie optymalnej czułości i dobrej swoistości. Jednak ich ograniczenia widoczne są w odniesieniu do wykrywania przeciwciał IgM podczas pierwszych dni fazy serokonwersji u niektórych pacjentów.
WO 92/22573 ujawnia peptydy o własnościach immunologicznych wspólnych ze szkieletem białka, tj. immunodominującym regionem przezbłonowego białka otoczki (np. gp41 lub gp36) różnych ssaczych wirusów niedoboru odporności. Potwierdza to także, że ten immunodominujący region obejmuje pętlę z mostkiem disulfidowym, która jest silnie konserwowana w wirusach niedoboru odporności pochodzących od różnych gatunków ssaków.
EP 396 559 dotyczy sztucznych peptydow niosących sekwencję aminokwasową odpowiadającą naturalnie występującej sekwencji aminokwasowej w HIV. Podobnie jak uprzednio, epitopy pochodzą z sekwencji odpowiadających strukturze pętli odpowiednio, gp41 lub gp36. Udoskonalono je dalej tak, aby zawierały mostek disiarczkowy, utworzony w wyniku chemicznej oksydacji zachodzącej między dwoma resztami cysteinowymi w pętli immunodominującej.
Dość znaczny procent przeciwciał obecnych w surowicy odpornościowej anty-HIV pacjentów zainfekowanych wirusem HIV nie reaguje jednak z motywem sekwencji lub jego wariantami pochodzącymi z immunodominującej pętli gp41 lub gp36. Podczas gdy te antygeny peptydowe mogą być stosowane z wykorzystaniem korzystnej idei mostka, to przeciwciała reagujące z z epitopami położonymi poza regionem pętli gp41 HIV nie są wykrywane. Nie tylko kluczowa jest bardzo wczesna diagnostyka infekcji wirusem HIV, ale jest również szczególnie ważne wykrywanie możliwie najwięcej podtypów wirusów HIV-1 i HIV-2. Im więcej epitopów, zwłaszcza prawidłowo sfałdowanych konformacyjnych epitopów rsgp, jest obecnych, tym mniejsze jest ryzyko niewykrycia zainfekowanej próbki z powodu fałszywie ujemnego wyniku.
Z powyższego powodu podjęto nieustanne wysiłki dostarczenia większych części cząsteczki retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, zwłaszcza gp41 z HIV-1, w postaci rozpuszczalnej.
Biofizyczne i biochemiczne właściwości gp41 były w ubiegłych latach intensywnie badane. Lu
M. i wsp. (Nat. Struct. Biol. 2 (1995) 1075-82) wyjaśnili częściowo trimerową strukturę gp41. Ponieważ w warunkach fizjologicznych gp41 tworzy nierozpuszczalne agregaty, badania ograniczono do skróconych wersji ektodomeny gp41.
PL 218 245 B1
Przy pomocy spektroskopii NMR udało się niedawno potwierdzić, że natywny trimer gp41 tworzy wiązkę sześciu helis, obejmującą trzy równoległe centralne helisy N-końcowe, do których przylegają helisy C-końcowe o orientacji antyrownoległej (Caffrey M. i wsp., J. Biol. Chem. 275 (2000) 19877-82).
Opisano również wysokocząsteczkowe agregaty gp41. Takie agregaty tworzą się najprawdopodobniej przez oddziaływanie tzw. wierzchołkowego regionu pętli gp41.
Projektując strukturę białek, opracowano inhibitor wejścia HIV-1 do komórek docelowych (Root M. J. i wsp, Science 291 (2001) 884-888). Inhibitor ten obejmuje trzy odcinki pochodzące z N-końcowej domeny helikalnej gp41 i dwa odcinki C-końcowej domeny helikalnej tej cząsteczki. Ten wytworzony przy użyciu inżynierii genetycznej konstrukt nie obejmuje jednak wielu domen i wielu epitopów antygenowych natywnej cząsteczki, a zwłaszcza nie zawiera tzw. motywu pętli, o którym wiadomo, że obejmuje szczególnie immunogenne epitopy (patrz powyżej).
Istnieje zatem wciąż ogromna potrzeba dostarczenia jak największej liczby epitopów retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych w rozpuszczalnej postaci. Zwłaszcza istnieje potrzeba dostarczenia takich rozpuszczalnych antygenów obejmujących odpowiednio gp41 z HIV-1 lub gp36 z HIV-2, do wykorzystania w wielu leczniczych i diagnostycznych zastosowaniach.
Zadaniem niniejszego wynalazku było zbadanie, czy możliwe jest dostarczenie większej liczby epitopów retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych lub nawet odpowiednio cząsteczek e-gp41 lub e-gp36, w postaci rozpuszczalnej.
Ponadto, zbadano możliwość dostarczenia wariantów gp41 lub gp36, które byłyby łatwiejsze do manipulowania, i/lub które, zwłaszcza w warunkach buforowych wymaganych do przeprowadzenia testu immunologicznego lub wymaganych do immunizacji, są rozpuszczalne w postaci kompleksu obejmującego wariant białka i białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.
Białka opiekuńcze, znane jako klasyczne „białka wspomagające fałdowanie”, są polipeptydami obecnymi w procesie fałdowania i podtrzymywania strukturalnej integralności innych białek. Mają one zdolność do pobudzania procesu fałdowania polipeptydu zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. Cząsteczki wspomagające fałdowanie dzieli się na ogół na dwie podgrupy: katalizatory fałdowania oraz cząsteczki pełniące rolę „opiekunów”. Katalizatory fałdowania przyspieszają etapy ograniczające szybkość fałdowania z powodu swoich katalitycznych właściwości. Przykłady takich katalizatorów zostały opisane poniżej. O „białkach opiekuńczych” wiadomo, że wiążą się ze zdenaturowanymi lub częściowo zdenaturowanymi polipeptydami i w ten sposób ułatwiają ich renaturację. Zatem, w przeciwieństwie do katalizatorów procesu fałdowania, białka opiekuńcze ograniczają się jedynie do funkcji wiążącej (Buchner i wsp., Faseb J. 10 (1996) 10-19).
Białka opiekuńcze są wszechobecnymi białkami, indukowanymi przez stres włączonymi w dojrzewanie, fałdowanie, translokację i degradację białek (Gething M. J. oraz Sambrook J., Nature 355 (1992) 33-45). Choć białka te obecne są w normalnych warunkach wzrostu, są obficie indukowane w warunkach stresu. Potwierdza to dalej ideę, że ich fizjologiczną funkcją jest radzenie sobie z warunkami stresu.
Obecnie znanych jest kilka różnych rodzin białek opiekuńczych. Wszystkie te białka opiekuńcze charakteryzują się zdolnością do wiązania niesfałdowanych lub częściowo sfałdowanych białek i mają fizjologiczną funkcję związaną z prawidłowym fałdowaniem białek lub z usuwaniem białek zdenaturowanych lub tych, które uległy agregacji.
Dobrze scharakteryzowanymi przykładami białek opiekuńczych są członkowie rodzin tak zwanych białek szoku termicznego, które noszą nazwy odpowiadające ich względnej masie cząsteczkowej; na przykład hsp100 hsp90, hsp70 oraz hsp60, jak również tak zwane małe białka szoku termicznego shsp ( small heat-shock proteins), opisane przez J. Buchnera (Faseb J. 10 (1996) 10-19) oraz M. Beissingera i J. Buchnera (J. Biol. Chem. 379 (1998) 245-259).
W odróżnieniu od białek opiekuńczych, katalizatory fałdowania wspomagają fałdowanie przez przyśpieszenie określonych etapów ograniczających szybkość całego procesu, obniżając w ten sposób stężenie produktów pośrednich fałdowania, podatnych na agregację. Jedna z klas tych katalizatorów, obejmująca tzw. białkowe izomerazy disulfidowe (noszące również nazwę oksydoreduktaz tiolowo-disulfidowych), katalizuje tworzenie się i rearanżację wiązań disulfidowych w białkach sekrecyjnych. U bakterii Gram-ujemnych, proces oksydatywnego fałdowania białek sekrecyjnych w periplazmie jest dostosowywany przez kaskadę białkowych izomeraz disulfidowych, oznaczonych jako DsbA, DsbB, DsbC oraz DsbD (Bardwell J. C., Mol. Microbiol. 14 (1994) 199-205 oraz Missiakas D. i wsp. Embo J. 14 (1995) 3415-3424).
PL 218 245 B1
Inna ważna klasa katalizatorów fałdowania, określonych jako izomerazy cis/trans peptydyloprolilowe (PPI) obejmuje takie białka jak CypA, PpiD (Dartigalongue, C. oraz Raina S., Embo J. 17 (1998) 3968-3980), FkpA (Danese, P. N. i wsp., Genes Dev. 9 (1995) 387-398) czynnik wyzwalający (Crooke E. oraz Wickner W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 5216-5220; Stoller G. i wsp., Embo J. 14 (1995) 4939-4948) oraz SlyD (Hottenrott S. i wsp., J. Biol. Chem. 272 (1997) 15697-15701). Spośród nich FkpA, SlyD i czynnik wyzwalający, wykazują pokrewieństwo na podstawie zestawienia ich sekwencji.
Izomerazę peptydyloprolilową FkpA zlokalizowano w periplazmie bakterii Gram-ujemnych. Podejrzewano, że to białko opiekuńcze jest istotne dla transportu i translokacji bakteryjnych białek zewnętrznej błony komórkowej. Ramm K. i Pluckthun A. (J. Biol. Chem. 275 (2000) 17106-1713) stwierdzili, że FkpA wykazuje podwójnie korzystny wpływ na prawidłowe fałdowanie białek. Po pierwsze, FkpA oddziałuje z wczesnymi produktami pośrednimi fałdowania, zapobiegając w ten sposób ich agregacji. Po drugie, białko FkpA ma zdolność reaktywowania nieaktywnego białka, prawdopodobnie również przez związanie się z częściowo niesfałdowanymi białkami, które mogą istnieć w stanie równowagi z postacią zagregowaną.
Niektóre białka wspomagające proces fałdowania zawierają zarówno domenę aktywną katalitycznie, jak i domenę „opiekuńczą” (lub wiążącą polipeptyd). Reprezentatywne przykłady obejmują np. czynnik wyzwalający (Zarnt T. i wsp., J. Mol. Biol. 271 (1997) 827-837; Wang C. C. oraz Tsou C. L., Faseb J. 7 (1993) 1515-1517), SurA (Behrens i wsp., EMBO J. 20 (2001) 285-294) oraz DsbA (Frech C i wsp., EMBO J. 15 (1996) 392-398). Zgodnie z naszymi obserwacjami, wydaje się, że taka sama struktura modułowa występuje odpowiednio w izomerazach peptydyloprolilowych FkpA oraz SlyD.
Stosując różne niezależne systemy wykazano, że wzmożona ekspresja białek opiekuńczych może ułatwiać wytwarzanie rekombinowanych polipeptydów. Odpowiedni przykład można znaleźć w publikacji WO 94/08012.
Wiadomo również, że zwiększone wytwarzanie białek można osiągnąć wykorzystując konstrukt genowy obejmujący sekwencję kodującą zarówno żądany polipeptyd, jak i sekwencję białka opiekuńczego. Ta koncepcja białka fuzyjnego zastosowana została z sukcesem, na przykład, do uzyskania znacznego zwiększenia wytwarzania ludzkiej proinsuliny w periplazmie Escherichia coli przez wykorzystanie konstruktu genowego obejmującego gen ludzkiej proinsuliny i DsbA (Winter J. i wsp. Journal of Biotechnology 84 (2000) 175-185).
Podejście do stosowania białek opiekuńczych do zwiększenia wytwarzania prawidłowo sfałdowanych polipeptydów wynika głównie ze zdolności tych białek do wiązania, a następnie działania solubilizacyjnego. Po rekombinacyjnym wytworzeniu polipeptydu fuzyjnego obejmującego białko opiekuńcze i żądany produkt białkowy dochodzi zazwyczaj do odcięcia białka opiekuńczego i otrzymania żądanego polipeptydu w czystej postaci. Niniejszy wynalazek jest natomiast oparty na wykorzystaniu korzystnego wpływu odpowiedniego białka opiekuńczego na rozpuszczalność związanej z nim na stałe retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej.
Ku naszemu zaskoczeniu, stwierdziliśmy, że białka wspomagające fałdowanie, np. wielu członków z klasy izomeraz peptydyloprolilowych (PPI), zwłaszcza z rodziny FKBP, nie tylko wykazują aktywność katalityczną, ale także w drastyczny sposób wpływają na rozpuszczalność amyloidogennych białek, lub, mówiąc bardziej ogólnie, białek wykazujących skłonność do agregacji. Osiągają to tworząc rozpuszczalne kompleksy z takimi białkami, które w innym wypadku (tj. w izolowanej postaci, bez asocjacji z białkiem opiekuńczym) byłyby skłonne do agregacji. Takie białka, które w innym wypadku prawie by się nie rozpuszczały lub w ogóle nie rozpuszczały w warunkach fizjologicznych, po związaniu w kompleksie z odpowiednim białkiem opiekuńczym PPI stają się rozpuszczalne w łagodnych fizjologicznych warunkach (tj. bez potrzeby stosowania solubilizatorów, takich jak detergenty lub czynniki chaotropowe). Zatem, jesteśmy w stanie wytwarzać, na przykład, rozpuszczalne kompleksy białka z białkiem opiekuńczym, np. obejmujące białko gp41 wirusa HIV-1 jako białko docelowe skłonne do agregacji i FkpA lub inne białko z rodziny FKBP, jako białko opiekuńcze nadające rozpuszczalność.
Stwierdziliśmy również, że pewne dobrze określone warianty gp41 HIV-1 lub gp36 HIV-2 są szczególnie odpowiednie do tworzenia rozpuszczalnych kompleksów z białkami opiekuńczymi z klasy PPI.
Na przykład, kompleksy gp41 i FkpA lub też gp36 i FkpA, są łatwo rozpuszczalne, np. w warunkach fizjologicznych, mogą być łatwo wyznakowane w korzystnym zakresie pH i mogą być też z wielkim sukcesem stosowane do wykrywania przeciwciał przeciwko gp41 lub gp36 (odpowiednio wirusów
HIV-1 i HIV-2), a zatem do diagnostyki infekcji HIV.
PL 218 245 B1
Krótki opis figur
Figury 1A i IB. Wyniki dichroizmu kołowego (CD) w dalekim (1A) i bliskim (IB) UV dla ektodomeny gp41 (535-681)-His6 HIV-1
Sfałdowane gp41 (gruba linia): warunki buforowe (30 mM mrówczan sodu, pH 3,0) ustalono tak, aby zaindukować zbliżoną do natywnej helikalną konformację białka gp41. Zdenaturowane białko gp41 (cienka linia): warunki buforowe (50 mM fosforan sodu pH 3,0; 7 M GuHCl) ustalono tak, aby całkowicie zdenaturować (rozfałdować) gp41. Wskutek wysokiego stężenia soli chaotropowej, referencyjny sygnał dichroizmu kołowego CD na fig. 1A (cienka linia) nie może być odpowiednio monitorowany przy długości fali poniżej 215 nm. Widma rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco-720 i uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia tła. Długość ścieżki wynosiła 0,2 cm dla CD w dalekim UV (fig. 1A) oraz 0,5 cm dla CD w bliskim UV (fig. 1B). Odpowiednie wartości stężenia białek wynosiły 1,5 μΜ i 29 μΜ. Jednostki na osi rzędnych odpowiadają średniej eliptyczności reszt i mają wie l2 -1 kość deg x cm2 x dmol-1.
Figura 2. Agregacja białka gp41 bez białka opiekuńczego w buforze fizjologicznym
Przedstawiono widma UV dla ektodomeny białka gp41 po upływie jednej minuty (dolna linia) i 10 minut (górna linia) od zmiany wartości pH z poziomu 3,0 do 7,5. Agregacja cząsteczek prowadzi do efektu rozproszenia światła oraz wyraźnej absorpcji poniżej 310 nm. Figura ta ma demonstrować wzmożoną skłonność do agregacji gp41; warto zauważyć, że proces agregacji nie zatrzymuje się na etapie wskazanym przez górną linię.
Figury 3A i 3B. FkpA solubilizuje ektodomenę gp41 w buforze o neutralnej wartości pH
Białko gp41 oraz dojrzałe FkpA inkubowano razem w buforze o niskim pH, a następnie zmieniono warunki buforowe na następujące: 20 mM fosforan sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA. Po upływie 1 lub 10 minut (dolna linia i górna linia, odpowiednio) rejestrowano widmo UV w celu oszacowania agregacji w próbkach. Figura 3A przedstawia supresję agregacji przy dwukrotnym nadmiarze stężenia molowego białka opiekuńczego. Figura 3B przedstawia efekt czterokrotnego nadmiaru. Końcowe stężenie gp41 wynosiło około 1 μM. Ponieważ rozproszenie światła (prowadzące do wyraźnej absorpcji poniżej 300 nm) uległo zmniejszeniu do minimum, otrzymano przekonujący spektroskopowy dowód, że FkpA wydajnie solubilizuje ektodomenę gp41 w sposób zależny od dawki.
Figura 4. Widmo UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5
Widmo UV dla polipeptydu fuzyjnego FkpA-gp41 po dializie wobec 50 mM fosforanu sodu, pH 2,5; 50 mM NaCl. Nieoczekiwanie, ten dwudomenowy konstrukt pozostaje całkowicie rozpuszczalny po usunięciu solubilizującego czynnika chaotropowego GuHCl. Brak jest dowodów na istnienie rozpraszających światło agregatów, które powinny powodować przesunięcie linii podstawowej i znaczącą absorpcję przy długościach fali poniżej 300 nm
Figura 5. Widmo CD w bliskim UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5.
Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 2,5 oraz 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C Uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia wartości tła. Stężenie białka wynosiło 2,5 |iM a długość ścieżki 0,5 cm. Aromatyczna eliptycznosc wykazuje typową sygnaturę gp41 (dla porównania patrz fig. 1B).Przy pH 2,5 FkpA jest przeważnie nieustrukturyzowane i nie przyczynia się w ogóle do sygnału CD w bliskim UV.
Figura 6. Widmo CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 przy pH 2,5
Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 2,5; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C Uśredniano dziewięć wyników w celu poprawienia stosunku sygnału do tła. Stężenie białka wynosiło 2,25 μΜ, a długość ścieżki 0,2 cm. Minima przy wartościach 220 i 208 nm wskazują na głównie heliakalną strukturę białka gp41 jako części białka fuzyjnego. Zwiększone wartości tła spektralnego poniżej 197 nm są wynikiem silnej absorpcji dla amidów i nie wskazują na żadne strukturalne cechy białka fuzyjnego. Niemniej jednak, można przypuszczać, że występuje w tym wypadku typowe maksimum helikalne przy długości fali 193 nm.
Figura 7. Widmo CD w bliskim UV dla FkpA-gp41 w buforze fizjologicznym
Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 7,4; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C Uśredniano dziewięć wyników w celu obniżenia wartości tła. Stężenie białka wynosiło 15,5 μΜ, a długość ścieżki 0,5 cm. Uderzające jest to, że aromatyczna eliptycznosc kowalencyjnie sprzężonych domen białkowych gp41 i FkpA (ciągła linia) powstała przez zsumowanie wkładu helikalnego białka gp41 o strukturze przypominającej natywną przy pH 3,0 (dolna przerywana linia) i wkładu FkpA przy pH 7,4 (górna przerywana linia). To wskazuje, że zarówno no8
PL 218 245 B1 śnikowe FkpA, jak i docelowe gp41 (tj. dwie odrębne funkcjonalnie jednostki fałdowania) ulegają fałdowaniu w sposób odwracalny i quasi-niezależny, gdy połączone są ze sobą w białku fuzyjnym.
Figura 8. Widmo CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 w buforze fizjologicznym
Widmo rejestrowano w spektropolarymetrze Jasco 720 w roztworze 20 mM fosforanu sodu pH 7,4; 50 mM NaCl, w temperaturze 20°C. Uśredniano dziewięć wyników w celu poprawienia stosunku sygnału do tła. Stężenie białka wynosiło 1,55 μΜ, a długość ścieżki 0,2 cm. Silne sygnały dla wartości odpowiednio 222 nm i 208 nm wskazują na głównie helikalną strukturę białka gp41 jako części białka fuzyjnego. Wartości tła spektralnego poniżej 198 nm są wynikiem wysokiej absorpcji dla białek i nie wskazują na żadną drugorzędową cechę strukturalną białka fuzyjnego FkpA-gp41.
Figura 9. gp41 sprzężone z FkpA jest zarówno rozpuszczalne, jak i silnie immunoreaktywne w teście HIV
FkpA-gp41 wykazuje silne właściwości kompetycyjne w teście Combi COBAS CORE HIV. Przedstawiono potencjał inhibicyjny rozpuszczalnego polipeptydu FkpA-gp41 (wypełnione kółka) po wstępnym potraktowaniu buforem do rozcieńczania (zawierającym Triton X-100 jako pomocniczy detergent) w porównaniu z samą ektodomeną gp41 (puste kółka). Jest oczywiste, że ektodomeną gp41 (zawarta w wewnątrzcząsteczkowym kompleksie białka fuzyjnego) zachowuje swoją wysoką immunoreaktywność nawet w obecności detergentu, podczas gdy nieosłonięta ektodomeną prawie całkowicie traci immunoreaktywność. Testowana HIV-dodatnia surowica była wewnętrzną surowicą numer 21284 w rozcieńczeniu 1:3000.
Figura 10. Widmo UV dla FF36 po renaturującej filtracji żelowej
Widmo dostarcza przekonującego dowodu na to, że peptyd fuzyjny gp36 jest rozpuszczalny i nie ulega agregacji po ponownym sfałdowaniu na kolumnie Sux 200 (zgodnie ze sposobem renaturującej filtracji żelowej, opisanej w sekcji przykłady).
Figura 11 (1 + 2). FkpA-gp21 jest zarówno rozpuszczalnym, jak i immunologicznie reaktywnym polipeptydem fuzyjnym
Po renaturującej filtracji żelowej, ponownie sfałdowane białko fuzyjne FkpA-gp21 ulega elucji w postaci wysoce rozpuszczalnej i nie wykazuje skłonności do agregacji w widmie UV (11/1). Wynik testu kompetycyjnego COBAS CORE z HTLV-pozytywną surowicą 858893-00 (rozcieńczenie 1:10) wskazuje, że FkpA-gp21 posiada znakomite właściwości immunologiczne (11/2).
Niniejszy wynalazek dotyczy kompleksu rozpuszczalnego obejmującego retrowirusową glikoproteinę powierzchniową wybraną spośród HIV-1gp41, HIV-2gp36 i HTLVgp21 i izomerazę peptydyloprolilową wybraną z grupy składającej się z FkpA i SlyD, w którym retrowirusową glikoproteina powierzchniowa i izomeraza peptydyloprolilową są ze sobą połączone wiązaniem wytworzonym rekombinacyjnie.
Kompleks taki można wykorzystać w diagnostyce zakażeń wirusowych HIV. Kompleks antygenbiałko opiekuńcze można wykorzystać w procesie wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV w testach immunologicznych, korzystnie przy zastosowaniu koncepcji mostka antygenowego lub jako immunogenu.
Opisane są również warianty obejmujące specyficzne podstawienia aminokwasowe w domenie N-helikalnej, należącej odpowiednio do białka gp41 wirusa HIV-1 lub gp36 wirusa HIV-2.
Korzystnie, w kompleksie wiązanie wytworzone rekombinacyjnie obejmuje łącznik peptydowy.
Korzystnie, łącznik peptydowy obejmuje przynajmniej 10 aminokwasów lub korzystniej przynajmniej 15 aminokwasów, lub najwyżej 50 lub 40 aminokwasów. W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja reagentów obejmująca rozpuszczalny kompleks określony powyżej.
„Białko docelowe” może być dowolnym białkiem, które jest w zasadzie nierozpuszczalne w zbuforowanym roztworze wodnym o pH 7,4, zawierającym 20 nM fosforan sodu i 150 mM chlorek sodu.
Korzystnie, białkami docelowymi są np. białka amyloidogenne, glikoproteiny powierzchniowe amyloidogennych wirusów, retrowirusowe glikoproteiny powierzchniowe, zwłaszcza HIV-1 gp21, HIV-2 gp36 i HTLV gp21.
Ważną grupę polipeptydów docelowych stanowią tzw. białka lub polipeptydy amyloidogenne. Takie amyloidogenne białka znajdowano w postaci zagregowanej w płynach ciała lub narządach. Dobrze znanymi przykładami są amyloid surowicy A (sAA), tak zwany β-Α4 lub Αβ (polipeptyd o długości lub 43 aminokwasów, tworzący charakterystyczne depozyty amyloidowe w mózgu w przypadku
Sc choroby Alzheimera), tak zwane białka prionowe (postać PrPSc akumuluje się w agregatach w przypadku BSE lub choroby Creutzfeldta i Jacoba) oraz retrowirusowe glikoproteiny powierzchniowe, takie
PL 218 245 B1 jak HIV-1 gp41, którą znajdowano w płytkach amyloido-podobnych w mózgach pacjentów cierpiących na demencję związaną z HIV (HAD). W korzystnym wykonaniu, wykorzystuje się białko opiekuńcze, korzystnie białko opiekuńcze PPI, do tworzenia rozpuszczalnego kompleksu obejmującego białko amyloidogenne i białko opiekuńcze. Taki kompleks może być z wielką korzyścią wykorzystany w rozmaitych testach immunologicznych.
Korzystnie, kompleks taki wykorzystywany jest w teście immunologicznym, w którym stosowana jest zasada mostku antygenowego. HIV i inne wirusy osłonięte otoczką, takie jak HTLV, wirus grypy oraz wirus Ebola, wyrażają glikoproteiny powierzchniowe, które pośredniczą w procesach przylegania do komórki i fuzji z błoną komórkową. Aby wypełniać wymienione funkcje, wszystkie te glikoproteiny powierzchniowe zawierają silnie hydrofobowe fragmenty, które sprawiają, że trudno jest pracować z nimi w warunkach in vitro (co obejmuje także próby doprowadzenia do ich ponownego sfałdowania) i że wykazują one skłonność do agregacji.
W kolejnym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy rozpuszczalnego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i glikoproteinę powierzchniową wirusa z otoczką. W szczególności, w wynalazku można wykorzystać kompleks, zawierający białko opiekuńcze PPI i glikoproteinę powierzchniową wirusa z otoczką do testu immunologicznego wykrywającego przeciwciała przeciwko glikoproteinie powierzchniowej.
HAD stanowi dobrze znane powikłanie towarzyszące zakażeniu HIV. Jak to opisali M. Caffrey i wsp. (patrz wyżej) w odniesieniu do objawów histologicznych, HAD przypomina bardzo encefalopatię gąbczastą zwaną chorobą Creutzfeldta i Jacoba. Etiologia choroby Creutzfeldta i Jacoba jest na ogół wiązana z akumulacją amyloidogennych płytek zawierających zmodyfikowane białko prionowe (Prusiner S. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 13363-13383). Analogiczna patogeneza dla HAD, włącznie z wysokocząsteczkowymi agregatami białka e-gp41, wydaje się być prawdopodobna. Warto zauważyć, że obrażenia neurologiczne w encefalopatii HIV wykazują cechy patologiczne i radiologiczne podobne do choroby Binswangera.
Korzystnymi białkami amyloidogennymi są odpowiednio białko gp41, pochodzące z wirusa HIV-1, białko gp36 pochodzące z wirusa HIV-2 i białko gp21 pochodzące z wirusa HTLV.
Białko jest uważane za „zasadniczo nierozpuszczalne”, jeśli w buforze zawierającym 20 mM fosforan sodu pH 7,4 i 150 mM NaCl jest rozpuszczalne w stężeniu 50 nM lub mniejszym.
Kompleks według niniejszego wynalazku, obejmujący białko opiekuńcze PPI oraz białko docelowe, jest uważany za „rozpuszczalny”, jeśli w warunkach fizjologicznych, tj. w buforze zawierającym 20 mM fosforan sodu pH 7,4 i 150 mM NaCl, białko docelowe zawarte w kompleksie z białkiem opiekuńczym PPI jest rozpuszczalne w stężeniu 100 nM lub większym.
Opracowaliśmy sposób obejmujący etap mieszania białka docelowego z białkiem opiekuńczym w buforze, w którym zarówno białko docelowe, jak i białko opiekuńcze są rozpuszczalne oraz etap doprowadzania buforu do warunków fizjologicznych, w których kompleks tworzony przez oba białka pozostaje rozpuszczalny.
Wytwarzanie rozpuszczalnego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze i białko docelowe rozpoczyna się od buforu zapewniającego warunki solubilizacji tj. od buforu, w którym zarówno białko docelowe, jak i białko opiekuńcze są rozpuszczalne. Odpowiedni bufor, który możemy nazwać buforem „niefizjologicznym” lub „solubilizującym”, musi spełniać ten warunek, że żadne z białek nie ulegnie w nim denaturacji lub przynajmniej nie będzie to denaturacja nieodwracalna. W takich startowych warunkach buforowych białko opiekuńcze wiąże się z białkiem docelowym, po czym możliwa jest zmiana buforu z niefizjologicznego na fizjologiczny, bez wywoływania precypitacji białka docelowego.
Odpowiedni (nie fizjologiczny) bufor, tj. bufor, w którym zarówno białko docelowe (w zasadzie nierozpuszczalne), jak i białko opiekuńcze, są rozpuszczalne, otrzymuje się zwykle przez zastosowanie wysokiego lub niskiego pH, albo wysokiego stężenia soli chaotropowych lub też kombinacji obu tych czynników.
W przypadku wytwarzania międzycząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i białko docelowe, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, niefizjologiczny bufor jest korzystnie buforem o raczej niskim lub raczej wysokim pH.
Korzystnie, bufor taki ma pH o wartości od 9 do 12 (w zakresie wysokiego pH) lub od 2 do 4,5 (w zakresie niskiego pH).
W przypadku wytwarzania wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i białko docelowe, które jest w zasadzie nierozpuszczalne, korzystny bufor rozpuszczający jest buforem o raczej wysokim stężeniu soli chaotropowej, np. 6,0 M chlorek guanidyniowy o pH około 6.
PL 218 245 B1
Po renaturacji, białko docelowe przyjmuje swą zbliżoną do natywnej strukturę i tworzy się kompleks wewnątrzcząsteczkowy.
W kontekście niniejszego wynalazku, warunki buforu fizjologicznego zdefiniowane są przez wartość pH w zakresie od 5 do 8,5, a całkowite stężenie soli poniżej 500 mM, niezależnie od innych składników (poza solami), które ewentualnie mogą być obecne w buforze (np. cukry, alkohole, detergenty), jak długo takie dodatki nie zaburzają rozpuszczalności kompleksu zawierającego białko docelowe oraz białko opiekuńcze.
W swoim kolejnym korzystnym wykonaniu ujawniono sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu według wynalazku zawierającego retrowirusową glikoproteinę i białko opiekuńcze, który to sposób obejmuje etap zmieszania retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej z izomerazą peptydyloprolilową w buforze, w którym zarówno retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa, jak i izomeraza peptydyloprolilowa ulegają rozpuszczeniu i tworzą kompleks, i etap doprowadzenia buforu do warunków fizjologicznych, w których kompleks jest nadal rozpuszczalny.
Terminy „retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa” lub „rsgp”, używane w niniejszym wynalazku, obejmują gp41 wirusa HIV-1 i gp36 wirusa HIV-2, a także odpowiadające im glikoproteiny otoczki, pochodzące od innych ssaczych wirusów niedoboru odporności. Korzystnymi retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi są gp41 wirusa HIV-1, gp36 wirusa HIV-2 i gp21 wirusa HTLV. Szczególnie korzystnymi retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi są gp41 wirusa HIV-1 i gp36 wirusa HIV-2. Termin rsgp, objaśniony powyżej, odnosi się zarówno do występujących naturalnie, jak i syntetycznych wariantów rsgp.
Stwierdzono, że pewne określone podstawienia aminokwasowe w obrębie N-helikalnej domeny białka gp41 lub gp36 nadają tym cząsteczkom korzystne cechy, w porównaniu do polipeptydów o sekwencji typu dzikiego białek gp41 lub gp36. Warianty te stanowią kolejne korzystne wykonanie według niniejszego wynalazku. Zwłaszcza wariant białka gp41 wirusa HIV-1, obejmujący przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe, a najwyżej cztery podstawienia aminokwasowe w jednej lub w większej liczbie pozycji, wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 555, Leu 566, Ile 573 i Ile 580, które to pozycje są pozycjami znanymi z sekwencji typu dzikiego białka gp41 wirusa HIV-1 (NR ID SEK: 1) lub odpowiadają pozycjom znanym z tej sekwencji, które to podstawienia charakteryzują się tym, że podstawionym aminokwasem jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy lub też wariant białka gp36 wirusa HIV-2, obejmujący przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe, a najwyżej trzy podstawienia aminokwasowe w jednej lub w większej liczbie pozycji, wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 554, Leu 565 i Val 579, które to pozycje są pozycjami znanymi z sekwencji typu dzikiego białka gp36 wirusa HIV-2 (NR ID SEK: 2) lub odpowiadają pozycjom znanym z tej sekwencji, które to podstawienia charakteryzują się tym, że podstawionym aminokwasem jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, są odpowiednie, aby dzięki ich użyciu przynajmniej częściowo rozwiązać problemy znane specjalistom z tej dziedziny.
Nowe warianty białek gp41 i gp36 są mniej podatne na agregację, lepiej rozpuszczalne i łatwiejsze w użyciu niż odpowiadające im polipeptydy o sekwencji typu dzikiego.
Zwiększona rozpuszczalność staje się szczególnie oczywista podczas prób poszukiwania czynnika doprowadzającego do rozpuszczenia gp41 lub gp36 w warunkach buforu fizjologicznego. Szczególnie korzystne okazało się połączenie korzystnych cech nowych wariantów z efektami otrzymywanymi w wyniku zastosowania białek opiekuńczych, wybranych z klasy izomeraz peptydyloprolilowych. Dlatego też w wynalazku ujawniono zastosowanie wariantu gp41 i/lub wariantu gp36 do wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu, obejmującego wspomniany wariant i białko opiekuńcze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.
Rozpuszczalny kompleks, obejmujący wariant glikoproteiny wirusa HIV i białko opiekuńcze z klasy PPI, jest korzystnie otrzymywany z pojedynczego rekombinowanego białka, zawierającego zarówno wariant gp41 wirusa HIV-1 lub wariant gp36 wirusa HIV-2 odpowiednio i białko opiekuńcze z klasy PPI. Zatem, korzystne wykonanie dotyczy rekombinowanego białka, obejmującego wariant gp41 wirusa HIV-1 lub wariant gp36 wirusa HIV-2, opisane powyżej i białka opiekuńczego, wybranego z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.
Ponieważ nowe warianty gp41 lub gp36 są łatwiejsze w użyciu niż polipeptydy typu dzikiego, sprawia to, że są idealnymi obiektami do wykorzystania jako immunogeny lub antygeny. Korzystne wykonanie niniejszego wynalazku obejmuje wykorzystanie wariantu gp41 i/lub wariantu gp36 lub też kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i taki wariant (np. w postaci pojedynczego rekombiPL 218 245 B1 nowanego białka), do testu immunologicznego. Co najbardziej ciekawe, białko fuzyjne obejmujące retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze PPI może być rozpuszczone i poddane renaturacji w odpowiednich warunkach, a ponadto tworzy rozpuszczalny wewnątrzcząsteczkowy kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym, który umożliwia wygodne znakowanie i skuteczną detekcję w teście immunologicznym wykrywającym wirusa HIV.
Rozpuszczalny kompleks, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze może być skutecznie wykorzystane w teście immunologicznym wykrywającym przeciwciała z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego.
Kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym obejmujący gp41 wirusa HIV-1 lub gp36 wirusa HIV-2 jest szczególnie korzystny w przypadku wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi HIV we wstępnej fazie infekcji. Przy zastosowaniu rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp41 lub też rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp36, możliwe jest przeprowadzenie testu immunologicznego, korzystnie z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego, pozwalającego na wczesne i czułe wykrywanie przeciwciał przeciw HIV w płynach ustrojowych.
Fakt, że białko opiekuńcze może tworzyć kompleksy z w innym przypadku nierozpuszczalnymi białkami można także zastosować z dużą korzyścią w celu ulepszenia większości testów immunologicznych, korzystnie testów immunologicznych z wykorzystaniem zasady mostka antygenowego. Zasada mostka antygenowego pozwala na wykorzystanie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem jako pierwszego antygenu (na ogół nazywanego antygenem wychwytującym na nośniku fazy stałej) i drugiego kompleksu białka opiekuńczego z antygenem (najczęściej jako antygenem detekcyjnym). W celu zminimalizowania problemów z tłem wywoływanych wiązaniem przeciwciał oddziałujących z białkiem opiekuńczym, taki test mostkowy może być korzystnie modyfikowany przez zastosowanie pierwszego białka opiekuńczego na nośniku fazy stałej i drugiego białka opiekuńczego do stworzenia drugiej strony (detekcyjnej), pochodzącej od różnych gatunków.
Możliwe jest obecnie przeprowadzenie testu immunologicznego według zasady mostka antygenowego z wykorzystaniem znakowanego kompleksu białka opiekuńczego z antygenem.
Możliwe jest również wytworzenie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem, w którym to kompleksie wyznakowane jest jedynie białko opiekuńcze, co chroni antygen przed modyfikacją lub negatywnym wpływem (np. na konformację) takiego znakowania.
Sposób i strategia przeprowadzanego chemicznego sprzęgania mogą być wybrane według uznania. W przypadku polipeptydów, dostępne są techniki umożliwiające sprzęganie reszt -SK2, -NH2 lub -COO-, grupy OH tyrozyny, grupy imidazolowej histydyny lub też heterocyklicznej grupy iminowej tryptofanu. Dla każdej z tych grup funkcjonalnych znanych jest kilka odpowiednich chemicznych procedur sprzęgania (M. Aslam i A. Dent, patrz wyżej). Rutynowe chemiczne procedury sprzęgania białek wymagają, aby białko było rozpuszczalne w warunkach buforu reakcyjnego, tj. w zakresie pH od około 5 do około 8,5. Ponieważ np. białko gp41 nie jest rozpuszczalne w tym zakresie pH, o ile nie poddane zostanie denaturacji (np. przy użyciu SDS), natywnie sfałdowane białko gp41 nie poddawało się procesowi chemicznego sprzęgania. Opisywany tu kompleks białka gp41 z białkiem opiekuńczym dostarcza zatem wygodnych sposobów wytwarzania rozpuszczalnych znakowanych białek otoczki wirusa HIV, nadających się do testów immunologicznych, bez względu na zastosowany format detekcji.
Proces wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu rsgp z białkiem opiekuńczym obejmuje etap mieszania rozpuszczonej retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej z białkiem opiekuńczym, wybranym z klasy izomeraz peptydyloprolilowych, w warunkach buforu niefizjologicznego, oraz etap doprowadzania buforu do warunków fizjologicznych, w których tworzy się międzycząsteczkowy kompleks.
Białko opiekuńcze i retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa mogą być wykorzystane nie tylko jako oddzielne polipeptydy. Nieoczekiwanie zauważyliśmy, że korzystne jest kowalencyjne połączenie obu tych białek. Takie kowalencyjne połączenie może być przeprowadzone przy użyciu konwencjonalnych procedur chemicznych; korzystne jednak jest otrzymanie kowalencyjnego wiązania przez wytworzenie rekombinowanego polipeptydu obejmującego retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze.
W kolejnym korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu rsgp z białkiem opiekuńczym obejmuje etap rozpuszczania, w odpowiednich warunkach buforowych, białka obejmującego retrowirusową glikoproteinę powierzchniową połączoną wiązaniem kowalencyjnym z białkiem opiekuńczym, wybranym z klasy izomeraz peptydyloprolilowych i etap doprowadzania buforu do warunków fizjologicznych. W ten sposób otrzymywany jest kompleks wewnątrzcząsteczkowy.
PL 218 245 B1
Niniejszy wynalazek informuje o zastosowaniu białek opiekuńczych pochodzących z klasy białek wspomagających proces fałdowania i określanych terminem izomeraz cis/trans peptydyloprolilowych (PPI) (patrz Dartigalongue C. i Raina S., powyżej). Dobrze znanymi przedstawicielami tej rodziny są białka o nazwach CypA, PpiD (Dartigalongue C. i Raina S., Embo J. 17 (1998) 3968-3980; Schmid F. X., Molecular chaperones in the life cycle of proteins (1998) 361-389, wyd. A. L. Fink oraz Y. Goto, Marcel Decker In., Nowy Jork, USA), FkpA (Danese P. N. i wsp., Genes Dev. 9 (1995) 387-398) oraz „czynnik wyzwalający” (Crooke E. oraz Wickner W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 5216-5220; Stoller G. i wsp., Embo J. 14 (1995) 4939-4948).
Izomerazy peptydyloprolilowe podzielone są na trzy rodziny: parwuliny (Schmid F. X., powyżej; Rahfeld J. U. i wsp. FEBS Lett. 352 (1994) 180-184), cyklofiliny (Fisher G. i wsp., Nature 337 (1989) 476-478) i rodzina FKBP (Lane W. S. i wsp., J. Protein Chem. 10 (1991) 151-160) Rodzina FKBP wykazuje interesującą właściwość biochemiczną, ponieważ członkowie tej rodziny byli początkowo identyfikowani na podstawie zdolności do wiązania antybiotyków makrolidowych, np. FK 506 i rapamycyny (Kay J. E., Biochem J. 314 (1996) 361-385).
Izomerazy prolilowe mogą zawierać różne podjednostki lub moduły o różnych funkcjach, np. moduł wykazujący aktywność katalityczną i moduł wykazujący aktywność białka opiekuńczego. Takimi modułowymi członkami rodziny FKBP są FkpA (Ramm K. oraz Pluckthun A., J. Biol. Chem. 275 (2000) 17106-17113), SlyD (Hottenrott S. i wsp., J. Biol. Chem. 272 (1997) 15697-15701) oraz „czynnik wyzwalający” (Scholz C i wsp., Embo J. 16 (1997) 54-58). W korzystnym wykonaniu wynalazek ten dotyczy rozpuszczalnego kompleksu, obejmującego retrowirusową glikoproteinę powierzchniową oraz białko opiekuńcze, wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych, należących do katalizatorów procesu fałdowania. Niniejszy wynalazek ujawnia również wykorzystywanie wymienionych tu z nazwy członków klasy izomeraz peptydyloprolilowych, ale można również wykonać konstrukt przy użyciu białek opiekuńczych pochodzących z tej samej klasy, ale uzyskanych z innych gatunków bakterii.
Korzystnie, wykorzystywane są białka z rodziny FKBP w obrębie klasy PPI białek opiekuńczych.
W kolejnym wykonaniu, korzystne jest wykorzystanie homologów pochodzących z organizmów eukariotycznych, a jeszcze korzystniejsze jest wykorzystanie ludzkich izomeraz PPI, ponieważ izomerazy te nie powinny być rozpoznawane przez przeciwciała z ludzkich surowic, a zatem nie powinny interferować z testami serologicznymi (tj. testami opartymi na detekcji ludzkich przeciwciał).
Powszechnie wiadomym i docenianym faktem jest możliwość wykorzystywania niekompletnych sekwencji białek opiekuńczych. Wykorzystywane mogą być też funkcjonalne fragmenty białek opiekuńczych (tzw. moduły), które wciąż posiadają wymagane zdolności i funkcje (patrz WO 98/13496).
Przykładowo, FkpA jest periplazmatyczną izomerazą PPI, która syntetyzowana jest jako nieaktywna cząsteczka prekursorowa w bakteryjnym cytozolu, a następnie poddawana jest translokacji przez błonę cytoplazmatyczną. Aktywna postać FkpA (dojrzałe lub periplazmatyczne białko FkpA) nie posiada sekwencji sygnałowej (aminokwasy 1-25) i dlatego obejmuje jedynie aminokwasy 26-270 cząsteczki prekursorowej. Odpowiednie informacje o sekwencji FkpA można łatwo uzyskać w publicznych bazach danych, np. w bazie SWISS-PROT pod numerem dostępu P 45523.
Białko SlyD, blisko spokrewnione z FkpA, składa się z ustrukturyzowanej domeny N-końcowej, odpowiedzialnej za funkcje katalityczne i opiekuńcze oraz z przeważnie nieustrukturyzowanego C-końca, wyjątkowo bogatego w reszty histydynowe i cysteinowe (Hottenrott S. i wsp., J. Biol. Chem. 272 (1997) 15697-15701). Stwierdziliśmy, że skrócony na C-końcu wariant białka SlyD, obejmujący aminokwasy 1-165, wydajnie się spełniać swoją funkcję rozpuszczającą wobec gp41 i gp36. W przeciwieństwie do białka SlyD typu dzikiego, zastosowanie tego skróconego wariantu SlyD (1 -165) skutecznie omija niebezpieczeństwo związane z upośledzeniem procesu „tasowania” mostków disiarczkowych.
Warianty omawianych powyżej białek opiekuńczych, zawierające jedną lub kilka zmian w rodzaju podstawienia lub delecji, mogą być również wykorzystane do procesów ujawnionych w niniejszym wynalazku.
Odpowiednie białka opiekuńcze pochodzące z alternatywnych źródeł, a także odpowiednie mutanty lub fragmenty białek opiekuńczych, mogą być łatwo wyselekcjonowane przy użyciu procedur opisanych w przykładach. Mogą być one wykorzystane w postaci wolnej lub kowalencyjnie związanej z retrowirusową glikoproteina powierzchniową, w celu wytworzenia rozpuszczalnego kompleksu rsgp z białkiem opiekuńczym. W korzystnym wykonaniu według niniejszego wynalazku, zdolne do wiązania białko opiekuńcze PPI jest wiązane rekombinacyjnie z retrowirusową glikoproteina powierzchniową, w celu osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji produktu genowego w cytozolu bakteryjnym. Zdolne
PL 218 245 B1 do wiązania białko opiekuńcze PPI, którego dotyczy niniejszy wynalazek, obejmuje przynajmniej funkcjonalną jednostkę pośredniczącą w wiązaniu wydłużonych substratów polipeptydowych (tj. motyw wiązania substratu lub motyw białka opiekuńczego), bez względu na posiadanie katalitycznej aktywności izomerazy PPI.
Zaobserwowaliśmy również, że niektóre białka opiekuńcze nie należące do klasy PPI katalizatorów procesu fałdowania mogą tworzyć rozpuszczalny kompleks z retrowirusową glikoproteina powierzchniową. Dlatego kolejne korzystne wykonanie niniejszego wynalazku może obejmuować rozpuszczalny kompleks białka Skp (znanego także jako OmpH; Missiakas D. i wsp., Mol. Microbiol. 21 (1996) 871-884) z retrowirusową glikoproteiną powierzchniową. Jeszcze inne korzystne wykonanie obejmuje rozpuszczalny kompleks składający się z retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej oraz białka GroEL lub jego części.
Zastosowane mogą być również białka opiekuńcze homologiczne wobec Skp.
Wiadomo, iż modułowe izomerazy PPI wiążą się preferencyjnie ze zdenaturowanymi lub częściowo zdenaturowanymi białkami (np. Scholz i wsp., jak wyżej).
Okazało się teraz również, że izomerazy PPI mają właściwość nie tylko katalizowania procesu fałdowania białek, ale także tworzenia stabilnych kompleksów z takimi białkami, przez co nadają im rozpuszczalność. Nieoczekiwanie badane izomerazy PPI (takie jak TF, SlyD oraz FkpA) wiążą się z retrowirusowymi glikoproteinami powierzchniowymi, przez co także zwiększają rozpuszczalność ich postaci o strukturze zbliżonej do natywnej. „Zbliżona do natywnej” struktura białka gp41 charakteryzuje się wysoką zawartością struktur helikalnych w strukturze drugorzędowej (co ocenić można na podstawie CD w dalekim UV) oraz odpowiednimi kontaktami trzeciorzędowymi (ocenianymi na podstawie CD w bliskim UV), co prowadzi do obserwowania typowej „sygnatury gp41”, jak przedstawiono odpowiednio na fig. 1B i fig. 5. Ponadto, widmo UV dla „zbliżonej do natywnej” struktury gp41 nie wykazuje znaczącej absorpcji przy długościach fali przekraczających 320 nm (która wskazywałaby na cząstki rozpraszające światło, takie jak agregaty).
Dostępne są liczne informacje na temat tworzenia kompleksów między modelowymi cząsteczkami biologicznymi, np. między przeciwciałem i antygenem (omówione w pracy przeglądowej: Braden B. oraz Poljak R. J., Faseb J. 9 (1995) 9-16). Zazwyczaj, tworzenie kompleksu i jego dysocjacja zachodzą równolegle, a zatem kompleks i jego pojedyncze składniki występują w stanie wolnej równowagi. To samo dotyczy kompleksów tworzonych między białkami opiekuńczymi PPI i białkami amyloidogennymi, opisanych w niniejszym wynalazku.
Tworzenie kompleksów, opisane w niniejszym wynalazku, jest szczególnie ważną właściwością, ponieważ kompleksy między białkiem opiekuńczym PPI a białkiem, które jest w zasadzie nierozpuszczalne np. w buforze fizjologicznym, okazały się być łatwo rozpuszczalne (np. w buforze fizjologicznym). Antygeny, które są rozpuszczalne w warunkach fizjologicznych, mają ogromne znaczenie w zastosowaniach diagnostycznych. Mogą one być wykorzystane bezpośrednio jako np. materiał standardowy. Ponadto, mogą być sprzężone z odpowiednimi markerami lub odpowiednimi grupami wiążącymi.
Jak omówiono powyżej, białko gp36 wirusa HIV-2 spełnia podobne funkcje (tj. uczestniczy w fuzji z błoną komórkową i procesie wniknięcia wirusa do komórki) i posiada podobne znaczenie diagnostyczne jak gp41 wirusa HIV-1. Wiele technicznych problemów omawianych jest w niniejszym zgłoszeniu na przykładzie białka gp41 HIV-1 (będącego prototypowym przykładem retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej). Skupienie się głównie na białku gp41 wirusa HIV-1 miało na celu zachowanie jasności opisu i dyskusji. Jednak podobne uwagi mają też zastosowanie wobec innych retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych, zwłaszcza gp36 wirusa HIV-2 i gp21 wirusa HTLV.
Wiadomo, że naturalnie występujące wirusy HIV-1 i HIV-2 mogą obejmować warianty oryginalnie wyizolowanych i opisanych sekwencji aminokwasowych. Takie występujące naturalnie lub zsyntetyzowane przez człowieka warianty retrowirusowych glikoprotein powierzchniowych związanych z występowaniem niedoboru odporności u ssaków są również objęte niniejszym wynalazkiem.
Korzystne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy wariantów rsgp lub przezbłonowych glikoprotein ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Ujawniono tutaj warianty obejmujące specyficzne podstawienia aminokwasowe w domenie N-helikalnej białka gp41 wirusa HIV-1 lub białka gp36 wirusa HIV-2.
Pozycje aminokwasowe domen N-helikalnych i C-helikalnych, uczestniczące w kontakcie między helisami, znane są z piśmiennictwa na temat białka gp41 wirusa HIV-1 i mogą być ekstrapolowane na homologiczne białko gp36 wirusa HIV-2. Okazało się, że wprowadzanie mutacji w tych pozy14
PL 218 245 B1 cjach wpływa na właściwości białka gp41 i białka gp36, zwłaszcza w przypadku białka fuzyjnego, zawierającego taki wariant wraz z odpowiednią domeną białka opiekuńczego PPI.
Pozycje aminokwasowe odpowiadające pozycjom „a” i „d” w modelu kołowym helisy leucynowego gp41 „zamka błyskawicznego” są korzystnymi celami wprowadzania zmian zmierzających do otrzymania wariantów ujawnionych w niniejszym wynalazku. Reszty aminokwasowe w pozycji „a” (numeracja wg Chan D. i wsp., Cell 89 (1997) 262-273) są to Q552, 1559, L566, 1573 i 1580; natomiast pozycji „d” odpowiadają reszty 1548, L555, Q562, T569 i L576.
W celu polepszenia rozpuszczalności bez zaburzania helikalnej integralności motywu „zamka błyskawicznego”, korzystne jest zachowanie odstępów między mutacjami o długości przekraczającej jeden obrót helisy. Warunek ten jest np. spełniony w przypadku podstawień w kolejnych pozycjach „a”, odpowiadających resztom Q552, 1559, L566 oraz 1573, a także np. w przypadku kolejnych pozycji „d”, odpowiadających resztom 1548, L555, Q562 oraz T569. Inaczej mówiąc, zmutowane reszty oddzielone są od siebie co najmniej sześcioma nie zmutowanymi resztami aminokwasowymi, co odpowiada dokładnie motywowi heptadowemu. Możliwe jest także zmutowanie zarówno reszt w pozycji „a”, jak i w pozycji „d”, w tym samym wariancie, pod powyższym warunkiem, że podstawione pozycje oddalone są od siebie o więcej niż jeden obrót helisy.
Podobnie, zmiany w ektodomenie białka gp36 wirusa HIV-2 nieoczekiwanie prowadziły do otrzymania łatwo rozpuszczalnego rekombinowanego białka w przypadku fuzji z SlyD lub FkpA. W tej sytuacji pozycjom „a” odpowiadają reszty Q551, V558, L565, T572 oraz V579, a pozycjom „d” reszty 1547, L554, Q561, T568 i L575.
Korzystnie, od jednego do sześciu aminokwasów wybranych z grupy obejmującej pozycje Q552, I559, L566, I573, I580, I548, L555, Q562, T569 i L576 w przypadku białka gp41 wirusa HIV-1 lub też Q551, V558, L565, T572, V579, 1547, L554, Q561, T568 i L575 w przypadku białka gp36 wirusa HIV-2, poddawane są podstawieniu przez wprowadzenie mniejszych lub bardziej hydrofilowych aminokwasów. Korzystnie, pozycje aminokwasowe ulegające podstawieniu wybrane są z grupy obejmującej Q552, 1559, L566, 1573 i 1580 w przypadku wirusa HIV-1 oraz L554, Q561, T568 i L575 w przypadku wirusa HIV-2.
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku ujawniono wariant białka gp41 wirusa HIV-1, który to wariant obejmuje przynajmniej jedno, a najwyżej cztery podstawienia aminokwasowe w pozycjach wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 555, Leu 566, Ile 573 oraz Ile 580, które to pozycje znane są z sekwencji typu dzikiego białka gp41, opisanej w NR ID SEK: 1 lub też które odpowiadają tym pozycjom, przy czym wprowadzane aminokwasy wybrane są (niezależnie od siebie) z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy.
To korzystne wykonanie ujawnione w niniejszym wynalazku oparte jest na zaskakującej obserwacji, że otrzymać można warianty białka gp41, które stanowią znaczne udoskonalenie w porównaniu do odpowiadającego im polipeptydu gp41 o sekwencji typu dzikiego. Podstawienia aminokwasowe prowadzące do otrzymania wariantów opisane są na podstawie numeracji i składu aminokwasowego sekwencji typu dzikiego białka gp41, znanej z publikacji D. C. Chana i wsp. (Cell. 89 (1997) 263-273) i przedstawionej tu jako NR ID SEK: 1.
Opisane powyżej podstawienia aminokwasowe mogą być oczywiście wprowadzone w odpowiadające pozycje sekwencji białka gp41, jak i innych znanych lub jeszcze nie zidentyfikowanych izolatów wirusa HIV-1. Termin „odpowiadająca pozycja” wprowadzono w celu wskazania, że znalezione lub utworzone mogą być także izolaty HIV-1 i ich warianty, które obejmować mogą dodatkowe lub brakujące aminokwasy, co z kolei mogłoby powodować, że w porównaniu z sekwencją NR ID SEK: 1 mogłyby nastąpić zmiany w numeracji odpowiednich pozycji sekwencji lub motywów.
Porównywano sekwencję białka gp41 typu dzikiego (NR ID SEK: 1) z innymi sekwencjami przy użyciu oprogramowania PileUp z pakietu GCG Package Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc). Program PileUp tworzy dopasowania liniowe wielu sekwencji, wykorzystując do tego uproszczoną wersję sposobu dopasowywania postępującego (Feng D. F. oraz Doolittle R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360). Określane są macierze wyników dla identycznych, podobnych lub różnych reszt aminokwasowych. Proces ten zaczyna się od dopasowania (sposobem tworzenia par) dwóch najbardziej podobnych sekwencji, co prowadzi do otrzymania zestawu dwóch dopasowanych sekwencji. Do tego zestawu może być następnie dopasowywana następna pod względem bliskości pokrewieństwa sekwencja lub zestaw dopasowanych sekwencji. Dwa zestawy dopasowanych sekwencji mogą być do siebie dopasowane w sposób analogiczny do dopasowywania dwóch pojedynczych sekwencji. Ostateczne dopasowanie osiągane jest przez przeprowadzenie serii postępujących dopasowań (sposobem
PL 218 245 B1 tworzenia par), obejmujących coraz mniej podobne sekwencje i zestawy, aż do momentu, gdy wszystkie sekwencje zostaną włączone do końcowego dopasowania. Dysponując wynikiem takiego dopasowania można łatwo zlokalizować te pozycje aminokwasowe w nowym izolacie wirusa HIV-1 lub w sztucznie wytworzonej cząsteczce gp41, które odpowiadają pozycjom 555, 566, 573 oraz 580 w sekwencji typu dzikiego.
Wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 555, gdzie Leu 555 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Kolejny wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 566, w której Leu 566 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Kolejny wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 573, w której Ile 573 jest podstawiona przez serynę lub treoninę, przy czym podstawienie przez serynę jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Kolejny wariant polipeptydu gp41 wirusa HIV-1 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 580, gdzie Ile 580 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Niniejszy wynalazek ujawnia również wariant białka gp36 wirusa HIV-2, który to wariant obejmuje przynajmniej jedno, a najwyżej trzy podstawienia aminokwasowe w pozycjach wybranych z grupy obejmującej pozycje Leu 554, Leu 565 oraz Val 579, które to pozycje znane są z sekwencji typu dzikiego białka gp36 wirusa HIV-2, opisanej w NR ID SEK: 2 lub też, które odpowiadają tym pozycjom, przy czym wprowadzane aminokwasy wybrane są (niezależnie od siebie) z grupy obejmującej serynę, treoninę, asparaginę, glutaminę, kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy.
Numeracja odpowiada w tym przypadku sekwencji typu dzikiego (NR ID SEK: 2) opublikowanej przez M. Guyadera i wsp. (Nature 326 (1987) 662-669). Pozycje aminokwasowe w obrębie sekwencji gp36, które odpowiadają pozycjom znanym z przedstawionej powyżej sekwencji, określane są w sposób opisany powyżej dla gp41.
Wariant polipeptydu gp36 wirusa HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 554, w której Leu 554 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Wariant polipeptydu gp36 wirusa HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 565, w której Leu 565 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem.
Wariant polipeptydu gp36 wirusa HIV-2 charakteryzuje się tym, że obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 579, w której Val 579 jest podstawiona przez kwas asparaginowy lub glutaminowy, przy czym podstawienie przez kwas glutaminowy jest najkorzystniejszym podstawieniem, w korzystnym wykonaniu, wariant białka gp41 lub wariant białka gp36 zawierają podstawienia w dwóch spośród pozycjach aminokwasowych opisanych powyżej.
Warianty zawierające trzy podstawienia aminokwasowe są również korzystne.
W kolejnym korzystnym wykonaniu, wariant białka gp41 zawiera podstawienia w czterech pozycjach aminokwasowych, omawianych szczegółowo powyżej.
W korzystnym wykonaniu, kompletna sekwencja białka gp41 lub białka gp36 (tj. ektodomeny, bez peptydu fuzyjnego i fragmentu przezbłonowego), albo też odpowiadającego im białka otoczki ssaczego wirusa niedoboru odporności (np. białka gp21 z wirusa HTLV), wykorzystana jest do tworzenia kompleksu z białkiem opiekuńczym PPI. Dopuszczalne jest również użycie fragmentów retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, jak np. opisanego przez Lu i wsp. (patrz wyżej) fragmentu białka gp41 wirusa HIV-1. Fragmenty takie zawierają korzystnie C-końcową oraz N-końcową helisę zewnątrzkomórkowej części białka gp41.
Przydatne diagnostycznie białko gp41, obejmujące pozycje aminokwasowe 535-681 (nomenklatura wg Chan D. C. i wsp., Cell. 89 (1997) 263-273), może być wytworzone przy użyciu technik rekombinacyjnych, zgodnie ze standardowymi procedurami. Inna interesująca cząsteczka gp41 obejmuje aminokwasy 540-669 cząsteczki prekursorowej gp160, którą opisał Lu i wsp. (wyżej) na fig. 1.
Będąc typowym przykładem retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej, małe białko otoczki wirusa HIV jest niezmiernie trudne w użyciu i wykazuje całkiem niezwykłe właściwości. Jak już wspomniano, jedną z istotniejszych cech cząsteczki e-gp41 jest jej nierozpuszczalność w buforze fizjologicznym. Wyprodukowane sposobem rekombinacji białko gp41 jest rozpuszczalne i zachowuje zbliżo16
PL 218 245 B1 ną do natywnej strukturę przy pH 3,0 niskiej sile jonowej. Jednak, nawet przy tej wartości pH pozostaje wrażliwe na stężenie soli w buforze. W zależności od użytej soli, gp41 precypituje w obecności soli o stężeniu przekraczającym 100-500 mM. Jak zostanie szczegółowo omówione poniżej, białko to może być (znów) rozpuszczone (w zdenaturowanej postaci) po zastosowaniu czynników chaotropowych.
Przez warunki fizjologiczne buforu rozumie się najczęściej warunki odpowiadające stężeniu soli i wartości pH, jakie występują w osoczu lub w surowicy zwierząt i są one definiowane jako pH wynoszące około 7,4 oraz stężenie soli wynoszące około 150 mM. Kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym, według niniejszego wynalazku, jest łatwo rozpuszczalny w buforze w tych warunkach. Obecne tam białko rsgp wykazuje reaktywność immunologiczną, co wskazuje na jego zbliżoną do natywnej strukturę. Podczas gdy białko gp41 przy nieobecności odpowiedniego detergentu (lub bez wstępnego potraktowania takim detergentem) jest w zasadzie nierozpuszczalne w buforze o warunkach fizjologicznych (tj. 20 mM fosforan sodu pH 7,4; 150 mM NaCl), opisany tu kompleks według niniejszego wynalazku staje się łatwo rozpuszczalny po ponownym sfałdowaniu w wyniku zastosowania odpowiedniego protokołu. Ektodomena białka gp41, zawarta w kompleksie według wynalazku, jest rozpuszczalna przynajmniej w stężeniu 100 mM, korzystnie w stężeniu 1 μm lub wyższym, najkorzystniej w stężeniu 10 μM lub wyższym. Zatem, rozpuszczalność ulega znacznemu poprawieniu, od wyjściowego zakresu stężeń niższych niż nanomolowe do osiągnięcia stężeń mikromolowych.
W celu lepszego zrozumienia zakresu niniejszego wynalazku, należy zaznaczyć, że warunki buforu stosowanego do rozpuszczania i renaturacji mogą być modyfikowane według potrzeb (co może obejmować bardzo szeroki zakres warunków) i nie należy ich rozumieć jako nadmiernych ograniczeń wynalazku.
Ogólne stężenie soli w buforze fizjologicznym nie stanowi wartości krytycznej, o ile zadba się o to, aby kompleks białka opiekuńczego z gp41 nie uległ dysocjacji, a białko gp41 pozostawało w roztworze.
Korzystnie, bufor fizjologiczny powinien zawierać przynajmniej 10 mM, ale nie więcej niż 200 mM składnika buforującego. Pozostałe składniki buforu (jeśli takie występują) mogą być solami o niewielkiej zdolności buforującej, takimi jak np. chlorek sodu. Bufor fizjologiczny zawiera korzystnie sól w stężeniu 20-500 mM, korzystniej w stężeniu 50-300 mM, najkorzystniej w stężeniu 100-200 mM.
W procesie tu ujawnionym wartość pH w buforze fizjologicznym może być w zakresie od 5,0 do 8,5, korzystniej od 5,5 do 8,3. Jeszcze korzystniej, fizjologiczne warunki buforu powinny być zdefiniowane przez stężenie soli w podanym powyżej zakresie oraz wartość pH w zakresie od 6,0 do 8,0, a najkorzystniej wartość pH powinna mieścić się w zakresie od 6,5 do 7,8.
Zgodnie ze sposobem opisanym w niniejszym wynalazku, retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa jest rozpuszczana w buforze o niefizjologicznych warunkach, dodawane jest białko opiekuńcze (lub jest już obecne jako związana kowalencyjnie domena białka), a następnie w mieszaninie zawierającej rozpuszczoną retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze, doprowadza się warunki buforu do warunków fizjologicznych. Podczas gdy sama retrowirusową glikoproteina powierzchniowa uległaby w takim momencie precypitacji, to w tym przypadku niespodziewanie pozostaje w roztworze. To ważne stwierdzenie związane jest najprawdopodobniej z tworzeniem się kompleksu pomiędzy retrowirusową glikoproteina powierzchniową a białkiem opiekuńczym.
W przypadku wytwarzania rekombinowanego białka gp41 w bakteriach E. coli, rekombinowane białko gp41 otrzymywane jest w postaci ciał inkluzyjnych. Materiał ten jest rozpuszczany przy użyciu silnie chaotropowego odczynnika, np. 7,0 M tiocyjanianu guanidyniowego. W tych warunkach polipeptyd gp41 pozostaje przeważnie nieustrukturyzowany. W wyniku zmiany buforu w następnych etapach (na 30 mM kwas mrówkowy pH 3,0) białko to przybiera helikalną strukturę, zbliżoną przypuszczalnie do natywnej. Jednym z prostych sposobów na monitorowanie statusu prawidłowego lub nieprawidłowego fałdowania białka jest analizowanie odpowiadającego temu białku widma CD (dichroizmu kołowego) w regionie amidowym (185-250 nm) i aromatycznym (260-320 nm). Ponadto, ze standardowego widma UV uzyskać można łatwo informacje o cząstkach rozpraszających światło (agregaty).
Ważne jest zaznaczenie faktu, że retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa, znajdująca się w kompleksie z białkiem opiekuńczym według niniejszego wynalazku, uzyskuje strukturę, która uważana jest za zbliżoną do struktury natywnej. W przeciwieństwie, retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa, która została rozpuszczona w neutralnym pH przy użyciu czynników chaotropowych, jest przeważnie nieustrukturyzowana, tracąc w ten sposób epitopy o charakteryzujące się uporządkowaną konformacją. Możliwy jest także alternatywny sposób zwiększania rozpuszczalności retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej przy użyciu detergentów. Na przykład, siarczan dodecylu sodu
PL 218 245 B1 (SDS) był z powodzeniem stosowany do rozpuszczania gp41. Jednak materiał uzyskany w wyniku rozpuszczania przy użyciu SDS nie jest materiałem chętnie wykorzystywanym w większości zastosowań, np. w testach immunologicznych do wykrywania przeciwciał przeciwko gp41. Ponadto (co omawiane jest powyżej), takie testy immunologiczne wykrywają korzystnie także przeciwciała przeciwko epitopom konformacyjnym białka gp41, a nie można wykluczyć, że detergenty częściowo niszczą epitopy konformacyjne.
Korzystnie, kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym według niniejszego wynalazku charakteryzuje się zbliżoną do natywnej strukturą przestrzenną. Sfałdowane podobnie do natywnego białka, białko rsgp znajdujące się w takim kompleksie przejawia np. wymagane właściwości immunologiczne lub fizyczne.
Korzystnie, prawidłowe sfałdowanie białka jest oceniane w spektroskopii CD w bliskim UV, który to sposób pozwala na oszacowanie kontaktów trzeciorzędowych w obrębie białek o strukturze globularnej. Wiadomo, że białko gp41 jest łatwo rozpuszczalne przy wartości pH 3,0 i stężeniu soli odpowiadającym niskiej sile jonowej. Wyniki analizy CD w bliskim UV wykazały, że w takich warunkach gp41 wykazuje charakterystyczny sygnał eliptyczności z typową sygnaturą natywnie sfałdowanego białka globularnego. Jak przedstawiono na fig. 5, część peptydu fuzyjnego (zawierającego gp41 i FkpA) odpowiadająca gp41 wykazuje ten typowy obraz widma w buforze o kwaśnym pH. W buforze o fizjologicznych warunkach, widmo CD w bliskim UV dla rozpuszczalnego kompleksu według niniejszego wynalazku składa się z widma prawidłowo sfałdowanego białka opiekuńczego oraz z widma gp41 odpowiadającego białku sfałdowanego w natywny sposób. Obraz ten, dla białka fuzyjnego FkpA-gp41, przedstawiono na fig. 7.
W korzystnym wykonaniu według niniejszego wynalazku, przy użyciu analizy CD w bliskim UV oceniane jest podobieństwo struktury białka gp41, w kompleksie gp41 z białkiem opiekuńczym, do prawidłowo (natywnie) sfałdowanego białka.
Korzystnie, analiza CD w bliskim UV wykorzystana była do zademonstrowania, że obie cząsteczki (gp41 i białko opiekuńcze) są prawidłowo sfałdowane.
Wytwarzanie rozpuszczalnego kompleksu białka opiekuńczego z gp41 rozpoczyna się buforze o warunkach niefizjologicznych. W przypadku tworzenia kompleksu między białkiem opiekuńczym a wolnym białkiem docelowym (np. gp41 wirusa HIV-1) bufor ten o niefizjologicznych warunkach musi spełniać dwa warunki:
(a) gp41 obecny jest w postaci, którą określa się jako zbliżona do natywnej;
(b) białko opiekuńcze PPI jest przynajmniej częściowo funkcjonalne (tj. zdolne do wiązania substratu).
W takich warunkach startowych białko opiekuńcze wiąże się z białkiem amyloidogennym, a zmiana warunków buforu z niefizjologicznych na (mniej więcej) fizjologiczne możliwa jest bez precypitacji białka amyloidogennego.
Podczas, gdy białka opiekuńcze zwykle wiążą się ze zdenaturowanymi białkami i oddziałują na nie, ułatwiając w ten sposób ich prawidłowe (ponowne) fałdowanie, sytuacja na której bazuje niniejszy wynalazek jest zdecydowanie odmienna. Białko gp41, rozpuszczane w odpowiednich niefizjologicznych warunkach, wydaje się być obecne w postaci zbliżonej do natywnej (patrz fig. 1A i 1B i fig. 5). Niezgodnie z powszechnymi opiniami na temat funkcji białka opiekuńczego, w ujawnionym w wynalazku sposobie białko opiekuńcze wydaje się wiązać prawidłowo sfałdowane białko i stabilizować je w takich warunkach buforu, w jakich samo białko gp41 stałoby się nierozpuszczalne i uległoby precypitacji.
W korzystnym wykonaniu białko opiekuńcze PPI jest wybrane z grupy obejmującej FkpA, SlyD i „czynnik wyzwalający”.
Stwierdzono, że zwłaszcza FkpA lub SlyD poprawiają rozpuszczalność gp41 i tworzą z nim dość stabilny kompleks. Dlatego kolejne korzystne wykonanie wynalazku obejmuje białko opiekuńcze wybrane z grupy obejmującej FkpA i SlyD. Najkorzystniejszym białkiem opiekuńczym jest FkpA.
Jak opisano powyżej, także fragmenty białek opiekuńczych mogą być wykorzystane do uzyskania żądanej funkcji. W przypadku białek opiekuńczych o budowie modułowej, takich jak np. białka FKBP zawierające moduł katalityczny oraz moduł odpowiedzialny za wiązanie, korzystne jest, aby takie fragmenty zawierały przynajmniej domenę odpowiedzialną za wiązanie lub aby te fragmenty wykazywały przynajmniej funkcję porównywalną z tą, jaką spełnia ta domena.
FKBP12 jest ludzkim białkiem należącym do rodziny FKBP i zasadniczo obejmuje jedynie kataliczną domenę izomerazy PPI. Ponieważ nie ma domeny wiążącej polipeptydy, wykazuje obniżone
PL 218 245 B1 powinowactwo wobec niesfałdowanych lub częściowo sfałdowanych substratów białkowych, w porównaniu z innymi białkami z rodziny FKBP. Wykazano, że rozfałdowanie i ponowne sfałdowanie białka FKBP12 jest procesem odwracalnym (Egan D. A. i wsp., Biochemistry 32 (1993) 1920-1927); Scholz C. i wsp., J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707). My zaobserwowaliśmy, że ponowne fałdowanie i rozfałdowanie białek FkpA (25-270) i SlyD (1-165) jest również odwracalne, co spełnia warunek istotny dla opisanego tu procesu.
W korzystnym wykonaniu rozpuszczalny kompleks obejmuje białko gp41 i białko opiekuńcze wybrane spośród białek należących do rodziny FKBP.
Jak opisano powyżej, takie rozpuszczalne kompleksy, zawierające białko gp41 wirusa HIV-1 lub jego homolog pochodzący z innego ssaczego wirusa niedoboru odporności, mogą być łatwo przygotowane przez zmieszanie białka opiekuńczego PPI (np. wyprodukowanego przy użyciu technik rekombinacyjnych) i rekombinowanego białka gp41. Tworzy się wówczas kompleks między dwoma niezależnymi cząsteczkami. Jest to więc kompleks międzycząsteczkowy.
Tworzenie kompleksu jest procesem dynamicznym, w którym dysocjacja i ponowna asocjacja zachodzą równolegle. Jest to prawdziwe zarówno dla między-, jak i wewnątrzcząsteczkowej asocjacji między np. FkpA i gp41. Ponieważ gp41 ulega natychmiastowej i ilościowej precypitacji w buforze o warunkach fizjologicznych, należy tak dobrać stężenia obu partnerów, aby zapewnić, że nie występuje krytyczne (lub wywołujące agregację) stężenie wolnej postaci gp41 i że zdecydowana większość gp41 jest związana i stabilizowana w postaci kompleksu białkiem opiekuńczym.
W zależności od zastosowanego białka opiekuńczego, konieczne jest zmieszanie przynajmniej dwukrotnego nadmiaru (molowego) białek opiekuńczych w stosunku do cząsteczek gp41.
W korzystnym wykonaniu wynalazek ujawnia reagent zawierający mieszaninę gp41 i białka opiekuńczego, korzystnie FkpA.
Korzystnie, mieszanina taka zawiera FkpA w molowym nadmiarze w porównaniu do gp41.
Korzystnie, białka FkpA było od 3 do 10 razy więcej. Najkorzystniejszy stosunek molowy FkpA do gp41 wynosi od 4 do 6.
Stwierdzono, że tworzenie się wewnątrzcząsteczkowego kompleksu, np. między różnymi domenami białka zawierającego kowalencyjnie związaną przynajmniej jedną domenę białka rsgp oraz przynajmniej jedną domenę białka opiekuńczego PPI, prowadzi do uzyskania dodatkowych korzystnych efektów, np. w odniesieniu do stabilności i łatwości wytwarzania.
Stwierdzono np., że stosunek 1:1 (rsgp wobec białka opiekuńczego) wystarcza do utworzenia rozpuszczalnego kompleksu, jeśli obie domeny są kowalencyjnie związane.
Rozpuszczalny kompleks, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze w rekombinowanej związanej postaci, stanowi następne korzystne wykonanie według niniejszego wynalazku. Najkorzystniejsze cząsteczki rsgp zawarte w takim rekombinowanym polipeptydzie to gp41 z wirusa HIV-1 oraz gp36 z wirusa HIV-2.
W przypadku rekombinowanego białka zawierającego przynajmniej jedną domenę rsgp i przynajmniej jedną domenę białka opiekuńczego PPI, transfer z warunków nie fizjologicznych do fizjologicznych może się odbywać różnymi sposobami. Rozpuszczalne wewnątrzcząsteczkowe kompleksy między gp41 a FkpA są łatwo otrzymywane przez doprowadzanie buforu do fizjologicznych warunków przy użyciu dializy, szybkiego rozcieńczenia lub ponownego sfałdowania na nośniku (macierzy). Mieszanina zawierająca rozpuszczalny kompleks gp41 z białkiem opiekuńczym może być użyta bezpośrednio do modyfikacji.
Kompleks rozpuszczalny, zawierający np. gp41 oraz PPI według niniejszego wynalazku może być również wyprodukowany wychodząc od polipeptydu zawierającego obie domeny (gp41 oraz białko opiekuńcze), który uzyskany został przy użyciu technik rekombinacyjnych. Kompleks gp41 z białkiem opiekuńczym ma więc wówczas naturę wewnątrzcząsteczkową.
Korzystnie, rekombinowany polipeptyd według niniejszego wynalazku obejmuje gp41 i białko opiekuńcze, lub też gp36 i białko opiekuńcze. W kolejnym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku dotyczy on rekombinowanego białka, zawierającego przynajmniej jedną domenę rsgp i przynajmniej dwie domeny białka opiekuńczego PPI. Korzystne są również rekombinowane polipeptydy zawierające przynajmniej jedną domenę rsgp oraz przynajmniej dwa białka opiekuńcze.
Ekspresję rekombinowanego polipeptydu, wykorzystywanego do otrzymywania rozpuszczalnych kompleksów gp41 z białkiem opiekuńczym według niniejszego wynalazku, uzyskuje się przy użyciu standartowych technik biologii molekularnej.
PL 218 245 B1
Korzystnie, gen białka opiekuńczego umieszcza się (zgodnie z ramką odczytu) w pozycji 5' od genu białka docelowego w wektorze ekspresyjnym, zawierającym w ten sposób informację genetyczną zarówno dla gp41, jak i dla białka opiekuńczego, a ewentualnie także dla odpowiedniego łącznika peptydowego.
Korzystnym gospodarzem przy wytwarzaniu takiego rekombinowanego białka fuzyjnego na dużą skalę jest bakteria E. coli.
W korzystnym wykonaniu rozpuszczalny kompleks zawiera odpowiednio gp41 lub gp36 i białko opiekuńcze wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.
Korzystnie, ten rozpuszczalny kompleks jest kompleksem wewnątrzcząsteczkowym, korzystnie kompleksem wewnątrzcząsteczkowym w obrębie rekombinowanego polipeptydu zawierającego gp41 lub gp36, oraz białko opiekuńcze PPI.
Najkorzystniej, białko opiekuńcze PPI, stanowiące część rekombinowanego polipeptydu, nie ma żadnego eksportowego peptydu sygnałowego (obecnego w odpowiedniej cząsteczce prekursorowej) i odpowiada dojrzałemu białku opiekuńczemu PPI. Ponieważ w tym korzystnym wykonaniu, rekombinowane białko nie ma funkcjonalnej sekwencji sygnałowej, produkt genu akumuluje się w cytozolu bakteryjnym.
Uderzającą cechą białka gp41 zawartego w rekombinowanej cząsteczce FkpA-gp41 jest jego wyjątkowo dobra rozpuszczalność w porównaniu z nie związaną z białkiem opiekuńczym (nie osłoniętą) ektodomeną gp41. Ciekawe jest też, że „materiał chaotropowy” (tj. FkpA-gp41 w 6,0-7,0 M GuHCl) może być poddany ponownemu sfałdowaniu na różne sposoby, z których wszystkie prowadzą do otrzymania stabilnej termodynamicznie i rozpuszczalnej postaci, przypominającej postać natywną. Ponowne fałdowanie przeprowadzane jest z dużą wydajnością, zarówno w przypadku dializy, jak i szybkiego rozcieńczania, a także przy użyciu chromatografii ekskluzyjnej i fałdowania na nośniku (macierzy). Obserwacje te wskazują na to, że polipeptyd fuzyjny gp41-FkpA, w postaci związanej kowalencyjnie, jest raczej białkiem stabilnym termodynamicznie niż metastabilnym.
Rekombinowany polipeptyd FkpA-gp41 zawiera dwie domeny białkowe, mające różne wymagania wobec procesu fałdowania. Ponieważ protokół oczyszczania obejmuje etap wstępnej denaturacji, obowiązkowe jest, żeby proces fałdowania białka opiekuńczego był procesem odwracalnym. Uzyskaliśmy zatem przekonujący dowód spektroskopowy na odwracalne i niezależne fałdowanie FkpA i gp41 w obrębie związanego kowalencyjnie kompleksu białkowego. Fałdowanie skróconego (od strony C-końca) białka SlyD okazało się również odwracalne.
Korzystny jest rekombinowany polipeptyd, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze, który zawiera dodatkowo sekwencję odpowiedniego łącznika peptydowego, usytuowanego między tymi dwoma domenami polipeptydowymi. Sekwencja tego łącznika peptydowego jest tak dobrana, aby zapewnić optymalną wewnątrzcząsteczkową asocjację domen rsgp i białka opiekuńczego.
Korzystnie, sekwencja takiego łącznika ma długość około 20 aminokwasów i zawiera aminokwasy wspomagające zarówno elastyczność, jak i rozpuszczalność, a zatem np. glicynę i serynę. Korzystnie, długość łącznika wynosi od 10 do 50 aminokwasów.
Korzystniej, długość ta wynosi od 12 do 40 aminokwasów, a najkorzystniej łącznik obejmuje od 15 do 35 aminokwasów. Białko opiekuńcze i rsgp są zawsze w bliskiej odległości od siebie (utrzymywane razem, np. przez odpowiedni łącznik).
W korzystnym wykonaniu, rekombinowany polipeptyd obejmuje dojrzałe białko FkpA połączone ze swoim białkiem docelowym za pośrednictwem elastycznego łącznika. Jak wskazują wyniki, zapewnia to dodatkowy efekt stabilizacyjny.
Stwierdzono dość nieoczekiwany fakt, że białko gp41, stanowiące fragment wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego gp41 i białko opiekuńcze PPI, jest zarówno rozpuszczalne, jak i stabilne. To samo donosi się do wewnątrzcząsteczkowego kompleksu obejmującego białko opiekuńcze PPI i gp36, lub też białko opiekuńcze PPI i gp21 z wirusa HTLV. Zwiększona stabilność gp41 w takim kompleksie wiąże się z uzyskaniem dodatkowych korzyści. Na przykład, umożliwia to stosunkowo łatwe uzyskanie całkowicie renaturowanej rekombinowanej cząsteczki zawierającej gp41 i białko opiekuńcze. Rekombinowane białko jest początkowo rozpuszczane przy użyciu czynnika chaotropowego (np. chlorku guanidyniowego). Całkowicie renaturowane białko można następnie otrzymać przepuszczając ten rozpuszczony materiał przez żelową kolumnę filtracyjną, w której wartość pH jest równoważona przy użyciu odpowiedniego buforu fizjologicznego (patrz przykład 2.3 oraz fig. 7 i 8).
PL 218 245 B1
Rozpuszczalny kompleks wewnątrzcząsteczkowy białka gp41 z białkiem opiekuńczym wykazuje jeszcze jedną korzystną cechę: jest stosunkowo stabilny wobec denaturującego działania detergentów. Ten efekt staje się jeszcze bardziej wyraźny, jeśli białko fuzyjne zawiera dwa białka opiekuńcze i jedną glikoproteinę powierzchniową (odpowiednio gp41 lub gp36). Większość testów immunologicznych przeprowadza się w obecności detergentów, co ma na celu zmniejszenie lub przynajmniej częściowe uniknięcie problemów związanych z nieswoistym wiązaniem przeciwciał. W przypadku diagnostyki HIV, stosuje się dość silne detergenty, co oprócz wymienionego powyżej celu ma również prowadzić do dezintegracji i rozbicia cząstek wirusowych tak, aby ułatwiało to wykrywanie antygenów wirusowych, takich jak gp24.
Rekombinowana ektodomena gp41 rozpuszczona przy użyciu SDS (siarczanu dodecylu sodu) nie wykazuje immunoreaktywności w używanym rutynowo buforze testowym, np. w testach wykrywającym przeciwciała przeciwko HIV lub antygen p24 (patrz fig. 9). Jednak, w buforze o tych samych warunkach, białko gp41, stanowiące fragment kompleksu obejmującego gp41 i białko opiekuńcze PPI według wynalazku, wykazuje silną immunoreaktywność. Jak widać to na fig. 9, przy zastosowaniu tych samych warunków testu i tej samej surowicy pacjenta, materiał ten uzyskuje doskonałą krzywą kompetycji, co można wyjaśnić jedynie obecnością rozpuszczalnego białka gp41 o właściwościach zbliżonych do białka natywnego, które w dodatku jest stabilne w obecności detergentu użytego w teście.
Istotną właściwością kompleksu według niniejszego wynalazku jest to, że rsgp stanowiące część rozpuszczalnego kompleksu rsgp-białko opiekuńcze jest sfałdowany w natywny sposób, w buforze o warunkach fizjologicznych (np. 20 mM fosforan, 150 mM chlorek sodu, pH 7,4). Stanowi to ogromną zaletę, istotną w przypadku aplikacji leczniczych i diagnostycznych. W korzystnym wykonaniu, wynalazek niniejszy odnosi się do kompozycji reagentów, która jest rozpuszczalna w buforze o warunkach fizjologicznych i zawiera wewnątrz- lub międzycząsteczkowy kompleks, obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i białko opiekuńcze wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych.
Rozpuszczalny kompleks, zawierający natywnie sfałdowane białko gp41 wirusa HIV-1 i białko opiekuńcze wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych stanowi więc bardzo korzystne wykonanie niniejszego wynalazku. Rozpuszczalny kompleks, zawierający natywnie sfałdowane białko gp36 wirusa HIV-2 i białko opiekuńcze wybrane z klasy izomeraz peptydyloprolilowych, stanowi więc także bardzo korzystne zastosowanie prezentowanego wynalazku.
W odniesieniu do leczenia, oczywisty jest postęp, jaki oznacza dostarczenie „rozpuszczalnego i natywnie sfałdowanego” białka gp41 lub gp36. Na przykład, po raz pierwszy stała się możliwa iniekcja gp41 przy zachowaniu fizjologicznych warunków buforu, jeśli chodzi o białko gp41.
W korzystnym wykonaniu, rozpuszczalny kompleks jak tu opisany, wykorzystany jest do wytwarzania kompozycji reagentów mającej zastosowanie jako lek. Kompozycja reagentów obejmuje kompleks gp41-białko opiekuńcze i dopuszczalną fizjologicznie substancję pomocniczą, a także, jeśli jest to korzystne, odpowiednie dodatki i/lub konwencjonalne substancje wspomagające.
Wiadomo, że peptydy pochodzące z regionu powtórzeń heptadowych (siódemkowych) białka gp41 lub z regionu C-końcowej helisy białka gp41, posiadają aktywność przeciwwirusową (Wild C. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10537-10541). Powstrzymują one wnikanie wirusa do komórek przez swoiste oddziaływanie z tzw. „produktem pośrednim o strukturze spinki do włosów” białka gp41 (patrz opracowanie przeglądowe Doms R. W. oraz Moore J. P., J. Cell. Biol. 151 (2000) F9-14). Stwierdziliśmy, że kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym według niniejszego wynalazku wykazuje aktywność przeciwwirusową. W pierwszym korzystnym leczniczym wykonaniu niniejszego wynalazku, skuteczna leczniczo dawka kompozycji reagentów, zawierającej kompleks gp41 z białkiem opiekuńczym, lub też kompleks gp36 z białkiem opiekuńczym wykorzystana jest do zapobiegania wnikaniu wirusa HIV i jego rozsiewaniu w obrębie organizmu gospodarza („zahamowanie wejścia wirusa”).
Kolejnym korzystnym leczniczym zastosowaniem kompozycji reagentów, zawierającej kompleks białka gp41 z białkiem opiekuńczym, jest wykorzystanie jej do wywołania odpowiedzi odpornościowej u ssaka. Użycie opisanego kompleksu pozwala na udostępnienie znacznie większej liczby epitopów białka gp41, niż jakikolwiek inny znany immunogen HIV (patrz np. Root i wsp., wyżej). Należy się ztem spodziewać, że ten nowy immunogen wywoływać będzie znacznie szerszą odpowiedź odpornościową.
W odniesieniu do procedur diagnostycznych, oczywistymi zaletami rozpuszczalnego kompleksu, obejmującego rsgp i białko opiekuńcze według niniejszego wynalazku, są np. zwiększona stabilność retrowirusowej glikoproteiny powierzchniowej (takiej jak np. gp41) w buforze o fizjologicznych
PL 218 245 B1 warunkach i/lub zwiększenie czułości testu diagnostycznego, i/lub zwiększenie liczby udostępnionych epitopów konformacyjnych, i/lub możliwość łatwego znakowania prawidłowo sfałdowanego białka rsgp, takiego jak gp41.
Dobrze znanymi znacznikami są grupy znacznikowe lub efektorowe, takie jak grupy wiążące się z nośnikami fazy stałej. Znakowany rozpuszczalny kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym może stanowić kolejne korzystne wykonanie niniejszego wynalazku.
Grupy znacznikowe mogą być wybrane z dowolnej znanej grupy wykrywalnych znaczników, takich jak barwniki, luminescencyjne grupy znacznikowe, takie jak grupy chemiluminescencyjne, np. estry akrydynowe lub dioksetany, lub barwniki fluoroscencyjne, np. fluoresceina, kumaryna, rodamina, oksazyna, resorufin, cyjanina, oraz ich pochodne. Innymi przykładami grup znacznikowych są luminescencyjne kompleksy metali, takie jak kompleksy rutenu lub europu, enzymy, np. enzymy wykorzystywane w testach ELISA lub CEDIA (ang. Cloned Enzyme Donor Immunoassay, np. EP-A-0 061 888) oraz radioizotopy.
Grupy efektorowe obejmują np. jeden element z pary wykazującej powinowactwo biologiczne. Podczas przeprowadzania testu, grupa efektorowa oddziałuje swoiście i korzystnie nie kowalencyjnie z innym elementem takiej pary. Przykładami takich par mogą być hapten lub antygen/przeciwciało, biotyna (lub analog biotyny, taki jak aminobiotyna, iminobiotyna lub desthiobiotyna) oraz awidyna lub streptawidyna, cukier/lektyna, kwas nukleinowy (lub jego analog) oraz komplementarny kwas nukleinowy, a także receptor/ligand (np. receptor hormonu sterydowego/hormon sterydowy). Korzystne elementy takich par obejmują hapten, antygen oraz hormon. Szczególnie korzystne są hapteny, takie jak digoksyna i biotyna lub ich analogi.
Kompleks rozpuszczalny, zawierający rsgp oraz białko opiekuńcze PPI, jest korzystnie stosowany w testach immunologicznych, wykrywających przeciwciała skierowane przeciwko rsgp.
Korzystnie, stosowane są kompleksy, zawierające gp41 lub gp36 oraz białko opiekuńcze. W bardzo korzystnym wykonaniu, znakowany rozpuszczalny kompleks obejmujący gp41 i białko opiekuńcze PPI jest stosowany w testach immunologicznych do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciw gp41. W najkorzystniejszym wykonaniu znakowany kompleks jest kompleksem wewnątrzcząsteczkowym w obrębie rekombinowanego polipeptydu zawierającego białko opiekuńcze PPI oraz białko gp41.
Testy immunologiczne są testami znanymi specjalistom z tej dziedziny. Sposoby przeprowadzania takich testów, a także praktyczne zastosowania i procedury, są opisane w odpowiednich podręcznikach. Przykładem może być opracowanie P. Tijssena „Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates” (w podręczniku „Practice and theory of enzyme immunoassays” (1990) 221-278, wyd. R. H. Burdon i P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam, Holandia) oraz rozmaite opracowania Tijssena w „Methods in Enzymology” (1980) wyd. S. P. Colowick, N. O. Caplan oraz
S. P., Academic Press), dotyczące sposobów immunologicznej detekcji, zwłaszcza w tomach 70, 73, 74, 84, 92 i 121.
Nowy rozpuszczalny kompleks rsgp z białkiem opiekuńczym może być wykorzystany do doskonalenia testów służących wykrywaniu przeciwciał przeciwko wirusowi HIV, niezależnie od zastosowanego sposobu detekcji (np. testu radioizotopowego, enzymatycznego testu immunologicznego, testu z wykorzystaniem elektrochemiluminescencji, itp.) lub zasady działania (np. testu paskowego, testu „kanapkowego”, testu homogennego, itp.).
Dla niezawodnego i czułego wczesnego wykrywania infekcji wirusem HIV istotne jest dokonywanie pomiaru zarówno antygenu wirusowego, jak i przeciwciała przeciwko wirusowi, w próbkach płynów organizmu. Kompleks rozpuszczalny według niniejszego wynalazku umożliwia wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciwko gp41 i/lub gp36 w buforze o warunkach fizjologicznych. Wykrywanie przeciwciał przeciwko gp41 i/lub gp36 jest cennym elementem takiego kombinowanego systemu detekcji HIV. Opisano również systemy detekcji wirusa HIV, obejmujące wykrywanie przeciwciał przeciwko gp41 i/lub gp36 w oparciu o wykorzystanie kompleksu zawierającego gp41 i/lub gp36 i białko opiekuńcze. Najkorzystniej, detekcja przeciwciał skierowanych przeciwko gp41 i/lub gp36, oparta na wykorzystaniu takiego kompleksu, przeprowadzana jest wraz z detekcją antygenu wirusa HIV, korzystnie antygenu gp24.
Jak wiadomo specjalistom z tej dziedziny, przeciwciała skierowane przeciwko czynnikom infekcyjnym, takim jak bakterie, grzyby lub wirusy, są korzystnie wykrywane przy użyciu testu wykorzystującego zasadę mostku antygenowego (czasami zasada ta nazywana jest też zasadą podwójnego mostka antygenowego, ponieważ za pośrednictwem przeciwciała łączone są dwa antygeny). W teście
PL 218 245 B1 tym wymagane jest, aby przeciwciało wykazywało zdolność do wiązania przynajmniej dwóch różnych cząsteczek danego antygenu przy pomocy swoich dwóch (IgG, IgA, IgE) lub 10 (IgM) paratopów.
Wykrywanie przeciwciał w płynach ustrojowych przy zastosowaniu koncepcji mostka może być przeprowadzone w różnych układach testu. Prosty układ obejmuje bezpośrednie pokrycie antygenem nośnika fazy stałej i wykorzystanie tego samego antygenu w postaci znakowanej. Przy zaistnieniu odpowiednich warunków testu, przeciwciało w próbce tworzy mostek pomiędzy antygenem związanym na nośniku fazy stałej a znakowanym antygenem. Dlatego też, mostek tworzony jest jedynie wtedy, jeśli w badanej próbce obecne jest przeciwciało, co prowadzi do wykrycia sygnału.
Zasadnicza struktura obu antygenów, czyli „antygenu na nośniku fazy stałej” i „antygenu detekcyjnego”, jest korzystnie taka sama. Na przykład, polipeptyd zawierający jeden lub kilka epitopów, może być pośrednio lub bezpośrednio przytwierdzony do fazy stałej i ten sam syntetyczny polipeptyd może być również sprzężony ze znacznikiem lub markerem i zastosowany jako antygen detekcyjny. Możliwe jest też wykorzystanie podobnych, lecz odmiennych antygenów, które wykazują reaktywność krzyżową w teście opartym na mostku antygenowym. Zasadniczym warunkiem przeprowadzenia takiego testu jest to, aby odpowiedni epitop lub epitopy były obecne na obu antygenach. Możliwe są oczywiście liczne warianty układu testowego opartego na podwójnym mostku antygenowym. Takie warianty obejmują np. przytwierdzenie antygenu do nośnika w sposób pośredni.
Korzystnie, do pośredniego wiązania antygenu z nośnikiem wykorzystywana jest para swoiście wiążących się elementów, a najkorzystniej jest to system obejmujący biotynę i streptawidynę (lub biotynę i awidynę). Z drugiej strony, antygen wykorzystywany do detekcji w takim systemie nie musi być bezpośrednio związany ze znacznikiem (np. radioizotopem, enzymem, cząsteczką fluoroscencyjną, itp.), lecz może być też wykrywany pośrednio, gdy np. połączony jest z haptenem (takim jak przykładowo digoksygenina). Taki pośredni sposób detekcji może być przeprowadzany np. przez wyznakowane przeciwciała skierowane przeciwko digoksygeninie.
W wynalazku ujawniono też test immunologiczny oparty na zasadzie podwójnego mostka antygenowego i obejmujący: pierwszy antygen, obejmujący pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem oraz drugi antygen, obejmując drugi kompleks białka opiekuńczego z antygenem.
Kolejnym ujawnionym testem immunologicznym jest test oparty na zasadzie mostka antygenowego i charakteryzujący się tym, że pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem zastosowany jest jako antygen wychwytujący, a drugi kompleks białka opiekuńczego z antygenem zastosowany jest jako antygen detekcyjny.
Opisane w niniejszym wynalazku kompleksy białka opiekuńczego z antygenem nie tylko poprawiają rozpuszczalność różnych polipeptydów, które w przeciwnym wypadku byłyby trudne do zastosowania, ale też umożliwiają zastosowanie bardzo korzystnego testu immunologicznego, opartego na koncepcji podwójnego mostka antygenowego.
Szczególnie atrakcyjną cechą takiego testu immunologicznego opartego na koncepcji podwójnego mostka antygenowego jest powstała możliwość wykorzystania różnych białek opiekuńczych odpowiednio dla tworzenia kompleksu z antygenem połączonym z nośnikiem fazy stałej i dla tworzenia kompleksu z antygenem detekcyjnym. Taka modyfikacja testu poprawia jego jakość w odniesieniu do problemu nieswoistego wiązania. Przeciwciała obecne w próbce, które mogłyby wykazywać reaktywność wobec białka opiekuńczego i powodować w ten sposób otrzymywanie sygnału fałszywie dodatniego, nie będą tworzyły mostka, jeśli do tworzenia kompleksu z antygenem fazy stałej i kompleksu z antygenem detekcyjnym użyte zostaną inne białka opiekuńcze. Dlatego też, przy zastosowaniu tego układu, prawdopodobieństwo otrzymania pozytywnego sygnału wskutek nieswoistego wiązania jest znacznie zredukowane. Niniejszym ujawniono również test immunologiczny oparty na koncepcji podwójnego mostka antygenowego, charakteryzujący się tym, że pierwsze białko opiekuńcze i drugie białko opiekuńcze, obecne odpowiednio w pierwszym i drugim kompleksie białka opiekuńczego z antygenem, różnią się od siebie.
Większość najlepiej scharakteryzowanych białek opiekuńczych wyizolowano z bakterii Escherichia coli, które są powszechnie wykorzystywane w naukach biotechnologicznych. Ponieważ Escherichia coli jest szeroko rozpowszechnionym gatunkiem bakterii, wiele ssaków wykształciło przeciwciała przeciwko białkom pochodzącym z tej bakterii. W celu zmniejszenia prawdopodobieństwa otrzymania wyniku fałszywie dodatniego, na skutek występowania takich przeciwciał, korzystne jest, aby stosowano przynajmniej jedno białko opiekuńcze PPI, pochodzące z innego gatunku bakterii, korzystnie gatunku ciepłolubnego.
PL 218 245 B1
Korzystnie, białko pochodzi od bakterii żyjących w ekstremalnych środowiskach, zwłaszcza z grupy bakterii obejmującej Thermatoga maritima, Aquifex aeolicus oraz Thermus thermophilus.
Wykorzystanie kompleksu białka opiekuńczego z antygenem w teście immunologicznym, a korzystnie w teście immunologicznym opartym na koncepcji mostka antygenowego, dostarcza także możliwości modyfikowania białka opiekuńczego w takim kompleksie, usuwając w ten sposób konieczność modyfikowania samego antygenu. Powszechnie uważa się, że modyfikowanie polipeptydu przez dodanie drugiej chemicznej cząsteczki (grupy), np. przez sprzężenie takiego polipeptydu ze znacznikiem, niesie ze sobą ryzyko negatywnego wpływu na właściwości danego polipeptydu. Na przykład, badany epitop może zostać uszkodzony, lub efektem takiego znakowania może być pojawienie się skłonności do nieswoistego wiązania.
Test immunologiczny oparty na koncepcji podwójnego mostka antygenowego charakteryzuje się dodatkowo tym, że pierwszy kompleks białka opiekuńczego z antygenem, wykorzystywany jako antygen wychwytujący, obejmuje grupę wiążącą się z nośnikiem fazy stałej.
Test immunologiczny oparty na koncepcji mostka antygenowego charakteryzuje się dodatkowo tym, że drugi kompleks białka opiekuńczego z antygenem, wykorzystywany jako antygen detekcyjny, obejmuje grupę znacznikową (markerową).
W innym wykonaniu, rozpuszczalny kompleks obejmujący rsgp i białko opiekuńcze PPI, np. kompleks białka gp41 lub gp36 z białkiem opiekuńczym, może być również wykorzystany do wywoływania odpowiedzi odpornościowej, np. u człowieka lub zwierzęcia. Rozpuszczalne kompleksy mogą być podawane osobnikowi w postaci kompozycji, zawierającej np. substancję pomocniczą lub nośnik. Kompozycje takie mogą również obejmować adiuwant. Przykłady powszechnie stosowanych adiuwantów obejmują, ale nie wyłącznie, niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, Merck 65, AS-2, ałun, fosforan glinu, żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, oraz powierzchniowo czynne substancje, takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaninę ze skałoczepa i dinitrofenol. Inne przydatne adiuwanty obejmują, ale nie wyłącznie bakteryjne wielocukry otoczkowe, dekstran, IL-12, GM-CSF, ligand CD40, IFN-y, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-13, IL-18 lub inne cytokiny, lub fragmenty bakteryjnego DNA.
Kompozycje zawierające rozpuszczalny kompleks mogą być podawane w jednej dawce. Po podaniu pierwszej dawki można podać dawkę przypominającą (raz, dwa, trzy lub więcej razy). Liczba podanych dawek zależy częściowo od odpowiedzi osobnika na kompozycję rozpuszczalnego kompleksu. W zakresie niniejszego wynalazku, odpowiednia liczba dawek obejmuje dowolną liczbę wymaganą do przeprowadzenia skutecznej immunizacji zwierzęcia przy użyciu rozpuszczalnego kompleksu.
Podanie drugiej (przypominającej) dawki kompozycji rozpuszczalnego kompleksu może nastąpić w terminie od około 7 dni do 1 roku od podania pierwszej dawki. Czas upływający między podaniem pierwszej i drugiej dawki może wynosić od 14 dni do 6 miesięcy, od 21 dni do 3 miesięcy, a często od 28 dni do 2 miesięcy. Trzecie podanie (druga dawka przypominająca) może nastąpić w terminie od około 14 dni do 3 lat od podania pierwszej dawki. Czas upływający między podaniem drugiej i trzeciej dawki może wynosić od 14 dni do 3 lat, od 21 dni do 1 roku, a często od 28 dni do 6 miesięcy. Kolejne dawki przypominające mogą być podawane w odstępach 2 tygodni, lub 1 miesiąca, 3 miesięcy, albo od 6 miesięcy do 10 lat.
Zazwyczaj, osobnikowi będzie podawana taka ilość rozpuszczalnego kompleksu, jaka wystarcza do immunizacji zwierzęcia w odniesieniu do antygenu (tj. będzie to „dawka skuteczna immunologicznie” lub „dawka skuteczna terapeutycznie”). Ilość odpowiadająca „dawce skutecznej immunologicznie” zależeć będzie częściowo od masy ciała i ogólnego stanu zdrowia osobnika, a także od oceny przepisującego te dawkę lekarza lub innego wykwalifikowanego członka personelu.
Skuteczna dawka rozpuszczalnego kompleksu może być oceniona na modelu zwierzęcym, tak aby wywoływała odpowiedź odpornościową, a następnie wyniki te mogą być wykorzystane do optymalizacji podawania u ludzi w oparciu o dane uzyskane u zwierząt. Dawka taka będzie zazwyczaj wynosić od około 1 μg do około 100 μg, często od około 1 μg do około 100 μg, jeszcze częściej od około 1 μg do około 50 μg, a najczęściej od około 100 μg do około 50 μg. W przeliczeniu na 1 kg masy ciała osobnika, dawka wynosi między około 1 μg a około 100 μg, często między około 1 μg a około 100 μg, jeszcze częściej między około 1 μg a około 50 μg, a najczęściej między około 100 μg a około 50 μg na 1 kg masy ciała.
Kompozycje zawierające rozpuszczalny kompleks według wynalazku mogą być podawane przy użyciu różnych sposobów i w różnej postaci. Kompozycje z rozpuszczalnym kompleksem mogą obejmować nośniki i zaróbki, takie jak bufory, węglowodany, mannitol, białka, polipeptydy lub aminokwasy,
PL 218 245 B1 takie jak glicyna, przeciwutleniacze, bakteriostatyki, czynniki chelatujące, czynniki zawieszające, czynniki zagęszczające i/lub konserwanty; wodę, oleje, roztwory solne, wodne roztwory dekstrozy i glicerolu, inne farmaceutycznie dopuszczalne substancje wspomagające wymagane do utrzymania warunków fizjologicznych, a więc takie jak czynniki buforujące, czynniki tonizujące, czynniki nawilżające, itp. Do kompozycji można również włączyć konwencjonalny adiuwant.
Choć do podawania kompozycji według wynalazku może być wykorzystany dowolny nośnik, to jego rodzaj będzie zależał od sposobu podawania. Podawane związki mogą być również umieszczone w liposomach. W niektórych przypadkach, np. tych opisanych przez Tice i wsp. (patent USA nr 5 942 252, 1999), wygodne może być zastosowanie jako nośników degradowanych biologicznie mikrosfer. Konieczna jest sterylizacja kompozycji, np. przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak sterylne filtrowanie. Otrzymane roztwory wodne mogą być pakowane w tej postaci lub liofilizowane.
Kompozycje z rozpuszczalnymi kompleksami według wynalazku mogą być podawane rozmaitymi drogami, włącznie z iniekcją (np. śródskorną, podskórną, domięśniową, dootrzewnową, itp.) inhalacją, podawaniem miejscowym, czopkami, plastrami do podawania przezskórnego lub podawaniem doustnym. Gdy podawanie odbywa się przy użyciu iniekcji, kompozycja może być przygotowana w roztworze wodnym, korzystnie w buforze fizjologicznym, takim jak roztwór Hanksa, roztwór Ringera, buforze zawierającym 20 mM fosforan i 150 mM chlorek sodu (pH 7,4), lub roztworze soli fizjologicznej. Roztwór ten zawierać może czynniki zawieszające, stabilizujące lub rozpraszające.
Alternatywnie, kompozycja może występować w postaci proszku, zmieszanego przed użyciem z odpowiednią zaróbką, np. sterylną, wolną od pirogenów wodą. Kompozycje podawane poprzez inhalację mogą mieć postać aerozolu rozpylanego z pojemnika pod ciśnieniem lub rozpylacza z odpowiednim propelentem, np. dichlorodifluorometanem, trichlorofluorometanem, ditlenkiem węgla lub innym odpowiednim gazem. W przypadku aerozolu ciśnieniowego, jednostkę dawkowania należy określić wprowadzając zastawkę, pozwalającą odmierzać określoną ilość. Można produkować kapsułki lub wkłady, np. z żelatyny, do inhalatora lub insuflatora, które mogą zawierać występującą w postaci proszku mieszaninę białek i odpowiedniej substancji stanowiącej podstawę proszku, np. laktozy lub skrobi. Do podawania miejscowego kompozycje mogą mieć postać roztworów, żelów, maści, kremów, zawiesin, itp., które są doskonale znane specjalistom. W niektórych wykonaniach, stosować można plastry do podawania przezskórnego. Kompozycje czopkowe, mogą być wytwarzane tak, aby zawierały konwencjonalne podstawy czopkowe.
W przypadku podawania doustnego, kompozycja musi być odpowiednio sformułowana przez połączenie jej z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Nośniki w postaci stałej obejmują mannitol, laktozę, stearynian magnezu, itp. Nośniki takie umożliwiają tworzenie tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żelów, syropów, papek, zawiesin, itp., do podawania doustnego. Stosowane preparaty obejmować więc mogą proszek, kapsułki oraz tabletki, a odpowiednie zaróbki obejmują wypełniacze, takie jak cukry, preparaty celulozy, czynniki granulujące oraz czynniki wiążące.
Sposoby wytwarzania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał, włącznie z fragmentami wiążącymi (np. F(ab)2) oraz wariantami jednołańcuchowymi, są dobrze znane. Wiele antygenów nie jest jednak zdolnych do wywoływania wystarczającej odpowiedzi przeciwciałowej. W jednym z wykonań, zwierzęciu podaje się kompozycję zawierającą rozpuszczalny kompleks według wynalazku, wywołując u niego w ten sposób odpowiedź odpornościową. Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała są następnie otrzymywane przy użyciu standardowych technik.
Rozpuszczalny kompleks zawierający rsgp oraz białko opiekuńcze PPI (np. kompleks gp41 lub gp36 z białkiem opiekuńczym), może być również wykorzystany do zahamowania procesu wnikania wirusa do komórki, np. przez zahamowanie fuzji z błoną komórkową. Dotyczy to komórek in vitro, in vivo lub ex vivo. Kompozycje oraz sposoby podawania są podobne do tych, jakie opisano dla kompozycji i sposobów podawania wykorzystywanych do wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Jeśli zahamowanie procesu wnikania wirusa do komórki osiągane jest przez szczepienie można wtedy użyć adiuwantów. Przy podawaniu in vitro bądź ex vivo, odpowiedni sposób, zależny częściowo od rodzaju komórek, warunków hodowli oraz ograniczeń czasowych (jeśli takie występują), powinien być wybrany przez specjalistę. Na przykład, jednym z użytecznym sposobów byłoby zastosowanie liposomów, przenoszących w swym wnętrzu rozpuszczalne kompleksy.
Przedstawione poniżej przykłady, odnośniki oraz figury mają pomóc w zrozumieniu prezentowanego wynalazku, którego rzeczywisty zakres przedstawiony jest w załączonych zastrzeżeniach.
Jest zrozumiałe, że do przedstawionych procedur wprowadzać można liczne modyfikacje, bez odchodzenia od ducha wynalazku.
PL 218 245 B1
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie rozpuszczalnego międzycząsteczkowego kompleksu obejmującego gp41 oraz białko opiekuńcze PPI
1.1. Wytwarzanie FkpA bakterii E. coli
FkpA sklonowano, poddano ekspresji i oczyszczono zgodnie z opisem H. Bothmana i A. J. Pluckthuna (J. Biol. Chem. 275 (2000) 17100-17105), z wprowadzeniem niewielkich modyfikacji. Dla celów przechowywania, roztwór białka poddawano dializie wobec 20 mM NaH2PO4/NaOH (pH 6,0), 100 mM NaCl i zagęszczono do stężenia 26 mg/ml (1 mM). Dla celów ekspresji w cytozolu, sekwencję kodującą FkpA powyższego wektora ekspresyjnego zmodyfikowano w celu usunięcia części sekwencji kodującej peptyd sygnałowy, i uzyskania w ten sposób jedynie sekwencji kodującej dojrzałego FkpA.
1.2. Produkcja gp41 (535-681)-His6
Sekwencję gp41 (535-681)-His6 sklonowano i poddano ekspresji przy użyciu systemu ekspresyjnego opartego na promotorze T7. Produkowane białko ulegało akumulacji w ciałach inkluzyjnych w komórkach gospodarza. Izolowane ciała inkluzyjne rozpuszczano w 6M chlorku guanidyniowym. Znakowane epitopem polihistydynowym białko oczyszczano na kolumnie niklowej i filtrowano przez żel (Sephacryl 100, 6M guanidynium). Białko poddawano fałdowaniu poprzez gwałtowne rozcieńczenie, wg opisu P. T. Wingfielda i wsp. (Protein Sci. 6 (1997) 1653-1660). Końcowy bufor zawierał 30 mM mrówczan sodu, pH 3,0. Stan fałdowania oceniano przy pomocy CD w bliskim i dalekim UV, dla obu warunków buforu. Jak widać na fig 1A i 1B, zarówno widmo CD w dalekim, jak i bliskim UV sugeruje, że gp41 jest sfałdowane w natywny sposób jedynie przy pH 3,0, przy nieobecności czynnika chaotropowego.
1.3. Zmiana wartości pH (z pH 3,0 do pH fizjologicznego) dla ektodomeny gp41 (HIV) w obecności FkpA E. coli
1.3.1. Doświadczenie kontrolne
W doświadczeniu kontrolnym, rozpuszczalną ektodomenę e-gp41 (w 30 mM mrówczanie, pH 3,0) rozcieńczono 100-krotnie w buforze końcowym (20 mM fosforan sodu, pH 7,5; 50 mM NaCl;
mM EDTA). Ostateczne stężenie białka wynosiło około 1 μΜ. Rejestrowano widmo UV po upływie 1 minuty oraz 10 minut. Z widm przedstawionych na fig. 2 wynika w sposób oczywisty, że ektodomena, nie związana z białkiem opiekuńczym, ulega spontanicznej agregacji po zmianie wartości pH na neutralną. Fig. 2 ma na celu podkreślenie wyjątkowej skłonności do agregacji białka gp41. Proces spontanicznej agregacji tej cząsteczki przekracza zasięg oznaczony górną linią.
1.3.2. Preinkubacja gp41 z FkpA przy pH 3,0 umożliwia zmianę wartości pH na neutralną
W celu dokonania oceny potencjału białka opiekuńczego w zakresie ułatwiania rozpuszczalności, zmieszano ektodomenę gp41 i FkpA w stosunku molowym 1: oraz 1:4 (w 30 mM mrówczanie przy pH wynoszącym około 3,5) i inkubowano razem przez 1 minutę. Powstający kompleks umieszczano następnie w buforze o neutralnym pH, stosując 12-krotne rozcieńczenie w nowym buforze (20 mM fosforan sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA). Końcowe stężenia obu elementów w probówce doświadczalnej wynosiły odpowiednio 1 μΜ dla gp41 oraz 2 μΜ lub 4 μΜ dla FkpA. Wszystkie reakcje przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Po upływie 1 minuty i 10 minut rejestrowano widmo UV w celu sprawdzenia obecności agregatów w próbkach. Z wyników przedstawionych na fig. 3A i 3B wynika w sposób oczywisty, że FkpA znacznie redukuje agregację gp41 w sposób zależny od dawki.
Porównywalne wyniki otrzymano także dla czynnika wyzwalającego z Thermatoga maritima oraz dla skróconego C-końcowo białka SlyD z E. coli.
P r z y k ł a d 2
Produkcja rekombinowanej cząsteczki obejmującej związane kowalencyjnie gp41 i FkpA
W pierwszym etapie, z plazmidu przedstawionego w przykładzie 1.1 usunięto miejsce restrykcyjne BamHI w regionie kodującym dojrzałe białko FkpA E. coli, stosując w tym celu zestaw Quick-Change (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wraz z następującymi starterami:
5'-gcgggtgttccgggtatcccaccgaattc-3' (NR ID SEK: 3),
5'-gaattcggtgggatacccggaacacccgc-3' (NR ID SEK: 4).
Otrzymany konstrukt nazwano EcFkpA (A BamHI)[GGGS]3.
W drugim etapie, przy użyciu PCR powielano fragment genu, kodujący aminokwasy 535-681 białka otoczki wirusa HIV-1, z konstruktu przedstawionego w przykładzie 1.2, stosując do tego następujące startery:
PL 218 245 B1
5'-cgggatccggtggcggttcaggcggtggctctggtggcggtacgctg-acggtacaggccag-3' (NR ID SEK: 5),
5'-ccgctcgaggtaccacagccaatttgttat-3' (NR ID SEK: 6).
Uzyskany fragment wstawiono do EcFkpA(A BamHI)[GGGS]3, wykorzystując miejsca restrykcyjne BamHI i Xhol. Kodony odpowiadające łącznikowi glicynowo-serynowemu pomiędzy FkpA i egp41 wstawiono stosując tylny (reverse) starter dla klonowania FkpA oraz przedni (forward) starter dla klonowania e-gp41.
Otrzymany konstrukt poddano sekwencjonowaniu, w wyniku którego stwierdzono, że koduje on pożądane białko.
2.2. Oczyszczanie białka fuzyjnego
Komórki szczepu bakteryjnego BL21 E. coli, zawierające plazmid ekspresyjny, hodowano do osiągnięcia OD600 = 0,7, po czym indukowano cytozolową nadekspresję poprzez dodanie 1 mM IPTG (w temperaturze 37°C). Po upłynięciu czterech 5 godzin od momentu indukcji zbierano komórki poprzez wirowanie (20 minut przy 5000 g). Osad bakteryjny zawieszano w buforze do lizy (50 mM fosforan sodu, pH 7,8; 6,0 Μ GuHCl, 5 mM imidazol) i mieszano (przy użyciu mieszadełka) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po powtórnym wirowaniu (Sorvall SS34, 2000 rpm, 4°C) filtrowano supernatant (0,8/0,2 μm) i nanoszono na kolumnę Ni-NTA (NTA: nitrylooctan, Qiagen, Germantown, MD, USA) zrównoważoną uprzednio buforem do lizy. Nieswoiście związane białka usuwano poprzez płukanie buforem do lizy (dziesięcioma objętościami kolumny). Związane białko eluowano przy użyciu odpowiedniego buforu (50 mM fosforan sodu, pH 2,5; 6,0 M GuHCl) i zbierano we frakcje o objętości 4 ml. Mierzono absorbancję przy długości fali 280 nm. Otrzymany kwaśny i chaotropowy roztwór może być przetrzymywany w temperaturze 4°C, przed poddaniem dalszemu oczyszczaniu lub przed użyciem do doświadczeń nad fałdowaniem in vitro.
Dysponując tym niesfałdowanym materiałem, wykorzystać można rożne sposoby prowadzące do indukcji fałdowania, takie jak dializa, gwałtowne rozcieńczenie, chromatografię ekskluzyjną SEC, lub fałdowanie na nośniku (macierzy), otrzymując w każdym przypadku natywnie sfałdowane i rozpuszczalne białko.
2.3. Renaturacja poprzez dializę i gwałtowne rozcieńczenie
Materiał poddany opisanej powyżej procedurze rozpuszczania przenoszono do buforu fizjologicznego stosując dializę. Wybrana wartość progowa (przesiewowa) dla procesu dializy wynosiła 4000-6000 daltonów. W celu indukowania procesu fałdowania ektodomeny (fragment odpowiadający gp41 w związanych kowalencyjnie domenach białkowych gp41 i FkpA), usuwano GuHCl z roztworu białka po elucji poprzez dializę wobec roztworu zawierającego 50 mM fosforan sodu (pH 2,5) oraz 50 mM NaCl (chlorek sodu). Wiadomo dobrze, że przy takiej ekstremalnej wartości pH izolowana ektodomeną przybiera strukturę helikalną i tworzy kontakty trzeciorzędowe. Podczas analizowania widma CD w bliskim UV dla rekombinowanego białka FkpA stwierdzono, że w tych samych warunkach białko to pozostaje w zasadzie nieustrukturyzowane. Zaskakujące jest więc, że fałdowanie gp41-FkpA przy zastosowaniu dializy prowadzi do otrzymania łatwo rozpuszczalnego kompleksu białkowego, zawierającego związane kowalencyjnie domeny białkowe gp41 i FkpA. W widmie UV (fig. 4) brak jest wyraźnej absorpcji poniżej 300 nm, która odpowiadałaby rozproszeniu światła. Takie rozproszone światło wskazywałoby na obecność agregatów, tak więc widmo przedstawione na fig. 4 wskazuje, że sfałdowany materiał nie zawiera znaczących ilości agregatów.
Dichroizm kołowy (CD) jest często wykorzystywanym sposobem oceniania drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury białek. Eliptyczność w regionie aromatycznym (260-320 nm) wskazuje na trzeciorzędowe oddziaływania (kontakty) w obrębie białka (tj. wskazuje na istnienie globularnej struktury odpowiadającej sfałdowanemu białku), podczas gdy eliptyczność w regionie amidowym odpowiada regularnie powtarzanym elementom w szkielecie peptydowym, tj. strukturze drugorzędowej.
Widmo CD w bliskim UV, przedstawione na fig. 5, dostarcza przekonującego dowodu na to, że ektodomena (stanowiąca część białka fuzyjnego) wykazuje obecność natywnych oddziaływań trzeciorzędowych przy pH 2,5. Widmo dla kowalencyjnie związanych domen białkowych gp41 i FkpA odpowiada niemal dokładnie obrazowi otrzymanemu dla izolowanej ektodomeny w tych samych warunkach (wyniki nie przedstawione). Stwierdzono występowanie typowej sygnatury gp41: maksimum eliptyczności dla 290 nm, charakterystyczne obniżenie (siodło) dla 285 nm oraz kolejne maksimum dla 260 nm, odpowiadające aktywnemu optycznie mostkowi disiarczkowemu. Należy zaznaczyć, że FkpA nie ma żadnego udziału w sygnale uzyskanym w bliskim UV w badanych warunkach. W rzeczywistości, aromatyczna eliptyczność dla FkpA przy pH 2,5 odpowiada w zasadzie linii podstawowej (wyniki nie przedstawione).
PL 218 245 B1
W zgodności z wynikami uzyskanymi w bliskim UV, wyniki CD w dalekim UV dla konstruktu fuzyjnego przy pH 2,5 wskazują na obecność w zasadzie ustrukturyzowanej cząsteczki gp41. Pojawiają się dwa maksima, dla 220 i 280 nm, które odpowiadają typowej sygnaturze heliakalnej ektodomeny (fig. 6). Ze wskazanych warunków (50 mM fosforan sodu, pH 2,5; 50 mM NaCl), polipeptyd fuzyjny FkpA-gp41 może być łatwo przeniesiony do warunków fizjologicznych poprzez gwałtowne rozcieńczenie. W konkluzji, zarówno widmo CD w bliskim, jak i dalekim UV, wskazują, że możliwe jest, w stosunkowo łatwy sposób, otrzymanie natywnej struktury białka gp41 (stanowiącego część białka fuzyjnego, zawierającego również FkpA). Co ciekawe, stwierdziliśmy, że natywną struktura polipeptydu fuzyjnego typu SlyD(1-165)-gp41 może być uzyskana w jeszcze łatwiejszy sposób poprzez dializę chaotropowego materiału (rozpuszczonego np. w 7,0 M GuHCl) wobec buforu zawierającego 50 mM fosforan sodu (pH 7,4) i 150 mM NaCl w temperaturze pokojowej. Sekwencje nukleotydowe dwóch konstruktów fuzyjnych białka opiekuńczego z gp41, które to konstrukty wykazały się wyjątkowo użyteczne w niniejszym wynalazku, przedstawiono odpowiednio w NR ID SEK: 7 i NR ID SEK: 8.
2.4. Renaturacja przy użyciu chromatografii ekskluzyjnej SEC
Niesfałdowany polipeptyd gp41-FkpA (rozpuszczony w 50 mM fosforanie sodu, pH 7,8; 7,0 M GuHCl) nanoszono na żelową kolumnę filtracyjną (Superdex 200) zrównoważoną odpowiednim buforem (20 mM fosforan sodu, pH 7,4; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). FkpA-gp41 eluuje zasadniczo w trzech frakcjach: jako wysokocząsteczkowy kompleks, jako heksamer oraz jako trymer. Frakcja odpowiadająca trymerom została zatężona i badana pod kątem struktury trzeciorzędowej przy użyciu CD w bliskim UV (fig. 7).
Otrzymany wykres jest w zasadzie sumaryczną krzywą, w której zarówno białko nośnikowe FkpA, jak i białko docelowe gp41, mają równy udział (1:1). Szczęśliwie, białko gp41 wykazuje obecność struktury trzeciorzędowej przy neutralnym pH i jest ewidentnie rozpuszczalne, dzięki towarzystwu kowalencyjnie związanego białka opiekuńczego. Inaczej mówiąc, białko opiekuńcze FkpA wydaje się traktować ektodomenę gp41 o natywnej strukturze jako substrat i rozpuszczać to trudno fałdujące białko przy neutralnym pH. Spełniono w ten sposób istotny warunek produkcji dużych ilości rozpuszczalnego antygenu gp41 dla celów diagnostycznych. Wyniki CD w dalekim UV dla FkpA-gp41 przy pH 7,4 (figura 6) potwierdzają wyniki otrzymane w bliskim UV i wykazują addytywność udziałów FkpA i gp41 w otrzymanym końcowym sygnale. Jak oczekiwano, widmo jest zdominowane przez zdecydowanie helikalną ektodomenę gp41 (maksymalna eliptycznosc dla 220 i 280 nm).
Wyniki uzyskane dla kowalencyjnie związanych domen białkowych gp41/FkpA, rozpuszczonych przy pH 7,4 po zastosowaniu opisanych tu warunków, wskazują, że FkpA oraz gp41 zachowują się w procesie fałdowania jak niezależne jednostki w obrębie konstruktu polipeptydowego.
P r z y k ł a d 3
Wpływ różnych detergentów na rekombinowane białko gp41 i rekombinowany kompleks FkpA-gp41, wykorzystywane jako antygeny w teście immunologicznym
3.1. Kompetycyjny test immunologiczny
Test COBAS CORE HIV Combi (Roche Diagnostics GmbH, Niemcy) jest wygodnym narzędziem do testowania immunoreaktywności rekombinowanego białka gp41. Zasadniczo, test ten służy wykrywaniu przeciwciał przeciwko białku gp41 wirusa HIV i oparty jest na koncepcji podwójnego mostku antygenowego. Antygenem detekcyjnym jest znakowane peroksydazą białko gp41, zawierające jednak materiał (gp41) rozpuszczony przy użyciu SDS.
W testach immunologicznych wykrywających wirusa HIV pożądane jest, aby stosowane odczynniki były łatwo rozpuszczalne i stabilne w buforze inkubacyjnym, zawierającym dość wysokie stężenia detergentu. Takie detergenty, np. Triton X-100® lub Nonidet P-40®, stosowane są w stężeniu od 0,1% do 0,2% w celu rozbicia cząstek wirusowych.
Zarówno białko gp41, rozpuszczone przy użyciu SDS, jak i białko fuzyjne FkpA-gp41, wyprodukowane według opisu z przykładu 1, testowano jako antygeny kompetycyjne w teście COBAS CORE
HIV Combi. W tym celu zastąpiono komercyjny bufor inkubacyjny buforem inkubacyjnym zawierają® cym 0,1% Triton X-100® i wolnym od ludzkiej surowicy. Testowany antygen jest inkubowany z surowicą ludzką, o której wiadomo, że jest reaktywna wobec gp41.
Antygen gp41-FkpA silnie tłumi sygnał w teście kompetycyjnym (w sposób zależny od dawki), podczas gdy białko gp41 rozpuszczone przy użyciu SDS jest w zasadzie niereaktywne (fig. 9). Inhibicję 50% uzyskano przy stężeniu antygenu FkpA-gp41 wynoszącym 0,1 μg/ml, co odpowiada stężeniu molowemu 2,2 nM.
PL 218 245 B1
Godny uwagi jest fakt, że FkpA-gp41 zachowuje swą doskonałą immunoreaktywność po uprzednim potraktowaniu buforem do rozcieńczania, zawierającym 0,1% Triton X-100 jako detergent (detergent pomocniczy) pomagający rozbić nienaruszone błony wirusowe. Stanowi to kontrast wobec samej ektodomeny gp41 (gp41 po rozpuszczeniu przy użyciu SDS), która w obecności detergentu pomocniczego niemal całkowicie traci swą immunoreaktywność (fig. 9).
Główne obawy towarzyszące produkcji kowalencyjnie związanego konstruktu gp41-FkpA dotyczyły tego, że albo białko FkpA mogłoby maskować istotne epitopy wskutek niewystarczającej dynamiki przyłączania, albo też detergent Triton X-100 (stanowiący ważny element testu) zaburzy wynik testu poprzez wywoływanie agregacji antygenu gp41. Doświadczalne wyniki wielu testów kompetycyjnych, przeprowadzonych z wykorzystaniem platformy COBAS CORE, dostarczają przekonującego dowodu na to, że istotne epitopy gp41 są dobrze dostępne w kompleksie obejmującym związane kowalencyjnie domeny białek. Co więcej, immunoreaktywność białka gp41, wchodzącego w skład wewnątrzcząsteczkowego kompleksu białka opiekuńczego z gp41, jest zachowana w obecności detergentów pomocniczych, takich jak Triton X-100.
3.2 Test elektrochemiluminescencyjny
Testy immunologiczne oparte na koncepcji podwójnego mostku antygenowego stanowią ważne narzędzie w diagnostyce serologicznej czynników infekcyjnych. Ponieważ kompleks FkpA-gp41 według niniejszego wynalazku jest rozpuszczalny w buforze o warunkach fizjologicznych, możliwe było zbadanie, czy materiał ten może mieć zastosowanie w teście opartym na podwójnym mostku antygenowym i detekcji elektrochemiluminescencyjnej.
Próby znakowania rutenem białka gp41 rozpuszczanego przy użyciu SDS zakończyły się niepowodzeniem. Natomiast, ponieważ kompleks FkpA-gp41 jest łatwo rozpuszczalny w warunkach fizjologicznych, jego sprzężenie z hydrofobowym znacznikiem rutenowym okazało się stosunkowo prostym zadaniem. Warto zauważyć, że nawet powstały w ten sposób zmodyfikowany kompleks białka opiekuńczego z białkiem docelowym pozostaje rozpuszczalny.
®
W celu wykonania analizy z użyciem systemu testowego Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Niemcy), kompleks FkpA-gp41 poddano odpowiednio biotynylacji i rutenylacji i testowano pod względem immunoreaktywności w teście mostkowym.
Kilka reprezentatywnych surowic przeciwko wirusowi HIV, zawierających głównie przeciwciała z klasy IgG (immunoglobuliny G), dały wynik pozytywny dla kowalencyjnie związanych domen białkowych FkpA-gp41. Stwierdzono również, że sygnał tła jest zbliżony do wewnętrznego tła testu, nawet przy stężeniach antygenu sięgających 500 ng/ml.
Stosunek sygnału do tła okazał się więc być doskonały. Ponadto, nic nie wskazywało na to, że białko nośnikowe, czyli białko opiekuńcze FkpA z E. coli, powoduje nieswoiste wiązanie przeciwciał, zawartych w tych ludzkich surowicach. Jak to omawiano powyżej, wczesne wykrywanie fazy serokonwersji jest kluczowe dla skutecznej diagnozy HIV. Podczas infekcji pierwsze pojawiają się przeciwciała klasy IgM. W celu skutecznego wykrywania bardzo wczesnej fazy infekcji wirusem HIV, konieczne jest zaprojektowanie takiego modułu antygenowego, który posiadałby duże zagęszczenie epitopów rozpoznawanych i wiązanych przez IgM.
Kompleks FkpA-gp41 jest właśnie dobrze rozpoznawany przez typowe surowice typu IgM, skierowane przeciwko wirusowi HIV. Jeszcze istotniejszy jest fakt, że próbki dla których trudno było uzyskać wynik pozytywny, jak np. surowice B i C z paneli serokonwersyjnych 9003 i 4009 (dostarczonych przez NABI, Miami, Floryda, USA), dały wynik pozytywny dla konstruktu fuzyjnego według niniejszego wynalazku. Jest to duże osiągnięcie, gdyż antygeny gp41 (w postaci izolowanych peptydow) nie wykazują żadnej reaktywności w testach z tymi surowicami IgM.
P r z y k ł a d 4
Rozpuszczalne kompleksy białka opiekuńczego z gp41 hamują wnikanie wirusa
Różne białka fuzyjne, obejmujące białko opiekuńcze i gp41, testowano pod względem ich zdolności do hamowania fuzji wirusa HIV-1 z błoną komórkową w warunkach in vitro. W skrócie, reporterową linię komórkową MAGI P4-CCR5, wykazującą ekspresję CD4, CCR5, oraz CXCR4, infekowano szczepem NL4-3 wirusa HIV-1 i testowano pod względem aktywności β-galaktozydazy zależnej od Tat (wg Meister i wsp., Virology (2001) 284(2), 287-296). Stwierdzono znaczną inhibicję infekcji, z wartościami IC50 w zakresie nM. Przykładowo, kompleks SlyD-gp41 hamował bardzo skutecznie proces wnikania wirusa, co odpowiadało IC50 < 70 nM.
Podsumowując, rozpuszczalny wewnątrzkomórkowy kompleks, zawierający odpowiednio białko gp41 wirusa HIV-1 lub białko gp36 wirusa HIV-2 oraz białko opiekuńcze PPI (izomerazę peptydyloproPL 218 245 B1 lilową), posiada znakomite właściwości w odniesieniu do rozpuszczalności i integralności konformacyjnej, co pozwala na zaprojektowanie udoskonalonych testów wykrywających przeciwciała przeciwko HIV oraz innych komercyjnych aplikacji.
P r z y k ł a d 5
Fuzja białka opiekuńczego FkpA z ektodomeną gp36 prowadzi do uzyskania polipeptydu cytozolowego, ulegającego łatwo sfałdowaniu w warunkach in vitro
W celu otrzymania białka gp36 (będącego homologiem białka gp41, występującym w wirusie HIV-2) w rozpuszczalnej i aktywnej immunologicznie postaci, sklonowaliśmy konstrukt nazwany FF36. Ten fuzyjny polipeptyd zawiera dwie jednostki FkpA oraz jednostkę gp36, połączone ze sobą elastycznymi odcinkami bogatymi w glicynę. W celu ułatwienia oczyszczania, konstrukt fuzyjny oznakowano epitopem His6 na jego C-końcu.
Białko oczyszczano wg protokołu zasadniczo zgodnego z wcześniej przedstawionym opisem: Po lizie chaotropowej białko wiązano na kolumnie Ni-NTA, a po intensywnym płukaniu przy użyciu odpowiedniego buforu (50 mM fosforan sodu pH 7,8; 7,0 M GuHCl) eluowano je obniżając pH. Eluowane białko następnie poddano indukcji procesu fałdowania poprzez przepuszczanie przez żelową kolumnę filtracyjną, równoważoną buforem zawierającym 50 mM fosforan sodu pH 7,8, 100 mM chlorek sodu oraz 1 mM EDTA.
Natywne białko, otrzymane tym sposobem renaturującej filtracji żelowej, wykazywało zadawalające właściwości immunologiczne i spektroskopowe (patrz fig. 10), porównywalne z właściwościami konstruktów F41 i FF41, odpowiadających białku gp41. Opisany tu protokół oczyszczania i fałdowania przeprowadzano wobec FF36 zawierającego trzy mutacje punktowe w N-końcowym regionie powtórzeń heptadowych białka gp36 (patrz sekwencja w NR ID SEK: 9). Ten sam protokół stosowano też z sukcesem wobec konstruktu fuzyjnego zawierającego ektodomenę gp36, uzyskując jednak niższą wydajność otrzymywania rozpuszczalnego białka.
P r z y k ł a d 6
Rozpuszczalne, immunoreaktywne białko FkpA-gp21 można otrzymać przy użyciu wygodnego i powtarzalnego sposobu.
Komórki bakterii E. coli, wykazujące nadekspresję FkpA-gp21, hodowano, indukowano i zbierano według wcześniejszego opisu. W celu osiągnięcia całkowitej lizy, osad bakteryjny zawieszano w 59 mM fosforanie sodu (pH 7,8), 7,0 M GuHCl i mieszano w temperaturze pokojowej przez godzinę. Chaotropowy lizat komórkowy nanoszono następnie na kolumnę Ni-NTA, równoważoną uprzednio buforem do lizy. Po etapie płukania, eluowano białko docelowe (zawierające C-końcowy znacznik sześciohistydynowy) poprzez obniżenie pH. W celu zainicjowania procesu fałdowania przepuszczano białko FkpA-gp21 (przechowywane w 50 mM fosforanie sodu (pH 6,0), 7,0 M GuHCl w temperaturze 4°C) przez żelową kolumnę filtracyjną (Superdex 200), równoważoną buforem zawierającym 50 mM fosforan sodu (pH 7,8) i 100 mM chlorek sodu. Analiza widma UV wykazała, że otrzymane w ten sposób białko FkpA-gp21 jest białkiem rozpuszczalnym, które, w przeciwieństwie do gp21 bez białka opiekuńczego, nie wykazuje już skłonności do agregacji (fig. 11/1). Ponadto, otrzymane białko FkpA-gp21 wykazuje znakomitą aktywność immunologiczną w teście kompetycyjnym COBAS COBE (fig. 11/2).
P r z y k ł a d 7
Fuzja dodatkowej podjednostki FkpA z białkiem FkpA-gp41 polepsza właściwości immunologiczne ektodomeny gp41.
Próbowaliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy dodatkowa podjednostka PPI dodana do polipeptydu fuzyjnego może jeszcze poprawić właściwości kompleksu ektodomeny gp41 z białkiem opiekuńczym. W tym celu wyprodukowaliśmy zarówno konstrukt F41 (jedna domena FkpA z dołączonym C-końcowo białkiem gp41), jak i konstrukt FF41 (dwie domeny FkpA z białkiem gp41 dołączonym do
C-końca jednej z nich), stosując opisany powyżej protokół. Biotynylowane i rutenylowane białka fuzyj® ne były następnie analizowane przy użyciu systemu Elecsys® E2010. Wyniki zdecydowanie wskazywały na polepszone właściwości konstruktu FF41, zawierającego dodatkową domenę białka opiekuńczego.
Sygnał tła uzyskiwany dla negatywnej surowicy, który to sygnał decyduje o wartości otrzymywanego stosunku sygnału do tła i możliwości dokonywania miarodajnych pomiarów przy niskim mianie surowic, okazał się być niższy o ponad 50% w przypadku FF41 (około 1600 zliczeń), w porównaniu do F41 (około 3800 zliczeń).
PL 218 245 B1
T a b e l a 1 Porównanie F41 i FF41
F41 FF41
R1: EMHR220 EMHR221
ESS w R1 F-41-Bi (UE) 25 FF-41-Bi-UEEK
β (AL) 500 ng/ml 750 ng/ml
R2 EMHR221 EMHR222
ESS W R2 F-41-Ru (UE) 25 FF41-2Ru-SK (4)
β (AL) 500 ng/ml 750 ng/ml
Średnia liczba zliczeń dla 7 negatywnych surowic 3768 1589
Podobne, pozytywne wyniki otrzymano dla białka fuzyjnego SS41, tj. białka fuzyjnego zawierającego dwie domeny SlyD i jedną domenę gp41, przyłączoną na C-końcu białka fuzyjnego.
PL 218 245 B1
Lista sekwencji <I10> Roche Diagnostics GmbH 7. Hoffmann-La Rochs AG <120> Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowinisowąglikoproteiną powierzchniową <130> 19290WO-W <140>
<141>
<150> EP0111S225.3 <151> 2001-06-22 <150> EP01120S39.2 <151> 2001-08-31 <1SO> 10 <170> Patent w wersji 2,1 <210> 1 <211> 147 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<22 3> Opis sztucznej sekwencji odpowiada pozycjom535-681 białka otoczki wirusa HIV-1
<40' 0> 1
Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser C-ly Ile Val Gin
1 5 10 15
Gir. Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile GlU Ala C-In Gin His Leu Leu
20 25 30
Gin Leu Thr val Trp Gly Ile Lys Gin Leu Gin Ala Arg Ile Leu Ala
35 40 45
Val Glu Arę Ty 3? Lsu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
50 55 60
Ser Gly Lys Leu Ile Cvs Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ser Asn Lvs Ser Leu Glu Gir. Ile Trp Asn Asn Met Thr Tro Met Glu
35 90 95
Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile
100 105 110
Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu
115 120 125
PL 218 245 B1
Leu Asp Lys Tro Ala Ser Leu Trp Asn Tro Phe Asn Ile Thr Asn Tro 130 135 140
Leu Tro Tyr
145 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji odpowiada pozycjom 534-676 białka otoczki wirusa HIV-1
<40 0> 2
Leu Thr Val Ser Ala Gin Ser Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ti s Val Gin
1 5 10 15
Gin Gin Gin Gin Leu Leu Asp Val Val Lys Arg GLn Gin Glu Leu Leu
20 25 30
Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys Asn Leu Gin Ala Arg Val Thr Ala
35 40 45
Ile Glu Lys Τντ Leu Gin Asp Gin Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys
50 55 50
Ala Phe Arg Gin Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp Tal Asn Asp Ser
55 70 75 80
Leu Ala Pra Asp Tro Asp Asn Met Thr Trp Gin Glu Trp Glu Lys Gin
85 90 95
Val Arg Tyr Leu C-lu Ala Asn Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gin Ala Gin
100 105 110
Ile Gin Gin Glu Lys Asn Met Tyr GlU Leu Gin Lys Leu Asn Ser Trp
115 120 125
Asp Ile Phe Gly Asn Trp Phe Asp Leu Thr Ser Trp Val Lys Tyr
130 135 140
<210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22C>
<22 3> Opis sztucznej sekwencji: primer 1 <4O0> 3 gcgggtgttc cgggtatccc accgaattc
PL 218 245 B1 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: primer 2 <400> 4 gaattcggtg ggatacccgg aacacccgc 29 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <2 ± J > s2tuczna sekwencja <220>
<2 23> Opis sztucznej sekwencji: primer 3 <400> 5 cgggatccgg tggcggttca ggcggtgact ctggtggcgg tacgczgacg gtacaggcca 60 σ 61 <210> 6 <211> 30 <212> DOS, <213> Sztuczna sekwencja <22Q>
<223> Opis sztucznej sekwencji: primer 4 <400> 6 ccactcgagg taccacagcc aatttgfctat 30 <210> 7 <211> 1269 <212> DNA <zl3> sztuczna sekwencja <220>
<223> Qp>s sztuczn£j sekwencji: sekwencja kodująca dla białka fuzyjnego FkpA-gp41 <400> 7 atggctgaag ctgcaaaacc tgctacaact gctgacagca aagcagcgtt caaaaatgac 60 gafccagaaat cagcttatgc actgggtgct tcgctgggtc gttacatgga aaactctctt 120 aaagaacaag aaaaactggg catcaaactg gataaagatc agctgatcgc tggtgttcag 130 gatgcafcttg ctgataagag caaactctcc gaccaagaga tcgaacagac tctgcaagca 240 ttcgaagctc gcgtgaagtc ttctgctcag gcgaagatgg aaaaagacgc ggctgataac 300 gaagcaaaag gtaaagagca ccgcgagaaa tttgccaaag agaaaggtgt gaaaacctct 360 tcaactggtc tggtttatca ggtagtagaa gccggtaaag gcgaagcacc gaaagacagc 420 gatactgtfcg fcagtgaacta caaaggtacg ctgatcgacg gtaaagagtt cgacaactct 430
PL 218 245 B1 tacacccęta gtgaaccgct ctctttccgt ctggacggtg ttatcccggg ctggacagaa 540 ggtctgaaga acatcaagaa aggcggtaag atcaaactgg ttattccacc agaactggct 600 tacggcaaaę cgggtgttcc gggtatccca ccgaattcta ccctggtgtt tgacgtagag 660 ctgctggatg tgaaaccagc gccgaaggct gatgcaaagc cggaagctga tgcgaaagcc 720 gcagattctg ctaaaaaagg tggcggttcc ggcggtggct ctggtggcgg atccggtggc 780 ggttccggcg gtggctctgg tggcggtacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct S40 ggtatagtgc agcagcagaa caatgagctg agggcfcattg aggcgcaaca gcatctggag 900 caactcacag tctggggcac caagcagctc caggcaagag aactggctgt ggaaagatac 360 ctaaaggatc sacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 1020 “ gctgtgcctt ggaatgcfcag ttcgagtaat aaatctctgg aacagatttg gaataacatg 1080 ’ acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca tfcccttaafct 1140 gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 1200 gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtacctcga gcaccaccac 1250 caccaccac
1269 <210> 8 <211> 1026 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Qpjs sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca dla białka fiizyjnego SlyD-gp4.1 <40Q> 3 atgaaagtag caaaagacct ggtggtcagc gtgttggttg atgagtctcc ggtgagtgcg ctgatctctg gcctggaaac ggcgctggaa gctgttggcg cgaacgacgc ttacggtcag aaagacgtat ttatgggcgt tgatgaactg gsccagggtc cggtaccggt tgaaatcact ggtaaccaca tgctggccgg tcagaacctg gaagcgactg aagaagaact ggctcatggt gatcacgs.cc acgacggtgg cggttccggc tccggcggtg gctctggtgg cggtacgctg atagtgcagc agcagaacaa tgagctgagg ctcacagtct ggggcaccaa gcagctccsg aaggatcaac agctcctggg gatttggggt gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tggatggagt gggacagaga aattaacaat caatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa agtttgtgga attggtttaa cataacaaat 1020 caccac
1026 ctcgcctatc aggtacgtac agaagacggt 60 ccgctggact acctgcatgg tcacggttcc 120 ggtcatgaag ttggcgacaa atttgatgtc 180 tacgacgaaa acctggtgca acgtgctcct 240 caggtaggta tgcgtttcct ggctgaaacc 300 gcggttgaag acgatcacgt cgtggttgat 360 aaattcaacg ttgasgttgt ggcgattcgc 420 cacgttcacg gcgcgcacga tcaccaccac 480 ggtggctctg gtggcggatc cggtggcggt 540 acggtacagg ccagacaatt attgtctggt 600 gctattgagg cgcaacagca tctggagcaa 6S0 gcaagagaac tggctgtgga aagataccta 720 tgctctggaa aactcatttg caccactgct 780 tctctggaac agatttggaa taacatgacc 840 tacacaagct taatacatcc cttaattgaa 900 caagaattat tggaattaga taaatgggca 960 tggctgtggt acctcgagca ccaccaccac <21C> 9
PL 218 245 B1 <211> 588 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Op:s sztucznej sekwencji: biaiko fozyjne FkpAFkpAgp3ó (3 mut) <400;- 9
Het Ala C-lu Ala Ala Lys Pro Ala Thr Tnr Ala Asp Ser Lys Ala Ala
1 5 10 15
?he Lys Asn Asp Asp Gin Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu
20 25 30
Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu Lys Glu Glu Glu Lys Leu Gly Ile
35 40 45
Lys L-eu Asp Lys Asp Gin Leu Ile Ala Gly Val Gin Ast Ala Fhe Ala
50 55 60
Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gin Glu He Glu Gin Thr Leu Gin Ala
65 70 75 80
Ehe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gin Ala Lys Met Glu Lys Asp
85 90 35
Al a Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly Lys Glu iyr Arg Glu Lys Phe Ala
100 105 110
Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gin 7al
115 120 125
Val Glu Ala C-ly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val
130 13 5 140
Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu He Aso Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser
145 150 155 160
Tyr Thr Arg Gly C-lu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro
165 170 175
Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys C-ly Gly Lys Ile Lys
ISO 135 190
Leu Val Ile Pro Fro Glu Leu AL a Tyr Gly Lys Ala Gly Val Ero Gly 135 200 ' 205
Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Ehe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val 210 215 220
Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Pra Glu Ala Asp Ala Lys Ala
225 230 235 240
Ala Asp Ser Ala Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255 “
PL 218 245 B1
Gly Ser Gly C-ly Gly Ser C-ly Gly Gly Ser C-ly Gly Gly Ala Glu Ala
260 265 270
Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe jjyg Isn Asp
275 280 235
Asp Gin Lys Ser Ala Tyr Ala Leu C-ly Ala Ser Leu Gly Arg Tyr Met
290 295 3 00
Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gin Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Aso Lys
305 310 315 320
Asp C-ln Leu Ile Ala Gly Val Gin Asp Ala Phe Ala Asn Lys Ser Lys
325 330 335
Leu Ser Asp Gin Glu Ile Glu Gin Thr Leu Gin Ala Phe Glu Ala Arg
340 345 350
Val Lys Ser Ser Ala Gin Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn
355 360 365
Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ale Lys Glu Lys Gly
373 375 380
Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Tal Tyr Gin. Val Val Glu Ala Gly
385 390 395 400
Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val Asn Tyr Lys
405 410 415 '
Gly Thr Leu Tle Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn. Ser Tyr Thr Arg Gly 420 425 430
Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro Gly Trp Thr Glu 435 440 445
Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys Leu Val Ile Pro
450 455 460
Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly Ile Pro Pro Asn
465 470 475 490
Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Tal Lys Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala ASP Ser Ala
500 505 510
Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser C-ly Gly Gly Ser Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Gly Gly Gly Ser C-ly Gly Gly Leu Thr Val Ser Ala C-ln Ser
530 535 540
Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile Val Gin C-ln Gin Gin Gin C-lu Leu Asp
PL 218 245 B1
545 550 555 560
Val Val Lys Arg Gin Gin Glu Leu Glu Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr
565 570 575
Lys Asn Leu Gin Ala Arg Glu Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gin Asp
530 585 590
Gin Ale Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg C-ln Val Cys His
595 600 605
Thr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn
610 615 620
Met Thr Trp Gin Glu Trp Glu Lys Gin Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn
625 630 635 640
Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gin Ala Gin Ile Glu Gin Glu Lys Asn Met
645 650 655
Tyr Glu Leu Gin Lys Leu Asn Ser Trp Asp Ile Piie Gly Asn Trp Phe
660 665 670
Asp Len Thr Ser Trp Val Lys Tyr Leu Glu His Eis His His His His
675 680 685 <210> 10 <211> 335 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 35 <220>
<223> Qpjs sztuczile,j sekwencji: białko fuzyjne FkpA-gp21
40 <40i 0> 1! 3
Met Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala
1 5 10 15
Lys Asn .Asn Asp Gin Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu
45 2 Ó 25 30
Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gin GlU Lys Leu Gly Ile
35 40 45
50 Lys Leu Asp Lys Asp Gin Leu Ile Ala Gly val Gin Asp Ala Phe Ala
50 55 60
Aso Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gin Glu Ile Glu Gin Thr Leu Gin Ala
65 70 75 30
55
Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gin Ala Lys Met Glu Lys Asp
PL 218 245 B1
90 35
s Ala Ala Asp Asn 100 b-U Ala Lys Gly Lys 105 Glu Tyr Arę Glu lys 110 PLs Ala
Lys Glu Lys i 15 C-ly Val Lys Thr Ser 120 Ser Thr C-ly Leu Val 125 Tyr Gin Val
10 Val Glu 130 Ais Gly Lys Gly Glu 135 Ais Pro Lys Asp Sar 140 Asp Thr Val Val
Zal Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Tle Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asu Sar
145 150 155 ISO
Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser ?he Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro 155 170 ' ’ 175
Gly ir© Thr Glu Gly 180 Leu. Lys Asn Ile Lys 135 Lys Gly Gly Lys Ile 190 Lys
Leu Val Ile Pro Pro 195 Glu Leu Ala 200 Tyr Gly Lvs Ala Gly ~ 205 Val Pro Gly
Ile Pro 210 Pro Asn Ser Thr Leu Val 215 Piie Asp Val C-lu Leu 22C Leu Asp Val
Lys 225 Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala 230 ' Lys Pro Glu Ale Asp 235 Ala Lys Ala 240
Ala Asp Ser Ala Lys 245 Lys Gly Gly Gly Ser 250 Gly Gly Gly Ser Gly 255 Gly
Gly Ser Gly Glv Gly ~ 260 Ser Gly Gly Gly Ser 2S5 Gly Gly Gly Ser Leu 270 Ala
Ssr Gly Lys Ser Leu 275 Leu His Glu 280 Val Asp Lys Asp Ile 285 Ser Gin Leu
Thr C-ln 290 Ala Ile Val Lys Asn His 295 Lys Asn Len Leu Lys 300 ’ Ile Ala Glu
Tyr 305 Ala Ala Gin Asn Arg Arg Gly 310 Leu Asp Leu Leu Phe 315 Tr© Glu Gin 320
Gly Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gin. Glu Gin Cys Cys ?he Leu Asn ile 325 330 325
Thr Asn Ser His Vai Ser Ile Leu Gin Glu Arg Pro Pro Leu C-lu Asn 340 345 350
Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu Asn Tra As© Leu Gly Leu Ser Gin
355 * 360 ‘ 365
Tr© Ala Arg Glu Ala Leu Gin Thr Gly Leu Glu His His His His His
370 375 330
His
3S5
PL 218 245 B1

Claims (7)

1. Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową wybraną spośród HIV-1gp41, HIV-2gp36 i HTLVgp21 i izomerazę peptydyloprolilową wybraną z grupy składającej się z FkpA i SlyD, w którym retrowirusowa glikoproteina powierzchniowa i izomeraza peptydyloprolilowa są ze sobą połączone rekombinacyjnie.
2. Kompleks rozpuszczalny według zastrz. 1, znamienny tym, że wiązanie wytworzone rekombinacyjnie obejmuje łącznik peptydowy.
3. Kompleks według zastrz. 2, znamienny tym, że łącznik peptydowy obejmuje przynajmniej 10 aminokwasów.
4. Kompleks według zastrz. 3, znamienny tym, że łącznik peptydowy obejmuje przynajmniej 15 aminokwasów.
5. Kompleks według zastrz. 3, znamienny tym, że łącznik peptydowy obejmuje najwyżej 50 aminokwasów.
6. Kompleks według zastrz. 3, znamienny tym, że łącznik peptydowy obejmuje najwyżej 40 aminokwasów.
7. Kompozycja reagentów, znamienna tym, że obejmuje rozpuszczalny kompleks określony w którymkolwiek z zastrz. 1-6.
PL397776A 2001-06-22 2002-06-24 Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks PL218245B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01115225 2001-06-22
EP01120939 2001-08-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL397776A1 PL397776A1 (pl) 2012-07-16
PL218245B1 true PL218245B1 (pl) 2014-10-31

Family

ID=26076626

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL367679A PL215170B1 (pl) 2001-06-22 2002-06-24 Sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu zawierajacego amyloidogenne bialko docelowe oraz bialko opiekuncze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych
PL397776A PL218245B1 (pl) 2001-06-22 2002-06-24 Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL367679A PL215170B1 (pl) 2001-06-22 2002-06-24 Sposób wytwarzania rozpuszczalnego kompleksu zawierajacego amyloidogenne bialko docelowe oraz bialko opiekuncze z klasy izomeraz peptydyloprolilowych

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7244819B2 (pl)
EP (3) EP1402015B1 (pl)
JP (6) JP4174422B2 (pl)
KR (2) KR100702373B1 (pl)
CN (1) CN100510068C (pl)
AT (2) ATE522603T1 (pl)
AU (2) AU2002317841A1 (pl)
BR (1) BRPI0210598B8 (pl)
CA (3) CA2770453C (pl)
DE (1) DE60233942D1 (pl)
DK (2) DK2267452T3 (pl)
ES (3) ES2372031T3 (pl)
HK (1) HK1068918A1 (pl)
MX (1) MXPA03011455A (pl)
PL (2) PL215170B1 (pl)
WO (2) WO2003000877A2 (pl)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE522603T1 (de) * 2001-06-22 2011-09-15 Hoffmann La Roche Löslicher komplex, der retrovirale oberflächen- glykoproteine und fkpa oder slyd enthält
US20050130259A1 (en) * 2002-06-25 2005-06-16 Akira Ideno Expression vector, host, fused protein, process for producing fused protein and process for producing protein
WO2004047869A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Danmarks Fødevareforskning Dendrimer conjugates for selective of protein aggregates
US20070026501A1 (en) * 2003-04-18 2007-02-01 Joe Chiba Immunogen, composition for immulogical use and process for producing antibody using the same
JP5631533B2 (ja) * 2004-12-23 2014-11-26 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ 遺伝子発現技術
CA2562738C (en) 2005-10-26 2011-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Soluble rubella e1 envelope antigens
CN101351550B (zh) * 2006-01-03 2012-10-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有卓越的伴侣和折叠活性的嵌合融合蛋白
WO2007141650A2 (en) * 2006-01-17 2007-12-13 Instituto De Medicina Molecular Compositions and methods for diagnosing hiv-2 infection
EP2024520B1 (en) 2006-05-11 2014-03-05 Becton, Dickinson and Company Method of protein extraction from cells
GB0611405D0 (en) * 2006-06-09 2006-07-19 Univ Belfast FKBP-L: A novel inhibitor of angiogenesis
ES2372359T3 (es) 2007-04-20 2012-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección de infecciones primarias por patógenos.
WO2009031852A2 (en) * 2007-09-06 2009-03-12 Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation Preparation method of recombinant protein by use of a fusion expression partner
US9207240B2 (en) 2007-11-14 2015-12-08 Arbor Vita Corporation Method of efficient extraction of protein from cells
JP5461423B2 (ja) 2007-12-13 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新規風疹ｅ１エンベロープタンパク質変異体および抗風疹抗体の検出におけるその使用
EP2127678A1 (en) * 2008-05-26 2009-12-02 Roche Diagnostics GmbH SlpA as a tool for recombinant protein and enzyme technology
ES2625406T3 (es) 2010-03-25 2017-07-19 Oregon Health & Science University Glicoproteínas de CMV y vectores recombinantes
DK2670847T3 (en) 2011-02-03 2017-01-16 Xoma Technology Ltd Methods and Materials for Improving Functional Protein Expression in Bacteria
AR086250A1 (es) 2011-05-05 2013-11-27 Hoffmann La Roche Polipeptido de fusion presentador de una secuencia de aminoacidos y utilizacion del mismo
ES2667425T3 (es) 2011-06-10 2018-05-10 Oregon Health & Science University Glucoproteínas y vectores recombinantes de CMV
EP2568289A3 (en) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
EP2617731A1 (en) 2012-01-19 2013-07-24 Roche Diagnostics GmbH Soluble immunoreactive Treponema pallidum TpN47 antigens
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2706115A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-12 Roche Diagnostics GmbH Chaperone-chaperone fusion polypeptides for reduction of interference and stabilization of immunoassays
WO2014072305A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-her3/her4 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3 and the beta-hairpin of her4
EP2917388B1 (en) 2012-11-08 2016-10-05 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acids encoding chimeric polypeptides for library screening
AR093378A1 (es) 2012-11-08 2015-06-03 Hoffmann La Roche PROTEINAS LIGANTES DE ANTIGENO HER3 DE UNION A LA HORQUILLA b DE HER3
EP2827146A1 (en) 2013-07-18 2015-01-21 Roche Diagnostics GmbH Vibrio cholerae lipoprotein 15 (Lp15) variants as anti-interference additive in TpN17-based immunoassays for detection of anti-Treponema antibodies
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
WO2015044083A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Thermus thermophilus slyd fkbp domain specific antibodies
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP2913338A1 (en) 2014-02-28 2015-09-02 Roche Diagniostics GmbH Soluable and immunoreactive variants of HTLV capsid antigen p24
JP2015215244A (ja) * 2014-05-12 2015-12-03 富士レビオ株式会社 免疫測定における抗ｈｔｌｖ抗体の検出感度を向上させる方法
CN106459207B (zh) 2014-05-14 2020-07-10 豪夫迈·罗氏有限公司 结合HER3β-发夹的抗HER3抗体
MX2016014862A (es) 2014-05-14 2017-02-27 Hoffmann La Roche Her3 / her2 anticuerpos biespecificos que se unen a la horquilla beta de her3 y al dominio ii de her2.
WO2016089782A1 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 Pfenex Inc. Fusion partners for peptide production
EP3257941A4 (en) * 2015-02-13 2018-07-04 Sekisui Chemical Co., Ltd. Nucleic acid, fusion protein, recombined cell, and isoprene or cyclic terpene production method
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3390424B1 (en) * 2015-12-15 2021-09-01 Roche Diagnostics GmbH Fkbp domain with transglutaminase recognition site
EP3465217A1 (en) 2016-05-31 2019-04-10 Roche Diagnostics GmbH Method for serological detection of viral antigens
ES2796479T3 (es) 2016-05-31 2020-11-27 Hoffmann La Roche Procedimiento de pretratamiento para la detección rápida del antígeno central del VHC
US10815472B2 (en) 2016-06-20 2020-10-27 Metgen Oy Method for obtaining active insoluble xylose isomerase
ES2865511T3 (es) 2017-02-02 2021-10-15 Hoffmann La Roche Inmunoanálisis que usa al menos dos agentes de unión específica a analito pegilado
JP2020517647A (ja) 2017-04-26 2020-06-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 可溶性および免疫反応性のジカウイルスｎｓ１ポリペプチド
EP3658171B1 (en) 2017-07-27 2023-08-30 Roche Diagnostics GmbH Multi-epitope fusion protein of an hcv antigen and uses thereof
CN110066343B (zh) * 2019-05-23 2021-04-09 北京新创生物工程有限公司 一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用
EP4139684A1 (en) 2020-04-23 2023-03-01 F. Hoffmann-La Roche AG Corona nucleocapsid antigen for use in antibody-immunoassays
EP4380955A1 (en) 2021-08-06 2024-06-12 Roche Diagnostics GmbH Chimeric igg-fc-binding ligand polypeptide and uses thereof for igg affinity purification
WO2023213758A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Hiv gp41 variants for immunodiagnostic assays

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2095818B (en) 1981-03-27 1985-10-02 Exxon Research Engineering Co Staged adsorption/resorption heat pump
US4735896A (en) 1986-03-04 1988-04-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptide and process of using same for the detection and diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions
US4879212A (en) 1986-04-02 1989-11-07 United Biomedical Inc. Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
DE3705686C2 (de) 1987-02-23 1995-11-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern
NZ224663A (en) 1987-05-28 1990-11-27 Amrad Corp Ltd Fusion proteins containing glutathione-s-transferase and expression of foreign polypeptides using glutathione-s-transferase encoding vectors
SE8704185L (sv) 1987-10-28 1989-04-29 Ferring Ab Nya peptider, artificiella antigener och immunoanalystestsatser
CA2003383A1 (en) * 1988-11-23 1990-05-23 Sushil G. Devare Synthetic dna derived recombinant hiv antigens
DE69223250T3 (de) 1991-06-14 2008-02-28 Idexx Laboratories, Inc. Detektion des immunschwäche-virus aus felis
WO1993013200A1 (en) * 1991-12-20 1993-07-08 Novo Nordisk A/S A process for the preparation of lipase
CA2133826A1 (en) 1992-04-09 1993-10-28 James L. Gallarda Assay for detection of hiv antigen and hiv antibody
WO1993025533A1 (en) 1992-06-05 1993-12-23 Abbott Laboratories Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents
DK0663010T3 (da) 1992-10-02 2000-11-13 Res Corp Technologies Inc Fremgangsmåde til forøgelse af sekretion af overudtrykte proteiner
US5459051A (en) 1993-03-26 1995-10-17 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
EP0785992A4 (en) 1994-10-25 1999-12-22 Univ Leland Stanford Junior TRANSFORMATION OF THE STATE OF CELLS PRODUCED BY GENETIC ENGINEERING
KR19990022651A (ko) 1995-06-07 1999-03-25 데이비드 엘. 버스테인 생물학적 사건에 대한 라파마이신 기재 조절방법
JP2000501171A (ja) 1995-09-15 2000-02-02 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 融合タンパク質を用いるハイスループットアッセイ
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
GB9614114D0 (en) 1996-07-05 1996-09-04 Amcor Packaging Uk Ltd New packages
EP0928336A1 (en) 1996-09-26 1999-07-14 Medical Research Council Chaperone fragments
US6225082B1 (en) 1997-05-09 2001-05-01 Research Corporation Technologies, Inc. Myelin basic protein MRNA transport and translation enhancer sequences
US5989868A (en) * 1997-09-12 1999-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli
CA2318402A1 (en) 1998-01-15 1999-07-22 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Regulation of biological events using multimeric chimeric proteins
DE19913117A1 (de) * 1998-05-06 1999-11-11 Roche Diagnostics Gmbh Entstörung durch Rheumafaktoren
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
ATE348177T1 (de) * 1998-10-02 2007-01-15 Vadeco Biotech Gmbh & Co Kg Methode zur herstellung von (poly)peptiden unter verwendung von verkürzten varianten von sv40 'large' t antigen mit einem intakten n terminus
JP2002529081A (ja) 1998-11-06 2002-09-10 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 生物学的事象のｆｋ５０６に基づく調節
AU3305100A (en) 1999-03-17 2000-10-04 Medical Research Council Method for refolding molecules of polypeptides containing ig domains
CA2372199A1 (en) 1999-05-14 2000-11-23 Medical Research Council Oligomeric chaperone proteins
GB9913437D0 (en) 1999-06-09 1999-08-11 Medical Res Council Fusion proteins
EP1077263A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
EP1267919A2 (en) 2000-03-17 2003-01-02 Panacos Pharmaceuticals, Inc. A method for generating immunogens that elicit neutralizing antibodies against fusion-active regions of hiv envelope proteins
JP2002262883A (ja) * 2001-03-13 2002-09-17 Sekisui Chem Co Ltd モノクローナル抗体の製造方法
ATE522603T1 (de) * 2001-06-22 2011-09-15 Hoffmann La Roche Löslicher komplex, der retrovirale oberflächen- glykoproteine und fkpa oder slyd enthält

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060027871A (ko) 2006-03-28
KR100702373B1 (ko) 2007-04-02
JP4309910B2 (ja) 2009-08-05
BRPI0210598B1 (pt) 2018-11-13
US8426167B2 (en) 2013-04-23
EP2267452A1 (en) 2010-12-29
MXPA03011455A (es) 2004-04-05
DK1402015T3 (da) 2011-12-05
JP4262594B2 (ja) 2009-05-13
ES2333108T3 (es) 2010-02-17
JP2007322436A (ja) 2007-12-13
PL215170B1 (pl) 2013-10-31
JP2009102320A (ja) 2009-05-14
AU2002317841A1 (en) 2003-01-08
ES2372031T3 (es) 2012-01-13
CN100510068C (zh) 2009-07-08
JP2007125026A (ja) 2007-05-24
US7244819B2 (en) 2007-07-17
BRPI0210598B8 (pt) 2021-05-25
AU2002325265B2 (en) 2006-10-19
JP2009100770A (ja) 2009-05-14
CA2770453A1 (en) 2003-01-03
CA2449747C (en) 2010-04-13
US20090028893A1 (en) 2009-01-29
EP2267452B8 (en) 2012-11-14
WO2003000877A3 (en) 2003-10-30
DE60233942D1 (de) 2009-11-19
WO2003000878A3 (en) 2003-10-09
JP4320351B2 (ja) 2009-08-26
US20030096352A1 (en) 2003-05-22
KR20040010774A (ko) 2004-01-31
CN1524123A (zh) 2004-08-25
EP1402041B1 (en) 2009-10-07
JP2004534831A (ja) 2004-11-18
ATE445016T1 (de) 2009-10-15
JP4523660B2 (ja) 2010-08-11
EP2267452B1 (en) 2012-07-25
BR0210598A (pt) 2004-07-20
EP1402015B1 (en) 2011-08-31
ATE522603T1 (de) 2011-09-15
HK1068918A1 (en) 2005-05-06
JP2004535195A (ja) 2004-11-25
CA2450476C (en) 2012-05-15
KR100611545B1 (ko) 2006-08-10
DK2267452T3 (da) 2012-10-29
WO2003000878A2 (en) 2003-01-03
EP1402041A2 (en) 2004-03-31
ES2391623T3 (es) 2012-11-28
EP1402015A2 (en) 2004-03-31
CA2770453C (en) 2014-12-09
CA2449747A1 (en) 2003-01-03
CA2450476A1 (en) 2003-01-03
PL367679A1 (pl) 2005-03-07
PL397776A1 (pl) 2012-07-16
WO2003000877A2 (en) 2003-01-03
JP4174422B2 (ja) 2008-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL218245B1 (pl) Kompleks rozpuszczalny obejmujący retrowirusową glikoproteinę powierzchniową i izomerazę peptydyloprolilową oraz kompozycja reagentów obejmująca ten kompleks
US7244575B2 (en) Soluble complex comprising a retroviral surface glycoprotein
AU2002325265A1 (en) A soluble complex comprising a retroviral surface glycoprotein
Joyce et al. Enhancement of α-helicity in the HIV-1 inhibitory peptide DP178 leads to an increased affinity for human monoclonal antibody 2F5 but does not elicit neutralizing responses in vitro: implications for vaccine design
JP5069558B2 (ja) ＨＩＶｇｐ４１融合中間物質の安定したペプチド模倣薬
JP5255998B2 (ja) Ｈｉｖに対する抗体の検出および識別に有用な抗原構築物
US11567079B2 (en) Soluble and immunoreactive variants of HTLV capsid antigen P24
JP2005139204A (ja) Ｈｉｖウイルスに対して免疫反応性である抗体の検出用の合成抗原
AU2007200052B9 (en) A soluble complex comprising a retroviral surface glycoprotein
US6149910A (en) Peptides for the detection of HIV-1 group O
CA2676762C (en) Peptides for the detection of hiv-1 group o
JP2015028479A (ja) 抗トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）抗体の検出のためのＴｐＮ１７に基づくイムノアッセイにおける、抗干渉添加剤としてのコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）リポタンパク質１５（Ｌｐ１５）変異体