JP2015028479A - 抗トレポネーマ属(Treponema)抗体の検出のためのTpN17に基づくイムノアッセイにおける、抗干渉添加剤としてのコレラ菌(Vibriocholerae)リポタンパク質15(Lp15)変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】単離試料において、梅毒トレポネーマのTpN17抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌リポタンパク質15(VcLp15)のペプチド配列またはその部分配列を、干渉を減少させるため、すなわち偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法に関する。さらに、VcLp15ペプチド配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチド、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての該融合ポリペプチドの使用、ならびにTpN17抗原および前記VcLp15−シャペロン融合ポリペプチドを含む単離試料において梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための試薬キットに関する。
【選択図】なし
Description
a)体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し
b)VcLP15ペプチドおよび場合によってシャペロンを含む融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
c)前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し;そして
d)前記免疫反応産物のいずれかの存在および/または濃度を検出する
工程を含む、前記方法にも関する。
表2〜5は、梅毒イムノアッセイにおけるコレラ菌Lp15の抗干渉活性に対する、実施例5にしたがって行う実験の結果を示す。
表4は、オリゴマーVcLp15(シャペロンとしてのSkpと融合)を干渉減少のために添加する、トレポネーマ属特異的抗原としてのオリゴマーTpN17に関する結果を示す。
梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のためのイムノアッセイは、本発明者らによって立証可能であるように、偽陽性結果を示す傾向がある。特に、トレポネーマ属抗原TpN17を用いる場合、偽陽性シグナルの数は、有意に上昇する。この現象は、抗トレポネーマ属陰性であると間違いなく性質決定されているヒト血清で観察されてきている:TpN17抗原を用いる場合、かなりの数の偽陽性が見出された(実施例5を参照されたい)。それでも、TpN17は、トレポネーマ属感染における非常に重要な免疫原および梅毒血清学における最重要抗原である。その結果、TpN17抗原を単に除くことによって、この干渉問題を回避するのは、実行可能なオプションではない。
困難なターゲット抗原配列にシャペロンを融合させて、該配列を可溶化し、そしてより良性にする、ポリペプチド融合タンパク質の使用が、当該技術分野に周知であり、そして国際特許出願WO 2003/000878などに以前に非常に詳細に記載されてきている。有用な融合シャペロンの、既知であり、そしてよく文書化された例は、SlyD、FkpA、SkpおよびSlpAである。欧州特許出願EP2127678A1もまた参照されたい。
干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての、VcLp15ペプチドおよびシャペロンを含む融合ポリペプチドの使用もまた、本発明の側面である。
a)体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し
b)上に定義するようなVcLp15ペプチド配列を含む融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
c)前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し;そして
d)前記免疫反応産物のいずれかの存在および/または濃度を検出する
工程を含む、前記方法を含む。
本発明にしたがって、トレポネーマ属抗体が検出可能でありうる任意の生物学的単離試料が使用可能である。特に、ヒト血液、血清、血漿または唾液は、試料材料として適切である。
TpN17およびVcLp15シャペロン融合ポリペプチドのクローニングおよび精製
発現カセットのクローニング
Novagen(米国ウィスコンシン州マディソン)のpET24a発現プラスミドに基づいて、TpN17およびVcLp15融合タンパク質をコードする発現カセットを、本質的に記載されるように得た(Scholz, C.ら, J. Mol. Biol.(2005)345, 1229−1241)。TpN17およびVcLp15抗原の配列を、SwissProtデータベース(それぞれ、SwissProt ID P29722およびQ9KQN6)から回収した。インフレームでN末端に融合させたグリシンリッチリンカー領域を含む、成熟TpN17 aa 23〜156(アミノ酸残基1〜22に渡るシグナルペプチドを除いた)をコードする合成遺伝子をMedigenomix(ドイツ・マルティンスリート)から購入した。酸化または分子間ジスルフィド架橋などの望ましくない副次的影響を防止するため、25位、29位、42位および58位のTpN17のシステイン残基を、アラニン残基に変化させた。BamHIおよびXhoI制限部位は、それぞれ、TpN17コード領域の5’および3’端であった。グリシンリッチリンカー領域を通じて連結され、そしてC末端にさらなるリンカー領域部分を含む、2つのEcSlyD単位(配列番号1記載の残基1〜165、SwissProt寄託番号第P0A9K9号)をコードするさらなる合成遺伝子を、同様に、Medigenomixから購入した。NdeIおよびBamHI制限部位は、それぞれ、このカセットの5’および3’端であった。単純な連結による、シャペロン部分EcSlyD−EcSlyDおよびTpN17抗原部分のインフレーム融合を可能にするように、遺伝子および制限部位を設計した。偶発的な組換えプロセスを回避し、そして大腸菌宿主における発現カセットの遺伝的安定性を増加させるため、EcSlyD単位をコードするヌクレオチド配列を、伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列と同様に、縮重させ、すなわち、同一のアミノ酸配列をコードするように、異なるコドンの組み合わせを用いた。
実質的に同一のプロトコルを用いることによって、すべてのTpN17およびVcLp15融合タンパク質変異体を精製した。特定のpET24a発現プラスミドを宿する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(30μg/ml)を加えたLB培地中、37℃で1.5のOD600まで増殖させ、そして1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを添加することによって、細胞質溶解性過剰発現を誘導した。誘導3時間後、遠心分離(5000gで20分)によって細胞を採取し、凍結し、そして−20℃で保存した。細胞溶解のため、冷却した50mMリン酸ナトリウムpH8.0、7.0M GdmCl、5mMイミダゾール中に凍結ペレットを再懸濁し、そして再懸濁物を氷上で2時間攪拌して、細胞溶解を完了させた。遠心分離および濾過(0.45μm/0.2μm)後、未精製溶解物を、5.0mM TCEPを含む溶解緩衝液で平衡化させたNi−NTAカラム上に適用した。続く洗浄工程を、それぞれのターゲットタンパク質用に調整して、そしてこれは、5〜15mMイミダゾール(50mMリン酸ナトリウムpH8.0、7.0M GdmCl、5.0mM TCEP中)の範囲であった。少なくとも10〜15体積の洗浄緩衝液を適用した。次いで、GdmCl溶液を、50mMリン酸カリウムpH8.0、100mM KCl、10mMイミダゾール、5.0mM TCEPによって置換して、マトリックスに結合したタンパク質のコンホメーション的再フォールディングを誘導した。同時精製プロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete(登録商標)EDTA不含、Roche)を再フォールディング緩衝液中に含んだ。総計15〜20カラム体積の再フォールディング緩衝液を一晩反応で適用した。次いで、3〜5カラム体積の50mMリン酸カリウムpH8.0、100mM KCl、10mMイミダゾールで洗浄することによって、TCEPおよびComplete(登録商標)EDTA不含阻害剤カクテルを除去した。続いて、非特異的に結合しているタンパク質混入物質を除去するため、イミダゾール濃度を、なお50mMリン酸カリウムpH8.0、100mM KCl中で、25〜50mM(それぞれのターゲットタンパク質に応じる)に上昇させた。次いで、同じ緩衝液中、500mMイミダゾールによって、天然タンパク質を溶出させた。Tricine−SDS−PAGEによって、純度に関してタンパク質含有分画を評価し、そしてプールした。最後に、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ(Superdex HiLoad、Amersham Pharmacia)に供し、そしてタンパク質含有分画をプールし、そしてAmiconセル(YM10)中、10〜20mg/mlに濃縮した。
分光光度測定
Uvikon XL二重光線分光光度計を用いて、タンパク質濃度測定を実行した。Pace(1995), Protein Sci. 4, 2411−2423によって記載される方法を用いることによって、モル消光係数(ε280)を決定した。別個の融合ポリペプチドに用いたモル消光係数(εM280)を表1に明記する。
実施例3
TpN17融合タンパク質へのビオチンおよびルテニウム部分のカップリング
TpN17融合ポリペプチドのリジンε−アミノ基を、10〜30mg/mlのタンパク質濃度で、それぞれ、N−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識分子で修飾した。標識/タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、2:1〜5:1(mol:mol)で多様であった。反応緩衝液は、150mMリン酸カリウムpH8.0、100mM KCl、0.5mM EDTAであった。反応を室温で15分間行い、そして10mMの最終濃度まで緩衝L−リジンを添加することによって、停止させた。標識の加水分解不活性化を回避するため、それぞれのストック溶液を乾燥DMSO(seccosolv品質、Merck、ドイツ)中で調製した。反応緩衝液中の最大25%のDMSO濃度は、研究したすべての融合タンパク質によく許容された。カップリング反応後、未精製タンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム(Superdex 200 HiLoad)上に通過させることによって、未反応未結合標識を除去した。
CDに検出される、EcSlyD−VcLp15の熱誘導性アンフォールディング
サーモスタットを備えた細胞ホルダーを持つJasco−720分光旋光計を用いて、近UV CDスペクトルを記録し、そして平均残基楕円率に変換した。緩衝液は、50mMリン酸カリウムpH7.0、250mM KCl、0.5mM EDTAであった。経路長は0.2cmであり、タンパク質濃度は〜74μM(2.6mg/ml)であった。測定範囲は250〜330nmであり、バンド幅は1.0nmであり、スキャン速度は0.5nmの解像度で20nm/分であり、そして反応は1秒であった。シグナル対ノイズ比を改善するため、スペクトルを9回測定し、そして平均した。
梅毒イムノアッセイにおけるコレラ菌Lp15の抗干渉活性
コレラ菌Lp15のポリペプチド融合変異体の抗干渉活性を、自動化Elecsys(登録商標)2010分析装置(Roche Diagnostics GmbH)において評価した。Elecsys(登録商標)は、Rocheグループの登録商標である。二重抗原サンドイッチ形式で測定を行った。
オリゴマーTpN17;単量体VcLp15の添加
単量体TpN17;単量体VcLp15の添加
オリゴマーTpN17;オリゴマーVcLp15の添加
単量体TpN17;オリゴマーVcLp15の添加
Claims (12)
- 単離試料において、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)のTpN17抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌(Vibrio cholerae)リポタンパク質15(VcLp15)のペプチド配列を、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法。
- UniProtID Q9KQN6(配列番号1)または配列番号2記載のペプチド配列、あるいは配列番号1または2の部分配列を用いる、請求項1記載の方法。
- VcLp15の前記部分配列が、配列番号1または2のアミノ酸26〜163を含む、請求項2記載の方法。
- 前記VcLp15ペプチド配列またはその部分配列がシャペロンに融合している、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 配列番号1または2記載のVcLp15ペプチド配列あるいは配列番号1または2の部分配列およびシャペロンを含む、融合ポリペプチド。
- 前記シャペロンがSlyD、SlpA、FkpAおよびSkpからなる群より選択される、請求項5記載の融合ポリペプチド。
- 配列番号3を含む請求項5または6記載の融合ポリペプチド。
- 干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするためのイムノアッセイにおける添加剤としての、請求項5〜7記載の融合ポリペプチドの使用。
- TpN17抗原および請求項5〜7記載の融合ポリペプチドを含む、イムノアッセイにより単離試料において梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための、試薬キット。
- 単離試料において、梅毒トレポネーマのTpN17抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
a)体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し、
b)請求項5〜7のいずれか記載の融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
c)前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し;そして
d)前記免疫反応産物のいずれかの存在および/または濃度を検出する
工程を含む、前記方法。 - 2つのTpN17抗原、
第一のTpN17抗原であって、TpN17配列および第一のシャペロンを含み、固相に結合可能である、前記の第一のTpN17抗原、
第二のTpN17抗原であって、TpN17配列および第二のシャペロンを含み、検出可能標識を所持する、前記の第二のTpN17抗原
を、単離試料中で検出しようとする抗体に関する特異的結合パートナーとして用い、
どちらのTpN17抗原も同一であるかまたは免疫学的に交差反応性であり、したがって、これらは試料中に存在する抗体によって特異的に結合可能であり、そして
第一および第二のシャペロンが異なる
請求項10記載の方法。 - 第一のTpN17抗原がシャペロンとして大腸菌(E. coli)FkpAを含み、そして第二のTpN17抗原がシャペロンとして大腸菌Skpを含む、請求項11記載の方法。
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